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【発明の名称】 ピルビン酸の製造方法
【発明者】 【氏名】澤井 秀樹

【氏名】伊藤 世人

【氏名】山田 勝成

【氏名】耳塚 孝

【氏名】米原 徹

【要約】 【課題】簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法によるピルビン酸の製造方法を提供すること。

【構成】発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物であるピルビン酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に保持または還流する連続発酵方法であって、分離膜として、高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい多孔性膜を用い、低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵によるピルビン酸の生産効率を著しく向上させることが可能とな製造方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物もしくは培養細胞の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によりピルビン酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が0.01μm以上1μm未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を0.1から20kPaの範囲にして濾過処理することを特徴とするピルビン酸の製造方法。
【請求項2】
多孔性膜の純水透過係数が、2×10−9/m/s/pa以上6×10−7/m/s/pa以下である請求項1記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項3】
多孔性膜の平均細孔径が0.01μm以上0.2μm未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が0.1μm以下である請求項1または2記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項4】
多孔性膜の膜表面粗さが0.1μm以下である請求項1から3のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項5】
多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項1から4のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項6】
多孔性膜の素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項1から5のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項7】
ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵原料が糖類を含む請求項1から6のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項8】
ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項9】
真核細胞が酵母であることを特徴とする請求項8記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項10】
酵母がトルロプシス・グラブラータであることを特徴とする請求項9記載のピルビン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物もしくは細胞の培養方法の改良に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収することおよび未濾過液を発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得ることを特徴とする連続発酵によるピルビン酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく(1)バッチ発酵法(Batch発酵法)および流加発酵法(Fed−Batch発酵法)と、(2)連続発酵法とに分類することができる。
【0003】
上記(1)のバッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過と共に培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。一方、上記(2)の連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積されることを回避することによって、長時間にわたって高収率でかつ高生産性を維持することができるという利点がある(非特許文献1参照。)。
【0004】
次に、従来の発酵法によるピルビン酸の製造法について説明する。従来の発酵法によるピルビン酸の製造法としては、大腸菌等の細菌および酵母による発酵生産法について技術開示がなされているが、それらはいずれも回分式(バッチ式)の発酵生産に関わるもののみであり(特許文献1、特許文献2、非特許文献1および非特許文献2参照。)、連続発酵に関してはその前例は見あたらない。
【0005】
すなわち、連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から発酵生産物であるピルビン酸を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を発酵培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【特許文献1】特開2000−78996号公報
【特許文献2】特開平7-308795号公報
【非特許文献1】財団法人バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編、「発酵ハンドブック」、348−349、共立出版(2001)
【非特許文献2】Y. Li et. al. Appl. Microbiol. Biotechnol.(アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー),57,451−459(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで本発明における課題は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法によるピルビン酸の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、上記の課題を解決せんとするものであって、本発明のピルビン酸の製造方法は、ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物もしくは培養細胞の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によりピルビン酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が0.01μm以上1μm未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を0.1から20kPaの範囲にして濾過処理することを特徴とするピルビン酸の製造方法である。
【0008】
本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は2×10−9/m/s/pa以上6×10−7/m/s/pa以下である。
【0009】
本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は0.01μm以上0.2μm未満であり、かつ、その平均細孔径の標準偏差は0.1μm以下である。
【0010】
本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜の膜表面粗さは0.1μm以下である。
【0011】
本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜は多孔性樹脂層を含む多孔性膜である。
【0012】
本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜の素材はポリフッ化ビニリデン系樹脂である。
【0013】
本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記のピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵原料は類を含むものである。
【0014】
本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記のピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞は真核細胞であり、その真核細胞は酵母であり、その酵母はトルロプシス・グラブラータである。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して、濾液から発酵生産物であるピルビン酸を回収すると同時に、濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や培養細胞の濃度を向上、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を維持させることができ、それにより、所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物であるピルビン酸を低コストで安定して生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0016】
本発明は、ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物もしくは培養細胞の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によりピルビン酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が0.01μm以上1μm未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を0.1から20kPaの範囲にして濾過処理することを特徴とするピルビン酸の製造方法である。
【0017】
本発明において分離膜として用いられる多孔性膜について説明する。まず、多孔性膜の構成について説明する。本発明で用いられる多孔性膜は、好ましくは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
【0018】
多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
【0019】
本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【0020】
多孔質基材の平均厚みは、好ましくは50μm以上3000μm以下である。
【0021】
多孔質基材の材質は、有機材料および/または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
【0022】
また、多孔質樹脂層には、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が50重量%以上、好ましくは60重量%以上含有することをいう。
【0023】
有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【0024】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【0025】
本発明で使用される多孔性膜は、その平均細孔径が、0.01μm以上1μm未満であることが重要である。多孔性膜の平均細孔径が、0.01μm以上1μm未満であると、発酵に使用される微生物もしくは培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。また、多孔性膜の平均細孔径が、0.01μm以上1μm未満であると、微生物もしくは培養細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。
【0026】
多孔性膜の平均細孔径が、微生物もしくは培養細胞の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、多孔性膜の平均細孔径は1μm未満である。多孔性膜の平均細孔径は、微生物もしくは培養細胞の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物もしくは培養細胞の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物もしくは培養細胞のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として0.4μm以下が好ましく、0.2μm未満であればより好適に実施することができる。
【0027】
また、微生物もしくは培養細胞が目的とするピルピン酸以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物もしくは培養細胞の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの物質による多孔性膜の閉塞を回避するために、平均細孔径は0.1μm以下であることが好適である。
【0028】
一般的に、多孔性膜の平均細孔径は、0.4μm以下であることが好ましく、より好ましくは0.2μm未満あるいは0.1μm以下である。
【0029】
一方、平均細孔径が小さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、0.01μm以上である。多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは0.02μm以上であり、より好ましくは0.04μm以上である。
【0030】
ここで、平均細孔径は、倍率10,000倍の走査型電子顕微鏡観察における、9.2μm×10.4μmの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【0031】
本発明で用いられる多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、0.1μm以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の9.2μm×10.4μmの範囲内で観察できる細孔数をNとして、測定した各々の直径をXkとし、細孔直径の平均をX(ave)とした下記の(式1)により算出される。
【0032】
【数1】


【0033】
本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ1mで透水量を測定し算出したとき、2×10−9/m/s/pa以上であることが好ましく、純水透過係数が、2×10−9/m/s/pa以上6×10−7/m/s/pa以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【0034】
本発明で用いられる多孔性膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物もしくは培養細胞が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。多孔性膜の表面粗さは、0.1μm以下であることが好ましい。表面粗さが0.1μm以下であると、膜に付着した微生物もしくは培養細胞が剥がれやすい。
【0035】
さらに好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが0.1μm以下であり、平均細孔径が0.01μm以上1μm未満であり、多孔性膜の純水透過係数が2×10−9/m/s/pa以上の多孔性膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。多孔性膜の表面粗さを、0.1μm以下とすることにより、微生物もしくは培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、多孔性膜の表面粗さを、0.1μm以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、多孔性膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。多孔性膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、多孔性膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【0036】
ここで、多孔性膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置(AFM)を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments(株)製Nanoscope IIIa)
・条件 探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments(株)製)
走査モード コンタクトモード(気中測定)
水中タッピングモード(水中測定)
走査範囲 10μm、25μm四方(気中測定)
5μm、10μm四方(水中測定)
走査解像度 512×512
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに15分浸漬後、RO水中に24時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。RO水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜(RO膜)を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。RO膜の孔の大きさは、概ね2nm以下である。
【0037】
膜表面粗さdroughは、上記の原子間力顕微鏡装置(AFM)により各ポイントのZ軸方向の高さから、下記の(式2)により算出した。
【0038】
【数2】


【0039】
本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは20μm以上5000μm以下であり、より好ましくは50μm以上2000μm以下である。
【0040】
また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは200μm以上5000μm以下であり、膜厚は、好ましくは20μm以上2000μm以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【0041】
本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
【0042】
まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。
【0043】
多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。
【0044】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、5〜120℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、N−メチルピロリジノン(NMP)、N,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N − メチル− 2 − ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ − ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いN−メチルピロリジノン(NMP)、N,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)およびジメチルスルホキシド(DMSO)が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし2種類以上を混合して用いても良い。
【0045】
また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【0046】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【0047】
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要について説明する。
【0048】
中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【0049】
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を20重量%以上60重量%以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング(積層)することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【0050】
本発明で用いられる多孔性膜は、樹脂などの部材を用いて中空糸膜の中空部を接着・封止し、支持体に設置することによって分離膜エレメントとすることができる。すなわち、本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも分離膜エレメントの好ましい態様である。
【0051】
本発明のピルビン酸の製造方法においては、膜間差圧を0.1から20kPaの範囲で濾過処理することが重要である。発酵培養液を濾過するために、20kPaより高い膜間差圧で濾過処理すると、圧力を加えるための動力が必要であり、ピルビン酸を製造するときの経済効果が低下する。また、20kPaより高い膜間差圧を加えることによって微生物もしくは培養細胞が破砕される場合があり、ピルビン酸を生産する能力が低下する。本発明のピルビン酸の製造方法は、濾過圧力である膜間差圧が0.1から20kPaの範囲であり、水頭差により膜間差圧を得られることから、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がなく、ピルビン酸を生産する能力が低下しない。また、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、多孔性膜を発酵反応槽内部に設置する様態も可能となり、発酵装置がコンパクト化できる利点も挙げられる。本発明のピルビン酸の製造方法では、膜間差圧を、好ましくは0.1から5kPaの範囲で濾過処理する。
【0052】
本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物もしくは培養細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物であるピルビン酸を良好に生産させ得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好適である。
【0053】
炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類およびグリセリンなども使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。
【0054】
本発明で使用されるピルビン酸を製造する能力を有する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、ピルビン酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【0055】
本発明では、発酵培養液中の糖類濃度は5g/l以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の濾過よる糖類の流失を最小限にするためである。微生物もしくは培養細胞の培養は、通常、pHが4〜8で、温度が20〜40℃の範囲で行われる。発酵培養液のpHは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
【0056】
発酵培養液中への酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を21%以上に保つ、あるいは発酵培養液を加圧し発酵培養液への酸素の溶解度を高めることにより、酸素の供給速度を上げることができる。また、攪拌速度を上げること、あるいは通気量を上げることにより、発酵培養液と通気した気泡の界面面積を上げ溶解速度を高めることにより、酸素の供給速度を上げることができる。
【0057】
本発明においては、培養初期に回分培養または流加培養を行って、微生物もしくは培養細胞の濃度を高くした後に連続培養(引き抜き)を開始しても良いし、高濃度の微生物もしくは培養細胞をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料液には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。発酵培養液中の微生物もしくは培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物もしくは培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得る上で好ましく、一例として、乾燥重量を5g/L以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【0058】
ピルビン酸の発酵生産能力のあるフレッシュな微生物もしくは培養細胞を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、単一の発酵反応槽で行うことが培養管理上好ましい態様である。しかしながら、微生物もしくは培養細胞を増殖しつつピルビン酸を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行ってもピルビン酸の高生産性は得られる。
【0059】
本発明で使用されるピルビン酸の生産能力を有する微生物もしくは培養細胞としては、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物もしくは培養細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【0060】
ピルビン酸の生産に用いることができる微生物もしくは培養細胞としては、シュードモナス属(Genus Pseudomonas)、コリネバクテリウム属(Genus Corynebacterium)、エシェリシア属(Genus Escherichia)、アシネトバクター属(Genus Acinetobacter)に属する細菌を好ましく用いることができる。さらに好ましくは、シュードモナス・フルオレエセンス(Pseudomonas fuluorescens)、シュードモナス・アエロギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびエシェリシア・コリ(Escherichia coli)などの細菌を用いることができる。これらの細菌を、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変したものを用いてもよい。例えば、酸化的リン酸化によるATP生産に直接関与するATPase遺伝子を、変異または欠失させた細菌も好ましく用いられる。
【0061】
また、ピルビン酸の生産に用いることができる微生物もしくは培養細胞としては、真核細胞を用いることができる。真核細胞としては、カビや酵母なども好ましく用いることができる。例えば、サッカロミセス属(Genus Saccharomyces)、トルロプシス属(Genus Toluropusis)、カンジダ属(Genus Candida)およびシゾフィリウム属(Genus Schizophyllum)に属するカビや酵母を用いて、ピルビン酸を製造することができる。さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・コプシス(Saccharomyces copsis)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・リポリチカ(Candida lipolytica)、トルロプシス・グラブラータ(Toluropusis glabrata)およびシゾフィリウム・コムネ(Schizophyllum commune)などのカビや酵母を用いて、ピルビン酸を製造することができる。これらのうち、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、トルロプシス・グラブラータ(Toluropusis glabrata)を好適に用いることができる。
【0062】
本発明のピルビン酸の製造方法によって得られた濾過・分離発酵液に含まれるピルビン酸の精製は、陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことができる。例えば、特開平6−345683号公報に示されている弱塩性イオン交換体を用いた精製法を好適に用いることができる。
【0063】
次に、本発明で用いられる連続発酵装置の構成および特徴について説明する。本発明で用いられる連続発酵装置は、ピルビン酸の生産能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によるピルビン酸を製造するための装置である。
【0064】
本発明で用いられる連続発酵装置は、ピルビン酸の生産能力を有する微生物もしくは培養細胞を発酵培養させるための発酵反応槽を有するものである。
【0065】
本発明で用いられる連続発酵装置のひとつの形態は、発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、その分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を0.1から20kPaの範囲に制御するための手段とからなり、その該分離膜として平均細孔径0.01μm以上1μm未満の細孔を有する多孔性膜が用いられる。
【0066】
本発明で用いられる連続発酵装置の別の形態は、発酵反応槽と、その発酵反応槽に発酵培養液循環手段を介して接続され内部に分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための膜分離槽と、その分離膜の膜間差圧を0.1から20kPaの範囲に制御する手段とからなり、その分離膜として平均細孔径0.01μm以上1μm未満の多孔性膜が用いられる。
【0067】
次に、本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置について、図面を用いて説明する。
【0068】
図1は、本発明で用いられる連続発酵装置の例を説明するための概要側面図である。本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図1の概要図に示す。
【0069】
図1において、連続発酵装置は、内部に分離膜エレメント2を備えた発酵反応槽1と水頭差制御装置3で基本的に構成されている。発酵反応槽1内の分離膜エレメント2には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜と分離膜エレメントとしては、例えば、国際公開第2002/064240号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【0070】
次に、図1の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ7によって、培地を発酵反応槽1に連続的もしくは断続的に投入する。培地は、投入前に必要に応じて、加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽1内の攪拌機5で発酵反応槽1内の発酵培養液を攪拌することができる。発酵生産時には、必要に応じて、気体供給装置4によって必要とする気体を発酵反応槽1内に供給することができる。発酵生産時は、必要に応じて、pHセンサ・制御装置9およびpH調整溶液供給ポンプ8によって発酵反応槽1内の発酵液のpHを調整し、必要に応じて、温度調節器10によって発酵反応槽1内の発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【0071】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、pHおよび温度を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やORPの制御、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により、発酵液中のピルビン酸の濃度を測定し、発酵培養液中のピルビン酸の濃度を指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入は、好ましくは、上記計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【0072】
図1において、発酵培養液は、発酵反応槽1内に設置された分離膜エレメント2によって、微生物と発酵生産物が濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物が装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント2による濾過・分離は発酵反応槽1の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ6および水頭差圧制御装置3によって、分離膜エレメント2の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽1内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメントによる濾過・分離には、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽(図示せず)で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽1内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、その培養液を必要に応じて発酵反応槽1内に供給することにより、常にフレッシュでピルビン酸の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【0073】
図2は、本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概要側面図である。図2は、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された連続発酵装置の代表的な例である。
【0074】
図2において、連続発酵装置は、発酵反応槽1と、分離膜エレメント2を備えた膜分離層12と、水頭差制御装置3とで基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント2には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性と膜分離膜エレメントとしては、例えば、国際公開第2002/064240号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することが好適である。また、膜分離槽12は、発酵培養液循環ポンプ11を介して発酵反応槽1に接続されている。
【0075】
図2において、培地供給ポンプ7によって培地を発酵反応槽1に投入し、必要に応じて、攪拌機5で発酵反応槽1内の発酵培養液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装置4によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置4で供給することができる。また必要に応じて、pHセンサ・制御装置9およびよびpH調整溶液供給ポンプ8によって発酵液のpHを調整し、また必要に応じて、温度調節器10によって発酵液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ11によって発酵反応槽1と膜分離槽12の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント2によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。
【0076】
ここで、分離膜エレメント2による濾過・分離は、膜分離槽12の水面との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力を必要としない。必要に応じて、レベルセンサ6および水頭差圧制御装置3によって、分離膜エレメント2の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。必要に応じて、気体供給装置4によって必要とする気体を膜分離槽12内に供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置4で膜分離槽12内に供給することができる。
【0077】
分離膜エレメント2による濾過・分離は、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽(図示せず)で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、得られた培養液を必要に応じて発酵槽内に供給することにより、常にフレッシュでピルビン酸の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【0078】
次に、本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置で、好ましく用いられる分離膜エレメントについて説明する。
【0079】
図3に示す分離膜エレメントについて説明する。図3は、本発明で用いられる分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、好ましくは、国際公開第2002/064240号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを用いることができる。分離膜エレメントは、図3に示されるように、剛性を有する支持板13の両面に、流路材14と前記の分離膜15(多孔性膜)をこの順序で配し構成されている。支持板13は、両面に凹部16を有している。分離膜15は、発酵培養液を濾過する。流路材14は、分離膜15で濾過された透過水を効率よく支持板13に流すためのものである。支持板13に流れた透過水は、支持板13の凹部16を通り、集水パイプ17を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【0080】
図4に示す分離膜エレメントについて説明する。図4は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図4に示すように、中空糸膜(多孔性膜)で構成された分離膜束18と上部樹脂封止層19と下部樹脂封止層20によって主に構成される。分離膜束18は、上部樹脂封止層19および下部樹脂封止層20よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層20による接着・固定化は、分離膜束18の中空糸膜(多孔性膜)の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層19は、分離膜束18の中空糸膜(多孔性膜)の内孔を封止しておらず、集水パイプ22に透過水が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム21を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束18によって濾過された透過水は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ22を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【0081】
本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、121℃で15分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、PVDF、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【0082】
本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは、図1のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図2のように発酵反応槽外に設置しても良い。分離膜エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を発酵培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵培養液を連続的に濾過することができる。
【0083】
本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【0084】
本発明のピルビン酸の製造方法に従って、ピルビン酸の連続発酵生産を行った場合、従来のバッチ発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の(式3)で計算される。
・発酵生産速度(g/L/hr)=抜き取り液中の生産物濃度(g/L)×発酵培養液抜き取り速度(L/hr)÷装置の運転液量(L) ・・・・(式3)
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量(g)を、炭素源の消費に要した時間(h)とその時点の培養液量(L)で除して求められる。
【実施例】
【0085】
以下、本発明のピルビン酸の製造方法をさらに具体的に説明するために、図1および図2の概要図に示す連続発酵装置を用いることによる連続的なピルビン酸の発酵生産について、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。また、下記に示すピルビン酸の製造に関する実施例においては、ピルビン酸を生産させる微生物として、酵母トルロプシス・グラブラータ(Torulopsis glabrata)のうち、トルロプシス・グラブラータP120−5a株(FERM P−16745)とNBRC0005株を用いた。
【0086】
(参考例1)多孔性膜の作製(その1)
樹脂としてポリフッ化ビニリデン(PVDF)樹脂を、また溶媒としてN,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)をそれぞれ用い、これらを90℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
[原液]
・PVDF:13.0重量%
・DMAc:87.0重量%
次に、上記の原液を25℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が0.48g/cm3で、厚みが220μmのポリエステル繊維製不織布(多孔質基材)に塗布し、直ちに下記組成を有する25℃の温度の凝固浴中に5分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
[凝固浴]
・水 :30.0重量%
・DMAc:70.0重量%
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、80℃の温度の熱水に3回浸漬してDMAcを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の9.2μm×10.4μmの範囲内を、倍率10,000倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は0.1μmであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、50×10-93/m2/s/Paであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ1mで行った。また、平均細孔径の標準偏差は0.035μmで、膜表面粗さは0.06μmであった。
【0087】
(参考例2)多孔性膜の作製(その2)
重量平均分子量41.7万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ38重量%と62重量%の割合で170℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度20℃のγ-ブチロラクトン80重量%水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【0088】
次いで、重量平均分子量28.4万のフッ化ビニリデンホモポリマーを14重量%、セルロースアセテートプロピオネート(イーストマンケミカル社、CAP482−0.5)を1重量%、N-メチル-2-ピロリドンを77重量%、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン(三洋化成株式会社、商品名イオネットT−20C)を5重量%、および水を3重量%の割合で95℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸多孔性膜を製作した。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、0.05μmであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、5.5×10-93/m2・s・Paであった。透水量の測定は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ1mで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は0.006μmであった。
【0089】
(実施例1)連続発酵によるピルビン酸の製造(その1)
微生物もしくは培養細胞としてP120−5a株を用い、発酵培地として表1に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、図1に示す連続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。図1の連続発酵装置は、本発明の一実施の形態を示す概要図であり、本発明で用いられる連続発酵装置はこの形態になんら限定されるものではない。また、上記のピルビン酸発酵培地は、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例1で作成したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例1における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
[運転条件]
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:1.5(L/min)
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・pH調整:4N NaOHによりpHを5.5に調整した。
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て121℃の温度で20分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御(0.1kPa以上20kPa以下で制御)。
【0090】
また、ピルビン酸の濃度の評価には、下記に示す条件でHPLC法により測定した。
・カラム:Shim-Pack SPR-H(島津社製)
・移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
・反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
・検出方法:電気伝導度
・温度:45℃。
【0091】
また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬社製)を用いた。
【0092】
【表1】


【0093】
まず、P120−5a株を、試験管で5mlのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した(前々々培養)。得られた培養液を、新鮮なピルビン酸発酵培地100mlに植菌し、500ml容坂口フラスコで24時間、30℃の温度で振とう培養した(前々培養)。前々培養液を、図1に示した連続発酵装置の1.5Lのピルビン酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽1を付属の攪拌機5によって800rpmで攪拌し、発酵反応槽1の通気量の調整、温度調整およびpH調整を行い、24時間培養を行った(前培養)。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を1.5Lとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置3により、膜間差圧として0.1kPa以上20kPa以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、そのピルビン酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表2に示す。
【0094】
(実施例2) 連続発酵によるピルビン酸の製造(その2)
微生物もしくは培養細胞としてP120−5a株を用い、表1に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、図2に示す連続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。図2の連続発酵装置は本発明の一実施の形態を示す概要図であり、本発明で用いられる連続発酵装置はこの形態になんら限定されるものではない。発酵培地は、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例2で作成したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例2における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
[運転条件]
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・膜分離槽容量:0.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:4000平方cm
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:1.5(L/min)
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・pH調整:4N NaOHによりpHを5.5に調整した。
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て121℃の温度で20分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御(0.1kPa以上20kPa以下で制御)。
【0095】
ピルビン酸およびグルコース濃度は、実施例1と同様の方法を用いて評価した。まず、P120−5a株を、試験管で5mlのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した(前々々培養)。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地100mlに植菌し、500ml容坂口フラスコで24時間、30℃の温度で振とう培養した(前々培養)。前々培養液を、図1に示した連続発酵装置の1.5Lのピルビン酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽1を付属の攪拌機5によって800rpmで攪拌し、発酵反応槽1の通気量の調整、温度調整およびpH調整を行い、24時間培養を行った(前培養)。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を1.5Lとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置3により、膜間差圧として0.1kPa以上20kPa以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、そのピルビン酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表2に示す。
【0096】
(比較例1)バッチ発酵によるピルビン酸の製造(その1)
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を、2L容のジャーファーメンターを用いて行い、そのピルビン酸生産性を評価した。発酵培地は、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例1では、微生物としてP120−5a株を用い、生産物であるピルビン酸の濃度の評価には、実施例1に示したHPLCを用いて評価し、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーC”(登録商標)(和光純薬社製)を用いた。比較例1の運転条件を、次に示す。
[運転条件]
・発酵反応槽容量(ピルビン酸発酵培地量):1.5(L)
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:1.5(L/min)
・発酵反応槽攪拌速度:600(rpm)
・pH調整:4N NaOHによりpHを5.5に調整した。
【0097】
まず、P120−5a株を、試験管で5mlのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した(前々培養)。前々培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地50mlに植菌し、500ml容坂口フラスコで24時間振とう培養した(前培養)。前培養液をジャーファーメンターの1.5Lのピルビン酸発酵培地に植菌し、バッチ発酵を行った。バッチ発酵の結果を、実施例1と実施例2の連続発酵試験で得られたピルビン酸発酵生産性と比較して、表2に示す。
【0098】
【表2】


【0099】
これら比較の結果、図1および図2に示す連続発酵装置を用いることにより、ピルビン酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液からピルビン酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるピルビン酸の製造が可能であることが明らかとなった。
【0100】
(実施例3)連続発酵によるピルビン酸の製造(その3)
微生物としてNBRC0005株を用い、実施例1と同じ培養培地、同じ条件および同じ評価法により、図1の連続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置3により、膜間差圧として0.1kPa以上20kPa以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、そのピルビン酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表3に示す。
【0101】
(実施例4) 連続発酵によるピルビン酸の製造(その4)
微生物としてNBRC0005株を用い、実施例2と同じ培養培地、同じ条件および同じ評価法により、図2の連続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置3により、膜間差圧として0.1kPa以上20kPa以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、そのピルビン酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表3に示す。
【0102】
(比較例2)バッチ発酵によるピルビン酸の製造(その2)
この比較例2では、微生物としてNBRC0005株を用い、その他条件はすべて比較例1に準じて行った。比較例2のバッチ発酵の結果を、実施例3および実施例4の連続発酵試験で得られたピルビン酸発酵生産性をと比較して、表3に示す。
【0103】
【表3】


【0104】
これら比較の結果、図1および図2の連続発酵装置を用いることにより、ピルビン酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液からピルビン酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるピルビン酸の製造が可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0105】
本発明のピルビン酸の製造方法は、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して、濾液から発酵生産物であるピルビン酸を回収すると同時に、濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や培養細胞の濃度を向上、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を維持させることができる製造方法である。そのため、所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能であり、広く発酵工業において、発酵生産物であるピルビン酸を低コストで安定して生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【0106】

【図1】図1は、本発明で用いられる連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。
【図2】図2は、本発明で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。
【図3】図3は、本発明で用いられる分離膜エレメントの例を説明するための概略斜視図である。
【図4】図4は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面説明図である。
【符号の説明】
【0107】
1 発酵反応槽
2 分離膜エレメント
3 水頭差制御装置
4 気体供給装置
5 攪拌機
6 レベルセンサ
7 培地供給ポンプ
8 pH調整溶液供給ポンプ
9 pHセンサ・制御装置
10 温度調節器
11 発酵培養液循環ポンプ
12 膜分離槽
13 支持板
14 流路材
15 分離膜
16 凹部
17 集水パイプ
18 分離膜束
19 上部樹脂封止層
20 下部樹脂封止層
21 支持フレーム
22 集水パイプ
【出願人】 【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
【出願日】 平成19年6月7日(2007.6.7)
【代理人】
【公開番号】 特開2008−17837(P2008−17837A)
【公開日】 平成20年1月31日(2008.1.31)
【出願番号】 特願2007−151250(P2007−151250)