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【発明の名称】 4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法
【発明者】 【氏名】吉岡 彰

【氏名】大泉 健一

【要約】 【課題】短時間で反応が完結でき、且つ多量の酵素を必要としない、ニトリルヒドラターゼによる4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法を提供する。

【解決手段】4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを減圧乾燥した後、前記ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。好ましくは、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを凍結処理した後、減圧乾燥を行う、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを減圧乾燥した後、前記ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させる、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。
【請求項2】
4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを凍結処理した後、減圧乾燥を行う、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法に関する。例えば4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドは、カルニチン、3,4−ジヒドロキシブタン酸などの種々の生理活性物質、医薬品、農薬などの合成原料として使用される。
【背景技術】
【0002】
一般にニトリルの水和によるアミド化合物の製造法としては、塩酸などの鉱酸やアルカリを使用する方法、アルカリと過酸化水素を併用する方法などが知られているが、これらの方法では工程が煩雑となり、対応する酸が副生し収率が低下してしまうなどの問題があった(特許文献1)。また、生物学的反応としては、ニトリルヒドラターゼの作用によりニトリル化合物を水和してアミド化合物を製造する方法、例えば、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルにニトリルヒドラターゼを作用させて4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドを製造する方法が知られている(特許文献2)。しかし、この製造方法では、反応時間が長く、尚且つ、ニトリルヒドラターゼを大量に必要とするという問題があった。
【0003】
一方、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法としては、エピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法(特許文献3)、エピハロヒドリンと青酸を反応させる方法(特許文献4)、1,3−ジハロ−2−プロパノールに青酸または青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法(特許文献5)などが知られている。
しかし、上記方法では、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを合成した後、反応液中に未反応の青酸が残存する。よって、次いでニトリルヒドラターゼにより、アミド化反応を実施する場合、残存している青酸により酵素が失活してしまうため、青酸を除去する必要がある。更に、青酸を例えば1ppm以下に除去しても、アミド化反応の反応速度が非常に遅く、反応速度を上昇させるためには大量の酵素を必要とする場合があった。
【0004】
【特許文献1】特開平1−287065
【特許文献2】特開平4−365491
【特許文献3】特開昭63−316758
【特許文献4】特開2002−241357
【特許文献5】特開平5−219965
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、短時間で反応が完結でき、且つ多量の酵素を必要としない、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
そこで本発明者らが、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを予め減圧乾燥処理をし、ニトリルヒドラターゼを作用させることで、煩雑な精製操作を必要とせずに、円滑にアミド化反応を進行させることができ、多量の酵素を必要とせず、短時間で4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【0007】
すなわち本発明は、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを減圧乾燥した後、前記ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法、である。
【発明の効果】
【0008】
4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを減圧乾燥処理した後、前記ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させることにより、煩雑な精製操作を必要とせずに、円滑にアミド化反応を進行させることができ、多量の酵素を必要とせず、短時間で4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0009】
本発明は、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを減圧乾燥した後、前記ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法以下、ニトリルヒドラターゼによる当該ニトリルからアミドへの変換反応を、「アミド化反応」と称す。
【0010】
本発明において、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリル、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミド、エピハロヒドリン、1,3−ジハロ−2−プロパノールの「ハロ」とはハロゲン元素を示し、具体的にはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を示す。好ましくは、塩素、臭素である。
【0011】
4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルは、例えば、特開昭63−316758号公報に記載の方法により合成することができる。また、アズマックス社等で市販されている市販品を使用しても良い。
本発明では、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルは、エピハロヒドリン又は1,3−ジハロ−2−プロパノール、及び青酸又は青酸のアルカリ金属塩とから酵素触媒を用いて調製されたものを使用することが好ましい。
【0012】
上記方法により得られた4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルは、反応終了後の溶液、その溶液から当該ニトリルを抽出した抽出液、抽出液を濃縮した濃縮液、カラムクロマトグラフィー等の常法により精製された精製物等、いずれの状態で次に続く減圧乾燥処理に供してもよい。いずれの状態を選択するかは、アミド化反応の際に使用するニトリルヒドラターゼの反応速度及び酵素の使用量等を考慮し、適宜選択することができる。
【0013】
4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルの減圧乾燥処理とは、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルそのもの、又はそれを含む溶液を減圧乾燥することをいう。
【0014】
4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを含む溶液を減圧乾燥処理する場合、使用する溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、オクタンなどの炭化水素系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、メタクリル酸メチルなどのエステル系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどの塩素系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テロラヒドロフラン、ジメチルスルフォキシド等の有機溶媒、水などが挙げられる。これらの溶媒は、2種類以上の混合溶媒であっても構わない。
【0015】
上記溶媒の内、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、プロピオン酸エチルなどのエステル系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどの塩素系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テロラヒドロフラン、ジメチルスルフォキシド、又は水を使用することが好ましい。水を使用する場合、緩衝液を用いてもよい。例えば酸成分としては塩酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、アコニット酸、コハク酸、酢酸、クエン酸二水素カリウム、フタル酸水素カリウム、クエン酸水素二ナトリウム、マレイン酸、マレイン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、四ホウ酸ナトリウムなど、塩基成分としては酢酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸水素二ナトリウム、酒石酸ナトリウム、クエン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、乳酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、アンモニア、炭酸ナトリウム、Trisなどが挙げられ、これら単独あるいは組み合わせで形成される緩衝液が挙げられる。
また前記溶媒に4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルが完全に溶解する必要は必ずしもない。
【0016】
減圧乾燥方法は、常温、加温、各条件下のいずれも選択できる。また4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリル溶液が水溶液である場合、試料を凍結した後、減圧乾燥する、すなわち凍結乾燥で処理することができる。
【0017】
凍結乾燥処理は、ニトリルヒドラターゼによる4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルの4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドは反応速度を早める効果をもたらすだけでなく、処理方法が穏和であることから新たな不純物の生成を抑制し、ニトリル化合物のアミド化の効率を向上させる効果をもたらす故、好ましい。
【0018】
乾燥時間は特に限定されないが、3〜24時間、さらには12〜18時間であることが好ましい。
【0019】
真空度は特に限定されないが、400Pa以下、さらには10〜50Paであることが好ましい。
【0020】
4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルの水溶液を減圧乾燥処理する時、その分解を防ぐため、pHは中性〜酸性領域が好ましく、pH3〜7がより好ましい。また減圧乾燥処理後にはニトリルヒドラターゼが高活性を示す至適pHに再度調節してから、アミド化反応に移ることが好ましい。
【0021】
次に上記のごとく減圧乾燥処理を行った4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルをニトリルヒドラターゼと接触させる。
【0022】
使用するニトリルヒドラターゼ(国際的な酵素分類によればリアーゼに属する酵素)は4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルのニトリルをアミドへ変換する反応を触媒する酵素であれば良い。
【0023】
例えば、アクロモバクターAchromobacter)属、アシドボラックス(Acidovorax)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バークホルデリア(Burkholderia)属、キャンディダ(Candida)属、カセオバクター(Caseobacter) 属、コマモナス(Comamonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ディーツィア(Dietzia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルビニア(Erwinia)属、ジオバチルス(Geobacillus)属、ゴルドナ(Gordona)属、クレブシエラ(Klebsiela)属、ミクロアスカス(Microascus)モルガネラ(Morganella)属、パントエア(Pantoea)属、プロテウス(Proteus)属、シュードモナス(Pseudomonas) 属、シュードノカルディナ(Pseudonocardia)属、ロドコッカス(Rhodococcus) 属、リゾビウム(Rhizobium)属、セラチア(Serratia)属、シクタリジウム(Syctalidium)属、ツカムレラ(Tukamurella)属、に属する微生物が産生するニトリルヒドラターゼである。
【0024】
具体的には、アースロバクター グロビフォルミス(Arthrobacter globi-formis)IFO 12138、ブレビバクテリウム ヘルボラム(Brevibacterium helvolum)ATCC 11822 、コリネバクテリウム フラベシエンス(Corynebacterium flaves-cens)IAM 1642 、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)IFO 12540 およびIFO 12539 、ストレプトマイセスアルボグリセルス(Streptomyces albogriseolus)HUT 6045、ストレプトマイセス クリゾマルス(Streptomyces chrysomallus)HUT 6141、ストレプトマイセス シネレオルバー(Streptomyces cinereouruber)HUT6142、ストレプトマイセス ヂアスタチカス(Streptomyces diastaticus)HUT 6116、ストレプトマイセス オリバセウス(Streptomyces olivaceus)HUT 6061、ストレプトマイセス ルブロシアノヂアスタチカス(Streptomyces rubrocyanodiastaticus)HUT 6117、クレブシエラ ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae)IFO 12019、IFO 3319、IFO12059、IAM 1063、クレブシエラ ニュウモニアエ サブスピーシズ ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) NH-36T2株、セラチア ピリムシカ(Serratia plymuthica)IFO 3055、セラチア マルセッセンス(Serratia marcescens )IAM 1105、エルビニア キャロトボラ(Erwinia carotovora)IFO 3057、ツカムレラ ポーロメタボラム(Tukamurella paurometabolum)JCM 3226、ゴルドナ ルブロペルチンクタス(Gordona rubropertinctus)JCM 3227、モルガネラ モルガニ(Morganella morganii)IFO 3848、プロテウス ブルガリス(Proteus vulgaris)IFO 3167、エンテロバクター エアロジェネス(Enterobacter aerogenes)IFO 12010、ミクロアスカス デスモスポラス(Microascus desmosporus)IFO6761、キャンディダ グイリエモンディー(Candida guilliermondii)NH-2株(FERM P-11350 号)、パントエア アグロメランス(Pantoea agglomerans)NH-3株(FERM P-11349 号)などが産生するニトリルヒドラターゼである。
【0025】
なお、ATCC番号が付与された微生物菌株は、各々アメリカンタイプカルチァーコレクション(ATCC)、から容易に入手することができる。IFO番号の付された微生物は、(財)醗酵研究所(IFO)発行の「List of Cultures、第8版、第1巻(1988)」に記載されており、現在は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門遺伝資源保存課から入手できる。IAM番号の付された微生物は東京大学応用微生物学研究所から入手できる。JCM番号の付された微生物は、理化学研究所 系統微生物保存機関発行の「Catalogue of strains 第4版(1989)」に記載されており、理化学研究所 系統微生物保存機関より入手できる。HUT番号の付された微生物は、日本微生物保存連盟(JFCC)発行の「 Catalogue of Cultures、第4版(1987)」に記載されており、広島大学工学部から入手できる。FERM番号の付された微生物は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターから入手できる。
【0026】
さらに山田らが土壌より分離したロドコッカス ロドクロウス J-1〔FERM BP-1478号〕、及び本発明者らの一部が土壌より分離したアースロバクター sp.SK103〔FERM P-11300号〕、カセオバクター sp. BC23 〔FERM P-11261号〕、シュードモナス sp. BC15-2 〔FERM BP-3320号〕、シュードモナス sp. SK31 〔FERM P-11310号〕、シュードモナス sp. SK87 〔FERM P-11311号〕、シュードモナスsp. SK13 〔FERM BP-3325号〕、ロドコッカス sp. SK70 〔FERM P-11304号〕、ロドコッカス sp. HR11 〔FERM P-11306号〕およびロドコッカス sp. SK49〔FERM P-11303号〕などが産生するニトリルヒドラターゼも挙げられる。これらの細菌は、それぞれ上記寄託番号にて独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
【0027】
また、上記微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子をクローニングし、形質転換(導入)した微生物も、上記のニトリルヒドラターゼを産生する微生物として含まれる。例えば、米国特許第5807730号に記載のシュードノカルディア(Pseudonocardia)属のニトリルヒドラターゼ遺伝子で形質転換した大腸菌 MT-10822株(FERM BP-5785)、特開平8-266277号公報記載のアクロモバクター(Achromobacter)属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌 MT-10770株(FERM P-14756))、特開平4−211379号公報記載のロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)種のニトリルヒドラターゼで形質転換した微生物などが挙げられる。
【0028】
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を培養するための培地組成としては、微生物が生育でき、所望の酵素を産生するのであれば特に限定はない。例えば、炭素源としてグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸類などの天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩などが使用でき、このほか、無機塩、微量金属、ビタミンなどが必要に応じて適宜使用される。
【0029】
また場合により、酵素活性を誘導させるために、4−クロロ−3−ヒドロキシブチロニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリル、ベンジルシアニドなどの各種ニトリル化合物、4−クロロ−3−ヒドロキシブチルアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドなどの各種アミド化合物などを培地に添加しても良い。上記微生物の培養は常法によればよく、例えば pH 4〜10、温度10〜45℃の範囲にて好気的に10〜180 時間培養する。培養は液体培養、固体培養のいずれでも行うことができる。
【0030】
アミド化反応に際し、上記のようにして得た微生物菌体は、培養液そのまま、遠心分離などにより得た菌体の懸濁液、菌体処理物(例えば菌体破砕物、菌体抽出物など)、常法により固定化した菌体または菌体処理物として使用することができる。上記のようにして得た菌体は、アミド化反応時に一括添加又は分割添加して反応を実施する。
【0031】
なお、アミド化反応が発熱反応であることから菌体の懸濁液を基質の水溶液に添加することが好ましい。反応液中の基質濃度は特に限定されないが、0.01 〜50(W/V) %程度が通常で、0.1〜40%程度がより好ましい。反応温度は0〜50℃程度で、0〜30℃程度がより好ましい。反応液のpHは4〜10の範囲で、6〜8程度で行うことがより好ましい。反応時間は基質濃度、菌体濃度あるいはそのほかの反応条件によって変わるが、通常0.5〜120 時間で終了するように条件を設定することが好ましく、副反応の進行を抑制するためにも、0.5〜24時間程度で終了するように設定することがより好ましい。
【0032】
以上のようにして合成した−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドは、抽出、カラム分離、再結晶等の定法に従い、単離精製することができる。
【0033】
なお、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリル、エピハロヒドリンには不斉炭素が存在するが、本発明ではラセミ体、光学活性体のどちらでも実施可能である。本発明において光学活性な4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを出発として反応を行った場合、光学純度を低下させることなく対応する光学活性な4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドを生成することができる。4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドはカルニチン(4−トリメチルアミノ−3−ヒドロキシ酪酸)や3−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン合成の中間体として使用することができる。4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの光学活性体は、L−カルニチンの合成中間体として使用することが可能であるため非常に有用である。
【実施例】
【0034】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
4−クロロ−3−ヒドロキシブチロニトリル(以下CHBNと略す)及び4−クロロ−3−ヒドロキシブチルアミド(以下CHBAと略す)の化学純度は、下記HPLC定量結果より算出した。
本発明において使用したHPLCはウォーターズ社製alliance2695もしくはアジレント社製HP1090である。詳細を以下に示す。
【0035】
[HPLC分析条件]
試料調製方法 : 反応液を移動相もしくは超純水に溶解
カラム : Capcell Pak C18 MGII(資生堂製)
2.0mm I.D.×100mm、 粒径3μm
カラムオーブン温度 : 40℃
移動相 : 0.05% ナノフルオロペンタン酸水溶液
流速 : 0.2mL/min
検出器 : 示差屈折計(SHODEX製RI SE−61)
CHBNの標品は、アズマックス株式会社製(化学純度98.9%)を用いた。CHBAの標品は、前記アズマックス株式会社製CHBNを原料とし、ニトリルヒドラターゼを用いて合成、酢酸エチルにより抽出後、シリカゲルカラムにより精製したCHBAを用いた。)
【0036】
(R)−CHBNの光学純度は、以下のようにして測定した。
(R)−CHBN1μlにジクロロメタン20μl、ピリジン20μlを加えた後、(R)−α−メトキシ−α−(トリフルオロメチル)フェニルアセチルクロライド(MTPA)2μlを添加し、そのまま室温で5時間撹拌を行った。反応終了液にジイソプロピルエーテル300μlを添加し、続いて1N HCl水溶液350μlを用いて洗浄、有機層を回収した。さらに有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液350μlで洗浄し、有機層を減圧乾燥、残渣をイソプロパノールに溶解させ、これをHPLCで分析を行った。
本分析に用いたHPLCシステムは以下の通りである。
【0037】
[HPLC分析条件]
(R)−CHBN MTPAエステル
(S)−CHBN MTPAエステル
カラム : Partisil-5(GL Science)
4.6mm×250mm
カラムオーブン温度 : 40℃
移動相 : ヘキサン:イソプロパノール=99:1
流量 : 1ml/min
検出器 : UV 254nm
保持時間 : (R)−CHBN MTPAエステル:11.9min
(S)−CHBN MTPAエステル:13.0min
【0038】
<参考例1>
本発明で使用するニトリルヒドラターゼは、以下のようにして調製した。ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J−1(FERM BP-1478)を、30L容ジャーファーメンター(高杉製作所社製)にてグルコース2質量%、尿素1質量%、ペプトン0.5質量%、酵母エキス0.3質量%、塩化コバルト0.05質量%を含む、20Lの培地(pH7.0)に植菌し、温度30℃で好気的に60時間培養した。上記の方法により培養して得た菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液(pH 7.7)にて2回洗浄後、懸濁することで保存菌体液とした。
<実施例1>
【0039】
アズマックス社製、化学純度98.9質量%、光学純度99.2%eeの(R)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチロニトリル(以下(R)−CHBNと略す)を採取し、超純水:9.0gを加えて試料溶液を調製した。この試料溶液を冷凍庫にて凍結処理した後、15時間かけて凍結乾燥を行った。
乾燥後、30mMのリン酸バッファー(pH=7.9)を9g加えて再溶解し、試料溶液を再調製した。この再調製液に添加するJ−1菌菌体液を算出するために、再調製液および凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液に含まれている各(R)−CHBN濃度を先に示したHPLC分析条件にて測定を行った。凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液に含まれている(R)−CHBN濃度を1とした場合の再調製液に含まれている(R)−CHBN濃度の比を算出した。そして凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液1gに対して参考例1で調製したJ−1菌菌体液を1.5μL加えた場合と同じ割合となるように再調製液1gに参考例1で調製したJ−1菌菌体液を加え、10℃で反応を開始した。加えたJ−1菌菌体液量および反応結果は表1のようになった。
【0040】
<比較例1>
アヅマックス社製(R)−CHBN:20mg(0.167mmol)に30mMのリン酸バッファー(pH=7.9):980mgを加えた。10℃に冷却した後、参考例1で調製したJ−1菌希釈溶液を1.5μL加え、10℃で反応を開始した。反応結果は表1のようになった。
【表1】


<実施例2>
【0041】
以下のようにしてハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養を行い、それを用いて1,3−ジクロロ−2−プロパノールから(R)−CHBNを合成し、ニトリルヒドラターゼによるアミド化反応を行った。詳細について順に示す。
【0042】
i)ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌(Escherichia coli) JM109/pST111(FERM P-12065、特開平5-317066号参照)を、LB培地(1%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%NaCl、1mM IPTG、50μg/mlアンピシリン)を 100mL入れた500mL容三角フラスコに植菌し、37℃で20時間振盪培養した。前記培養菌体を遠心分離により集菌し、集菌した菌体を50mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)で洗浄し、50mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)で懸濁した。この菌体懸濁液0.25gを50mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)100mLに加え、さらに50mMとなるように1,3-ジクロロ-2-プロパノールを加え、20℃で10分間反応した。HPLCにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、11mMであった。
【0043】
ii)1,3−ジクロロ−2−プロパノールからの(R)−CHBNの合成
pH電極、ならびにpHコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した300mL4つ口フラスコに水127.55g、HCN4.41g(0.1632mol)を入れ、30%NaOH 0.65g(0.0049mol)で、pH7.5に調整した。1,3-ジクロロ-2-プロパノール10.00g(0.0775mol)を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
【0044】
上記i)の方法により調製したハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ菌体懸濁液20.00gを加え、20℃で反応を開始した。系内のpHを7.5〜7.6に維持するよう、30%NaOHを投入するようにpHコントローラーを設定し、投入されたNaOHとほぼ等モルの割合で1,3-ジクロロ-2-プロパノール, HCNを追加していくことで、系内の1,3-ジクロロ-2-プロパノールの濃度を0.5mol/kgを超えないよう、また、系内のシアンイオン濃度を1.1mol/kgを超えないようにした。
23時間後、4-クロロ-3-ヒドロキシブチロニトリルを0.753mol/kg蓄積することができ、その光学純度は94.8%e.e.の(R)−体過剰であった。反応により消費された1,3-ジクロロ-2-プロパノールからの収率は96.3%であった。
この反応液を塩酸でpH=5.0に調節し、60℃、140torrで減圧して11時間HCNの除去を行い、反応系内のHCNを硝酸銀で滴定、1ppm以下であることを確認した。
【0045】
iii)アミド化反応
上述の方法で合成した(R)−CHBNの反応終了水溶液1.5gを50mlのナスフラスコに採り、冷凍庫にて凍結処理した後、15時間かけて凍結乾燥を行った。乾燥後、30mMのリン酸バッファー(pH=7.9)を1.35g加えて再溶解し、試料溶液を再調製した。この再調製液に添加するJ−1菌菌体液を算出するために、再調製液および凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液に含まれている各(R)−CHBN濃度を先に示したHPLC分析条件にて測定を行い、凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液に含まれている(R)−CHBN濃度を1とした場合の再調製液に含まれている(R)−CHBN濃度の比を算出した。そして凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液1gに対して参考例1で調製したJ−1菌菌体液を1.5μL加えた場合と同じ割合となるように再調製液1gに参考例1で調製したJ−1菌菌体液を加え、10℃で反応を開始した。加えたJ−1菌菌体液量および反応結果は表2のようになった。
【0046】
<比較例2>
実施例2のi)〜ii)で合成した(R)−CHBNの反応終了水溶液1gを10℃に冷却した後、参考例1で調製したJ−1菌希釈溶液を1.5μL加え、10℃で反応を開始した。反応結果は表2のようになった。
【0047】
【表2】




【出願人】 【識別番号】000006035
【氏名又は名称】三菱レイヨン株式会社
【出願日】 平成18年12月19日(2006.12.19)
【代理人】
【公開番号】 特開2008−148637(P2008−148637A)
【公開日】 平成20年7月3日(2008.7.3)
【出願番号】 特願2006−340962(P2006−340962)