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【発明の名称】 乳酸製造用培地及び乳酸の製造方法
【発明者】 【氏名】樋口 七生

【氏名】澤井 健司

【氏名】耳塚 孝

【氏名】澤井 秀樹

【要約】 【課題】乳酸合成能力を有する微生物を用いた乳酸の製造方法において、乳酸の収量を効率的に向上させることを課題とする。

【解決手段】乳酸合成能力を有する微生物を、葉酸を含む培地を用いて培養する乳酸の製造方法、及び葉酸を含む乳酸製造用培地を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地であって、葉酸又は葉酸前駆体を10μg/L以上70μg/L以下含む乳酸製造用培地。
【請求項2】
サトウキビの圧搾汁を含む請求項1に記載の乳酸製造用培地。
【請求項3】
微生物が酵母である請求項1又は2に記載の乳酸製造用培地。
【請求項4】
請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸製造用培地を用いる乳酸の製造方法。
【請求項5】
乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造する方法であって、葉酸又は葉酸前駆体を10μg/L以上70μg/L以下含む培地を用いる乳酸の製造方法。
【請求項6】
微生物が酵母である請求項5に記載の乳酸の製造方法。
【請求項7】
酵母がサッカロミセス(Saccharomyces)属に属する酵母である請求項8に記載の乳酸の製造方法。
【請求項8】
酵母が、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された酵母である請求項6又は7に記載の乳酸の製造方法。
【請求項9】
乳酸脱水素酵素遺伝子が、ゼノプス・レービス(Xenopus laevis)由来のL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である請求項8に記載の乳酸の製造方法。
【請求項10】
L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、配列番号1に示す塩基配列を有する遺伝子である請求項9に記載の乳酸の製造方法。
【請求項11】
L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されている請求項9又は10に記載の乳酸の製造方法。
【請求項12】
L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素1遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されている請求項9〜11のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項13】
微生物を25〜37℃の培地中で培養する請求項5〜12のいずれかに記載の乳酸の製造方法。

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地ならびに微生物を培養する発酵による乳酸の製造法に関する。
【背景技術】
【0002】
環境問題の悪化が懸念される中、持続可能な資源循環型社会の構築が求められており、素材分野でも生物資源由来の材料を用いたグリーンプラスチックと呼ばれる工業原料の生産が盛んに行われている。それらの中でも乳酸を原料とするポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目され、次世代の素材として期待が集まっている。
【0003】
原料となる乳酸は、主にショ糖、グルコース、でんぷん等を炭素源とする、発酵法によって製造されてきた。しかしながら、現段階では、生産量や生産収率などに多くの課題が残っており、ポリマー原料としての乳酸を市場に安定供給できるまでには至っていない。
【0004】
酵母を用いた乳酸の発酵生産では、酵母を培養する培地として一般的に知られているYPAD培地(非特許文献1)やYPADに含まれている酵母エキス、ペプトンを、過剰に添加した培地で、培養を行うことにより、乳酸の生産量及び生産収率が向上することは良く知られている。しかしながらこのような培地における乳酸生産では、培地のコストが問題となっていた。
【0005】
そこで、安価な培地を用いた乳酸製造に効果的な培地成分の検討が行われている。これまでに、乳酸生産性を向上させる培地成分としては、ニコチン酸(非特許文献2)や、脂肪酸(特許文献1および非特許文献3、4参照。)が提案されている。これらは、ニコチン酸は、乳酸脱水素酵素(ldh)が必要とする補酵素であるNADHの前駆体であることが、また脂肪酸は、乳酸生産時に酵母中の不飽和脂肪酸含有量が低下することが知られており、これらを添加することによって、培地中の炭素源あたりの乳酸生産収率を向上させているものである。
【0006】
しかしながら、これらの方法を用いても、産業的に必要とされる乳酸の生産収率には至っておらず、培地価格も高価格のままである。また、酵母エキスやペプトンを用いることによって、乳酸生産後の生成過程の煩雑化など、実用化への課題が多く残っている。
【0007】
従って、より効果的に乳酸の生産収率を向上させる方法が望まれている。
【特許文献1】特開2000−37185号公報
【非特許文献1】「メソッド イン イースト ジェネティクス(Methods in Yeast Genetics)」、ColdSpring Harbor Laboratory Volume194、1991年、12〜18頁
【非特許文献2】アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー(Applied and Environmental Microbiology)、71、2789(2005)
【非特許文献3】ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング(Journal of Bioscience and Bioengineering)、99、512(2005)
【非特許文献4】アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー(Applied and Environmental Microbiology)、69、1499(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、微生物を培養する発酵によって、乳酸を、低コスト且つ高い乳酸生産効率(対糖収率)で製造することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、乳酸合成能力を持つ酵母を用いた乳酸発酵において、葉酸を培地に添加することにより、高い対糖収率で乳酸を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0010】
すなわち、本発明は、乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地であって、葉酸又は葉酸前駆体を10μg/L以上70μg/L以下含む乳酸製造用培地である。
【0011】
本発明の乳酸製造用培地の好ましい態様は、サトウキビの圧搾汁を含むものである。
【0012】
また、本発明の乳酸製造用培地の好ましい態様は、乳酸合成能力を有する微生物が酵母である。
【0013】
また、本発明は、上記本発明の乳酸製造用培地を用いる乳酸の製造方法である。
【0014】
さらに、本発明は、乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造する方法であって、葉酸又は葉酸前駆体を10μg/L以上70μg/L以下含む培地を用いる乳酸の製造方法である。
【0015】
本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、微生物が酵母である。より好ましい態様は、該酵母がサッカロミセス(Saccharomyces)属に属する酵母である。
【0016】
また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、酵母が、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された酵母である。また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、該乳酸脱水素酵素遺伝子が、ゼノプス・レービス(Xenopus laevis)由来のL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である。また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、該L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が配列番号1に示す塩基配列を有する遺伝子である。
【0017】
また本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、上記L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されている。また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素1遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されている。
【0018】
また、本発明の乳酸の製造方法の好ましい態様は、微生物を25〜37℃の培地中で培養する。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、微生物を培養する発酵によって、乳酸を、低コスト且つ高い乳酸生産効率で製造することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0020】
本発明は、乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地であって、葉酸又は葉酸前駆体を10μg/L以上70μg/L以下含む乳酸製造用培地である。
【0021】
本発明の乳酸製造用培地に含まれる葉酸又は葉酸前駆体の濃度は、10μg/L以上70μg/L以下である。好ましくは、培地中に葉酸又は葉酸前駆体を20μg/L〜60μg/L含むものであり、より好ましくは30μg/L〜50μg/L含むものである。
【0022】
本発明の乳酸製造用培地に含まれる葉酸は、ビタミンM、ビタミンB9、プテロイルグルタミン酸とも呼ばれ、水溶性ビタミンに分類される生理活性物質である。葉酸は、微生物内で種々の還元を受け、ジヒドロ葉酸を経てテトラヒドロ葉酸に変換された後、主にC1代謝に関与する補酵素として作用する。
【0023】
本発明の乳酸製造用培地において、葉酸は、葉酸を含有する天然物として含まれていても良い。葉酸を含有する天然物としては、緑黄色野菜をはじめ、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、トウモロコシ等が挙げられ、これらのなかでもサトウキビを好ましく用いることができる。
【0024】
また、葉酸は前躯体の形で培地中に含まれていてもよい。ここでいう葉酸の前駆体とは、培養中に微生物内または培養液中で葉酸に変換されるものをいう。葉酸の前躯体としては、例えばパラアミノ安息香酸や、テトラヒドロ葉酸、などが挙げられ、これらのなかでもパラアミノ安息香酸を好ましく用いることができる。
【0025】
葉酸の培地への添加時期は、培養前でも培養開始後でもよく、添加回数も1回でも2回以上であっても良い。
【0026】
本発明の乳酸製造用培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源および/又は無機塩類等を発酵原料として含んでいてもよい。また、本発明の乳酸製造用培地は、動植物煮出し汁、土壌や腐植質の抽出液等の天然物をほぼそのままの組成で利用する天然培地、市販されている化学品から調製される合成培地、合成培地に天然物を添加した半合成培地のいずれを用いても良い。
【0027】
上記の炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有するデンプン、デンプン加水分解物、サトウキビやトウモロコシの圧搾汁、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、また酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどを使用することができる。
【0028】
これらの炭素源のなかでも、サトウキビの圧搾汁が好ましい。サトウキビの圧搾汁を例えば8000rpmで遠心後、上澄を例えばヴィヴァフロー50(VIVAFLOW)(サルトリウス・エー・ジー・バイオテクノロジー(Satorius AG Biotechnology)社製)でろ過した透過液を用いることが、特に好ましい。サトウキビは、フィルター処理や、オートクレーブ処理などによって滅菌することができ、オートクレーブの回数は、一回でも複数回でも良い。また、サトウキビの中には葉酸が含まれている場合があり、上記の葉酸を含む天然物としてこれを添加して使用することもできる。サトウキビの圧搾汁は、特に微生物として酵母を用いる場合に、好ましい炭素源として用いることができる。
【0029】
また、上記の窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硫酸アンモニウム等の硫酸塩類、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【0030】
また、上記の無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【0031】
本発明において、使用する微生物が栄養要求性である場合、すなわち微生物が生育するために特定の栄養素を必要とする場合には、本発明の乳酸製造用培地は、その栄養素または該栄養素を含む物質もしくは該栄養素に変換される物質を含むことが好ましい。
【0032】
微生物が栄養要求性である場合の必要とする栄養素の具体例としては、メチオニン、チロシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギン酸、バリン、セリン、アルギニン、ウラシル、アデニン、リシン、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジン等が知られている。例えば、微生物が酵母である場合は、酵母が要求する栄養素は、ヒスチジン、ロイシン、リジン、トリプトファン、ウラシル、アデニンである。
【0033】
栄養要求性を示す微生物が有する遺伝子型としては、メチオニン要求性:met1、met2、met3、met4、met5、met6、met7、met8、met10、met13、met14、met20、チロシン要求性:tyr1、イソロイシン、バリン要求性:ilv1、ilv2、ilv3、ilv5、フェニルアラニン要求性:pha2、グルタミン酸要求性:GLU3、トレオニン要求性thr1、thr4、アスパラギン酸要求性:asp1、asp5、セリン要求性:ser1、ser2、アルギニン要求性:arg1、arg3、arg4、arg5、arg8、arg9、arg80、arg81、arg82、arg84、ウラシル要求性:ura1、ura2、ura3、ura4、ura6、アデニン要求性:ade1、ade2、ade3、ade4、ade5、ade6、ade8、ade9、ade12、ADE15、リシン要求性:lys1、lys2、lys4、lys5、lys7、lys9、lys11、lys13、lys14、トリプトファン要求性:trp1、trp2、trp3、trp4、trp5、ロイシン要求性:leu1、leu2、leu3、leu4、leu5、ヒスチジン要求性:his1、his2、his3、his4、his5、his6、his7、his8などが主に利用されている。
【0034】
本発明の乳酸生産用培地に含まれる上記炭素源、窒素源、無機塩類、栄養素等の各成分は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもできる。また、消泡剤も必要に応じて使用する。
【0035】
本発明の乳酸生産用培地の好ましい具体的な例として、表1に示す組成の培地(以下、MMF3と略すことがある)、表2に示す組成の培地(以下、CMF4培地と略すことがある)等があげられる。
【0036】
【表1】


【0037】
【表2】


【0038】
MMF3培地は、次のように調製することができる。例えば、表1に示された栄養素のうちビタミン類、金属塩についてはそれぞれフィルター処理により滅菌を、それ以外については、糖、アミノ酸及び核酸、無機塩類のグループに分け、グループごとにオートクレーブ処理により滅菌し、室温以下まで冷却した後、表1に示す濃度となるように調製する。葉酸は、フィルターろ過により滅菌し必要量を添加することができる。
【0039】
CMF4培地は、次のように調製することができる。例えば、まず、サトウキビの圧搾汁を8000rpmで遠心後、上澄を例えばヴィヴァフロー50(VIVAFLOW)(サルトリウス・エー・ジー・バイオテクノロジー(Satorius AG Biotechnology)社製)でろ過し、サトウキビ圧搾汁ろ過液を調製しておく。次に、表2に示すアミノ酸、核酸及び硫酸アンモニウムをそれぞれオートクレーブにより処理して滅菌し、室温以下まで冷却した後、サトウキビ圧搾汁ろ過液と合わせ、表2に示す濃度となるように調製する。葉酸は、フィルター処理によって滅菌し、必要量を添加することができる。
【0040】
本発明の乳酸生産用培地において使用される微生物としては、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌や乳酸菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【0041】
これらの微生物のうち、酵母が好適である。酵母としては、サッカロミセス属(Saccharomyces)属に属する酵母が挙げられる、さらにこのなかでも(Genus Saccharomyces)に属する酵母とサッカロミセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)に属する酵母が挙げられる。
【0042】
本発明の乳酸生産用培地において使用される乳酸合成能力を有する微生物としては、乳酸脱水素酵素(乳酸合成素酵素)を有する微生物、乳酸脱水素酵素が導入された微生物等を用いることができる。例えば、乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された酵母、大腸菌、コリネ型細菌や乳酸菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞及び昆虫細胞等が挙げられる。乳酸菌は、乳酸脱水素酵素遺伝子を導入せずに乳酸合成能力を有する微生物としてそのまま使用することができる。
【0043】
本発明において、乳酸脱水素酵素を遺伝子(ldh遺伝子)とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)とピルビン酸を乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)に変換する活性を持つ乳酸脱水素酵素をコードしている遺伝子である。
【0044】
乳酸脱水素酵素は、微生物の種類に応じてもしくは微生物内においても各種同族体が存在する。また、本発明において使用される微生物が有する又は微生物に導入される乳酸脱水素酵素には、天然由来の乳酸脱水素酵素の他、化学合成的あるいは遺伝子工学的手法で人工的に合成された乳酸脱水素酵素も包含される。 まず、天然由来の乳酸脱水素酵素としては、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来のもの、ウシ、カエルもしくはヒトなどの哺乳類を含む高等真核生物由来の乳酸脱水素酵素遺伝子にコードされるタンパク質からなる酵素を挙げることができる。これらのうち、カエル由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、アオガエル科(Rhacophoridae)、アカガエル科(Ranidae)、アマガエル科(Hylidae)、ジムグリガエル科(Microhylidae)、ヒキガエル科(Bufonidae)、クサガエル科(Hyperoliidae)、スキアシガエル科(Pelobatinae)、スズガエル科(Discoglossidae)、コモリガエル科(Pipidae)に属するldh遺伝子が挙げられ、これらの中でもコモリガエル科(Pipidae)に属するldh遺伝子を用いることが好ましい。コモリガエル科に属するカエルの中でも、入手が容易であるゼノプス・レービス(Xenopus laevis)由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子、特にL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることがさらに好ましい。具体的には、特に好ましいldh遺伝子は、配列番号1に示す塩基配列を有するldh遺伝子である。
【0045】
また、本発明において微生物に導入されるldh遺伝子には、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。ここでいう遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいい、例えば、部位特異的変異導入用キット(Mutan-K(タカラバイオ社製))を用いる方法や、ランダム変異導入用キット(BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH社製))を用いる方法などがある。
【0046】
さらに、酵素活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするDNAが導入された微生物を用いることが好ましい。酵素活性が強化された乳酸脱水素酵素をコードするDNAとしては、例えば、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる酵素活性が強い乳酸脱水素酵素をコードするDNAや、強力なプロモーターの支配下に乳酸脱水素酵素をコードするDNAを連結したDNAなどを挙げることができる。
【0047】
本発明の乳酸の製造方法は、乳酸合成能力を有する微生物を培養する発酵によって乳酸を製造する方法であって、葉酸又は葉酸前駆体を10μg/L以上70μg/L以下含む培地を用いる製造方法である。
【0048】
また、本発明の乳酸の製造方法は、前記の、葉酸又は葉酸前駆体を10μg/L以上70μg/L以下含む本発明の乳酸製造用培地を用いる製造方法である。
【0049】
本発明の乳酸の製造方法において用いる葉酸又は葉酸前駆体は、前記前記本発明の乳酸生産用培地において使用されるものと同様である。葉酸は、葉酸そのものであっても、葉酸を含有する天然物を用いても、葉酸の前駆体であってもよい。
【0050】
本発明の乳酸の製造方法は、葉酸又は葉酸前駆体を10μg/L以上70μg/L以下の濃度含む培地を用いる。前記本発明の乳酸生産用培地において使用されるものと同様に、好ましくは、葉酸又は葉酸前駆体の濃度を20μg/L〜60μg/L、より好ましくは30μg/L〜50μg/Lとする。
【0051】
本発明の乳酸の製造方法において使用される微生物は、前記本発明の乳酸生産用培地において使用されるものと同様に、乳酸合成能力を有する微生物であって、乳酸脱水素酵素(乳酸合成素酵素)を有する微生物、乳酸脱水素酵素が導入された微生物等を用いることができる。微生物としては、前記と同様に、具体的には、酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられ、これらのなかでも酵母が好ましい。
【0052】
本発明の乳酸の製造方法に用いられる微生物として酵母を用いる場合には、乳酸脱水素酵素(Lactate dehydrogenase;乳酸合成酵素)をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入した酵母を用いることができるが、酵母が既に目的とする乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を有している場合は、必ずしも該遺伝子を導入する必要はない。
【0053】
本発明の乳酸の製造方法で使用する酵母としては、乳酸脱水素酵素遺伝子を導入しうる酵母が好ましく、サッカロミセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属又はクリベロミセス(Kluyveromyces)属に属する酵母が挙げられる。好ましくは、サッカロミセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)であって、具体的には、NBRC10505株、NBRC10506株が好ましい。
【0054】
酵母に導入する乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、前記本発明の乳酸生産用培地において使用されるものと同様に、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来のもの、ウシ、カエルもしくはヒトなどの哺乳類を含む高等真核生物由来の乳酸脱水素酵素遺伝子を挙げることができる。これらのうち、カエル由来の乳酸脱水素酵素遺伝子としては、アオガエル科(Rhacophoridae)、アカガエル科(Ranidae)、アマガエル科(Hylidae)、ジムグリガエル科(Microhylidae)、ヒキガエル科(Bufonidae)、クサガエル科(Hyperoliidae)、スキアシガエル科(Pelobatinae)、スズガエル科(Discoglossidae)、コモリガエル科(Pipidae)に属するldh遺伝子が挙げられ、これらの中でもコモリガエル科(Pipidae)に属するldh遺伝子を用いることが好ましい。コモリガエル科に属するカエルの中でも、入手が容易であるゼノプス・レービス(Xenopus laevis)由来の乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子、特にL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であることがさらに好ましい。具体的には、特に好ましい乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、配列番号1に示す塩基配列を有するL−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である。
【0055】
酵母への乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の導入は、該遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて行うことができる。乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子(ldh遺伝子)を酵母に導入する方法としては、例えば、ldh遺伝子をクローニングし、クローニングした該遺伝子を組み込んだ発現ベクターを酵母に形質転換する方法、クローニングした該遺伝子を染色体上の目的箇所に相同組換えで挿入する方法等が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0056】
本発明で使用するldh遺伝子をクローニングする方法としては特に制限はなく、既知の手法を用いることができる。例えば、既知の遺伝子情報に基づき、PCR(Polymerase Chain Reaction)法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法や、ゲノムライブラリーやcDNAライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。また、既知のタンパク質情報に基づき化学合成的又は遺伝子工学的に合成する方法も可能である。
【0057】
クローニングしたldh遺伝子を組み込む発現ベクターとしては、酵母で汎用的に利用される発現ベクターを用いることができる。酵母で汎用的に利用される発現ベクターとしては、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列、大腸菌細胞内での自立的複製に必要な配列、酵母選択マーカー及び大腸菌選択マーカーを有しており、また、組み込んだldh遺伝子を発現させるために、その発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター又はエンハンサー等のいわゆる調節配列をも有していることが望ましい。
【0058】
ここで、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、酵母の自立複製開始点(ARS1)とセントロメア配列の対もしくは酵母の2μmプラスミドの複製開始点であり、大腸菌内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、大腸菌のColE1複製開始点である。また、酵母選択マーカーとしては、URA3又はTRP1等の栄養要求性相補的遺伝子もしくはG418耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられ、大腸菌の選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。調節配列としては、GAPDH(グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ)プロモーター、ADH(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、GAPDHターミネーターが挙げられる。しかしながら、発現ベクターはこれらに限定されるものではない。
【0059】
上記L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、発現ベクターの該遺伝子を発現可能にするプロモーターの下流に導入することが好ましい。得られたldh遺伝子発現ベクターを、後述する方法により酵母に形質転換することにより、ldh遺伝子を酵母に導入することができる。
【0060】
また、L−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素1遺伝子(pdc1遺伝子)のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入することが好ましい。ピルビン酸脱炭酸酵素1遺伝子をプロモーターの下流に相同組み換えで挿入する方法としては、ldh遺伝子の上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてPCRを行い、得られたPCR断片を後述する方法により酵母に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転換株の選択を容易にするために、上記PCR断片には酵母選択マーカーが含まれることが好ましい。
【0061】
ここで用いるPCR断片を調整する方法は、例えば、下記(1)〜(3)のステップ1〜3の工程により行うことができる。その概略を図1に示す。
【0062】
(1)ステップ1:ldh遺伝子の下流にターミネーターがつながったプラスミドを鋳型とし、プライマー1,2をセットとしてldh遺伝子及びターミネーターを含む断片をPCRで増幅する。プライマー1は、導入目的箇所の上流側に相同的な配列40bp以上を付加するようデザインし、プライマー2は、ターミネーターより下流のプラスミド由来の配列をもとにデザインする。好ましくは、プライマー1に付加する導入目的箇所の上流側に相同的な配列は、ピルビン酸脱炭酸酵素1遺伝子(pdc1遺伝子)の上流に相同的な配列である。
【0063】
(2)ステップ2:酵母選択マーカーを持つプラスミド、例えばpRS424、pRS426等を鋳型として、プライマー3,4をセットとして酵母選択マーカーを含む断片をPCRで増幅する。プライマー3は、ステップ1のPCR断片のターミネーターより下流の配列と相同性のある配列が30bp以上を付加するようにデザインし、プライマー4には、導入目的箇所の下流側に相同的な配列40bp以上を付加するようデザインする。好ましくは、プライマー4に付加する導入目的箇所の下流側に相同的な配列は、pdc1遺伝子の下流に相同的な配列である。
【0064】
(3)ステップ3:ステップ1,2で得られたPCR断片を混合したものを鋳型とし、プライマー1,4をセットとしてPCRを行うことにより、両末端に導入目的箇所の上流側及び下流側に相同的な配列が付加された、ldh遺伝子、ターミネーター及び酵母選択マーカーを含むPCR断片が得られる。好ましくは、前記PCR断片は、両末端にpdc1遺伝子の上流及び下流に相同的な配列が付加された、ldh遺伝子、ターミネーター及びマーカー遺伝子を含むPCR断片である。
【0065】
上記で得られたldh遺伝子発現ベクターまたはPCR断片を酵母に導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法やプロトプラスト法等がある。
【0066】
得られた形質転換株の培養方法としては、例えば、「M.D. Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)」等に記載されている既知の方法を用いることができる。ldh遺伝子発現ベクター又はPCR断片が導入された酵母は、発現ベクター又はPCR断片が有する酵母選択マーカーによって、栄養非添加培地又は薬剤添加培地で培養することにより選択することができる。
【0067】
本発明のldh遺伝子が導入された酵母を培養することにより、培地中に乳酸を製造することができる。
【0068】
導入する発現ベクターを酵母内に保持させるのであれば、選択マーカーによる選択圧をかけた培地を用いることが好ましい。培地としては、例えば、ベクターの持つ選択マーカーに符号するアミノ酸を除去した合成培地などが挙げられる。特に好ましい培地は、炭素源としてグルコースを1〜10%、窒素源としてYeast Nitrogen Base without amino acid(DIFCO社製)を0.67%含有し、適切なアミノ酸を添加した合成培地である。
【0069】
本発明の乳酸の製造方法において、微生物の培養は、振とう培養もしくは撹拌培養などで行うことができる。さらに、培養形態として、回分培養、半回分培養、連続培養などで行うことができる。酸素供給条件は特に限定されるものではないが、好気的条件下あるいは微好気条件下で行うことができる。培養温度は摂氏25〜35度がよく、培養時間は、通常24時間〜5日間である。培養中の培養液のpHは2.5〜5.0に保持することが望ましく、このpHの調整は、アルカリ溶液、アンモニア、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム等を用いて行うことができる。
【0070】
本発明の乳酸の製造方法において、葉酸の培地への添加は、培養前でも培養開始後でもよく、また葉酸の添加回数は1回でも2回以上であってもよい。また、上記炭素源、窒素源、無機塩類、栄養素等の各成分は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもできる。また、消泡剤も必要に応じて使用してもよい。
【0071】
乳酸の製造に際しては、まず、本発明の酵母を前培養し、前培養液を新しい培地に移して本培養することにより、培養液中に乳酸を製造することができる。培養温度は、菌株の増殖が実質的に阻害されず乳酸を生産し得る範囲であれば特に制限されるものでないが、好ましくは摂氏20〜40度の範囲の温度であり、より好ましくは摂氏25〜37度の範囲の温度であり、さらに好ましくは摂氏30〜34度である。培養には、静置、撹拌または振とうのいずれの方法も採用し得る。
【0072】
上記のような条件で培養することにより、培地中に1〜20%の乳酸を得ることができる。得られた乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、HPLCを用いる方法や、F-キット(ロシュ社製)を用いる方法などがある。
【0073】
本発明において、乳酸脱水素酵素活性とは、ピルビン酸とNADHを乳酸とNAD+に変換する活性を示す。また限定されるわけではないが、乳酸脱水素酵素活性は比活性を指標として比較できる。すなわち、ldh遺伝子導入方法及び遺伝的バックグラウンドが同じ酵母を同条件で培養し、培養菌体から抽出したタンパク質を用いてNADHの減少に伴う340nmにおける吸光度の変化を測定する。その際に、室温において1分間当たりに1μmolのNADHを減少させる酵素量を1単位(Unit)と定義する事により、乳酸脱水素酵素の比活性は式(1)であらわせる。ここで、Δ340は1分間あたりの340nmの吸光度の減少量、6.22はNADHのミリモル分子吸光係数である。
【0074】
【数1】


【0075】
得られた培養液中の乳酸は、従来から知られている方法によって、精製することができる。例えば、微生物を遠心分離した発酵液をpH1以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとしてから蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などがある。
【0076】
また培地中の葉酸濃度は、例えば以下に示す条件でHPLCにより測定できる。
【0077】
カラム:TSK-GEL ODS−80TM 4.6×250mm
移動相:A=0.3%リン酸水溶液、B=アセトニトリル
検出方法:電気伝導度
温度:50℃
【実施例】
【0078】
以下、上記ldhとしてカエル由来のL−ldh遺伝子、酵母としてサッカロミセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)を選定して具体的な実施形態を示し、本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【0079】
(参考例1: 乳酸合成能力を持つ酵母の造成)
ldh遺伝子として、配列番号1に示す塩基配列を有するゼノプス・レービス(Xenopus laevis)由来のldh遺伝子を使用した。ldh遺伝子のクローニングはPCR法により行った。PCRには、ゼノプス・レービスの腎臓由来cDNAライブラリー(STRATAGENE社製)より付属のプロトコールに従い調製したファージミドDNAを鋳型とした。
【0080】
PCR増幅反応には、KOD-Plus polymerase(東洋紡社製)を用い、反応バッファー、dNTPmixなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドDNAを50ng/サンプル、プライマーを50pmol/サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを1ユニット/サンプルになるように50μlの反応系に調製した。反応溶液をPCR増幅装置iCycler(BIO−RAD社製)により94℃の温度で5分熱変成させた後、94℃(熱変成):30秒、55℃(プライマーのアニール):30秒、68℃(相補鎖の伸張):1分を1サイクルとして30サイクル行い、その後4℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー(配列番号2,3)は、5末端側にはSalI認識配列、3末端側にはNotI認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【0081】
PCR増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase(タカラバイオ社製)によりリン酸化後、pUC118ベクター(制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの)にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2(タカラバイオ社製)を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌DH5αのコンピテント細胞(タカラバイオ社製)に形質転換し、抗生物質アンピシリンを50μg/mLを含むLBプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドDNAを回収し、制限酵素SalI及びNotIで切断し、ldh遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【0082】
上記ldh遺伝子が挿入されたpUC118ベクターを制限酵素SalI及びNotIで切断し、DNA断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いldh遺伝子を含む断片を精製した。得られたldh遺伝子を含む断片を、図2に示す発現ベクターpTRS11のXhoI/NotI切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドDNAを回収し、制限酵素XhoI及びNotIで切断することにより、ldh遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作成したldh遺伝子を組み込んだ発現ベクターをpTRS102とする。
【0083】
得られた発現ベクターpTS102を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号4,5)をプライマーセットとしたPCRにより、ldh遺伝子及びGAPDHターミネーター配列を含む1.3kbのDNA断片を増幅した(図1のステップ1に相当)。ここで配列番号4は、pdc1遺伝子の上流65bpに相同性のある配列が付加されるようデザインした。
【0084】
次に、プラスミド酵母選択用マーカーを持つプラスミドpRS424を増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド(配列番号6,7)をプライマーセットとしたPCRにより、酵母選択マーカーであるTRP1遺伝子を含む1.2kbのDNA断片を増幅した。ここで、配列番号7は、pdc1遺伝子の下流65bpに相同性のある配列が付加されるようデザインした。
【0085】
それぞれのDNA断片を1.5%アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各1.3kb断片、1.2kb断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号:4,7)をプライマーセットとしたPCR法によって、ldh遺伝子、GAPDHターミネーター及びTRP1遺伝子が連結された約2.5kbのDNA断片を増幅した。
【0086】
上記のDNA断片を1.5%アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセNBRC10505株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、ldh遺伝子が染色体上のpdc1遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【0087】
上記のようにして得られた形質転換株が、ldh遺伝子が染色体上のpdc1遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムDNAをゲノムDNA抽出キットGenとるくん(タカラバイオ社製)により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号7,8)をプライマーセットとしたPCRにより、約2.8kbの増幅DNA断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記PCRによって約2.1kbの増幅DNA断片が得られる。以下、上記ldh遺伝子が染色体上のpdc1遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、B2株とする。
【0088】
(比較例1:葉酸を添加しないMMF3培地を用いたL−乳酸生産性テスト)
表1に示した最小合成培地(以下、MMF3と略す)10mLを試験管に取り、そこに参考例1において作成した少量のB2株を植菌し、30℃で一晩培養した(前々培養)。次に、MMF3培地100mLを500ml容三角フラスコにいれ、各前々培養液をそれぞれ全量植菌し、30℃で24時間振とう培養した(前培養)。続いて、MMF3培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養開始から24時間後の前培養液をそれぞれ全量植菌した。培養は攪拌速度(120rpm)、通気量(0.1L/min)、温度(30℃)、pH(pH5)を一定にして行った(本培養)。本培養開始後10時間毎の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でHPLCによりL−乳酸の生産量を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図3に、乳酸生産収率(対糖収率:培地中に投入した炭素源あたりの乳酸生産量)を表3に示した。
【0089】
カラム:Shim−Pack SPR−H(島津社製)
移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
検出方法:電気伝導度
温度:45℃。
【0090】
(実施例1:葉酸を添加したMMF3培地を用いたL−乳酸生産性テスト1)
比較例1と同様に前培養液まで調製し、葉酸10μgとMMF3培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例1と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図3に、乳酸生産収率(対糖収率)を表3に示した。
【0091】
(実施例2:葉酸を添加したMMF3培地を用いたL−乳酸生産性テスト2)
比較例1と同様に前培養液まで調製し、葉酸30μgとMMF3培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例1と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図3に、乳酸生産収率(対糖収率)を表3に示した。
【0092】
(実施例3:葉酸を添加したMMF3培地を用いたL−乳酸生産性テスト3)
比較例1と同様に前培養液まで調製し、葉酸40μgとMMF3培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例1と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図3に、乳酸生産収率(対糖収率)を表3に示した。
【0093】
(実施例4:葉酸を添加したMMF3培地を用いたL−乳酸生産性テスト4)
比較例1と同様に前培養液まで調製し、葉酸50μgとMMF3培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例1と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図3に、乳酸生産収率(対糖収率)を表3に示した。
【0094】
【表3】


【0095】
比較例1、実施例1〜4の結果、葉酸非添加条件下(比較例1)では乳酸の生産収率が40.2%であるのに対し、葉酸を添加条件下(実施例1〜4)では乳酸の生産収率(対糖収率)が向上した。特に、葉酸30μg/L添加条件下(実施例3)では、乳酸の生産収率は57.3%まで向上した。葉酸の添加が乳酸の生産収率向上に効果的であった。
【0096】
(比較例2:葉酸を添加しないCMF4培地を用いたL−乳酸生産性テスト)
参考例1において作製したB2株を用いて、次のように、葉酸を添加した培地を用いた乳酸発酵試験を行った。
【0097】
表2に示した組成の培地(以下、CMF4培地と略す)10mLを試験管に取り、そこに少量のB2株を植菌し、30℃で一晩培養した(前々培養)。次に、CMF4培地100mLを500ml容三角フラスコにいれ、各前々培養液をそれぞれ全量植菌し、30℃で24時間振とう培養した(前培養)。続いて、CMF4培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養開始から24時間後の前培養液をそれぞれ全量植菌し、攪拌速度(120rpm)、通気量(0.1L/min)、温度(30℃)、pH(pH5)を一定にして培養を行った(本培養)。本培養開始後10時間毎の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、比較例1と同様の方法でHPLCによりL−乳酸量を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図4に、乳酸生産収率(対糖収率)を表4に示した。
【0098】
(実施例5:葉酸を添加したCMF4培地を用いたL−乳酸生産性テスト1)
比較例2と同様に前培養液まで調製し、葉酸10μgとCMF4培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例1と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図4に、乳酸生産収率(対糖収率)を表4に示した。
【0099】
(実施例6:葉酸を添加したCMF4培地を用いたL−乳酸生産性テスト2)
比較例2と同様に前培養液まで調製し、葉酸30μgとCMF4培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例1と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図4に、乳酸生産収率(対糖収率)を表4に示した。
【0100】
(実施例7:葉酸を添加したCMF4培地を用いたL−乳酸生産性テスト3)
比較例2と同様に前培養液まで調製し、葉酸40μgとCMF4培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例1と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図4に、乳酸生産収率(対糖収率)を表4に示した。
【0101】
(実施例8:葉酸を添加したCMF4培地を用いたL−乳酸生産性テスト4)
比較例2と同様に前培養液まで調製し、葉酸50μgとCMF4培地を1L投入したミニジャーファメンター(丸菱バイオエンジ社製、容量5L)に、前培養液全量を植菌した。その後、比較例1と同様の方法で培養し、乳酸を測定した。測定結果から算出したL−乳酸の生産量を図4に、乳酸生産収率(対糖収率)を表4に示した。
【0102】
【表4】


【0103】
比較例2、実施例5〜8の結果、葉酸非添加条件下(比較例2)では乳酸の生産収率が65.3%であるのに対し、葉酸を添加条件下(実施例5〜8)では乳酸の生産収率(対糖収率)が向上した。特に、葉酸を30μg/Lまたは50μg/L添加した条件下(実施例5、7)では、乳酸の生産収率は71%まで向上した。葉酸の添加が乳酸の生産収率向上に効果的であった。
【産業上の利用可能性】
【0104】
本発明によれば、乳酸合成能力を持つ微生物を用いた乳酸の発酵生産において、乳酸生産量(対糖収率)が向上し、効率的に乳酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0105】
【図1】図1は、pdc1遺伝子プロモーター下流にldh遺伝子を導入する方法を説明する概略図である。
【図2】図2は、本発明で用いられる酵母発現ベクターpTRS11のフィジカルマップを示す図である。
【図3】図3は、MMF3培地における葉酸の添加による乳酸生産量増加効果を表すグラフである。横軸は培養時間、縦軸はL−乳酸の生産量を表す。
【図4】図4は、CMF4培地における葉酸の添加による乳酸生産量増加効果を表すグラフである。横軸は培養時間、縦軸はL−乳酸の生産量を表す。
【配列表フリ−テキスト】
【0106】
配列番号1―カエル由来L-乳酸脱水素酵素:DNA
配列番号2―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号4―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号5―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号6―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号7―人工DNA配列の説明:合成DNA
配列番号8―人工DNA配列の説明:合成DNA
【出願人】 【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
【出願日】 平成19年6月8日(2007.6.8)
【代理人】
【公開番号】 特開2008−301766(P2008−301766A)
【公開日】 平成20年12月18日(2008.12.18)
【出願番号】 特願2007−152534(P2007−152534)