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【発明の名称】 多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンの製造方法
【発明者】 【氏名】高本 幹也

【氏名】梅原 泰男

【氏名】横山 進之介

【氏名】船山 誠

【要約】 【課題】有機溶媒及び乳化剤を使用せずに、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンの製造方法を提供する。

【解決手段】ホスホリパーゼDの存在下でレシチンとセリンを反応させて多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを製造する方法において、ホスホリパーゼD、セリン、水及びレシチンを含む反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で上記反応を行うことを特徴とする方法。多価不飽和脂肪酸は好ましくはn−3系で、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも一つである。レシチンは好ましくは海産物組織より抽出され、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールのうちの少なくとも一つを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホスホリパーゼDの存在下でレシチンとセリンを反応させて多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを製造する方法において、ホスホリパーゼD、セリン、水及びレシチンを含む反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で前記反応を行うことを特徴とする、前記方法。
【請求項2】
前記反応系の容量が、反応槽の容量に対して5〜50%である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記反応系の容量が、反応槽の容量に対して10〜40%である、請求項1に記載の方法。
【請求項4】
前記反応系が、レシチン1gに対して10〜200mlの水を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記反応系が、レシチン1gに対して10〜50mlの水を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
多価不飽和脂肪酸が、n−3系の多価不飽和脂肪酸である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
多価不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも一つである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
レシチンが、海産物組織より抽出されたレシチンである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
レシチンが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールのうちの少なくとも一つを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリン(以下、PSと称することがある)を含む油脂組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、多価不飽和脂肪酸(高度不飽和脂肪酸ともいう)、例えばドコサヘキサエン酸(以下、DHAと称することがある)、エイコサペンタエン酸(以下、EPAと称することがある)を構成要素とするリン脂質の持つ生理機能の有効性が明らかにされてきた。このため、多価不飽和脂肪酸を高濃度に含有する材料、例えばイクラなどの魚卵、或いは魚油添加飼料で飼育した鶏の卵から、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするリン脂質を回収することが行われている。一方、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするリン脂質の物理化学的特性を生かして、単に乳化剤或いは分散剤としての利用のみならず、リポソーム等の基剤として薬剤運搬体への応用が近年注目されている。また、リン脂質自体が生理活性、薬理作用をもつ素材として、医薬品、化粧品、飼料等の分野だけでなく、一般加工食品或いは健康食品等の分野においても高度利用が検討されている。
【0003】
他方、レシチンの一種であるPSは、天然動植物の組織、とりわけ大豆或いは牛脳等の組織における細胞膜構成物質として比較的多く存在している。従来は、牛脳等の動植物組織より抽出し、濃縮、分画及び分別等の精製処理を施して採取されていた。PSは、生体内中では脳細胞のシナプス周辺に局在し、神経伝達物質の橋渡しに大きく寄与することが知られている。また、PSは、近年、記憶力及び集中力を向上させるなどの脳の機能を維持、改善し得る栄養学的かつ医薬的に有望な素材として注目を集めており、PSを経口的に1日100〜300mg摂取することで、加齢に伴う記憶障害或いは認知力を改善する効果が明らかになっている。また、一般にグリセロリン脂質を大量生産するために、出発物質のレシチンを化学的或いは酵素的にホスファチジル基を転移置換し、これから濃縮、分画等して精製する方法が提案されてきた(下記引用文献1〜6を参照)。
【0004】
ホスホリパーゼDを用いてホスファチジル基転移反応を利用し、レシチンの塩基部分を交換しようとする場合、一般的には、酵素、反応受容体、pH緩衝液、無機塩等を含む水相と、親油性であるレシチン等を含む有機溶媒相とを、攪拌、混合して接触させる酵素反応系(二相溶媒系)が利用されてきた。
【0005】
このような二相溶媒系において、ホスファチジル基転移反応を促進させる有機溶媒として、石油エーテル、ジエチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、n−オクタン、イソオクタン、酢酸エチル、ベンゼン等、或いはこれらの混合溶媒が知られている。しかし、これらの有機溶媒はレシチンを溶解することはできるが、転移反応を促進させる効果は十分でなく、また反応で得られたPSを食品等に利用しようとする場合には安全性などの点からこれら有機溶媒を使用することができない。
【0006】
このように酵素反応を二相溶媒系で行う場合には、酵素と交換させる塩基性物質と、レシチンとを効率よく接触させる必要があり、親油性有機溶媒と、水或いは親水性溶媒との二相を使用することが必須条件であった。このため食品用途を考慮した場合、使用可能な安全性の高い反応溶媒という観点から使用可能な有機溶媒としてn−ヘキサン(以下、単にヘキサンという)とアセトンとがあるが、これら反応溶媒を用いたとしても食品として、さらに生産面での安全性等についての問題が残る。
【0007】
また、乳化剤を加えて、無溶剤で酵素反応を行う方法もあるが、乳化剤の種類の適切な選択、さらに乳化を十分に行う必要性がある。
【0008】
【特許文献1】特開昭63−36791号公報
【特許文献2】特開平8−133984号公報
【特許文献3】特開平9−121879号公報
【特許文献4】特開平7−17855号公報
【特許文献5】特開2001−186898号公報
【特許文献6】特開2002−218991号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
このような実状に鑑み、本発明は、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを食品等においても安全性を懸念することなく使用することができようにするために、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンの新たな製造方法を提供することを目的とする。
【0010】
さらに、本発明は、ホスホリパーゼDのホスファチジル基転移活性を効率良く発現させることによって、食品用途をはじめとする各産業分野において使用できる多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを得る方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは前述の課題を解決するために検討を重ねた結果、ホスホリパーゼDの存在下でレシチンとセリンを反応させて多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを製造する方法において、ホスホリパーゼD、セリン、水及びレシチンを含む反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で上記反応を行うと、二相溶媒系或いは乳化剤を使用することなく、ホスファチジル基転移反応(塩基交換反応)が起こることを見出した。レシチンは水に溶けにくいために二相溶媒系或いは乳化剤を使用しない場合、ホスファチジル基転移反応が進みにくいが、本発明に従うホスファチジルセリンの製造方法では、上記反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で上記反応を行うことによって、二相溶媒系或いは乳化剤を必要とすることなくホスファチジル基転移反応が起こることは驚きである。これまで、超臨界又は亜臨界二酸化炭素を用いて、有効成分の抽出或いはリパーゼを用いての加水分解或いはエステル交換反応の研究が行われているが、レシチンの塩基交換反応によってホスファチジルセリンを合成することは報告されていない。また、従来、トリグリセライドと遊離脂肪酸のエステル交換反応のために超臨界装置を用いた例はあるが、係る場合において水を加えると加水分解が起こり目的とする物質が得られないため、水そのものを溶媒として加えることはない。
【0012】
本発明では、上記反応系の容量が、反応槽の容量に対して好ましくは5〜50%、より好ましくは10〜40%である。本発明では、上記反応系が、レシチン1gに対して好ましくは10〜200mlの水、より好ましくは10〜50mlの水を含む。アシル基として、n−3系の多価不飽和脂肪酸残基を含むものが好ましい。n−3系の多価不飽和脂肪酸として、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される1又は2種以上であることが好ましい。レシチンとして、海産物由来のものが挙げられる。海産物として、海産物組織、具体的にはイカ(イカミール)を挙げることができる。また、レシチンは、アシル基をもつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールのうちの少なくとも一つを含むことが好ましい。
【発明の効果】
【0013】
本発明は以上説明したとおり、多価不飽和脂肪酸を構成要素とするレシチンを基質とし、従来使用されてきた溶剤或いは乳化剤を使用しないで、多価不飽和脂肪酸を豊富に含有するPSをホスファチジル基転移反応で容易に製造することができる。また、本発明に従い製造されたPSは、溶媒として、超臨界又は亜臨界二酸化炭素及び水を用いるだけであることから、安全性の点で懸念がなく、食品分野等をはじめとして多くの分野で利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
本発明では、ホスホリパーゼDを用いる酵素反応において、ホスホリパーゼD、セリン、水及びレシチンを含む反応系を超臨界又は亜臨界二酸化炭素の存在下で反応を行う。すなわち、本発明では、超臨界又は亜臨界二酸化炭素及び水を用いることを必須とする。
【0015】
超臨界装置として、二酸化炭素の超臨界又は亜臨界状態を作れればどのような装置であってもよい。超臨界二酸化炭素とは、二酸化炭素の臨界温度である31℃以上及び臨界圧力である7.38MPa以上の超臨界条件下の二酸化炭素をいう。また、亜臨界条件すなわち臨界点付近の条件下の二酸化炭素である亜臨界二酸化炭素を用いうる。亜臨界二酸化炭素とは、圧力7.0MPa以上、かつ温度25℃以上であって超臨界状態ではない二酸化炭素をいう。このように、超臨界状態又は亜臨界状態は、温度と圧力の関係によって作られる。超臨界装置は反応槽を有し、該反応槽に、ホスホリパーゼD、セリン、水及びレシチンを含む反応系を入れ、二酸化炭素を加えて超臨界又は亜臨界状態にする。超臨界又は亜臨界状態にする条件は、当業者によって適宜設定されうる。
【0016】
反応系の容量は、上記反応槽の容量に対して好ましくは5〜50%、より好ましくは10〜40%である。この範囲をはずれると、ホスホリパーゼDによるホスファチジル基転移反応の効率が著しく低下するためである。二酸化炭素の量は、上記反応系を含む反応槽に二酸化炭素が導入されて超臨界又は亜臨界状態にされることから、反応槽及び反応系の容量によって決まる。
【0017】
上記反応系は、レシチン1gに対して好ましくは10〜200mlの水、より好ましくは10〜50mlの水を含む。10ml未満では原料基質を溶解した溶液の粘度が高くなって反応効率の低下を招く原因になり、一方200mlを超えると生産性の効率が悪くなるためである。
【0018】
ホスファチジル基転移反応の温度は5〜50℃で行うのがよく、より好ましくは20〜50℃、さらにより好ましくは31〜50℃であるが、超臨界を保つためにその都度圧力を調整、例えば7.38MPa以上にする必要がある。当該反応の所要時間は、酵素量或いは反応温度により変動するが、おおむね2〜48時間である。反応後、内容物から水相(酵素を含む)を除去することによって本発明の目的物である多価不飽和脂肪酸を構成要素とするPSを得ることができる。なお、得られたPSを、溶剤分別、クロマト分画等の処理によりさらに高純度に精製することも可能である。
【0019】
レシチンはいかなる起源のものを用いてもよいが、アシル基を有するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールのうちの少なくとも一つを含むことが好ましい。用いる起源によっては、ホスファチジルセリンを元々含んでいる場合がある(例えば、下記実施例1のイカ由来のレシチン)。また、アシル基は不飽和結合の有無或いは炭素数は任意であるが、n−3系の多価不飽和脂肪酸残基を含むものが好ましい。このような脂肪酸とし、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等を例示でき、これらの1又は2種以上を含むものが好適である。かかるレシチンの原料としては大豆等の植物由来の物、鶏卵、マグロ、イカ等の海産物由来の物、海産物由来の組織(海産物組織)から常法により採取したレシチンを用いることができる。また、合成品のレシチンでもさしつかえない。目的とするホスファチジルセリンの構成脂肪酸としてドコサヘキサエン酸を必要とする場合は、イカ、マグロ等の海産物組織から得られるドコサヘキサエン酸を高濃度に含む構成脂肪酸残基を有するレシチンを用いるのが好ましい。
【0020】
セリンは、D−セリン又はL−セリンを使用できるが、ホスファチジル基転移の反応効率及び生体内活性の点からL−セリンが好ましい。
【0021】
ホスホリパーゼDは、キャベツ、米糠又は放線菌等から採取されるものを使用できる。とりわけストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物由来のホスホリパーゼDが好適であり、一般に市販されているものを用いてもよいが、ホスホリパーゼDを含む該微生物の培養液をそのまま反応に使用してもかまわない。
【0022】
水はイオン交換水、精製水又は蒸留水を用いるのが好ましく、これに酢酸等でpHを弱酸性に調整したものを使用するのが好ましい。例えば、pH4〜6の酢酸緩衝液或いは同様のpHのリン酸緩衝液とするのがより好ましい。塩化カルシウムを5〜100mM含む緩衝液を使用してもかまわない。
【0023】
本発明によれば、ホスホリパーゼDを用いるホスファチジル基転移反応において、水と水に溶解しないリン脂質とが、超臨界又は亜臨界二酸化炭素及び水を溶媒として反応することにより、レシチンが水中で反応しうる状態になる。
【0024】
このようにして得られたPSは脳機能改善効果を有する。PSによる脳機能改善効果のメカニズムは不明であるものの、多価不飽和脂肪酸の持つ効果が相乗され(投与期間が短くても効果がある)、従来製造されている、レシチン(ホスファチジルコリンなど)よりも優れた脳機能改善を有する。さらに、本発明に従う製造方法は安全性の点で懸念がなく、食品分野をはじめ各分野で利用可能な、生体機能性の高い多価不飽和脂肪酸を構成要素とするホスファチジルセリンを効率よく製造することができる。
【0025】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。また、以下の記載において、%は特に断らない限り、重量%を意味する。
【0026】
リン脂質の分析及び定量方法を示す。リン脂質の分析方法は、公知のアセトン沈殿法によりリン脂質組成物からリン脂質を分別し、該分別したリン脂質について、基準油脂分析試験法(日本油化学会制定)(社団法人 日本油化学会編集「基準油脂分析試験法」)に基づき、脂肪酸の組成のうちのDHA、EPAの量はガスクロマトグラフィーを用いて測定し、リン脂質中のホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等の量は薄層クロマトグラフィーを用いて分析した。
【0027】
本実施例で使用する超臨界装置として、インテリジェント超臨界CO2ポンプ SCF−Bpg型(日本分光株式会社製)、作動圧力プログラマブルバックプレッシャーレギュレータ SCF−Get型(同上)、晶析プログラム低温循環装置PCC−7000型(EYELA株式会社製)を用いた。
【実施例1】
【0028】
イカミールを定法で抽出し、該抽出物をアセトン分別して得たイカ由来のレシチン(ホスファチジルコリン:45.8%、ホスファチジルセリン:1.7%、構成脂肪酸のうちドコサヘキサエン酸:40.1%)0.1 g、並びにL−セリン 1.07 g、ホスホリパーゼD(名糖産業株式会社製、1,500U/g)6 mgを含む0.2M酢酸バッファー(pH 5.5)3 mlを反応槽(10ml)に入れ、炭酸ガス(純度99.95%以上)を反応槽に入れ(流速3ml/分)、圧力17.7 MPa、温度33℃の超臨界状態にし、その状態で6時間保った。その後、圧力を解放して二酸化炭素を除いた。内容物から水層(L−セリン及びホスホリパーゼDを含む)を除き、残部を分析したところ、ホスファチジルセリンの量は、残部に対して34.9%であった。下記参考例1の有機溶媒を用いた系と比較して同等の反応率でホスファチジルセリンが得られた。
【実施例2】
【0029】
実施例1と同じレシチン 0.2 g、並びにL−セリン 1.2 g、塩化カルシウム 17 mg、酢酸ナトリウム 55 mg、酢酸 6 μl、及びホスホリパーゼD 6 mgを含む精製水 2 mlを反応槽(10ml)に入れ、実施例1と同条件で超臨界状態にし、その状態で4時間保った。その後、圧力を解放して二酸化炭素を除いた。内容物から水層(L−セリン、ホスホリパーゼD等を含む)を除き、残部を分析したところ、ホスファチジルセリンの量は、残部に対して35.9%であった。下記参考例1の有機溶媒を用いた系と比較して同等の反応率でホスファチジルセリンが得られた。
【0030】
[参考例]
実施例1と同じレシチン 1.2 gを酢酸エチル 100 mlに溶解し、これにL−セリン12.8 gを0.2M酢酸バッファー(pH 5.5)40 mlに溶解したものを加え、ホスホリパーゼD 72mgを添加し、40℃で4時間攪拌した。その後、内容物から水層(ホスホリパーゼDを含む)を除き、残部を分析したところ、ホスファチジルセリンの量は、残部に対して35.1%であった。
【産業上の利用可能性】
【0031】
本発明の製造方法により製造されたホスファチジルセリンは、その製造過程において有機溶媒及び乳化剤、特に有機溶媒を使用していないことから食品用途をはじめとする各産業分野において安全性を懸念することなく使用することができる。
【出願人】 【識別番号】594072993
【氏名又は名称】日本化学飼料株式会社
【出願日】 平成18年11月10日(2006.11.10)
【代理人】 【識別番号】100085545
【弁理士】
【氏名又は名称】松井 光夫


【公開番号】 特開2008−118902(P2008−118902A)
【公開日】 平成20年5月29日(2008.5.29)
【出願番号】 特願2006−305787(P2006−305787)