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【発明の名称】 シチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸およびN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法
【発明者】 【氏名】甲斐田 みどり

【氏名】木村 豪秀

【氏名】米谷 良之

【要約】 【課題】効率的なシチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸およびN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法を提供する。

【構成】以下の(1)(2)より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、CTPおよびN‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐N‐アセチルノイラミン酸(CMP‐NeuAc)を生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP‐NeuAcを採取することを特徴とするCMP‐NeuAcの製造法を提供することができる。(1) 特定のアミノ酸配列を有するCMP‐NeuAcシンターゼ(2)特定の塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン‐5’‐三リン酸(以下、CTPと略す)またはCTP前駆物質(I)およびN‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシチジン‐5’‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸(以下、CMP-NeuAcと略す)を生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP-NeuAcを採取することを特徴とするCMP-NeuAcの製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項2】
CTPまたはCTP前駆物質(I)が、CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびCTP前駆物質(II)を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCTPまたはCTP前駆物質(I)を生成、蓄積させて得られるCTPまたはCTP前駆物質(I)である、請求項1に記載のCMP-NeuAcの製造法。
【請求項3】
N‐アセチルノイラミン酸が、N‐アセチルグルコサミン-2‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させて得られるN-アセチルノイラミン酸である、請求項1または2に記載のCMP-NeuAcの製造法。
【請求項4】
N-アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N-アセチルノイラミン酸シンターゼおよび以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、およびCTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、CTP前駆物質(II)、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP-NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP-NeuAcを採取することを特徴とする、CMP-NeuAcの製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項5】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質を生産する能力およびCTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を持っている1つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、CTP前駆物質(I)およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP‐NeuAcを採取することを特徴とする、CMP‐NeuAcの製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項6】
シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、請求項1から5のいずれかの方法で製造されたCMP-NeuAcおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
【請求項7】
以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N-アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とするN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【請求項8】
N‐アセチルノイラミン酸が、N‐アセチルグルコサミン-2‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることによって得られたものである、請求項7記載のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
【請求項9】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を持っている1つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、N‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN-アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、シチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸合成酵素活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたシチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸の製造法、およびN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に関する。
【背景技術】
【0002】
シチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸(以下CMP‐NeuAcと略す)の製造法としては、CTPとN‐アセチルノイラミン酸から、精製したCMP‐NeuAcシンターゼによる酵素反応で製造する方法(非特許文献1)がよく知られているが、酵素の精製工程は複雑で費用もかかるため、工業生産には適さない。
精製酵素を用いずにCMP‐NeuAcを製造する方法としては、CTP前駆物質とN‐アセチルノイラミン酸を原料として、CMP‐NeuAcシンターゼを生産する微生物菌体を用いる方法(特許文献1)がある。この方法では、微生物本来の代謝活性を利用してオロット酸等の安価な原料からCTPを供給するが、この方法で用いられている大腸菌由来のCMP‐NeuAcシンターゼの反応至適pHは塩基性側にあることが明らかになっており(非特許文献2)、微生物菌体の代謝活性を利用するのに適した中性条件で、より効率的にCMP‐NeuAcを合成する酵素の取得が求められている。
【0003】
またシチジン‐5´‐一リン酸(以下CMPと略す)とN‐アセチルノイラミン酸またはN‐アセチルグルコサミンを原料として、CMP‐NeuAcシンターゼを発現する微生物菌体と酵母菌体を用いてCMP‐NeuAcを製造する方法も知られている(非特許文献2)。この方法は、高価なCMPと酵母菌体とを組み合わせて使わなくてはならず、より安価で効率的なCMP‐NeuAcの製造方法が求められている。
【0004】
パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)のpm0187で表されるORFは、クローニングがされており、該ORFにコードされる蛋白質を大腸菌を宿主細胞として発現させ、CMP−NeuAcシンターゼ活性を有することが確認されている(非特許文献3)。
【特許文献1】国際公開特許第98‐12343号パンフレット
【特許文献2】国際公開特許第04‐009830号パンフレット
【非特許文献1】Appl. Microbiol. Biotechnol., 44, 59-67(1995)
【非特許文献2】J. Biol. Chem., 262, 17556-17562 (1987)
【非特許文献3】INFECT. IMMUN., 73, 1284-1294(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、シチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸合成酵素活性を生産する能力を有する微生物を用いたシチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸の製造法、および該微生物を用いたN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は以下の[1]〜[9]に関する。
[1] 以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン‐5´‐三リン酸(以下、CTPと略す)またはCTP前駆物質(I)およびN‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸(以下、CMP−NeuAcと略す)を生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP−NeuAcを採取することを特徴とするCMP−NeuAcの製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
[2] CTPまたはCTP前駆物質(I)が、CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびCTP前駆物質(II)を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCTPまたはCTP前駆物質(I)を生成、蓄積させて得られるCTPまたはCTP前駆物質(I)である、請求項1に記載のCMP−NeuAcの製造法。
【0007】
[3] N‐アセチルノイラミン酸が、N‐アセチルグルコサミン-2‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させて得られるN‐アセチルノイラミン酸である、請求項1または2に記載のCMP−NeuAcの製造法。
[4] N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物、およびCTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、CTP前駆物質(II)、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP−NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP−NeuAcを採取することを特徴とする、CMP−NeuAcの製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
[5] N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質を生産する能力およびCTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を持っている1つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、CTP前駆物質(I)およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中からCMP‐NeuAcを採取することを特徴とする、CMP‐NeuAcの製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
[6] シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、請求項1から5のいずれかの方法で製造されたCMP‐NeuAcおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
[7] 以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N-アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とするN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
[8] N‐アセチルノイラミン酸が、N‐アセチルグルコサミン-2‐エピメラーゼとN‐アセチルノイラミン酸シンターゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることによって得られたものである、請求項7に記載のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
[9] N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、以下の(1)〜(5)より選ばれる蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を持っている1つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、N‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することを特徴とする、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法。
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP-NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
【発明の効果】
【0008】
本発明により、安価で効率的にシチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸およびN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0009】
本発明で用いる微生物が生産するCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質としては、
(1)配列番号1に表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1に表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(3)配列番号1に表されるアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
(4)配列番号2に表される塩基配列を有するDNAにコードされる蛋白質
(5)配列番号2に表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされ、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質
をあげることができる。
【0010】
1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(以下、モレキュラー・クローニング第2版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【0011】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、1個から数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
また、上記の配列番号1で表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどがあげられる。
【0012】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
また、上記の1以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質がCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有するためには、配列番号1記載のアミノ酸配列と、少なくとも80%以上、通常は90%以上、特に95%以上、さらには98%の同一性を有していることが好ましい。
【0013】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている(J. Mol. Biol., 215, 403(1990))。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【0014】
また、本発明で用いられるCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAとしては、配列番号2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつCMP‐NeuAcシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAをあげることができる。
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるDNAである。プローブとして用いられるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAをあげることができる。
【0015】
DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第2版、第3版(2001年)、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press(1994)、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従って行うことができる。
【0016】
上記のストリンジェントな条件とは、DNAを固定化したフィルターとプローブ、好ましくはプローブDNAとを50%ホルムアミド、5×SSC(750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム)、50mmol/lのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整(ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる)、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE(20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4)、0.5%のSDS、30%のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1%SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度(例えば5×SSC)の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【0017】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメーター等に基づいて計算したときに、配列番号2で表される塩基配列と少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
【0018】
配列番号2で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、CMP‐NeuAcシンセターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAであることは、例えば以下に記載した方法により、遺伝子組換え法を用いて該DNAにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
【0019】
本発明のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するシアリルトランスフェラーゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来の蛋白質がよい。具体的にはパスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida) PM70株 由来のα-2,3-sialyltransferase (WO03/27297)、Photobacterium damselae JT0160株由来のα-2,6-sialyltransferase (GenBank ACCESSION No. BAA25316)などがあげられる。
【0020】
本発明のCMP‐NeuAcおよびN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するN‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来のものがよい。具体的にはSynechocystis sp. PCC6803株(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria, INSTITUTE PASTEUR)由来のN‐アセチルグルコサミン‐2−エピメラーゼ(WO00/47730)があげられる。
【0021】
本発明のCMP‐NeuAcおよびN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に使用するN‐アセチルノイラミン酸シンターゼは、微生物が活性のある蛋白質として生産することができる蛋白質であればよく、好ましくは細菌等の原核生物または酵母、特に好ましくは原核生物由来のN‐アセチルノイラミン酸シンターゼがよい。具体的にはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli) K1株由来のN‐アセチルノイラミン酸シンターゼ(GenBank ACCESSION No. AAC43302)があげられる。
[A]CMP−NeuAcの製造
(1)CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の作製
本発明の方法で使用するCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、上記した本発明で使用するCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば特に限定されず、該微生物としては、人為的な操作を行わなくても該CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有している微生物と、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換された微生物があげられる。
【0022】
人為的な操作を行わなくともCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、パスツレラ属に属する微生物、例えばPasteurella multocida PM70株(ミネソタ大学より分譲可能)があげられる。
上記した本発明で使用するCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換された微生物としては、例えば配列番号2で表される塩基配列を有するDNAを適当な発現ベクターに挿入した組換え体DNAで形質転換された微生物、配列番号2で表される塩基配列を有するDNAを染色体上に挿入された微生物があげられる。
【0023】
1)CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA断片の取得
上記した本発明で使用するCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAは、該蛋白質を生産する生物の染色体DNA等からのクローニング、または該蛋白質をコードするDNAをDNA合成機等を用いて合成することによって取得することができるが、例えば、配列番号2で表される塩基配列を有するDNAは、以下のようにして取得することができる。
【0024】
配列番号2で表される塩基配列を有するDNAは、パスツレラ属の微生物より調製することができる。パスツレラ属に属する微生物としては、例えばPasteurella multocida をあげることができ、具体的にはPasteurella multocida PM70株(ミネソタ大学より分譲可能)をあげることができる。
Pasteurella multocidaに属する微生物を公知の方法(例えば、FEMS Microbiol. Lett., 166, 289 (1998))により培養し、培養後、公知の方法(例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法)により、該微生物のゲノムDNAを単離精製することにより、該微生物のゲノムDNAを取得することができる。
【0025】
配列番号2で表される塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ゲノムDNAを鋳型として、PCR法(PCR Protocols, Academic Press (1990))により配列番号2で表される塩基配列を有するDNA断片を取得することができる。
また、配列番号2の塩基配列に基づいて設計された合成DNAをプローブとしたハイブリダイゼーション法などにより目的とするDNAを取得することもできる。
【0026】
取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977))あるいはABI377(アプライド・バイオシステムズ ジャパン社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
【0027】
上記の取得されたDNAを組み込むベクターとしては、pBluescript KS(+)(ストラタジーン社製)、pDIRECT(Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990))、pCR-Script Amp SK(+)(ストラタジーン社製)、pT7Blue(ノバジェン社製)、pCR II(インビトロジェン社製)およびpCR-TRAP(ジーンハンター社製)などをあげることができる。
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。
【0028】
2)CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の作製
CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記1)に記載の方法により取得したDNAを宿主細胞中に導入することにより取得することができる。
【0029】
上記1)で得られるDNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。
【0030】
該組換え体DNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の製造法で用いる形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明の製造法に用いられるDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【0031】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、CMP−NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA(以下、CMP−NeuAcシンターゼをコードするDNAとも言う)を含有する組換え体DNAは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、CMP−NeuAcシンターゼをコードするDNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【0032】
発現ベクターとしては、pHelix1(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)、pKK233-2(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)、pSE280(インビトロジェン社製)、pGEMEX-1(プロメガ社製)、pQE-8(キアゲン社製)、pET-3(ノバジェン社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200(Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984))、pLSA1(Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989))、pGEL1(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985))、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)(ストラタジーン社製)、pTrS30(大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製)、pTrS32(大腸菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製)、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19(Gene, 33, 103 (1985))、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118(タカラバイオ社製)、pPA1(特開昭63-233798)等を例示することができる。
【0033】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター(Ptrp)、lacプロモーター(Plac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またPtrpを2つ直列させたプロモーター(Ptrp ×2)、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【0034】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離(例えば6〜18塩基)に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
組換え体DNAには、CMP−NeuAcシンターゼをコードするDNAを発現させるための転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【0035】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli NM522、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli HN0074 (FERM BP-4425)、Serratia ficariaSerratia fonticolaSerratia liquefaciensSerratia marcescensBacillus subtilisBacillus amyloliquefaciensBrevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenesCorynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
【0036】
組換え体DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972))、プロトプラスト法(特開昭63-248394)、エレクトロポレーション法(Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988))等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を用いることができる。
【0037】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiaeSchizosaccharomyces pombeKluyveromyces lactisTrichosporon pullulansSchwanniomyces alluviusPichia pastorisCandida utilis等をあげることができる。
【0038】
組換え体DNAの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法(Methods Enzymol., 194, 182 (1990))、スフェロプラスト法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984))、酢酸リチウム法(J. Bacteriol., 153, 163 (1983))等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pCDM8、pREP4(以上、インビトロジェン社)、pAGE107(特開平3-22979)、pAS3-3(特開平2-227075)、pAGE103(J. Biochem., 101, 1307 (1987))、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。
【0039】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【0040】
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ(Namalwa)細胞またはNamalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637(特開昭63-299)等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC: CRL-1573)等、ヒト白血病細胞としては、BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。
【0041】
組換え体DNAの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法(Cytotechnology, 3, 133 (1990))、リン酸カルシウム法(特開平2-227075)、リポフェクション法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987))、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。
【0042】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
【0043】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(ともにインビトロジェン社製)等をあげることができる。
【0044】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
【0045】
Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21(バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル)等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4(インビトロジェン社製)等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2-227075)、リポフェクション法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987))等をあげることができる。
【0046】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Tiプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター等をあげることができる。
【0047】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)(特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977)、エレクトロポレーション法(特開昭60-251887)、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(特許第2606856、特許第2517813)等をあげることができる。
【0048】
また特に、本発明のCMP‐NeuAcの製造法およびN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法には、N‐アセチルノイラミン酸の分解活性が低下した微生物細胞を用いるのが好ましい。そのような微生物としては、例えばN‐アセチルノイラミン酸リアーゼ活性が低下した微生物をあげることができ、具体的には、Escherichia coli NAN8-71 (FERM BP-7908, WO03/72783)をあげることができる。
【0049】
また、公知の方法によりCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAを微生物の染色体に挿入することにより(J. Bacteriol., 180, 2063 (1998))、本発明の製造法で用いる微生物を作製することができる。
(2)CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物の調製
本発明の製造法に用いられるCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【0050】
CMP−NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有するエシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【0051】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【0052】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【0053】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【0054】
CMP−NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地(J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967))、EagleのMEM培地(Science, 122, 501 (1952))、DMEM培地(Virology, 8, 396 (1959))、199培地(Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950))またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
【0055】
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5%CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
CMP−NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する昆虫細胞を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地(ライフ・テクノロジーズ社製)、ExCell400、ExCell405(いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製)、Grace's Insect Medium(Nature, 195, 788 (1962))等を用いることができる。
【0056】
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
CMP−NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する植物細胞は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
【0057】
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
(3)CMP‐NeuAcの製造
1)CMP‐NeuAcの製造1
上記(2)の培養により得られた微生物の培養物および該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、CTPまたはCTP前駆物質(I)およびN‐アセチルノイラミン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐NeuAcを生成、蓄積させ、該水性媒体中にCMP‐NeuAcを製造することができる。
【0058】
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物あるいは該菌体の固定化物など、細胞の状態を維持し、上記した微生物の培養物と実質的に同一の活性を有している培養物の処理物が用いられる。
【0059】
CTP前駆物質(I)としては、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物が代謝してCTPに変換できる物質であればいずれでもよく、好ましくは、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、ウリジン‐5´‐一リン酸(以下UMPと略す)、ウリジン‐5´‐三リン酸(以下UTPと略す)およびCMPをあげることができ、微生物が大腸菌の場合は、シチジン、UTPおよびCMP、好ましくはCMPをあげることができる。
【0060】
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
CMP‐NeuAcの生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン(例えばナイミーンS-215、日本油脂社製)などの非イオン系界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド(例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製)などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン(例えば三級アミンFB、日本油脂社製)などの三級アミン類など、CMP‐NeuAcの生成を促進するものであればいずれでもよく、1種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常0.1〜50 g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用いられる。
【0061】
CMP‐NeuAcの生成反応は水性媒体中、pH 5〜7.5、好ましくはpH 6.5〜7.5、20〜50℃の条件で1〜96時間行う。該生成反応において、必要に応じてMnCl2、MgCl2、MgSO等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
CMP‐NeuAcの製造に用いられるCTPまたはCTP前駆物質(I)は、CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体およびCTP前駆物質(II)を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCTPまたはCTP前駆物質(I)を生成、蓄積させることによっても得ることができる。
【0062】
CTP前駆物質(II)としては、原核生物が代謝してCTPまたはCTP前駆物質(I)に変換できる物質であればいずれでもよく、好ましくはオロット酸、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、CMP、UTPおよびUMPをあげることができ、より好ましくはオロット酸およびCMP、さらに好ましくはオロット酸をあげることができる。
【0063】
CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物としては、該能力を有する原核生物であれば特に制限はないが、好ましくはコリネバクテリウム属に属する原核生物、より好ましくはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)を用いるのがよい。
CMP‐NeuAcの製造に用いるCTPまたはCTP前駆物質(I)は特に制限はなく、市販のCTPまたはCTP前駆物質(I)を用いてもよいし、予め上記の方法で媒体中に生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたCTPまたはCTP前駆物質(I)を用いてもよい。また、CTPまたはCTP前駆物質(I)が生成、蓄積した上記の媒体をそのままCTPまたはCTP前駆物質(I)として用いることもできる。さらにCMP‐NeuAcを生成する反応とCTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する反応を同一媒体中で同時に行うことにより、同一水性媒体中でCTPまたはCTP前駆物質(I)を生成させるとともに、CMP‐NeuAcを生産することもできる。
【0064】
CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養は(1)に記載の形質転換体の培養と同様の方法で行うことができる。
CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の処理物としては、前記した培養物の処理物と同じものをあげることができる。
CMP‐NeuAcの製造に用いるCTP、CTP前駆物質(I)および(II)は、1mmol/l〜1mol/lの範囲で用いる。
【0065】
CMP‐NeuAcの製造に用いるエネルギー供与体としては、微生物または原核生物が代謝することができ、かつアデノシン‐5´‐三リン酸(以下ATPと略す)などのエネルギー物質を生産させることができる物質であればいずれでもよく、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、N‐アセチルノイラミン酸等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができる。
【0066】
CMP‐NeuAcの製造に用いるエネルギー供与体はいずれも、5mol/l以下で用いることが好ましい。
CMP‐NeuAcの製造に用いるN‐アセチルノイラミン酸としては、市販品または微生物を用いて製造されたものなどいずれでもよく、好ましくはN‐アセチルグルコサミンからN‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いて製造したN‐アセチルノイラミン酸をあげることができる。
【0067】
N‐アセチルグルコサミンからN‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であれば特に制限はないが、N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼを生産する能力を有する微生物およびN‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力を有する微生物の2つの微生物の組み合せ、またはN‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼおよびN‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力を有する微生物をあげることができる。
【0068】
上記した微生物としては、N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAおよび/またはN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAで形質転換された微生物をあげることができる。
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAで形質転換された微生物およびN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAで形質転換された微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる時は、それぞれの微生物の培養物または該培養物の処理物の混合物を酵素源として用いてもよい。
【0069】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAおよび/またはN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAで形質転換された微生物としては、該酵素をコードするDNAを含む組換え体DNAを保持する微生物、該酵素をコードするDNAが染色体に挿入された微生物等があげられる。
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAおよび/またはN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAで形質転換された微生物は、(1)に記載の方法に準じ、それぞれのDNAの塩基配列に基づき取得することができる。また、該微生物の培養物は、(2)に記載の方法に準じて取得することができる。
【0070】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAおよび/またはN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAで形質転換された微生物の培養物の処理物としては、前記した培養物の処理物と同じものをあげることができる。
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAおよび/またはN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAで形質転換された微生物としては、例えばSynechocystis sp. PCC6803株由来のN‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAおよびEscherichia coli由来のN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAを含む組換え体DNAであるpLT4を導入されたEscherichia coli NAN8-71/pLT4(WO03/72783)等があげられる。
【0071】
[A]の(2)と同様の方法によりN−アセチルグルコサミンからN−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物を培養し、得られた培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることができる。
【0072】
N‐アセチルグルコサミンからN‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いて得られるN‐アセチルノイラミン酸をCMP‐NeuAcの製造のための基質に用いるときは、上記の媒体中に生成、蓄積したN‐アセチルノイラミン酸を採取して用いてもよいし、N‐アセチルノイラミン酸が生成、蓄積した媒体をそのままN‐アセチルノイラミン酸として用いてもよい。
【0073】
反応溶液からのN‐アセチルノイラミン酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
CMP−NeuAcの製造に用いるN−アセチルノイラミン酸は、1mmol/l〜3mol/lの範囲で、好ましくは10〜500mmol/lの範囲で用いる。
CMP‐NeuAcの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして1〜500g/l、好ましくは50〜300g/lで用いる。
【0074】
水性媒体中に生成したCMP‐NeuAcの分離定量はHPLCを用いて公知の方法に従って行うことができる(WO98/12343)。
反応液中に生成したCMP−NeuAcの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
2)CMP‐NeuAcの製造2
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび本発明で用いられるCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物、およびCTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、CTP前駆物質(II)、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐NeuAcを生成、蓄積させることができる。
【0075】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力および本発明で用いられるCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記能力から選ばれる1つ以上の能力を有する微生物、前記で選択されなかった能力を1つ以上有する微生物、前記2つの微生物が有していない残りの能力のうち1つ以上の能力を有する微生物からなる複数の微生物をあげることができる。
【0076】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよび本発明で用いられるCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する一つの微生物またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記の酵素または蛋白質をコードするDNAで形質転換された1つまたは複数の微生物があげられる。
【0077】
上記した微生物、および該微生物の培養物は、(1)および(2)に記載の方法に準じ、それぞれ取得することができる。
上記した微生物の培養物の処理物としては、1)に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物としては、1)に記載の原核生物をあげることができる。
【0078】
CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養は(1)に記載の形質転換体の培養と同様の方法で行うことができる。
CTP前駆物質(II)からCTPまたはCTP前駆物質(I)を生産する能力を有する原核生物の培養物の処理物としては、1)に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
【0079】
CTP前駆物質(II)としては、1)に記載のCTP前駆物質(II)と同じものを用いることができ、1mmol/l〜1mol/lの範囲で用いることができる。
CMP‐NeuAcの製造法で用いられる水性媒体は、1)に記載のものと同じものを用いることができる。
CMP‐NeuAcの製造法において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよく、1)に記載の界面活性剤あるいは有機溶媒と同じものを、いずれも同様の濃度で用いることができる。
【0080】
CMP‐NeuAcの製造法において、CMP‐NeuAcの生成反応は、水性媒体中、pH5〜7.5、好ましくはpH6.5〜7.5、20〜50℃の条件で1〜96時間行う。該生成反応において、必要に応じてMnCl、MgCl、MgSO等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
CMP‐NeuAcの製造法において用いるエネルギー供与体は、1)に記載のものと同じものを、同様の濃度で用いることができる。
【0081】
CMP‐NeuAcの製造に用いるN‐アセチルグルコサミンは、特に制限はなく、市販品や微生物を利用して生産したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005)) などを用いることができる。
CMP‐NeuAcの製造に用いるN‐アセチルグルコサミンは、1mmol/l〜3mol/lの範囲で、好ましくは10〜500mmol/lの範囲で用いる。
【0082】
CMP‐NeuAcの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして1〜500g/l、好ましくは50〜300g/lで用いる。
水性媒体中に生成したCMP‐NeuAcの分離定量はHPLCを用いて公知の方法(WO98/12343)に従って行うことができる。
反応液中に生成したCMP−NeuAcの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
3)CMP‐NeuAcの製造3
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびCTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を持っている1つの原核生物、またはこれらの能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、CTP前駆物質(I)およびN‐アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でCMP‐NeuAcを生成、蓄積させることもできる。
【0083】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびCTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物としては、上記能力から選ばれる1つ以上の能力を有する原核生物、前記で選択されなかった能力を1つ以上有する原核生物、前記2つの原核生物が有していない残りの能力のうち1つ以上の能力を有する原核生物、および前記3つの原核生物が有していない残りの能力を有する原核生物からなる複数の原核生物をあげることができる。
【0084】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびCTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を持っている1つの原核生物としては、例えば、CTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を持っている原核生物であって、かつN‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼおよびCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換された原核生物をあげることができる。
【0085】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼを生産する能力、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼを生産する能力、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質を生産する能力およびCTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の原核生物としては、CTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を有する原核生物であって、かつCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換された原核生物、ならびにN‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAおよびN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAで形質転換された原核生物をあげることができる。
【0086】
該原核生物は、CTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を持っている原核生物を宿主として用い、(1)に記載の方法に準じ、それぞれのDNAの塩基配列に基づいて取得することができる。
CTP前駆物質(I)からCTPを生産する能力を持っている原核生物としては、該能力を有する原核生物であれば特に制限はないが、好ましくはエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する原核生物、より好ましくはEshcerichia coliまたはCorynebacterium ammoniagenes、さらに好ましくはEshcerichia coliをあげることができる。
【0087】
また、該原核生物の培養物は、(2)に記載の方法に準じて取得することができる。
該培養物の処理物としては、1)に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
CMP‐NeuAcの製造法に用いるCTP前駆物質(I)としては、1)に記載のCTP前駆物質(I)と同じものを同様の濃度で用いることができる。
【0088】
CMP‐NeuAcの製造法に用いる水性媒体としては、1)に記載の水性媒体と同じものを用いることができる。
CMP‐NeuAcの製造法において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよく、1)に記載の界面活性剤あるいは有機溶媒と同じものを、いずれも同様の濃度で用いることができる。
【0089】
CMP‐NeuAcの製造法において、CMP‐NeuAcの生成反応は、水性媒体中、pH5〜7.5、好ましくはpH6.5〜7.5、20〜50℃の条件で1〜96時間行う。該生成反応において、必要に応じてMnCl、MgCl、MgSO等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
CMP‐NeuAcの製造法において用いるエネルギー供与体は、1)に記載のものと同じものを、同様の濃度で用いることができる。
【0090】
CMP‐NeuAcの製造に用いるN‐アセチルグルコサミンは、特に制限はなく、市販品や微生物を利用して生産したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005))などを用いることができ、1mmol/l〜3mol/lの範囲で、好ましくは10〜500mmol/lの範囲で用いる。
CMP‐NeuAcの生成に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして1〜500g/l、好ましくは50〜300g/lで用いる。
【0091】
水性媒体中に生成したCMP‐NeuAcの分離定量はHPLCを用いて公知の方法(WO98/12343)に従って行うことができる。
反応液中に生成したCMP−NeuAcの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
[B]N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
(1)シアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の作製
本発明の方法で使用するシアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であれば特に制限されないが、該微生物としては、人為的な操作を行わなくてもシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有している微生物と、シアリルトランスフェラーゼをコードするDNAで形質転換された微生物をあげることができる。
【0092】
人為的な操作を行わなくてもシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物としては、パスツレラ属に属する微生物、例えばPasteurella multocida PM70株(ミネソタ大学より分譲可能)があげられる。
シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAで形質転換された微生物としては、例えばPasteurella multocidaのpm0188で特定される塩基配列を有するDNA(WO03/27297)を適当な発現ベクターに挿入した組換え体DNAで形質転換された微生物、該塩基配列を有するDNAを染色体上に挿入された微生物があげられる。該塩基配列を有するDNAで形質転換された微生物は、その塩基配列に基づき[A]の(1)および(2)に記載の方法に準じて同様に調製することができる。
(2)N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
1)N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造1
上記[B]の(1)で得られるシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物は[A]の(2)に記載の方法に従い調製することができる。
【0093】
得られた培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、[A]の(3)のいずれかの方法で得られるCMP‐NeuAcおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させることができる。
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いるCMP‐NeuAcは、本発明の方法で製造したCMP‐NeuAcであればよく、CMP‐NeuAcが生成、蓄積した媒体中から採取したCMP‐NeuAcを用いてもよいし、CMP‐NeuAcが生成、蓄積した媒体をそのままCMP‐NeuAcとして用いてもよい。
【0094】
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造において用いられる受容体糖質としては、シアリルトランスフェラーゼの基質になるものであれば、オリゴ糖、多糖、ならびに糖蛋白質および糖脂質等の複合糖質などいずれでもよい。
オリゴ糖または多糖としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖または多糖、あるいは非還元末端にN‐アセチルノイラミン酸を有するオリゴ糖または多糖をあげることができ、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、N‐アセチルラクトサミン、ラクト‐N‐テトラオース、ラクト‐N‐ネオテトラオース、ルイスaおよびルイスXからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、または非還元末端にNeuAcα2-Galβ1-4GlcおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、より好ましくはラクトースをあげることができる。
【0095】
複合糖質としては、非還元末端にガラクトースまたはN‐アセチルノイラミン酸を有する複合糖質をあげることができる。
N−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる受容体糖質は、1mmol/l〜3mol/l、好ましくは50mmol/l〜1mol/lの範囲で用いる。
本発明のN−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で生産されるN‐アセチルノイラミン酸含有糖質としては、受容体糖質にN‐アセチルノイラミン酸が付加した糖質、具体的には非還元末端にNeuAcα2−3Galβ1−4Glc、NeuAcα2−6Galβ1−4GlcおよびNeuAcα2−8NeuAcからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖を含む糖質をあげることができ、好ましくは3´‐シアリルラクトースまたは6´‐シアリルラクトースをあげることができる。
【0096】
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物の培養物の処理物としては、[A]‐(3)の1)に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる水性媒体、界面活性剤および有機溶媒は、[A]の(3)に記載のCMP‐NeuAcの製造方法に準じた方法で用いることができる。
【0097】
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、pH、温度および時間等の条件については、[A]の(3)に記載のCMP‐NeuAcの製造方法に準じた方法で用いることができる。
N−アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてMnCl、MgCl、MgSO等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
【0098】
N−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして1〜500g/l、好ましくは50〜300g/lの濃度で用いる。
水性媒体中に生成したN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
【0099】
水性媒体中に生成したN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
2)N‐アセチルノイラミン酸含有複合等質の製造2
CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N‐アセチルノイラミン酸および受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することによりN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造することもできる。
【0100】
CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を有する微生物は、[A]の(1)に準じた方法でそれぞれの蛋白質をコードするDNAの塩基配列に基づいて作製することができ、該微生物の培養物は、[A]の(2)に準じた方法で該微生物を培養することにより得ることができる。
CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質とシアリルトランスフェラーゼとを生産する能力を有する微生物、またはそれぞれの蛋白質を生産する能力を有する2種の微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を酵素源として、N‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造するときは、必要に応じて媒体中にエネルギー供与体を加えてもよい。
【0101】
上記したエネルギー供与体は、微生物細胞内で代謝されてATPを生成することができる物質であればよく、具体的にはグルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができる。
【0102】
N−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるエネルギー供与体はいずれも、5mol/l以下の濃度で用いることが好ましい。
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いるN‐アセチルノイラミン酸は、市販品や、N−アセチルグルコサミンからN−アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、N‐アセチルグルコサミンおよびエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にN‐アセチルノイラミン酸を生成、蓄積させることにより製造したN‐アセチルノイラミン酸など、特に制限はない。
【0103】
また、N‐アセチルグルコサミンからN‐アセチルノイラミン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として製造したN‐アセチルノイラミン酸を用いるときは、媒体中に生成、蓄積したN‐アセチルノイラミン酸を分離精製して用いてもよいし、N‐アセチルノイラミン酸の生成、蓄積した媒体を、N‐アセチルノイラミン酸として用いてもよい。
【0104】
受容体糖質としては、[B]の(2)の1)の方法と同じ受容体糖質を用いることができ、またこの方法で生産されるN‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、[B]の(2)の1)に記載のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質と同じN‐アセチルノイラミン酸含有糖質である。
上記した微生物の培養物は、[A]の(2)に記載の方法に準じて取得することができる。
【0105】
該培養物の処理物としては、[A]‐(3)の1)に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる水性媒体あるいは界面活性剤または有機溶媒については、[A]の(3)に記載のCMP‐NeuAcの製造方法に準じた方法で用いることができる。
【0106】
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、pH、温度または時間等の条件については、[A]の(3)に記載のCMP‐NeuAcの製造方法に準じた方法で行うことができる。
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてMnCl、MgCl、MgSO等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
【0107】
N−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして1〜500g/l、好ましくは50〜300g/lの濃度で用いる。
水性媒体中に生成したN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
【0108】
水性媒体中に生成したN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
3)N‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造3
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼのすべてを生産する能力を持っている1つの微生物、またはこれらの蛋白質を生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、エネルギー供与体、N‐アセチルグルコサミンおよび受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体中からN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を採取することによっても製造することができる。
【0109】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、上記蛋白質から選ばれる1つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、前記で選択されなかった1つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、前記2つの微生物が有していない残りの蛋白質のうち1つ以上の蛋白質を生産する能力を有する微生物、および前記3つの微生物が有していない残りの蛋白質を生産する能力を有する微生物からなる複数の微生物をあげることができる。
【0110】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼのすべてを生産する能力を持っている1つの微生物としては、N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNA、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNA、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAおよびシアリルトランスフェラーゼをコードするDNAで形質転換された微生物をあげることができる。
【0111】
N‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼ、N‐アセチルノイラミン酸シンターゼ、CMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質およびシアリルトランスフェラーゼを生産する能力を任意の組み合わせですべて有する複数の微生物としては、例えばN‐アセチルグルコサミン‐2‐エピメラーゼをコードするDNAおよびN‐アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするDNAで形質転換された微生物、並びにCMP‐NeuAcシンターゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAおよびシアリルトランスフェラーゼをコードするDNAで形質転換された微生物をあげることができる。
【0112】
上記した微生物は、[A]の(1)に記載の方法に準じてそれぞれの蛋白質をコードする塩基配列に基づいて作製することができ、該微生物の培養物は、[A]の(2)に記載の方法に準じて該微生物を培養し、得ることができる。
上記のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で用いるエネルギー供与体は、微生物細胞内で代謝されてATPやホスホエノールピルビン酸等に変換される物質であればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができ、いずれも、1mmol/l〜5mol/lの濃度で用いる。
【0113】
上記のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法で用いるN‐アセチルグルコサミンは、市販品でも微生物を利用して製造したもの(Metab. Eng., 7, 201(2005))でもよく、また1mmol/l〜1mol/lの濃度で用いる。
上記のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際に用いる受容体糖質としては、[B]の(2)の1)の方法で用いる受容体糖質と同じものを用いることができ、また上記の方法で製造可能なN‐アセチルノイラミン酸含有糖質は、[B]の(2)の1)と同じN‐アセチルノイラミン酸含有糖質である。
【0114】
上記製造法で用いられる微生物の培養物は、[A]の(2)に記載の方法に準じて取得することができる。
該培養物の処理物としては、[A]の(3)の1)に記載の培養物の処理物と同じものをあげることができる。
上記のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法に用いられる水性媒体あるいは界面活性剤または有機溶媒としては、[A]の(3)に記載したものをあげることができ、当該記載に準じた方法で用いることができる。
【0115】
上記のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する際の、pH、温度または時間等の条件としては、[A]の(3)に記載の条件をあげることができる。
N‐アセチルノイラミン酸含有糖質を製造する反応において、必要に応じてMnCl、MgCl、MgSO等の無機塩、補酵素、フィチン酸等を添加することができる。
上記のN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造に用いる各酵素源はいずれも、培養物を遠心分離して得られる菌体の湿重量にして1〜500g/l、好ましくは50〜300g/lの濃度で用いる。
【0116】
上記の製造法により水性媒体中に生成したN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の分離定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる(Anal. Biochem., 189, 151 (1990))。
水性媒体中に生成したN‐アセチルノイラミン酸含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
【0117】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例1】
【0118】
Pasteurella multocida由来のCMP-NeuAcシンターゼを使ったCMP−NeuAcの生産
(1)N‐アセチルノイラミン酸リアーゼ遺伝子(nanA)欠損株の調製
Escherichia coli HN0074(FERM BP-4425)の染色体DNA上のnanAが欠損した菌株は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000))を用いて作製した。
【0119】
使用するEscherichia coli HN0074(FERM BP-4425)の染色体DNAは、該微生物を公知の方法によって培養し、培養後カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により単離精製した。プラスミドpKD46、pKD3およびpCP20は、エシェリヒア・コリ ジェネティックストックセンター(米国エール大学)から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、該大腸菌から抽出したものを用いた。
【0120】
配列番号13に表されるEscherichia coliのnanA遺伝子を含む塩基配列のうち、塩基番号1〜958および1971〜2874で表される塩基配列からなるDNA断片をPCR反応により増幅した。これらの増幅断片を、pKD3を鋳型として増幅した、両端にFRT(FLP recognition target)サイトを持つcat(chloramphenicol acetyl transferase)遺伝子断片の両端に連結した。該連結断片を、あらかじめpKD46を導入し、λ Red recombinaseを誘導発現させたEscherichia coli HN0074株にエレクトロポレーション法により導入した。該連結断片の導入株を培養し、cat遺伝子が染色体上に組み込まれたクロラムフェニコール耐性株を選択した。該クロラムフェニコール耐性株からpKD46を除去した後、pCP20を導入してFLP recombinaseを誘導発現させ培養した後、cat遺伝子が取り除かれたクロラムフェニコール感受性株を選択し、最後にpCP20を除去した。
【0121】
これらの一連の操作により、Escherichia coli HN0074株の染色体DNA上の配列番号13に表される塩基配列の塩基番号959〜1970に相当する部分が欠損した大腸菌を取得することができた。
当該nanA欠損株を、Escherichia coli N18-14と名づけた。
(2)発現ベクターpTK31の作製
発現ベクターpTrS32(FERM BP-5408)をPstIおよびHindIIIで酵素消化し、3.5kbのDNA断片を回収し、同様にpKYP10(特開昭58−110600)をPstIおよびHindIIIで酵素消化し、1.0kbの断片を回収した。該3.5kbと1.0kbの断片を連結し、4.5kbのpTrS31を取得した。
【0122】
pTrS31をClaIおよびPstIで酵素消化し得られた3.5kbのDNA断片と、pPAC1(FERM BP-6054, WO 98/12343)をClaIおよびPstIで酵素消化して得られた2.3kbのDNA断片とを連結し、5.8kbのpNT22を取得した。
配列番号3および4で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーとしてpTrS31を鋳型にPCRを行って得られた3.8 kbのPCR産物をXhoIで酵素消化した。pUC4K(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)をSalIで酵素消化しカナマイシン耐性遺伝子を含む1.3kbのDNA断片を取得し、上記のXhoI消化DNA断片と連結した。
【0123】
その後、Stratagene社のSite-directed mutagenesis kitを用いて、カナマイシン耐性遺伝子上のClaIサイト、HindIIIサイトおよびNruIサイトの破壊を行い、4.9kbのpTK31を造成した。
(3)CMP‐NeuAcシンターゼ発現株の造成
Pasteurella multocida PM70株の染色体DNAは、ミネソタ大学より分譲されたものを用いた。
【0124】
配列番号5および6で表される塩基配列を有する合成DNAを用いて、Pasteurella multocida PM70株の染色体DNAより、CMP‐NeuAcシンターゼをコードすると推定されたORFを含むDNA断片を下記方法で増幅した。
上記合成DNAをプライマーセットとして用い、Pasteurella multocida PM70株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは染色体DNA0.1μg、プライマー各0.5μmol/l、Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)2.5units、Pyrobest DNAポリメラーゼ用×10緩衝液5μl、deoxyNTP 各200μmol/lを含む反応液50μlを用い、98℃で10秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
【0125】
PCR反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液をQIA quick PCR purification Kit (QIAGEN社製)を用いて精製した。各増幅されたDNA断片の溶出は、滅菌水50μlにて行った。
該DNA断片をpCR-Blunt vector(インビトロジェン社製)と連結し、該連結反応液を用いて公知の方法によりEscherichia coli DH5α株を形質転換し、得られた形質転換体を50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地[バクトトリプトン(ディフコ社製)10g/l、酵母エキス(ディフコ社製)10g/l、塩化ナトリウム5g/l、アガロース15g/l]に塗布後、30℃で一晩培養した。
【0126】
生育した形質転換体を50μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地にて30℃で一晩培養して得られた培養物からクラボウ社製核酸自動分離装置PI50を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるPCR増幅断片の塩基配列を常法により決定し、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする、配列番号2で表される塩基配列であることを確認した。
【0127】
該プラスミドを制限酵素Csp45I、BamHIにより切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、約0.7kbの断片をGENECLEANII kit(Qbiogene社製)を用いて回収した。同様に、pTK31を制限酵素ClaI、BamHIにより切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、4.6kbの断片を回収した。
該0.7kbと4.6kbの断片とを、ライゲーションキット(タカラバイオ社製)を用いて連結した。連結反応は16℃で16時間行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli DH5α株を公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
【0128】
生育した該形質転換体を50μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地にて30℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置PI50を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し、該プラスミドをpMnK1と命名した。
pMnK1を用いてEscherichia coli N18-14株を公知の方法に従って形質転換し、CMP‐NeuAcシンターゼを発現するEscherichia coli N18-14/pMnK1を取得した。
(4)Escherichia coli N18-14/pMnK1湿菌体の取得
実施例1(3)で得たEscherichia coli N18-14/pMnK1株を、カナマイシン50μg/mlを含むLB培地125mlの入った1L容バッフル付き三角フラスコに接種し、30℃、220rpmの条件で10時間培養した。該培養液125mlを、カナマイシン50μg/mlを含むTB+Glc培地[グルコース10g/l(別殺菌)、バクトトリプトン(ディフコ社製)12g/l、酵母エキス(ディフコ社製)24g/l、KH2PO42.3g/l(別殺菌)、K2HPO4 12.5g/l(別殺菌)]2.5Lの入った5L容培養槽に接種し、30℃、600rpm、通気量2.5L/分の条件で8時間培養を行った。培養中、培地中のグルコースが消失した時点でさらにグルコース10g/l溶液125mlを添加した。該培養中、28%アンモニア水を使用して培養液のpHを7.0に維持した。
【0129】
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
(5)CMP−NeuAcの生産
Escherichia coli N18-14/pMnK1株湿菌体 200g/l、K2HPO47.3g/l、KH2PO4 12.7g/l、MgSO4 15g/l、フラクトース50g/l、シアル酸30g/l、CMP・2Na 17g/l、ナイミーンS−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成からなる反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーを用い、900rpmで攪拌し、32℃で26時間反応を行った。
【0130】
反応中、5N NaOHを用いて該反応液のpHを7.2に維持した。
該反応により、反応液中に10g/lのCMP‐NeuAc(Na塩)が生成した。
【実施例2】
【0131】
N−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造
(1)Escherichia coli K235株由来CMP−NeuAcシンターゼ発現株の調製
配列番号7および8で表される塩基配列を有する合成DNAを用いて、Escherichia coli K235株(ATCC13027)の染色体DNAより、CMP‐NeuAcシンターゼ遺伝子neuAを含むDNA断片を下記方法で増幅した。
上記合成DNAをプライマーセットとして、実施例1の(3)と同一の条件でPCRを行った。
【0132】
該PCR反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液と等量のTE[10mmol/l Tris-HCl、1mmol/l EDTA (pH 8.0)]飽和フェノール/クロロホルム(1vol/vol)を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離しDNAの沈殿を取得し、該DNAの沈殿を20μlのTEに溶解した。該溶解液5μlを用い、DNAを制限酵素HindIIIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、1.3kbの断片を回収した。
【0133】
pBluescript II SK(+)(ストラタジーン社製)0.2μgを制限酵素HindIIIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に2.9kbのDNA断片を回収した。
該1.3kbおよび2.9kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、得られた形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
【0134】
生育した形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地にて30℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置PI50を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるPCR増幅断片の塩基配列を常法により決定したところ、GenBank ACCESSION No. J05023に記載のEscherichia coli 由来のCMP‐NeuAcシンターゼをコードするneuAと同じ塩基配列であった。
【0135】
該プラスミドをClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、1.3kbのDNA断片を回収した。
pNT22 0.2μgを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に5.5kbのDNA断片を回収した。
該1.3kbおよび5.5kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
【0136】
生育した形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地にて30℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置PI50を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化によって確認し、該プラスミドをpTA23と命名した。
配列番号9および10で表される塩基配列を有するDNAを用いてEscherichia coli W3110株の染色体DNAより、CTPシンターゼ遺伝子pyrGを含む部分を増幅した。上記と同様の方法で目的とするDNA断片の増幅を確認し、該DNA断片の回収を行った。また、該DNA断片の塩基配列を常法により決定したところ、GenBank ACCESSION No. M12843に記載のpyrGと同じ塩基配列であった。
【0137】
該DNA断片をBglIIで酵素消化し、1.6kbのDNA断片を、pTA23をBamHIで酵素消化して、6.8kbのDNA断片をそれぞれ得た。該1.6kbと6.8kbのDNA断片を上記と同様の方法で連結し、Escherichia coli NM522に形質転換して得られた形質転換体から抽出したプラスミドをpYP41と命名した。
pYP41をHindIIIおよびSalIで制限酵素消化し、2.9kbのDNA断片を取得した。同様にpTK31をHindIIIおよびSalIで制限酵素消化し、4.4kbのDNA断片を取得した。
【0138】
該2.9kbおよび4.4kbのDNA断片を連結し、得られたプラスミドをpTCN21と命名した。pTCN21を公知の方法に従ってEscherichia coli HN0074株に導入し、得られた形質転換体をEscherichia coli HN0074/pTCN21と命名した。
(2)N‐アセチルノイラミン酸転移酵素発現株の調製
配列番号11および12で表される塩基配列を有するDNAを用いてNeisseria gonorrhoeae ATCC33084株の染色体DNAよりα2,3‐シアル酸転移酵素遺伝子(以下、2,3-siaTとも言う)を含むDNA断片を下記方法により増幅した。
【0139】
上記合成DNAをプライマーセットとして用い、公知の方法で調製したNeisseria gonorrhoeae ATCC33084株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。実施例1(3)と同様の組成の反応液50μlを用い、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
該PCR反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルム(1vol/vol)を添加し、混合した。
【0140】
該混合液を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離しDNAの沈殿を取得し、該DNAの沈殿を20μlのTEに溶解した。該溶解液5μlを用い、DNAを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、1.0kbの断片を回収した。
【0141】
pBluescript II SK(+)(ストラタジーン社製)0.2μgを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に2.9kbのDNA断片を回収した。
該1.0kbおよび2.9kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、得られた形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
【0142】
生育した形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地にて30℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置PI50を用いてプラスミドを抽出した。
得られたプラスミドに含まれるPCR増幅断片の塩基配列を常法により決定したところ、Gen Bank ACCESSION No. U60664に記載のα2,3‐シアル酸転移酵素をコードする2,3-siaTと同じ塩基配列であった。
【0143】
該プラスミドをClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、1.0kbのDNA断片を回収した。
pNT22 0.2μgを制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に5.5kbのDNA断片を回収した。
該1.0kbおよび5.5kbの断片をライゲーションキットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてEscherichia coli NM522を公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
【0144】
生育した形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地にて30℃で一晩培養して得られた培養物から、クラボウ社製自動核酸分離装置PI50を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミドの構造を制限酵素消化によって確認し、該プラスミドをpYP3、pYP3をEscherichia coli NM522に導入して得られた形質転換体をEscherichia coli NM522/pYP3と命名した。
(3)Escherichia coli NM522/pYP3湿菌体の取得
上記(2)で得たNM522/pYP3株を、実施例1の(4)と同様に培地および培養条件で培養を行った。その際、カナマイシン50μg/mlの代わりにアンピシリン100μg/mlを用いた。また、5L容培養槽での培養は、30℃で4時間、40℃で4時間行った。得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。
(4)Escherichia coli HN0074/pTCN21湿菌体の取得
上記(1)で得たHN0074/pTCN21株を、実施例1の(4)と同様に培養を行い、得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。
(5)シアリルラクトースの生産
Escherichia coli N18-14/pMnK1株またはEscherichia coli HN0074/pTCN21の湿菌体 120g/l、Escherichia coli NM522/pYP3の湿菌体40g/l、K2HPO47.3g/l、KH2PO4 12.7g/l、MgSO4 15g/l、フラクトース50g/l、シアル酸30g/l、ラクトース50g/l、ナイミーンS−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成からなる反応液50ml
を微生物培養装置BMJ(250ml)(エイブル社製)に入れ、600rpmで攪拌しながら、32℃で24時間反応を行った。
【0145】
反応中、5N NaOHを用いて該反応液のpHを7.2に維持し、また1L/分の通気を行った。
N18-14/pMnK1を使用した反応では29.0g/l、HN0074/pTCN21を使用した反応では19.2g/lの3´‐シアリルラクトースが蓄積した。
【産業上の利用可能性】
【0146】
本発明により、シチジン‐5´‐一リン酸‐N‐アセチルノイラミン酸およびN‐アセチルノイラミン酸含有糖質を効率よく製造することができる。
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配列番号3−人口配列の説明:合成DNA
配列番号4−人口配列の説明:合成DNA
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配列番号7−人口配列の説明:合成DNA
配列番号8−人口配列の説明:合成DNA
配列番号9−人口配列の説明:合成DNA
配列番号10−人口配列の説明:合成DNA
配列番号11−人口配列の説明:合成DNA
配列番号12−人口配列の説明:合成DNA
【出願人】 【識別番号】000001029
【氏名又は名称】協和醗酵工業株式会社
【出願日】 平成18年6月30日(2006.6.30)
【代理人】
【公開番号】 特開2008−5794(P2008−5794A)
【公開日】 平成20年1月17日(2008.1.17)
【出願番号】 特願2006−181071(P2006−181071)