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【発明の名称】 腎障害の判定方法
【発明者】 【氏名】坂爪 実
【氏名】下条 文武
【氏名】成田 一衛
【氏名】津畑 豊
【氏名】小川 麻
【課題】腎障害、とくに糸球体上皮障害を非浸襲的な検出方法で判定することが可能な腎障害の判定方法を提供する。

【解決手段】尿中のアログラフト炎症因子‐１（ＡＩＦ‐1）蛋白を検出することにより腎障害を判定する。ＡＩＦ‐1蛋白の検出には、免疫化学的方法またはＰＣＲ法またはＥＬＩＳＡ法が好適に用いられる。免疫化学的方法は、抗ＡＩＦ‐1抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより行う。ＰＣＲ法は、ＡＩＦ‐１特異的プライマーを用いて行う。ＥＬＩＳＡ法は、抗ＡＩＦ‐1抗体を用いて行う。そして、尿は、遠心分離法により得られた尿沈渣または尿上清である。このように、腎障害、とくに糸球体上皮障害を非浸襲的な検出方法で判定することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中のアログラフト炎症因子‐１（ＡＩＦ‐1）蛋白を検出することを特徴とする腎障害の判定方法。
【請求項２】
前記アログラフト炎症因子‐１蛋白の検出を免疫化学的方法またはＰＣＲ法またはＥＬＩＳＡ法により行うことを特徴とする請求項１記載の腎障害の判定方法。
【請求項３】
前記免疫化学的方法を抗アログラフト炎症因子‐１抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより行うことを特徴とする請求項２記載の腎障害の判定方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ法をアログラフト炎症因子‐１特異的プライマーを用いて行うことを特徴とする請求項２記載の腎障害の判定方法。
【請求項５】
前記ＥＬＩＳＡ法を抗アログラフト炎症因子‐１抗体を用いて行うことを特徴とする請求項２記載の腎障害の判定方法。
【請求項６】
前記尿が遠心分離法により得られた尿沈渣または尿上清であることを特徴とする請求項１記載の腎障害の判定方法。
【請求項７】
前記腎障害が糸球体上皮障害であることを特徴とする請求項１〜６記載の腎障害の判定方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎障害、とくに、糸球体上皮障害を判定する腎障害の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、腎障害（腎不全）治療のための透析医療費は１兆円を超え、全医療費の約３%を占め、腎障害患者数は年々増加している。そして、その腎障害の中で、糸球体上皮が様々な原因により機能的あるいは構造的な障害を受けるものを糸球体上皮障害という。そして、その糸球体上皮障害の原因としては、炎症細胞から放出される活性酸素、蛋白分解酵素、あるいは血清中の毒素やメディエーターなどが考えられている。また、糸球体上皮障害は、腎硬化症に直接結びつく病態である。そのため、糸球体上皮障害を非浸襲的な方法で検出することは、糸球体上皮障害の早期発見につながり、腎硬化症への進展を阻止する早期治療を行うためにも、非常に重要である。
【０００３】
これまでに、非浸襲的な検出方法であり、ポドカリキシンなどの糸球体上皮特異蛋白をマーカーとして、糸球体上皮障害を判定しようとする例がある。
【０００４】
引用文献１には、簡便で所要時間が短く、かつ、ヒトポドカリキシンの定量も可能な、腎炎の診断に適用することができる、ヒトポドカリキシンの測定方法が開示されている。引用文献１の方法によれば、固相に結合した第１の抗ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、前記第１の抗ヒトポドカリキシン抗体とは対応エピトープが異なる第２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を反応させ、次いで固相に結合した該第２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定することにより、検体中のヒトポドカリキシンを測定することができる。
【０００５】
また、引用文献２には、腎障害に関連して見られる物質、例えば尿中のポドカリキシンおよび／またはネフリンを測定することによる、簡便な腎障害の検査手段が開示されている。引用文献２の方法によれば、腎障害に関連して見られるポドサイトの表面に存在するタンパク質を細胞表面から遊離させる処理を施すことにより、尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または遊離の物質を測定することができる。
【特許文献１】特開平６−１１５０７号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００２／０３７０９９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、糸球体上皮は、障害を受けると特異蛋白を欠失しやすく、従来、ポドカリキシン以外には尿で検出できる蛋白が報告されていなかった。
【０００７】
そのため、糸球体上皮が障害を受けた際に、ポドカリキシン以外に尿で検出できる蛋白を発見することは、その蛋白を糸球体上皮障害の判定に利用するためのマーカーとして使用するためにも、非常に重要であった。
【０００８】
そこで、本発明は、障害を受けると特異蛋白を欠失しやすい糸球体上皮の、ポドカリキシン以外に尿で検出できる蛋白をマーカーとして使用し、非浸襲的な方法で糸球体上皮障害を判定することが可能な、腎障害の判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて腎臓に発現する遺伝子を網羅的に検出した本発明者らの研究（J Immunol 2003 Mar 15;170(6):3377-85）から、これまでに腎臓での発現が知られていなかった蛋白、アログラフト炎症因子‐１（Allograft Inflammatory Factor：ＡＩＦ‐1）が糸球体上皮に発現することを見出した（Kidney International 2006 Dec;70(11):1948-1954）。また、ＡＩＦ‐１は、糸球体上皮細胞障害のないヒトの尿検体では検出できず、腎生検で糸球体上皮細胞障害が明らかな患者の尿検体で検出されることを発見した。そこで、本発明者らは、尿中におけるＡＩＦ‐１蛋白の同定を行い、ポドカリキシンとほぼ同等の検出感度があることを明らかした。このことから、本発明者らは、上皮細胞障害を示す各種腎疾患において、ＡＩＦ‐1陽性の糸球体上皮が尿中に出現することが、糸球体上皮障害を判定するための、マーカーの１つとなりうることを発見した。
【００１０】
ここで、上述のように、糸球体上皮は、障害を受けると特異蛋白を欠失しやすく、従来、ポドカリキシン以外には尿で検出できる蛋白が報告されていなかった。そのため、ＡＩＦ‐1蛋白が糸球体上皮に発現すること、そして、糸球体上皮障害を判定するためのマーカーの１つとなりうること、という今回の発見は重要であった。しかも、ポドカリキシンは細胞膜蛋白であるが、ＡＩＦ‐１は細胞質蛋白であるので、今後の検討により、両者の臨床的意義に重要な相異が見出される可能性がある。
【００１１】
このように、上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、ＡＩＦ‐１蛋白を免疫化学的方法またはＰＣＲ法またはＥＬＩＳＡ法により検出するという、非浸襲的な検出方法で、腎障害、とくに糸球体上皮障害を判定できることを見出し、本発明に想到した。
【００１２】
本発明における請求項１記載の腎障害の判定方法は、尿中のＡＩＦ‐1蛋白を検出することを特徴とする。
【００１３】
本発明における請求項２記載の腎障害の判定方法は、請求項１において、前記ＡＩＦ‐1蛋白の検出を免疫化学的方法またはＰＣＲ法またはＥＬＩＳＡ法により行うことを特徴とする。
【００１４】
本発明における請求項３記載の腎障害の判定方法は、請求項２において、前記免疫化学的方法を抗ＡＩＦ‐1抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより行うことを特徴とする。
【００１５】
本発明における請求項４記載の腎障害の判定方法は、請求項２において、前記ＰＣＲ法をＡＩＦ‐１特異的プライマーを用いて行うことを特徴とする。
【００１６】
本発明における請求項５記載の腎障害の判定方法は、請求項２において、前記ＥＬＩＳＡ法を抗ＡＩＦ‐1抗体を用いて行うことを特徴とする。
【００１７】
本発明における請求項６記載の腎障害の判定方法は、請求項１において、前記尿が遠心分離法により得られた尿沈渣または尿上清であることを特徴とする。
【００１８】
本発明における請求項７記載の腎障害の判定方法は、請求項１〜６において、前記腎障害が糸球体上皮障害であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
糸球体上皮障害は腎硬化症に直接結びつく病態である。そのため、これを非侵襲的な尿検査で検出できることは、糸球体上皮障害の早期発見につながり、腎硬化症への進展を阻止する早期治療を実施することができる。また、糸球体上皮障害を早期に発見し、早期治療を実施することにより、透析療法を必要とする腎不全患者の増加に歯止めをかけることが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
本発明における腎障害の判定方法は、尿中のアログラフト炎症因子‐１（ＡＩＦ‐1）蛋白を検出することを特徴とする。
【００２２】
ここで、ＡＩＦ‐１（Allograft Inflammatory Factor）は、１４３のアミノ酸から成り、進化的に保存された、ヒトにおけるヒト白血球抗原クラスIIIゲノム領域内でエンコードされたカルシウム結合タンパク質である。そして、その発現は、炎症過程に関与することが知られている。また、ＡＩＦ‐１は、糸球体上皮細胞障害のないヒトの尿検体では検出できず、腎生検で糸球体上皮細胞障害が明らかな患者の尿検体では検出された。したがって、尿中のＡＩＦ‐1蛋白を検出することにより、腎障害を判定することができる。
【００２３】
そして、特定の方法に限定されるものではないが、前記ＡＩＦ‐1蛋白の検出には、免疫化学的方法またはＰＣＲ法またはＥＬＩＳＡ法が好適に用いられる。
【００２４】
そして、前記免疫化学的方法は、抗ＡＩＦ‐1抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより行う。
【００２５】
そして、前記ＰＣＲ法は、ＡＩＦ‐１特異的プライマーを用いて行う。
【００２６】
そして、前記ＥＬＩＳＡ法は、抗ＡＩＦ‐1抗体を用いて行う。
【００２７】
そして、前記尿は、遠心分離法により得られた尿沈渣または尿上清である。
【００２８】
ここで、ＡＩＦ‐1蛋白の検出を、免疫化学的方法により行う場合、及び、ＰＣＲ法により行う場合は、尿沈渣が好適に用いられる。そして、ＥＬＩＳＡ法により行う場合は、尿上清が好適に用いられる。
【００２９】
また、本発明の実施例１で述べているように、ＡＩＦ‐１は、尿炎症細胞（ＣＤ３+、ＣＤ１４+）においても発現していることが明らかにされた。このことから、ＡＩＦ‐１蛋白の検出は、ＰＣＲ法及びＥＬＩＳＡ法よりも、免疫化学的方法により行うことが望ましい。
【００３０】
このように、本発明における腎障害の判定方法により、腎障害、とくに糸球体上皮障害を非浸襲的な検出方法で判定することができる。
【００３１】
以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
近年、尿沈渣におけるポドサイトの検出は、糸球体における激しいポドサイトの損傷の出現を示唆することが報告されている。我々の知るところ、ポドカリキシンは、ヒト尿沈渣におけるポドサイトとそれらのフラグメントの最も確実なマーカーである。このため、我々は、ＡＩＦ‐１蛋白が、尿沈渣におけるポドサイトとそれらのフラグメントのマーカーとして有用であるかの評価を試みた。
【００３３】
（対象症例）
尿サンプルと腎臓標本は、２０００年から２００６年にかけて、９人の患者から得た。その患者は、３人の腎臓移植のドナー（４４，４９，及び５３歳，女性，尿タンパク値，０．０１−０．０４ｇ／１日）、急性拒絶を伴う腎臓移植レシピエント（バンフ診断基準αＡ）（３０歳，男性）、及び腎生検によりＩｇＡ腎症と診断された５人の患者（４０−５１歳（平均，４５．２歳），尿タンパク値，０．４７−３．３ｇ／１日（平均，１．８ｇ／１日））であった。そのドナー腎臓は、ノーマルコントロールと見なした。本研究は、新潟大学病院の倫理委員会により承認された。患者の研究協力に際しては研究の主旨を説明し、インフォームドコンセントを得た。
【００３４】
（免疫組織化学法）
定法によりパラフィン中に包埋されたヒト腎臓組織（４μｍ）は、キシレン中で脱パラフィン化し、アルコール系勾配中で再水和した。そして、ＰＢＳで洗浄した。全ての試料は、抗原回復のために１２１℃で１５分間、１０ｍMクエン酸塩溶液中で高圧滅菌により水和する前処理を施した。スライドは、１０分間３％過酸化水素水で固定し、そして、１５分間、３％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。ＡＩＦ‐１検出のために、そのスライドを、ヤギ抗ラットＡＩＦ‐１ポリクローナル抗体、また、ヒトＡＩＦ‐１ポリクローナル抗体（アブカム，ケンブリッジ，ＵＫ）で４℃で１晩処理した。そして、そのスライドを、２次抗体として、１／１００希釈したペルオキシダーゼ‐ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体複合体（ダコ，カーピンテリア，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理した。その免疫複合体は、３，３’‐ジアミノベンジジン４塩酸塩（ダコ）で検出した。そして、ヘマトキシリンで対比染色を行った。コントロール試料は、抗ＡＩＦ‐１抗体の代わりに、ノーマルヤギＩｇＧ（ジムド ラボラトリーズ，サウス サン フランシスコ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理した。
【００３５】
（免疫蛍光顕微鏡法）
新鮮尿５０−２００ｍｌから遠心分離法により尿沈渣を得、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして、遠心分離により沈殿物を得た。それらの尿沈渣は、その後、スライドガラス上に処理し（サイトスピン処理）、４℃で５分間アセトン中で固定した。尿沈渣は、室温で９０分間、抗ＡＩＦ‐１抗体（５μｇ／ｍｌ）で処理した。そして、２次抗体として、１／４０に希釈したウサギ抗ヤギＩｇＧフルオレセインイソチオシアネート複合体（ジムド ラボラトリーズ）で室温において６０分間処理した。ＰＢＳで十分洗浄した後、そのスライドは、ポドサイトマーカーとしてマウス抗ポドカリキシンモノクローナル抗体（４Ｄ５）、また、フィコエリトリン−マウス抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体複合体（ＢＤ バイオサイエンシーズ，サンノゼ，ＣＡ，ＵＳＡ）、また、フィコエリトリン‐マウス抗ヒトＣＤ３ モノクローナル抗体複合体（ＢＤ バイオサイエンシーズ）で処理した。イソチオシアン酸テトラメチルローダミン‐ウサギ抗マウス免疫グロブリン複合体（ダコ）は、４Ｄ５の２次抗体として使用した。その免疫蛍光シグナルは、免疫電子顕微鏡法により検出した。コントロール試料は、アイソタイプにマッチしたコントロール抗体；抗ＡＩＦ‐１抗体の代わりにヤギＩｇＧ（ジムド ラボラトリーズ）、及び、４Ｄ５の代わりにマウスＩｇＧ２ａ（ＢＤ バイオサイエンシーズ）で処理した。
【００３６】
（結果と考察）
まず、本発明者らは、ヒトの腎臓標本において免疫組織化学的研究を行った（図１ａ−ｃ）。（図１ａ及びｂ）正常ヒト腎臓組織を、抗ＡＩＦ‐１抗体で染色した。また、（図１ｃ）急性拒絶を伴うヒト腎臓組織を、抗ＡＩＦ‐１抗体（茶）で染色した。
【００３７】
この結果、正常の腎臓標本において、ＡＩＦ‐１蛋白はポドサイトに検出された（茶）。そして、移植された急性拒絶を伴う腎臓移植片標本において、ＡＩＦ‐１蛋白は、ポドサイトと同様に浸潤炎症細胞においても検出された（茶）。
【００３８】
つぎに、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ腎炎の５人の患者の尿沈渣を、免疫蛍光顕微鏡法により、抗ＡＩＦ‐１抗体及び抗ポドカリキシン抗体で二重染色した。また、（図１ｄ−ｌ）５人のＩｇＡ腎症患者の尿沈渣において、（図１ｄ−ｆ）抗ＡＩＦ‐１抗体（緑）と（図１ｇ−ｈ）抗ポドカリキシン抗体（赤）、あるいは、（図１ｉ）抗ＣＤ１４抗体（赤）を用いた間接的二重染色による免疫蛍光顕微鏡的研究を行った。（図１ｊ−ｌ）融合した写真（黄）は、ポドサイトとそれらのフラグメントにおいて、ＡＩＦ‐１蛋白が存在すること、それらはまた、ポドカリキシン成分を有していること、そして、ＡＩＦ‐１陽性のいくつかの細胞成分は、ＣＤ１４に対して陽性であったことを示している。写真は、５人のＩｇＡ腎症患者から作成したスライドの代表である（オリジナル倍率；ａ−ｃ，×４００，ｄ−ｌ，×４００）。
【００３９】
この結果、図１ｄ−ｌは、ＩｇＡ腎炎の患者の尿沈渣におけるポドサイトとそれらのフラグメントに対する抗ポドカリキシン抗体及び抗ＡＩＦ‐１抗体の反応が同一であることが明らかになった。アイソタイプマッチしたコントロール抗体で処理された全ての試料において、有意なシグナルは検出されなかった（データ示さず）。これらの結果は、ＡＩＦ‐１がヒトにおけるポドサイトと尿中に検出されるポドサイトの新規のマーカーであることを示唆している。
【００４０】
ここで、抗ポドカリキシン抗体及び抗ＡＩＦ‐１抗体の反応パターンは、全ての沈渣においてほとんど同じであったが、いくつかのＡＩＦ‐１陽性細胞はポドカリキシンに対して陰性であった。
【００４１】
次に、ＡＩＦ‐１は、活性化糸球体腎炎の尿における炎症細胞と炎症Ｔ細胞、及び、マクロファージにおいて発現するので、我々は、ＩｇＡ腎炎の３人の患者の尿沈渣において、抗ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）、また、抗ＣＤ１４（マクロファージマーカー）を用いて二重染色による免疫蛍光顕微鏡法を行った。我々は、いくつかのＡＩＦ‐１陽性細胞成分は、ＣＤ３あるいはＣＤ１４に対して陽性であること（図１ｆ、ｉ及びｌ）、そしてそれは、ＡＩＦ‐１陽性細胞は、一部分において、Ｔ細胞あるいはマクロファージを含んでいる可能性のあることを見出した。
【００４２】
本発明のための研究において、尿ポドサイトとポドカリキシン陽性粒状構造は、抗ＡＩＦ‐１抗体と抗ポドカリキシン抗体にほとんど同程度に陽性であることを示した。それゆえ、ＡＩＦ‐１は、ヒト尿沈渣におけるポドサイトマーカーのひとつであると考えられた。本発明者らは初めて、ＡＩＦ‐１は、ポドサイトの新規細胞質成分であり、そして、尿ポドサイトの数少ないマーカーの一つであることを見出した。また、ＡＩＦ‐１は、糸球体上皮細胞障害のないヒトの尿検体では検出できず、腎生検で糸球体上皮細胞障害が明らかな患者の尿検体では検出された。したがって、尿中のＡＩＦ‐１を検出することにより、腎障害、とくに糸球体上皮細胞障害を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の実施例１における、ヒト腎臓組織における免疫組織化学法及びヒト尿沈渣における免疫蛍光顕微鏡法の結果を示す写真である（オリジナル倍率；ａ−ｃ，×４００，ｄ−ｌ，×４００）。

特許の図
【出願人】 【識別番号】３０４０２７２７９
【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学
【出願日】 平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【代理人】 【識別番号】１０００８００８９
【弁理士】
【氏名又は名称】牛木 護

【識別番号】１００１３７８００
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 正義

【識別番号】１００１４０３９４
【弁理士】
【氏名又は名称】松浦 康次

【識別番号】１００１１９３１２
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 栄松
【公開番号】 特開２００８−１５１５１７（Ｐ２００８−１５１５１７Ａ）
【公開日】 平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願番号】 特願２００６−３３６７０６（Ｐ２００６−３３６７０６）