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ポリフェノール配糖体の製造方法 - 特開2008−161133 | j-tokkyo
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【発明の名称】 ポリフェノール配糖体の製造方法
【発明者】 【氏名】濱田 博喜

【氏名】下地 清吉

【要約】 【課題】グルコースが複数結合したポリフェノール配糖体を効率よく得ることができるポリフェノール配糖体の製造方法を提供する。

【解決手段】ポリフェノール化合物(A)のフェノール性水酸基にグルコースが1分子結合した化合物(B)及びα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも1種である糖供与体(C)にγ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とするポリフェノール配糖体(D)の製造方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリフェノール化合物(A)のフェノール性水酸基にグルコースが1分子結合した化合物(B)及び糖供与体(C)にγ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とするポリフェノール配糖体(D)の製造方法。
【請求項2】
ポリフェノール化合物(A)がクルクミンである請求項1記載のポリフェノール配糖体(D)の製造方法。
【請求項3】
糖供与体(C)が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも1種である請求項1又は2記載のポリフェノール配糖体(D)の製造方法。
【請求項4】
γ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼが、バチルス・マセランス由来の酵素である請求項1〜3のいずれか記載のポリフェノール配糖体(D)の製造方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリフェノール配糖体の製造方法に関する。特に、ポリフェノール化合物のフェノール性水酸基にグルコースが複数結合したポリフェノール配糖体の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリフェノールとは、同一分子内に複数のフェノール性水酸基を有する化合物の総称であり、植物等に含まれていることが知られている。ポリフェノールの多くが生理活性機能を有するが、水に対する溶解性が良好ではないことが多く、シクロデキストリン等を用いてポリフェノールを包接化したり、配糖化したりして種々の用途に利用されている。
【0003】
例えば、特開平9−3089号公報(特許文献1)には、茶ポリフェノール類の配糖体及びその製造方法について記載されている。具体的には、茶ポリフェノール類とデキストリン、サイクロデキストリン、澱粉もしくはこれらの混合物に、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることによって、ポリフェノール類を配糖化できることが記載されている。これによれば、従来のポリフェノール類とは異なり、苦味、渋味、えぐみや収斂性などの嫌味がほとんどなく、その精製の程度や純度を問わず、そのままで、あるいは他の素材と共に含有させて食品、医薬部外品、化粧品、医薬品などの広い分野に用いることができるとされている。しかしながら、必ずしも効率良く配糖体を得ることができない場合も多く、改善が望まれていた。
【0004】
また、特開2005−41817号公報(特許文献2)には、クルクミノイド配糖体及びその製造方法について記載されている。具体的には、配糖化した芳香族アルデヒド化合物を出発原料としてアセチルアセトン−酸化ホウ素錯体と縮合してクルクミノイド配糖体とし、かつ反応生成物を低級アルコールと加熱することでホウ素を除去することにより、広範囲のクルクミノイド配糖体を効率的に製造することができるとされている。しかしながら、このような化学合成による方法では必ずしも効率良く配糖体を得ることができない場合も多く、改善が望まれていた。
【0005】
【特許文献1】特開平9−3089号公報
【特許文献2】特開2005−41817号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、グルコースが複数結合したポリフェノール配糖体を効率よく得ることができるポリフェノール配糖体の製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題は、ポリフェノール化合物(A)のフェノール性水酸基にグルコースが1分子結合した化合物(B)及び糖供与体(C)にγ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることを特徴とするポリフェノール配糖体(D)の製造方法を提供することによって解決される。
【0008】
このとき、ポリフェノール化合物(A)がクルクミンであることが好適であり、糖供与体(C)が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも1種であることが好適である。また、γ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼが、バチルス・マセランス由来の酵素であることも好適である。
【発明の効果】
【0009】
本発明のポリフェノール配糖体の製造方法によれば、グルコースが複数結合したポリフェノール配糖体を効率よく得ることができる。こうして得られたポリフェノール配糖体は、分子内にグルコースが複数結合したユニットを有するため、溶解性が良好であるとともに、光、熱、pHなどに対する安定性が良好である。また、生体内に投与した場合には、ポリフェノール化合物とグルコースとの結合が容易に切断されるため、ポリフェノール化合物が有する生理活性機能を低減させることがない。したがって、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等として好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0010】
本発明のポリフェノール配糖体の製造方法は、ポリフェノール化合物(A)のフェノール性水酸基にグルコースが1分子結合した化合物(B)及び糖供与体(C)にγ−シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ(以下「γ−CGTase」と略記することがある)を作用させることを特徴とするものである。
【0011】
本発明で用いられるポリフェノール化合物(A)としては、同一分子内にフェノール性水酸基を2つ以上有する天然化合物又はその誘導体であれば特に限定されない。ポリフェノール化合物(A)としては、例えば、フラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノノール、イソフラボン、フラバン、フラバノール(カテキン)、フラバン−3,4−ジオール、カルコン、オーロン、アントシアニジン、リグナン、クマリン、クルクミン、エラグ酸、クロロゲン酸等が挙げられ、中でもクルクミンが好適に用いられる。
【0012】
ポリフェノール化合物は、抗酸化作用、抗変異原性、抗ガン作用、血圧上昇抑制作用、血糖上昇抑制作用、抗アレルギー作用、抗菌作用、抗ウイルス作用等を有することが知られている。特に、ポリフェノール化合物は、水酸基を複数有するので他の共存化合物よりも酸化されやすく、抗酸化作用が優れているとされている。
【0013】
本発明で用いられるポリフェノール化合物(A)を得る方法は特に限定されず、植物などから有機溶媒等や超臨界二酸化炭素を用いて抽出したり、化学合成などにより得ることができる。例えば、クルクミンを得る方法としては、ウコンなどのクルクミンを多く含有する植物等から抽出する方法が挙げられる。
【0014】
本発明のポリフェノール配糖体(D)の製造方法は、上記ポリフェノール化合物(A)の1つのフェノール性水酸基に対してグルコースが1分子のみ結合することにより得られる化合物(B)を用いるものである。このような化合物(B)としては特に限定されず、化合物(B)が有するフェノール性水酸基の複数箇所にグルコースが1分子ずつ結合したものであってもよいし、前記フェノール性水酸基の1箇所のみにグルコースが1分子結合したものであってもよい。その際、フェノール性水酸基とグルコースとの結合は、α結合であってもβ結合であってもよい。フェノール性水酸基をできるだけ複数有する方が抗酸化作用等の活性が良好である観点からは、化合物(B)としては、フェノール性水酸基の1箇所のみにグルコースが1分子結合したものであることが好ましい。
【0015】
このような化合物(B)を得る方法は特に限定されないが、好適には化学合成により得ることができる。例えば、ポリフェノール化合物(A)がクルクミンである場合には、クルクミンとテトラ−O−アセチル−α−D−グルコシルブロマイド(以下「TAGB」と略記することがある)とをAgCO存在下で反応させ、次いで脱アセチル化することでグルコースが1分子結合した化合物(B)であるクルクミン誘導体を得ることができる。
【0016】
本発明は、上記化合物(B)及び糖供与体(C)にγ−CGTaseを作用させることを特徴とするものである。このような方法により、化合物(B)にグルコースが複数結合したポリフェノール配糖体(D)を得ることができる。本発明者らは、化合物(B)の代わりにクルクミンを用いてγ−CGTaseを作用させた場合には、グルコースが複数結合したポリフェノール配糖体を得ることが困難となることを確認している。したがって、本発明ではフェノール性水酸基にグルコースが1分子結合した化合物(B)を用いることが重要である。本発明により得られるポリフェノール配糖体(D)は、分子内にグルコースが複数結合したユニットを有するため、溶解性が良好であるとともに、光、熱、pHなどに対する安定性が良好である等の利点を有する。
【0017】
本発明で用いられる糖供与体(C)としては特に限定されないが、α−シクロデキストリン(以下「α−CD」と略記することがある)、β−シクロデキストリン以下「β−CD」と略記することがある)及びγ−シクロデキストリン(以下「γ−CD」と略記することがある)からなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。上記α−CD、β−CD及びγ−CDは、それぞれ単独で用いてもよいし、混合物として用いてもよい。
【0018】
本発明では、糖供与体(C)の使用態様により、得られるポリフェノール配糖体(D)におけるグルコースの結合数が異なる。実際に、後述するα−CD、β−CD及びγ−CDをそれぞれ用いた実施例における実施例1、2及び3から明らかなように、反応時間によりグルコースの結合数が各々異なったポリフェノール配糖体(D)が得られた。用いられるポリフェノール化合物(A)の種類により異なる場合があるが、グルコースの結合数ができるだけ多いポリフェノール配糖体(D)を短い反応時間で得る観点からは、α−CDを用いることが好ましく、コスト面での利点を有する観点からはβ−CDを用いることが好ましい。
【0019】
本発明ではポリフェノール化合物(A)のフェノール性水酸基にグルコースが1分子結合した化合物(B)に対してγ−CGTaseを作用させるため、ポリフェノール配糖体(D)におけるグルコースの結合数は2以上である。糖鎖が長くなることによって溶解性が良好となる観点からは、グルコースの結合数が7以上のものが5モル%以上であることが好ましく、7以上のものが10モル%以上であることがより好ましく、7以上のものが20モル%以上であることが更に好ましい。ここで、上記モル%は、吸光度430nmでLC−MS測定を行った際のピーク面積から求めた。上記吸光度430nmは、主としてクルクミン骨格由来の吸収波長である。また、通常、グルコースの結合数は30以下である。
【0020】
本発明により得られるポリフェノール配糖体(D)は、例えば、用いられるポリフェノール化合物(A)がクルクミンである場合、下記化学式(1)又は(2)で示される。
【化1】


[式中、nは1以上の正の整数である。]
【0021】
【化2】


[式中、nは1以上の正の整数である。]
【0022】
上記化学式(1)及び(2)において、クルクミン由来のフェノール性水酸基と直接結合しているグルコースとの結合はβ結合であるが、前記結合はα結合であっても何ら差し支えない。フェノール性水酸基をできるだけ複数有する方が抗酸化作用等の活性が良好である観点からは、ポリフェノール配糖体(D)は、上記化学式(1)のように、クルクミン由来のフェノール性水酸基の1箇所のみにグルコースが多数結合したものであることが好ましい。
【0023】
本発明で用いられるγ−CGTaseとは、デンプンに作用させた場合にα−CD、β−CD及びγ−CDの各シクロデキストリンのうち、主にγ−CDを産生する酵素をいう。本発明で用いられるγ−CGTaseとしては、特に限定されないが、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ポリミキサ(Bacillus polymyxa)、クレブシーラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、等の微生物によって産生されるものが挙げられる。中でも食品の利用の観点からはバチルス・マセランス(Bacillus macerans)由来であることが好ましい。
【0024】
本発明において、化合物(B)に対するグルコース換算での糖供与体(C)のモル比(糖供与体(C)/化合物(B))は、10〜10000であることが好ましい。モル比が10未満の場合、シクロデキストリンの分解が抑えられて反応が進行しないおそれがあり、より好適には100以上である。一方、モル比が10000を超える場合、シクロデキストリンの分解が早く起きて、糖同士で結合(重合)をして高分子のデキストラン(デンプン)が生じるおそれがあり、より好適には2000以下である。
【0025】
本発明で用いられるγ−CGTaseの添加量は特に限定されず、化合物(B)1μmol当たり300〜1000単位であることが好ましく、400〜800単位であることがより好ましい。
【0026】
また、γ−CGTaseを添加して反応する際の反応温度は特に限定されず、グルコースの結合数が所望のポリフェノール配糖体(D)を得ることを考慮すると、反応温度は20〜70℃であることが好ましい。反応温度が20℃未満の場合、反応の進行が困難となるおそれがあり、より好適には35℃以上であり、更に好適には45℃以上である。一方、反応温度が70℃を超える場合、γ−CGTaseが失活するおそれがあり、より好適には60℃以下である。
【0027】
また、γ−CGTaseを添加して反応する際のpHも特に限定されず、酵素の最適pHを考慮することにより定めることができる。pHは3〜11であることが好ましく、4〜8であることがより好ましい。
【0028】
γ−CGTaseを添加してからの反応時間は特に限定されず、用いられる糖供与体(C)によりグルコースの結合数が異なったポリフェノール配糖体(D)が得られることとなる。本発明では、反応時間が長くなるほどグルコースの結合数が減少する傾向が見られる。反応時間は、通常、1分〜100時間であるが、反応時間を適宜調整することでグルコースの結合数が所望のポリフェノール配糖体(D)を得ることができる。本発明において、α−CDを用いた際の好適な反応時間は1分〜6時間であり、β−CDを用いた際の好適な反応時間は1時間〜12時間であり、γ−CDを用いた際の好適な反応時間は3時間〜24時間である。
【0029】
本発明により得られるポリフェノール配糖体(D)を生体内に投与した場合には、生体内に存在するα−アミラーゼやα−グルコシターゼ等の作用により、ポリフェノール化合物(A)とグルコースとの結合が容易に切断されるため、ポリフェノール化合物(A)が有する抗酸化作用等を示すこととなる。したがって、本発明により得られるポリフェノール配糖体(D)は、ポリフェノール化合物(A)が有する生理活性機能を低減させることがなく、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等として好適に用いることができる。
【実施例】
【0030】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。
【0031】
実施例1
ペンタ−O−アセチル−β−D−グルコース20gを25%臭化水素−酢酸溶液100gを用いて25℃で8時間反応させることにより、テトラ−O−アセチル−α−D−グルコシルブロマイド(TAGB)を得た。得られたTAGBをAgCO0.4gを用い、モレキュラーシーブス4A(MS−4A)の存在下、アセトン中で反応させることにより、クルクミン−O−アセチル−β−D−グルコピラノシドを3.2g得た。次いで、得られたクルクミン−O−アセチル−β−D−グルコピラノシドに対して、KCO1gを用いてメタノール中で加水分解し、オープンカラムクロマトグラフィーを用いて単離精製してクルクミン−O−β−D−グルコピラノシドを100mg得た。化学反応式を以下に示す。
【0032】
【化3】


【0033】
【化4】


【0034】
上記で得られたクルクミン−O−β−D−グルコピラノシド3mmol、α−CD(和光純薬工業株式会社製)0.5mmol及び塩化カルシウム1mgを量り取り、50mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)を3ml加え、更にバチルス・マセランス(Bucillus macerans)由来のγ−CGTase(天野株式会社製)を600単位加え、攪拌しながら55℃で、5分、1時間、6時間、12時間、24時間及び48時間反応をそれぞれ行った。反応後、80℃で1時間熱処理を行って酵素を失活させ、メンブランフィルター(孔径0.45μm)を通すことによりクルクミン配糖体をそれぞれ得た。得られたクルクミン配糖体に対して、吸光度430nmでLC−MS測定を行ったところ、15配糖体までのピークが確認された。得られたチャートを図1に示す。
【0035】
実施例2
実施例1において、α−CDを用いる代わりにβ−CD(和光純薬工業株式会社製)を0.5mmol用いて5分、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間及び48時間反応をそれぞれ行った以外は実施例1と同様にして反応を行った。
【0036】
実施例3
実施例1において、α−CDを用いる代わりにγ−CD(和光純薬工業株式会社製)を0.5mmol用いて5分、1時間、6時間、12時間、24時間及び48時間反応をそれぞれ行った以外は実施例1と同様にして反応を行った。
【0037】
実施例4
実施例1において、α−CDを用いる代わりに可溶性デンプンを600mg用いて24時間反応を行った以外は実施例1と同様にして反応を行った。
【0038】
α−CDを用いた実施例1、β−CDを用いた実施例2、及びγ−CDを用いた実施例3では、グルコースの結合数が少ない配糖体よりも、比較的グルコースの結合数が多い配糖体が主として得られた。これに対し、可溶性デンプンを用いた実施例4では、グルコースの結合数が少ない配糖体が主として多く見られた。
【0039】
α−CDを用いた実施例1の場合は、反応時間が5分の時に7糖以上の配糖体が多く確認され、反応時間が進むにつれて加水分解されてグルコースの結合数が減少する傾向が見られた。また、β−CDを用いた実施例2の場合は、反応時間が3時間の時に、γ−CDを用いた実施例3の場合は、反応時間が6時間の時に7糖以上の配糖体がそれぞれ多く確認された。β−CD及びγ−CDを用いた場合も、α−CDを用いた場合と同様に反応時間が長くなり過ぎるとグルコースの結合数が減少する傾向が見られた。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】α−CDを用い、5分、1時間、6時間、12時間、24時間及び48時間反応させて得られたポリフェノール配糖体(D)のLC−MS分析チャートである。
【図2】β−CDを用い、5分、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間及び48時間反応させて得られたポリフェノール配糖体(D)のLC−MS分析チャートである。
【図3】γ−CDを用い、5分、1時間、6時間、12時間、24時間及び48時間反応させて得られたポリフェノール配糖体(D)のLC−MS分析チャートである。
【図4】可溶性デンプンを用い、24時間反応させて得られたポリフェノール配糖体のLC−MS測定チャートである。
【出願人】 【識別番号】504380356
【氏名又は名称】株式会社バイオ・タキソール
【識別番号】502290657
【氏名又は名称】有限会社沖縄長生薬草本社
【出願日】 平成18年12月28日(2006.12.28)
【代理人】 【識別番号】100075960
【弁理士】
【氏名又は名称】森 廣三郎

【識別番号】100114535
【弁理士】
【氏名又は名称】森 寿夫

【識別番号】100113181
【弁理士】
【氏名又は名称】中務 茂樹

【識別番号】100126697
【弁理士】
【氏名又は名称】齊宮 瑞枝


【公開番号】 特開2008−161133(P2008−161133A)
【公開日】 平成20年7月17日(2008.7.17)
【出願番号】 特願2006−355240(P2006−355240)