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【発明の名称】 サイクロデキストランの製造方法およびサイクロデキストラン合成酵素の製造方法
【発明者】 【氏名】舟根 和美

【氏名】北岡 本光

【氏名】川端 康之

【氏名】宮城 貞夫

【氏名】儀部 茂八

【要約】 【課題】サイクロデキストランを効率的にかつ安価に製造する方法を提供すること。

【解決手段】デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
【請求項2】
デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、得られた培養液をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物に作用させることを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
【請求項3】
デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、バチルス属に属する微生物である、請求項1または2に記載の製造方法。
【請求項4】
バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)である、請求項3に記載の製造方法。
【請求項5】
デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、パエニバチルス属に属する微生物である、請求項1または2に記載の製造方法。
【請求項6】
パエニバチルス属に属する微生物が、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)である、請求項5に記載の製造方法。
【請求項7】
デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする、サイクロデキストラン合成酵素の製造方法。
【請求項8】
デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、バチルス属に属する微生物である、請求項7に記載の製造方法。
【請求項9】
バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)である、請求項8に記載の製造方法。
【請求項10】
デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、パエニバチルス属に属する微生物である、請求項7に記載の製造方法。
【請求項11】
パエニバチルス属に属する微生物が、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)である、請求項10に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なサイクロデキストランの製造方法およびサイクロデキストラン合成酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来から用いられているサイクロデキストランの合成技術は、まず砂糖からデキストランを合成し、続いてデキストンからサイクロデキストランを合成するという二段階の工程からなる。具体的には、砂糖を含む培地でデキストラン合成酵素生産菌を培養してデキストランを合成し(非特許文献1)、その一方で、デキストランを含む培地でサイクロデキストラン合成酵素生産菌を培養してサイクロデキストラン合成酵素液を調製し(非特許文献2)、これをデキストランに加えてサイクロデキストランを合成する(特許文献1〜6)。また、遺伝子組換え技術を用いて製造したサイクロデキストラン合成酵素をデキストランに作用させて合成する方法も報告される(特許文献7〜8)。
【0003】
従来のサイクロデキストラン生産技術で原料として用いている砂糖は、一般に糖類の原料として用いられているデンプンなどと比較して価格が高い。また、砂糖はグルコースとフルクトースより成るが、デキストランを合成する際、フルクトース部分は用いられないので、50%が廃棄されることなる。また、前記各種の従来法で行われているサイクロデキストラン合成酵素によるデキストランからサイクロデキストランへの転換効率は50%未満と低い。従って、砂糖を原料としてサイクロデキストランを合成した場合、最終的な収率は最大25%であり、また廃棄物も多いため、製造効率が極めて悪く、コスト高となるのが問題である。従って、サイクロデキストランをより効率的にかつ安価に製造できる手段が望まれている。
【0004】
【特許文献1】特許第3075873号
【特許文献2】特許第3117328号
【特許文献3】特開2002−51796号
【特許文献4】特開2002−51797号
【特許文献5】特開2004−166624号
【特許文献6】特開2005−192510号
【特許文献7】特許第3429569号
【特許文献8】特許第3487711号
【非特許文献1】Funane K., Matsuo M., Ono H., Ishii T., Gibu S., Tokashiki T., Kobayashi M., Characterization of glucans and glucansucrases from novel Leuconostoc strains (including sp. S-51). J. Appl. Glycosci., 50(3):379-382 (2003)
【非特許文献2】Oguma, T., Tobe, K., Kobayashi, M., Purification and properties of a novel enzyme from Bacillus sp. T-3040, which catalyzes the conversion of dextran to cyclic isomaltooligosaccharides. FEBS Lett., 345, 135-138 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、サイクロデキストランを効率的にかつ安価に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、バチルス属またはパエニバチルス属に属する微生物の中に、デンプンと培養することによりサイクロデキストランを生産する能力を有する微生物を見出し、この微生物を利用してデンプンから一段階でサイクロデキストランを製造することに成功した。
【0007】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
(2) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、得られた培養液をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物に作用させることを特徴とする、サイクロデキストランの製造方法。
(3) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、バチルス属に属する微生物である、(1)または(2)に記載の製造方法。
(4) バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)である、(3)に記載の製造方法。
(5) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、パエニバチルス属に属する微生物である、(1)または(2)に記載の製造方法。
(6) パエニバチルス属に属する微生物が、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)である、(5)に記載の製造方法。
(7) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする、サイクロデキストラン合成酵素の製造方法。
(8) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、バチルス属に属する微生物である、(7)に記載の製造方法。
(9) バチルス属に属する微生物が、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)である、(8)に記載の製造方法。
(10) デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物が、パエニバチルス属に属する微生物である、(7)に記載の製造方法。
(11) パエニバチルス属に属する微生物が、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)である、(10)に記載の製造方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明のサイクロデキストランの製造方法は、原料に砂糖ではなくデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を用いるため、従来法に比べて原料が安価である。また、従来法は砂糖からデキストラン、デキストランからサイクロデキストランを合成するという2段階反応であるのに対し、本発明はデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物から1段階反応でサイクロデキストラン発酵生産を行うために工程が1回で済み、簡便である。本発明の方法により得られるデキストラン合成酵素の活性は、従来のデキストランを含有する培地でバチルス属菌を培養することによって得られるサイクロデキストラン合成酵素の活性と比べて、約100倍で非常に高活性である。さらに、従来の砂糖を原料とするサイクロデキストランの合成では、収率が約25%であるのに対し、本発明のデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を原料とするサイクロデキストランの合成では、収率が約50%となる。また、従来法では利用されないフルクトースが副産物として大量に余るが、本発明では原料とするデンプンはすべてサイクロデキストランに転換可能なグルコースより成るので廃棄部分が著しく減少する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0009】
以下、本発明を詳細に説明する。
1.サイクロデキストランの製造方法
本発明のサイクロデキストランの製造方法は、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストランを採取することを特徴とする。
【0010】
本発明方法に用いることのできる微生物としては、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物であれば特に限定はされないが、例えば、バチルス属に属する微生物またはパエニバチルス属に属する微生物が挙げられる。バチルス属に属する微生物として、具体的には、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)、パエニバチルス属に属する微生物として、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)が好適に用いられる。
【0011】
本発明方法で製造されるサイクロデキストランとは、グルコース5〜33分子がα-1,6結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストラン(CI−5〜CI−33)を含むものであればよく、特には、グルコース7〜12分子がα-1,6結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストラン(CI−7〜CI−12)をいい、これらのサイクロデキストランの全種または複数種の混合物であってもよい。
【0012】
上記微生物の培養は、一般微生物の好気的培養で通常行われる方法を用いることができ、例えば、液体培地による振盪培養法または通気攪拌培養法等が用いられる。培地としては、上記サイクロデキストランの原料となるデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含んだものであれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地中のデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物の濃度は0.5〜50%が適当である。
【0013】
デンプン以外の培地成分としては、当該技術分野で通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要な栄養源等が用いられる。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、炭水化物(グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の糖類等)、有機酸(酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等)、アルコール類(エタノール、プロパノール等)が用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はペプトン、ポリペプトン、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等、が用いられる。デンプン以外の上記培地成分の使用量は微生物の培養に用いられる一般的な培地の例に従えばよい。
【0014】
また、上記のデンプンの成分としては、アミロース、アミロペクチンなどが挙げられ、デンプンまたはデンプンの成分の部分分解物としては、デキストリン、マルトオリゴ糖などが挙げられる。
【0015】
培地のpHは、本微生物が成育するpH域ならばいずれでもよいが、通常は、6〜8の範囲が好ましい。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養条件は、例えば、通常20〜40℃、好ましくは30℃で、16時間〜6日間、好ましくは3〜4日間振盪培養または通気攪拌培養を行う。
【0016】
以上のような条件で所定の時間培養した後、培養物からサイクロデキストランを採取する。培養物からサイクロデキストランを採取する方法としては、通常のオリゴ糖分離方法であればいかなる方法でもよく、例えば、遠心分離、膜濃縮等により菌体を除去し、上清液を回収する。その後、当該上清液を公知の精製法に従って処理することにより、高純度のサイクロデキストラン画分を得ることができる。サイクロデキストランの精製法としては、オリゴ糖の精製に一般に用いられている公知の方法であればいずれでもよく、例えば、冷却処理、有機溶媒添加処理、活性炭処理、または特異的にサイクロデキストランを吸着するカラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー等の方法を、単独もしくは適宜組み合わせて用いることができる。更に、必要に応じて分配吸着モードのカラムを用いたHPLC等の精製手段を用いて、個々のサイクロデキストランの高純度品を得ることが出来る。
【0017】
上記の培養において微生物の形態は、微生物の菌体であっても、菌体処理物(例えば、菌体破砕物)であってもよい。微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖(アセチルセルロース、アガロース)、無機物質(多孔質ガラス、金属酸化物)、合成高分子(ポリアクリルアミド、ポリスチレン)等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖(アルギン酸、カラギーナン)、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに菌体を包み込むことによって固定化する。
【0018】
本発明のサイクロデキストランの製造方法は、他の態様として、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、得られた培養液をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物に作用させる方法でもよい。
【0019】
まず、上記の微生物を同様な培地で培養し、培養物の中から培養液を回収する。次に、得られた培養液をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物の溶液と混合し、培養液中に含まれる酵素と、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を反応させる。デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物の濃度は0.5〜50%が好ましい。また、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物との反応には、培養液の除菌濃縮液を用いてもよく、また、培養液から後記の方法にて精製した精製酵素を用いてもよい。
【0020】
反応は、温度10〜60℃、好ましくは40℃、pH4.5〜10.0、好ましくは5.0〜8.0の範囲で、反応時間10〜72時間、好ましくは48時間行う。また必要により反応液の撹拌及びメタノール、エタノール等の有機溶媒の反応液への添加を行う。
【0021】
この反応により、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物は、サイクロデキストランに転換される。反応液からサイクロデキストランを採取する方法は、上述した微生物菌体をデンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養する方法と同様にして行うことができる。
【0022】
2.サイクロデキストラン合成酵素の製造方法
本発明によればまた、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物からサイクロデキストラン生産能を有する微生物を、デンプン、デンプンの成分、またはそれらの部分分解物を含む培地で培養し、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取することを特徴とする、サイクロデキストラン合成酵素の製造方法が提供される。
【0023】
上記微生物の培養は1.に記載の方法と同様にして行う。培養終了後、培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を分離するには遠心分離、膜濃縮等により除菌及び濃縮するのみでもよく、さらに、必要に応じて、通常用いられる酵素の精製法により粗酵素液から精製酵素を得る。培養物よりサイクロデキストラン合成酵素を採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を超音波破砕処理、摩砕処理等で破砕するか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、または、トルエン等の存在下で振盪または放置して自己消化させ、本酵素を菌体外に排出させる。この溶菌液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、または硫酸マンガンにより除核酸したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、これを水に透析した後、真空乾燥して粗酵素を得る。
【0024】
更に、サイクロデキストラン合成酵素の精製標品を得るには、DEAE-セファロース(ジエチルアミンエチルセファロース、ファルマシア社製)、DEAE-セファデックス(ファルマシア社製)、リソースQ(アマシャム・バイオサイエンス社製)等のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは、リソースISO(アマシャム・バイオサイエンス社製)等の疎水クロマトグラフィー、あるいは、セファデックスG−200(ファルマシア社製)、バイオラッドP-150(バイオラッド社製)、スーパーロース12(アマシャム・バイオサイエンス社製)等のゲル濾過による各種クロマトグラフィーを行い、必要により、TSK gel DEAE-5PW(東ソー社製)等のイオン交換クロマトグラフィー、あるいは、TSK gel エーテル5PW〔東ソー社製〕、TSK gel フェニル5PW〔東ソー社製〕等の疎水クロマトグラフィー、あるいは、TSK gel G3,000SW(東ソー社製)等のHPLC(高速液体クロマトグラフィー)操作を適宜組み合わせて実施することにより、高度に精製されたサイクロデキストラン合成酵素を得ることができる。
【実施例】
【0025】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
(実施例1)
(1)T−3040株のデンプン含有培地での培養
バチルス属菌のサイクロデキストラン(CI)生産株として、バチルス・サーキュランス(Bacillis circulans)T−3040株(FERM BP−4132)(以下、T−3040株という)を用いた。2%可溶性デンプン(ナカライテスク社製)、0.5%酵母エキス(バクト社製)、1%トリプトン(バクト社製)、1%NaClの組成の培地を、121℃で20分オートクレーブした後、これにT−3040株を接種し、30℃で3〜6日間振盪培養した。得られた培養液を、遠心し、菌体を取り除き、100℃で10分加熱して冷却し、8,000rpmで20分間遠心し、変性したタンパク等の沈殿を取り除いた。さらに、得られた培養上清に等量のアセトニトリルを加え、15,000rpmで10分間遠心し、沈殿を取り除いた。
【0026】
(2)反応産物の分析
上記の方法で得られたデンプン含有培地で培養したT−3040株の培養上清を、高速液体クロマトグラフLC−10ADVP(島津社製)とAmide−80カラム(4.6mm×25cm)(東ソー社製)を用いて分析した。溶出は50%アセトニトリルで流速1mL/分にて行い、検出には、噴霧蒸発光散乱検出器ELSD−LT(島津社製)を用い、データ解析には、分析ソフトウェアCLASS−VP(島津社製)を用いた。
【0027】
また、スタンダードのCIは、特開2004−166624号(特許文献5)に示した方法に従い、上記T−3040株由来のサイクロデキストラン合成酵素(CITase)にデキストランを添加して合成した、CI−7(グルコースがα−1,6結合で7個環状に連なったサイクロデキストラン)、CI−8(グルコースがα−1,6結合で8個環状に連なったサイクロデキストラン)、CI−9(グルコースがα−1,6結合で9個環状に連なったサイクロデキストラン)、CI−10(グルコースがα−1,6結合で10個環状に連なったサイクロデキストラン)、CI−11(グルコースがα−1,6結合で11個環状に連なったサイクロデキストラン)、CI−12(グルコースがα−1,6結合で12個環状に連なったサイクロデキストラン)をそれぞれ分離精製して13C NMR分析及び質量分析で構造決定をしたものを用いた。なお、上記のCITaseは、T−3040株を培養して得られたものでもよいが、遺伝子組換え技術を用いてCITase遺伝子を組み込んだ大腸菌等により発現させたものを用いてもよい。
【0028】
図1に示すように、スタンダードのCI(図1の上段)であるCI−7、CI−8、CI−9、CI−10、CI−11、およびCI−12と同じリテンションタイムに溶出するオリゴ糖ピークが、T−3040株の培養上清(培養4日目)にa,b,c,d,e,fとして認められた(図1の中段)。
【0029】
(3)反応産物の酵素分解
上記のT−3040株の培養上清に、ブタ膵臓由来α−アミラーゼ(シグマ社製)、多分岐デキストラン水解酵素(以下、HBDaseという)、およびリゾープス・エスピー由来グルコアミラーゼ(ワコー社製)を加え、20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で、40℃にて一晩反応を行い、α−1,4グルコシド結合を分解すると同時に、直鎖のオリゴ糖や多糖をすべてグルコースまで分解した(酵素処理1)。この酵素処理により培養上清にはα−1,4結合以外の環状糖のみが残存することになる。
【0030】
なお、上記で用いるHBDaseは、特許第3607789号記載のスフィンゴバクテリウム・エスピー V−54(FERM P−16086)を培養して得られたものでもよく、また、特開2001−054382号公報記載の大腸菌JM109(pKK223−3−3)(FERM P−17510)等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。
【0031】
上記酵素処理1後の培養上清について同様にして高速液体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、前述のピークa,b,c,d,e,fは消失しなかったことから、これらのピークは環状構造を持ち、α−1,4結合を持たないことが示された(図2の上段)。
【0032】
一方、上記のT−3040株の培養上清に、Chetomium erraticum由来デキストラナーゼL(天野エンザイム社製)を添加し、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で60℃にて4時間反応を行い、α−1,6グルコシド結合を分解した(酵素処理2)。
【0033】
上記酵素処理2後の培養上清について同様にして高速液体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、前述のピークb,c,d,e,fはすべて消失し、ピークaもかなり減少したことから、これらのピークは、α−1,6グルコシド結合から成ることが示された(図2の下段)。
【0034】
以上の結果から、T−3040菌株をデンプン含有培地で培養したときに生成するオリゴ糖は、α−1,6グルコシド結合からなる環状オリゴ糖、サイクロデキストランであることが推定された。さらにT−3040菌株のデンプン含有培地で培養したときに生成するオリゴ糖がサイクロデキストランであることを、NMR分析および質量分析で確認した。
【0035】
具体的には、T−3040株を、2%デンプンを含む培地で4日間培養し、菌体を遠心で取り除いた培養上清100mlを100℃で10分加熱後、冷却し、8,000rpmで20分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清に体積の2培量のエタノールを加え、よく攪拌した後、再び8,000rpmで20分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清のエタノールをロータリーエバポレーターによって取り除いた。
【0036】
上記方法で得た反応液にHBDaseを加え、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中にて30℃で12時間反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖又はデキストランをすべてグルコースまで分解した。ここで、HBDaseは特開平10−229876号公報記載のスフィンゴバクテリウム・エスピー V−54(FERM P−16086)を培養して得られたものでもよく、また特開2001−054382号公報記載の大腸菌JM109(pKK233−3−3)(FERM P−17510)等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。これを100℃で10分間加熱後冷却し、8,000rpmで20分間遠心し、沈殿を取り除いた。
【0037】
このようにして得た遠心上清を逆相カラムSep−Pak C−18カートリッジ(ウォーターズ社製)に通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖又はデキストランを取り除いた。ついで、20%エタノールでカラムに吸着している画分を溶出した。これを遠心濃縮機またはロータリーエバポレーターによってエタノールを取り除き、ついで凍結乾燥させた後、50%アセトニトリルに溶かして15,000rpmで10分間遠心し、ごみを取り除いた。
【0038】
上記方法で得た反応液を、高速液体クロマトグラフSPD6AV(島津社製)とAmide−80カラム(21.5mm×30cm)(東ソー社製)を用いて55%アセトニトリルで流速5mL/分で分離し、示唆屈折計RI Model504(GLサイエンス社製)で検出されるピークa、b、c、d、e、f(図2の酵素処理1で観察されるピークa、b、c、d、e、fに相当。順にCI−7、CI−8、CI−9、CI−10、CI−11、CI−12と推定される)をそれぞれ集めてロータリーエバポレーターで濃縮、次いで凍結乾燥した。
【0039】
上記のようにして得られたオリゴ糖の構造を13C NMRで解析した。具体的には1〜1.5mg/0.6mLの濃度の環状オリゴ糖溶液になるように、重水(DO)(アルドリッチ社製)に溶かし、指標として0.025%3−(trimethylsilyl)−1−propanesulphonic acid(DSS)を加え、500MHzのNMR装置(AVANCE500、Bruker社製)により308Kで、完全デカップリングの条件で13C一次元スペクトルを測定した。
【0040】
対照として既に構造解析がなされているCI−7の精製品も同じ条件で13C NMRで解析した。その結果、下記表1に示すように、ピークa、b、c、d、e、fはCI−7と全く同様のα−1,6結合のグルコースを示すシグナルが観察された。
【0041】
次に、これらオリゴ糖の質量分析を行った。オリゴ糖の凍結乾燥標品それぞれ0.1mg以下を日本電子製のJMS HX−110/110Aで、正イオンモードでグリセロールをマトリクスとして測定した。T−3040株がデンプンから生産するオリゴ糖ピークa、b、c、d、e、fの測定結果を同じく下記表1に示す。
【0042】
サイクロデキストランは、同じグルコース分子より成る直鎖のイソマルトオリゴ糖よりもHO分子が1分子少なく、それぞれのサイクロデキストランの分子量は、CI−7が1134、CI−8が1296、CI−9が1458、CI−10が1620、CI−11が1782、CI−12が1944と計算される。
【0043】
ピークa、b、c、d、e、fはすべて1価イオン[M+H](分子量より水素1分子が多い値を示す)が観察された。その結果、質量分析によるオリゴ糖ピークa、b、c、d、e、fの推定分子量はピークaがCI−7、ピークbがCI−8、ピークcがCI−9、ピークdがCI−10、ピークeがCI−11、ピークfがCI−12の分子量に一致した。
【0044】
上記13C NMR分析及び質量分析の結果、バチルス・サーキュランスT−3040株が原料デンプンより生産するオリゴ糖ピークa、b、c、d、e、fはすべてグルコースがα−1,6結合で環状につながった環状イソマルトオリゴ糖すなわちサイクロデキストランであり、それらの分子式は下記のように示されることを確認した。これらはT−3040株がデキストランから生産するサイクロデキストランCI−7、CI−8、CI−9、CI−10、CI−11、CI−12と全く同じ構造である。
ピークa:C427035
ピークb:C488040
ピークc:C549045
ピークd:C6010050
ピークe:C6611055
ピークf:C7212060
【0045】
【表1】


【0046】
(実施例2)
(1)598K株のデンプン含有培地での培養
バチルス属菌のCI生産株として、パエニバチルス・エスピー598K株(FERM P−19604)(以下、598K株という)を用いた。2%可溶性デンプン(ナカライテスク社製)、0.5%酵母エキス(バクト社製)、1%トリプトン(バクト社製)、1%NaClの組成の培地を、121℃で20分オートクレーブした後、これに598K株を接種し、30℃で2〜4日間振盪培養した。得られた培養液を、遠心し、菌体を取り除き、100℃で10分加熱して冷却し、8,000rpmで20分間遠心し、変性したタンパク等の沈殿を取り除いた。さらに、得られた培養上清に等量のアセトニトリルを加え、15,000rpmで10分間遠心し、沈殿を取り除いた。
【0047】
(2)反応産物の分析
上記の方法で得られたデンプン含有培地で培養した598K株の培養上清を、高速液体クロマトグラフLC−10ADVP(島津社製)とAmide−80カラム(4.6mm×25cm)(東ソー社製)を用いて分析した。溶出は50%アセトニトリルで流速1mL/分にて行い、検出には、噴霧蒸発光散乱検出器ELSD−LT(島津社製)を用い、データ解析には、分析ソフトウェアCLASS−VP(島津社製)を用いた。
【0048】
図1に示すように、スタンダードのCI(図1の上段)であるCI−7、CI−8、CI−9、CI−10と同じリテンションタイムに溶出するオリゴ糖ピークが、598K株の培養上清(培養4日目)にもそれぞれa,b,c,dとして検出された(図1の下段)。
【0049】
(3)反応産物の酵素分解
上記の598K株の培養上清に、α−アミラーゼ、HBDase、およびグルコアミラーゼを加え、実施例1と同様に酵素処理1を行った。
【0050】
上記酵素処理1後の培養上清について、同様にして高速液体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、前述のピークa,b,c,dは消失しなかったことから、これらのピークは環状構造を持ち、α−1,4結合を持たないことが示された(図3の上段)。
【0051】
一方、上記の598K株の培養上清に、デキストラナーゼLを添加し、実施例1と同様にし酵素処理2を行った。
【0052】
上記酵素処理2後の培養上清について、同様にして高速液体クロマトグラフィーによる分析を行ったところ、前述のピークc,dは消失し、ピークa,bもかなり減少したことから、これらのピークは、α−1,6グルコシド結合から成ることが示された(図3の下段)。
【0053】
以上の結果から、598K菌株をデンプン含有培地で培養したときに生成するオリゴ糖もまたα−1,6グルコシド結合からなる環状オリゴ糖、サイクロデキストランであることが推定された。さらに598K菌株のデンプン含有培地で培養したときに生成するオリゴ糖がサイクロデキストランであることを、NMR分析および質量分析で確認した。
【0054】
具体的には、598K株を、2%デンプンを含む培地で4日間培養し、菌体を遠心で取り除いた培養上清100mlを100℃で10分加熱後、冷却し、8,000rpmで20分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清に体積の2培量のエタノールを加え、よく攪拌した後、再び8,000rpmで20分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清のエタノールをロータリーエバポレーターによって取り除いた。
【0055】
上記方法で得た反応液にHBDaseを加え、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中にて30℃で12時間反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖又はデキストランをすべてグルコースまで分解した。ここで、HBDaseは特開平10−229876号公報記載のスフィンゴバクテリウム・エスピー V−54(FERM P−16086)を培養して得られたものでもよく、また特開2001−054382号公報記載の大腸菌JM109(pKK233−3−3)(FERM P−17510)等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。これを100℃で10分間加熱後冷却し、8,000rpmで20分間遠心し、沈殿を取り除いた。
【0056】
このようにして得た遠心上清を逆相カラムSep−Pak C−18カートリッジ(ウォーターズ社製)に通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖又はデキストランを取り除いた。ついで、20%エタノールでカラムに吸着している画分を溶出した。これを遠心濃縮機またはロータリーエバポレーターによってエタノールを取り除き、ついで凍結乾燥させた後、50%アセトニトリルに溶かして15,000rpmで10分間遠心し、ごみを取り除いた。
【0057】
上記方法で得た反応液を、高速液体クロマトグラフSPD6AV(島津社製)とAmide−80カラム(21.5mm×30cm)(東ソー社製)を用いて55%アセトニトリルで流速5mL/分で分離し、示唆屈折計RI Model504(GLサイエンス社製)で検出されるピークc、d(図3の酵素処理1で観察されるピークc、dに相当。順にCI−9、CI−10と推定される)をそれぞれ集めてロータリーエバポレーターで濃縮、次いで凍結乾燥した。
【0058】
上記のようにして得られたオリゴ糖の構造を13C NMRで解析した。具体的には1〜1.5mg/0.6mLの濃度の環状オリゴ糖溶液になるように、重水(DO)(アルドリッチ社製)に溶かし、指標として0.025%3−(trimethylsilyl)−1−propanesulphonic acid(DSS)を加え、500MHzのNMR装置(AVANCE500、Bruker社製)により308Kで、完全デカップリングの条件で13C一次元スペクトルを測定した。
【0059】
対照として既に構造解析がなされているCI−9の精製品も同じ条件で13C NMRで解析した。その結果、下記表2に示すように、ピークc、dはCI−9と全く同様のα−1,6結合のグルコースを示すシグナルが観察できた。
【0060】
次に、これらオリゴ糖の質量分析を行った。オリゴ糖の凍結乾燥標品それぞれ0.1mg以下をMALDI−TOFMS REFLEXII(Bruker Daltonik社製GmbH、ブレーメン、ドイツ)で測定した。598K株がデンプンから生産するオリゴ糖ピークc、dの測定結果を同じく下記表2に示す。
【0061】
サイクロデキストランは、同じグルコース分子より成る直鎖のイソマルトオリゴ糖よりもHO分子が1分子少なく、それぞれのサイクロデキストランの分子量は、CI−9が1458、CI−10が1620と計算される。
【0062】
ピークc、dはいずれも1価イオン[M+Na](分子量よりナトリウム1分子が多い値を示す)が観察された。その結果、質量分析によるオリゴ糖ピークc、dの推定分子量はピークcがCI−9、ピークdがCI−10の分子量に一致した。
【0063】
上記13C NMR分析及び質量分析の結果、パエニバチルス・エスピー598K株が原料デンプンより生産するオリゴ糖ピークcとdはいずれもグルコースがα−1,6結合で環状につながった環状イソマルトオリゴ糖すなわちサイクロデキストランであり、それらの分子式は下記のように示されることを確認した。これらは598K株がデキストランから生産するサイクロデキストランCI−9、CI−10と全く同じ構造である。
ピークc:C549045
ピークd:C6010050
【0064】
【表2】


【0065】
(実施例3)
T−3040および598Kの2菌株について、それぞれ培養日数と培養上清50ml中にデンプン1gから生産されたサイクロデキストラン量を下記表3に示す。T−3040株では培養4日でデンプンの約20%がサイクロデキストランに転換され、598K株は培養3日で約3%がサイクロデキストランに転換された。T−3040株をさらに培養を続けると50%程度のデンプンがサイクロデキストランに転換された。
【0066】
【表3】


【0067】
(実施例4)
T−3040および598Kの2菌株について、それぞれ培養日数と培養上清50ml中に生産されたサイクロデキストラン合成酵素の酵素活性を下記表4に示す。サイクロデキストラン合成酵素量は、T−3040株の培養液の場合は、2%デキストラン40(アマシャムファルマシア製)、10mM CaClを含む40mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で、40℃で反応を行い、598K株の培養液の場合は、2%デキストラン40(アマシャムファルマシア製)を含む40mM Tris−マレイン酸緩衝液(pH8.0)中で、50℃で反応を行うことによって測定した。酵素1Uは1分間に1μmolのCI(CI−7,CI−8,CI−9の合計量)を生産する酵素量とする。サイクロデキストラン生産酵素として望ましい酵素活性は0.12U/ml以上という報告があるが(川端康之, 北尾悟, 舟根和美, 渡嘉敷唯章, 儀部茂八, 宮城貞夫:ニトロソグアニジン変異およびストレプトマイシン耐性変異による環状イソマルトオリゴ糖合成酵素(CITase)生産菌Bacillus circulans の育種. 食品・臨床栄養 1:43-48, 2006)、T−3040株はデンプン含有培地で培養することにより4日間で目標の酵素量に達し、598K株は3日間で目標の1/10の酵素量に達した。
【0068】
【表4】


【0069】
(実施例5)
T−3040株をデンプン含有培地で4日間培養した培養上清、および598K株をデンプン含有培地で3日間培養した培養上清に、さらにデンプンをそれぞれ加えて24時間反応させ、合成されたサイクロデキストラン(CI)量とデンプンを基質とした場合のサイクロデキストラン合成酵素活性を下記表5に示す。サイクロデキストラン合成酵素活性は、2%可溶性デンプン(ナカライテスク社製)、10mM CaClを含む40mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中で、40℃にて24時間で反応を行うことによって測定した。酵素1Uは1分間に1μmolのCI(CI−7,CI−8,CI−9の合計量)を生産する酵素量とする。デンプンを基質とした場合のサイクロデキストラン合成酵素活性は強くないが、菌体を除いた培養上清にさらにデンプンを加えることによってサイクロデキストラン生産を行うことができた。
【0070】
【表5】


【図面の簡単な説明】
【0071】
【図1】標準のCI−7、CI−8、CI−9、CI−10、CI−11、CI−12(上段)、バチルス・サーキュランスT−3040株を、デンプン含有培地で培養した際の上清に生産するオリゴ糖(中段)、パエニバチルス・エスピー598K株を、デンプン含有培地で培養した際の上清に生産するオリゴ糖(下段)を示すHPLC分析の図である。
【図2】バチルス・サーキュランスT−3040株をデンプン含有培地で培養した際の上清を、α−アミラーゼ、HBDase、グルコアミラーゼ(酵素処理1)で分解した際に残存するオリゴ糖(上段)、同上清をデキストラナーゼL(酵素処理2)で分解した際に残存するオリゴ糖(下段)を示すHPLC分析の図である。
【図3】パエニバチルス・エスピー598K株をデンプン含有培地で培養した際の上清を、α−アミラーゼ、HBDase、グルコアミラーゼ(酵素処理1)で分解した際に残存するオリゴ糖(上段)、同上清をデキストラナーゼL(酵素処理2)で分解した際に残存するオリゴ糖(下段)を示すHPLC分析の図である。
【出願人】 【識別番号】501203344
【氏名又は名称】独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
【識別番号】506413812
【氏名又は名称】株式会社シー・アイ・バイオ
【識別番号】505337445
【氏名又は名称】学校法人樟蔭学園
【出願日】 平成19年10月24日(2007.10.24)
【代理人】 【識別番号】100091096
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔

【識別番号】100096183
【弁理士】
【氏名又は名称】石井 貞次

【識別番号】100118773
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 節

【識別番号】100120905
【弁理士】
【氏名又は名称】深見 伸子


【公開番号】 特開2008−167744(P2008−167744A)
【公開日】 平成20年7月24日(2008.7.24)
【出願番号】 特願2007−276158(P2007−276158)