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ダイフラクトースアンハイドライドIV(DFAIV)の製造方法 - 特開2008−307010 | j-tokkyo
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【発明の名称】 ダイフラクトースアンハイドライドIV(DFAIV)の製造方法
【発明者】 【氏名】浅野行蔵

【要約】 【課題】ダイフラクトースアンハイドライドIV(DFA IV)の製造方法の提供。

【解決手段】レバン生産菌の1つであるBatillus subtilisに外来性のレバンフルクトトランスフェラーゼ(LFTase、EC 4.2.2.16)遺伝子を発現させ、砂糖を原料に、一液系でダイフラクトースアンハイドライドIVを製造する方法。枯草菌が、Bacillusi subtilis/pLFT−G (AHU1841 FERMP AP−21304)である、DFA IVの製造方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
レバン生成能を持つ枯草菌を宿主として、レバンフルクトトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物を用いて、砂糖を原料に、一液系でダイフラクトースアンハイドライドIV(DFA IV)を製造する方法。
【請求項2】
請求項1の枯草菌が、Bacillusi subtilis/pLFT−G (AHU1841 FERMP AP−21304)であるDFA IVの製造方法

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、ダイフラクトースアンハイドライドIV(DFA IV)の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ダイフラクトースアンハイドライド類(DFA類)は、フルクトース二分子から成る環状の二糖であり、これまでに4種類のDFA(DFA I,DFA III,DFA IV,およびDFA V)が微生物の酵素によって生産されることが報告されている(非特許文献1参照)。その中でもdi−D−fructofranosyl1、2’:2,3’anhydride(DFA III)およびdi−D−fructofranosyl2、6’:2’、6anhydride(DFA IV)はその特殊な機能から注目を集めている。
DFA IIIやDFA IVは、様々な栄養分の吸収に関わるタイトジャンクションの透過性を上げ、小腸および大腸におけるカルシウム、マグネシウム、亜鉛の吸収を促進することがラットを用いた試験により報告されている(非特許文献2および3参照)。また、DFA IIIおよびDFA IVは、難消化性のオリゴ糖であり、ヒトの消化酵素によっては分解されない。しかし、腸内細菌によって腸内発酵が起こり、酢酸や酪酸、乳酸などの有機酸に変換される。これらの有機酸は盲腸内容物のpHを低下させ、カルシウムの可溶化度を上げることにより、カルシウム吸収を促進させる(非特許文献4参照)。以上の点からDFA IIIやDFA IVは新規の機能性食品素材として重要である。
【0003】
DFA IIIはイヌリン(フルクトースがβ−2、1結合したフルクタン)からArthrobacter sp.H65−7の持つ酵素inulinfructotransferase(EC 2.4.1.93;inulase II)によって生産される(非特許文献5参照)。この酵素を用いたDFA IIIの商業的な大量生産が行われており、DFA IIIについてはさらに詳細な機能解析が進められている。ヒトおよびラットにおけるDFA IIIの腸内菌叢への影響が報告されており(非特許文献6および7参照)、DFAIIIを資化する細菌がヒトの糞便(Ruminococcus productus AHU1760、FERM AP−20042)(非特許文献8および9参照)およびラットの盲腸内容物から(R.productus M−1およびM−2)単離されている(非特許文献7および10参照)。
【0004】
DFA IVはレバン(フルクトースがβ−2、6結合したフルクタン)からDFA IV合成酵素levanfructotransferase(LFTase、EC 4.2.2.16)の働きによって生産されArthrobacter nicotinovorans GS−9(AHU1840、FERM P−15285)やArthrobacter ureafaciens K2032がLFTaseを発現することが報告されている(非特許文献参照11、12)
【0005】
DFA IVの大量生産はDFA IVの詳細な機能解析や食品、医薬品産業への応用に必要な技術であるが、原料となるレバンの生産が困難であることが大量生産を難しくしている。
レバンは砂糖からlevansucrase(EC 2.4.1.10)によって生産される多糖であり、フルクトースがβ−2、6結合した主鎖およびβ−2、1結合による枝分かれ構造からなる(非特許文献参照13)。
Bacillus subtilis(非特許文献参照14)、Pseudomonas syringae(非特許文献参照15)、Zymomonas mobilis(非特許文献参照16)、およびSerratia levanicum(非特許文献参照17)などがレバン生産菌として報告されている。レバン生産においては、レバンが生産されると培養液の粘性が上昇し、攪拌の障害となることや培地からのレバンの精製に大量の有機溶剤が使用されるなどの問題がある(非特許文献参照18)。
【0006】
これまでにA.nicotinovorans GS−9およびA.ureafaciens K2032からLFTaseをコードする遺伝子(lftgene)がクローニングされ、Escherichia coli JM109における発現が報告されている。(非特許文献参照19、20)しかし、いかにLFTaseの発現が行われても、DFA IVの生産には別に調製したレバンが必要となり、DFA IV生産において問題となるレバン生産の困難さは解決されずに残っていた。
【0007】
【非特許文献1】斎藤および冨田、Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000年64巻、ページ1321−1327.
【非特許文献2】原および近藤、Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005年69巻、ページ839−841.
【非特許文献3】峰尾ら、Dig. Dig. Sci. 2004年49巻、ページ122−132.
【非特許文献4】斎藤ら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999年63巻、ページ655−661.
【非特許文献5】横田、榎本、および冨田 J. Ferment. Bioeng. 1991年72巻、ページ262−265.
【非特許文献6】南田ら、J. Biosci. Bioeng. 2004年98巻、ページ244−250.
【非特許文献7】南田ら、J. Biosci. Bioeng. 2005年99巻、ページ230−236.
【非特許文献8】南田ら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006年70巻、ページ332−339.
【非特許文献9】南田ら、J. Biosci. Bioeng. 2006年101巻、ページ149−156.
【非特許文献10】南田ら、J. Biosci. Bioeng. 2005年99巻、ページ548−554.
【非特許文献11】斎藤ら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997年61巻、ページ1705−1709.
【非特許文献12】Songら、Enzyme. Microb. Technol. 2000年、27巻、ページ212−218.
【非特許文献13】Hestrinら、Biochem. J. 1943年、37巻、ページ450−456.
【非特許文献14】Lepesantら、Mol. Gen. Genet. 1972年、118巻、ページ135−160.
【非特許文献15】Hettwerら、J. Bacteriol. 1995年、177巻、ページ2834−9.
【非特許文献16】Dawesら、Biochem. J. 1966年、98巻、ページ804−812.
【非特許文献17】小島ら、J. Ferment. Bioeng. 1993年、75巻、ページ9−12.
【非特許文献18】Hanら、Appl. Microbiol. 1990年、35巻、ページ171−94.
【非特許文献19】斎藤ら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997年、61巻、ページ2076−2079.
【非特許文献20】Kimら、Lett. Appl. Microbiol. 2005年、40巻、ページ228−234.
【非特許文献21】Xueら、J. Microbiol. Methods. 1999年、34巻、ページ183−191.
【非特許文献22】Sambrookら、Molecular Cloning, 第2版 New York: CSH Press;1989年.
【非特許文献23】田中ら、Carbohydr. Res. 1982年、99巻、ページ197−204.
【非特許文献24】Shinら、J. Agric. Food Chem. 2005年、53巻、ページ8211−8215.
【0008】
今般、発明者らは、レバン生産菌である枯草菌B.subtilisを宿主とすることでDFA IVを砂糖から直接生産することを可能とし、レバン生産の難しさを避けることを可能とし、発明を完成させるに至った。

【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
解決しようとする問題点は、天然多糖類であるレバンを原料として用いないとDFA IVが、作れないことである。

【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、レバン生産菌である枯草菌B.subtilisを宿主とすることでDFA IVを砂糖から直接生産することを可能とし、レバン生産の難しさを避けることを可能とし、発明を完成させるに至った。
より具体的には、レバン生産菌の1つであるBacillus subtilisに外来性のlftgeneを発現させることで、DFA IVを砂糖から直接、1つの培養系で生産できるシステムを構築した。

【発明の効果】
【0011】
この生産系の利点は、レバンの精製工程を避けることができるため、レバン生産の難しさ、および精製の際に大量に使用される有機溶媒を削減できる点にある。
様々なレバン生産菌の中からBacillus subtilisを宿主として選択した理由は、様々な遺伝子工学的な手法が使えること、組換え酵素を培地中に分泌できること、さらにGRASに認定された菌であることが挙げられる。

【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
DFA IVを効率的に生産する目的を、原料であるレバンも微生物で生産させ、かつ、同じ培養液系で、同時にDFA IVへの反応が進行し、1液系でDFA IVの生産ができる仕組みを実現したい。

【実施例1】
【0013】
材料と方法
(1)供試菌株、使用したプラスミド、培地など
A.nicotinovorans GS−9より取得したゲノムDNAを使用した。iikori TOP10およびDB3.1はInvitrogen Corp.(Carlsbad、USA)より購入し、発現ベクターの構築に使用した。レバン生産菌であることが報告されているB.subtilis 168((非特許文献参照14)、JCM 10629)を発現、およびDFA IV生産の宿主とした。PCRによって増幅した断片のpENTR/D−TOPOへのTOPO−cloningおよびLRclonase(Invitrogen Corp.)の反応は製品に添付のプロトコルに従った。Gateway vector conversion kitはInvitrogen Corp.より購入し、KOD−plus DNA polymerase(Toyobo、Osaka、Japan)およびT4−ligase(New England BiolabsInc.Beverly、MA)をPCRおよびライゲーション反応に用いた。塩基配列はABI PRISM3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて解析した。B.subtilis 168のコンピテント細胞はXueらの方法に従って作成した(非特許文献参照21)
Ampicillinは100μg/mlの濃度で、chloramphenicolは10μg/mlの濃度で適時使用した。

【0014】
(2)lft遺伝子発現ベクターの構築
エントリークローンの作成
A.nicotinovorans GS−9の遺伝子lftの配列は既に報告されている(非特許文献参照19)。この配列をもとにLFTaseの成熟タンパク部分を含むように2つのプライマー、R1(5‘−cacccaggcatccctccgggcga−3’)とF1(5’−gctctagagtcagatgcgaactgcccaa−3’)を設計した。また、R1プライマーの5’末端にはTOPOクローニングの際に必要となるCACCの配列が付与するように設計した。A.nicotinovorans GS−9のゲノムDNA、設計した2つのプライマーを用いてPCRにより目的のDNA配列を増幅した。PCRは以下の条件で行った。94℃4分間の熱変性後、94℃30秒間(熱変性)、60℃30秒間(アニーリング)、68℃1分間(伸長,25サイクル)及び68℃7分間(伸長)で行った。
増幅したDNA断片をpENTR/D−TOPOに挿入し、エントリークローンpLFT−ENTRを構築した。

【0015】
デスティネーションベクターの構築
pHT43 Bacillus subtilis expression vector(MoBiTec、Goettingen、Germany)をGatewayシステムにおけるdestinationvectorとするため、まずpHT43をSmaI(タカラ(株))で消化し、Gateway Reading Frame Cassette A(Invitrogen Corp.)をT4−ligaseを用いて挿入した。ここで構築したdestination vectorをpHT43−GATEとし、pLFT−ENTRと共にLR反応に使用した。

【0016】
形質転換
LR反応の結果、構築された発現用ベクターをpLFT−Gとした。pLFT−Gおよびインサートを含まないコントロールベクターpHT43をB.subtilis 168に形質転換し、それぞれB.subtilis/pLFT−G(AHU1841、FERM AP−21304)、およびB.subtilis/pHT43とした。

【0017】
(3)LFTase活性の検出。
基質として使用するレバンはSerratia levanicum由来のものを和光純薬(株)から購入して使用した。反応はリン酸ナトリウム緩衝液(終濃度50mM、pH6.0)とレバン(終濃度10mg/ml)、および0.25mlの培養上清を混合し、最終的に体積が0.5mlとなるようにして、37℃で3時間反応を行った。反応産物をTLCまたはHPLCにより分析した。TLCには参考文献(非特許文献参照5)に記載されている方法Bを使用し、HPLCによる測定ではrefractive index detectorを検出に使用し、カラムはYMC−Pack ODS−AQ 6×250mm、(YMC(株)京都)を使用し、移動相は水とした。1UのLFTase活性は1分間に1μmolのDFA IVを生産するのに必要な酵素量とした。

【0018】
(4)DFA IVの精製
B.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)の培養上清に市販パン酵母を添加し、27度で48時間反応を行うことでDFA IV以外の糖を除去した。これは、パン酵母が砂糖やフルクトース、グルコース、およびレバン型のオリゴ糖を資化する一方でDFA IVを資化しないという性質を利用したものである(非特許文献参照1)。
反応後、酵母菌体は遠心により除去し、上清に吸着剤として活性炭を添加した。この活性炭をカラム(2.6×30cm)に充填し、超純水で十分に洗浄した。その後25%エタノールで溶出を行い、溶出液をエバポレーターで濃縮、乾燥後、重水に溶解した。13C−NMR解析はBrukerAMX−500を用いて行った。

【0019】
結果と考察
(1)B.subtilisにおけるlftgeneの発現の検出
B.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)およびB.subtilis/pHT43をLB培地で培養し、生育が1.0(OD660)に達した時点で終濃度1mMとなるようにIsopropyl−thio−β−D−galactoside(以下IPTG)を添加した。培養3時間後および6時間後に培養液の一部を回収し、Serratia levanを基質として上清のLFTase活性を検出した。TLCによる解析の結果、B.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)のサンプルにのみDFA IVに一致するスポットが検出された(図1)。この結果からB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)においてlft遺伝子が発現されたことが示唆された。

【0020】
(2)単一培養系における砂糖からのDFA IVの生産
B.subtilis/pHT43およびB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)をTerrificBroth(TB培地)(非特許文献参照22)で10時間培養した。500 mlの培養液を25 mlのTB培地に接種し、500ml容の坂口フラスコを用いて120rpm、37℃の条件で振盪培養した。生育、LFTase活性、DFA IV生産量を図2に示した。
生育が1.0(OD660)になった時点でIPTG(終濃度1mM)を添加した。誘導後15.5時間までB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)のLFTase活性が上昇した。B.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)の最大活性(0.062 U/ml)はこれまでに報告されているA. nicotinovorans GS−9のLFTase活性(3.3 U/ml)(非特許文献参照19)よりも低いものであった。誘導15.5時間後、終濃度が200 g/lとなるように砂糖溶液を培地中に添加した。HPLCによる分析の結果、DFA IVに一致する生産物はB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)の培養上清にのみ検出された。砂糖添加78時間後、20.5g/lのDFA IVの生産が確認された。また、139.3g/lの砂糖の消費が確認された。
培養上清から精製したDFA IVのHPLC純度は95.4%であった。

【0021】
13C−NMR解析の結果、精製産物の化学シフトはこれまでに報告されているDFA IVのケミカルシフト(非特許文献参照23)に一致した。値を表1に示す。この結果からB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)が単一培養系において砂糖からDFA IVを生産したことが示された。

【0022】
(表1)
13C−NMR 培地上清から精製した物質の化学シフトAssignment
―――――――――――――――――――――――――
炭素番号 13C−NMR化学シフト
――――――――――――――――――――
精製物質(a) DFA IV(b)
―――――――――――――――――――――――――
1 60.7 60.7
2 103.5 103.5
3 81.2 81.2
4 77.2 77.4
5 72.1 72.3
6 59.6 59.8
―――――――――――――――――――――――――
(a)TSPを外部標準として用いた.
(b)非特許文献参照23に記載された化学シフト

【0023】
これまでに砂糖からDFA IVを生産した報告例は無い。そこで2分子の砂糖から2分子のフルクトースが遊離し、1分子のDFA IVが合成されると仮定した。
この仮定の下で砂糖からのDFA IV生産の理論重量収率は47.3%であり、本研究における重量収率は14.7%であった。(139.3g/lの砂糖20.5g/lのDFA IVが生産された)
この収率は理論収率の31.1%であった。
B.subtilis/pHT43はB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)とほぼ同じ生育を示したが、培養上清にLFTase活性やDFA IVの生産は確認されなかった。


【産業上の利用可能性】
【0024】
複雑な工程を経ることなく、1液系で、原料の砂糖から最終生成物であるDFA IVまでの反応が行われるため、より狭い場所で、より少ない工数でDFA IVを製造することができるため、量産化、コスト低減が可能となった。

【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】Serratiaレバンを基質とした反応のTLC分析の結果を示している(実施例1)
【図2】砂糖からのDFA IV生産における生育とLFTase活性を示している(実施例1)
【符号の説明】
【0026】
S1,セラチアレバン
S2 DFA IVおよびフルクトース
レーン1および2,B.subtilis/pHT43の反応物(それぞれ誘導後3時間または6時間後のもの)
レーン3および4,B.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)の反応物(それぞれ誘導後3時間または6時間後のもの)
S3,フルクトース

18時間の点線はスクロースを入れた時点を示す(図2)。
黒丸と実線はB.subtilis/pHT43の生育を示す
黒三角と実線はB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)の生育を示す。
白三角と実線はB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)のLFTase活性を示す。
白三角と破線はB.subtilis/pLFT−G (AHU1841,FERM AP−21304)のDFA IV生産量を示す。なお、B.subtilis/pHT43の上清にはDFA IVの生産は確認できなかった。

【出願人】 【識別番号】593013074
【氏名又は名称】浅野 行蔵
【出願日】 平成19年6月18日(2007.6.18)
【代理人】
【公開番号】 特開2008−307010(P2008−307010A)
【公開日】 平成20年12月25日(2008.12.25)
【出願番号】 特願2007−159610(P2007−159610)