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【発明の名称】 α−D−グルコピラノシルグリセロールの製造方法
【発明者】 【氏名】菊川 紀子

【氏名】久保 貴司

【氏名】竹中 史人

【氏名】壱岐 正志

【要約】 【課題】

【構成】少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−D−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−D−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とするα−D−グルコピラノシルグリセロールの製造方法。本製造方法により、純度の高いα−D−グルコピラノシルグリセロールを製造することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−D−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−D−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とするα−D−グルコピラノシルグリセロールの製造方法。
【請求項2】
糖化酵素が、マルトオリゴ糖のα結合を加水分解するがα−D−グルコピラノシルグリセロールを加水分解しない酵素である請求項1に記載の製造方法。
【請求項3】
糖化酵素が、グルコアミラーゼである請求項1に記載の製造方法。
【請求項4】
微生物が、ピキア(Pichia)属微生物である請求項1に記載の製造方法。
【請求項5】
ピキア(Pichia)属微生物が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)である請求項4に記載の製造方法。
【請求項6】
酵素反応後、さらに培養終了液から培地成分を除去する請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、α−D−グルコピラノシルグリセロールの製造方法に関し、さらに詳しくはα−D−グルコピラノシルグリセロールをより安価に、且つ効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
α−D−グルコピラノシルグリセロールは、低褐変性、低メイラード反応性、加熱安定性、非う蝕性、難消化性、高い保湿性を有する甘味物質として有用な物質である。従来、このα−D−グルコピラノシルグリセロール(以下、GGとも表記する)の製造方法としては、例えば、マルトオリゴ糖などを含有する糖類とグリセロールの混合物にカビ由来のα−グルコシダーゼを作用させることにより、グリセロールにグルコシル基を転移させて製造する方法(特許文献1)、清酒、味噌、みりん等の醸造物から抽出する方法、イソマルトース、マルチトールなどを四酢酸鉛や過ヨウ素酸塩でグリコール開裂したものを還元する方法、あるいはKoenigs−Knorr反応により合成したβ−グルコシドをアノメリゼーションした後、β−グルコシダーゼでβ−グルコシドを加水分解する方法などが知られている。
【0003】
上記既知方法の中でも、特許文献1に記載の方法が最も収率がよく工業的に優れた方法である。この方法で得られる酵素反応液中には、GGの他にグルコース、グリセロール、イソマルトオリゴ糖なども残存しているため、前記特許文献1では、前記酵素反応液中のα−グルコシダーゼ活性を失活させた後、該反応液をイオン交換樹脂アンバーライトMB−2処理および活性炭カラムクロマトグラフィーに付し、溶出液を濃縮することによりシロップ状の高純度のGGを得ている。
【0004】
【特許文献1】特許第3569432号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
高純度のGGを得るための精製方法としては、アミノカラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、擬似移動床式クロマト分離装置などがあるが、アミノカラムクロマトグラフィーは、溶出液にアセトニトリルを用いるため、食品などに使用する場合に安全性に欠け、また精製効率が悪い。活性炭カラムクロマトグラフィーは精製効率がアミノカラムクロマトグラフィーよりは良いが、擬似移動床式クロマト分離装置に比べると格段に効率が悪い。もっとも効率の良い擬似移動床式クロマト分離装置は、高額な装置であり、充填剤の劣化等によるメンテナンスにもかなりの費用がかかる上に、GG含有反応液に共存するグルコースとグリセロールにより精製効率が落ちるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
そこで本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼ活性を失活させて得られるGGを含む溶液(以下、GG反応液とも表記する。)に、糖化酵素(例えば、グルコアミラーゼ)を作用させて、残存しているマルトオリゴ糖類を加水分解することで、GGの減少なしに、GG、グルコース、グリセロールのほぼ三成分になることを見出した(以下、加水分解後に得られる溶液を加水分解液とも表記する)。
さらに本発明者らは、グルコース及びグリセロールの資化性を持つ酵母の中でもGGを資化しない酵母を見出し、加水分解液を添加した培養液中でこの酵母を培養すると、グルコースとグリセロールが除去された高純度のGG溶液が得られることを見出した。
本発明は、上記知見に基づき、さらに検討して完成したものである。
【0007】
すなわち、本発明は、
[1]少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−D−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−D−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とするα−D−グルコピラノシルグリセロールの製造方法、
[2]糖化酵素が、オリゴ糖のα結合を加水分解するがα−D−グルコピラノシルグリセロールを加水分解しない酵素である前記[1]に記載の製造方法、
[3]糖化酵素が、グルコアミラーゼである前記[1]に記載の製造方法、
[4]微生物が、ピキア(Pichia)属微生物である前記[1]に記載の製造方法、
[5]ピキア(Pichia)属微生物が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)である[4]に記載の製造方法、および
[6]酵素反応後、さらに培養終了液から培地成分を除去する前記[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【0008】
本発明方法は、煩雑な処理や高額なランニングコストの必要がなく、GGを安価に製造することができる。GGは呈味がよく、安定性に優れており、近年多くの機能性が明らかとなってきていることから、より安価に製造することで、さらに広範な利用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0009】
本発明のα−D−グルコピラノシルグリセロールの製造方法は、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−D−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液を準備し、該溶液中に残存するマルトオリゴ糖を糖化酵素で加水分解し、その後または加水分解と同時に、グルコースおよびグリセロールを資化するがα−D−グルコピラノシルグリセロールを資化しない微生物を加えて培養することを特徴とする。
【0010】
(原料溶液の準備)
本発明の第一工程は、少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類とグリセロールとの混合物にα−グルコシダーゼを作用させたのち該α−グルコシダーゼを失活させて得られるα−D−グルコピラノシルグリセロールを含む溶液(GG反応液)を準備する工程である。
少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類としては、例えばデンプンやアミロースにアミラーゼを作用させることによって得られるマルトオリゴ糖を含む糖類が好適に挙げられる。ここにマルトオリゴ糖としては、例えばマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなど、グルコースが2〜7個α−1,4−グルコシド結合したオリゴ糖が挙げられる。
少なくともマルトオリゴ糖を含む糖類に対するグリセロールの使用比率は特に限定されない。
【0011】
一方、α−グルコシダーゼとしては、カビ由来のα−グルコシダーゼが好ましく、特にアスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)などの生産するα−グルコシダーゼが好ましい。また、この酵素は、精製酵素であっても、粗精製酵素であってもよい。
マルトオリゴ糖とグリセロールとの酵素反応は常法に従って行なうことができ、例えばpH4〜6で、かつ40〜60℃で好適に実施することができる。酵素反応時間は、特に限定されないが、通常12〜48時間である。
酵素反応後、反応液を加熱することによりα−グルコシダーゼを失活させることができる。このようにして得た溶液(GG反応液)中には、GG以外にもグリセロール、グルコース、オリゴ糖などが存在する。
【0012】
なお、GG反応液中に含まれるGGは、α−D−グルコピラノシル基がグリセロールの1位又は2位に置換した化合物であり、式1:
【化1】


で示される(2R)−1−O−α−D−グルコピラノシルグリセロール、式2:
【化2】


で示される(2S)−1−O−α−D−グルコピラノシルグリセロール、式3:
【化3】


で示される2−O−α−D−グルコピラノシルグリセロール、またはこれらの混合物のいずれであってもよい。例えば、後記実施例において使用するGG反応液に含まれるGGは、式1で示される(2R)−1−O−α−D−グルコピラノシルグリセロールを主成分とする前記三種の混合物である。
【0013】
(糖化酵素との反応)
本発明の第2工程は、原料溶液である上記GG反応液中に残存するオリゴ糖を糖化酵素で加水分解する反応である。この反応により、残存するオリゴ糖が分解し、GG、グリセロール、グルコースのほぼ3成分からなる溶液となる。
【0014】
糖化酵素(グルコアミラーゼ)は、マルトオリゴ糖などの基質の非還元性末端グルコース残基から順に加水分解する。グルコアミラーゼには酵母やカビ由来のものがあるが、GGを分解しないものであれば使用可能であり、中でもアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)やリゾプス・ニベウス(Rhizopus niveus)などの生産するグルコアミラーゼが好適である。また、α−グルコシダーゼの作用で生成する副産物としてイソマルトオリゴ糖があり、そのα−1,6結合を加水分解するプルラナーゼ等を併用してもよい。
【0015】
作用条件は特に限定されないが、例えば、反応温度は、20〜50℃が好ましいが、反応温度60℃でも酵素反応には支障がない。反応液の液性は、pH3〜6、特にpH4〜5が好ましい。また、グルコアミラーゼの添加量は、GG反応液に含まれる固形分を基質とし、40℃、24時間反応させた場合、50%(w/w)以下の基質に対し、基質グラム(g)あたり30U以上、好ましくは60U以上(1Uは、0.56%可溶性澱粉溶液9mlに希釈酵素液1mlを加え、40℃、pH4.5で30分反応させた時に、グルコース10mg相当の還元力を与える酵素量とする)であれば十分目的を達成することができる。
反応後の加水分解液には、GGの他にグルコース、グリセロール、及びわずかに残存しているオリゴ糖類などが含まれる。
【0016】
(微生物の培養)
続く第3工程は、微生物を用いて加水分解溶液中で微生物を培養してグルコース及びグリセロールを除去する工程である。
本発明で使用可能な微生物は、GGを分解することなく、グルコース及びグリセロールの資化性を有していれば良く、例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、エンテロバクター・エアロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、シトロバクター・フロンディ(Citrobacter freundii)などである。ピキア・パストリスは、一般的にはメタノール資化性酵母として知られているが、グルコース及びグリセロール資化性も有しており、本発明者らは鋭意検討の結果、グルコース及びグリセロール、GGの存在する培養液中でピキア・パストリスを培養すると、先にグルコースを資化し、次いでグリセロールを資化し、GGをまったく資化しないということを初めて確認した。なお、本発明の実施例で使用した微生物(酵母)は、ピキア・パストリスの標準株で、独立行政法人 製品評価技術基盤機構にNBRC No.10777として寄託されており、容易に入手することができる。
【0017】
培養条件は特に限定されないが、例えば最終固形分濃度3〜10%になるように調整した加水分解溶液に、微生物の生育に必要な成分(例えば、ペプトン、麦芽エキス、酵母エキスなどの培地成分)を添加し、ピキア・パストリスなどの微生物を植菌して培養を行う。残存する糖類を適宜分析し、グルコースとグリセロールがなくなれば、さらに加水分解液を固形分濃度3〜10%になるように添加し、培養することを繰り返せば、培養液中のGG濃度を上げることができる。
【0018】
なお、第2工程の酵素による残存オリゴ糖の加水分解と、第3工程の微生物によるグルコースとグリセロールの除去は同時に行うこともできる。即ち、GG反応液を最終固形分濃度3〜10%になるように添加した培地中にグルコアミラーゼなどの酵素を添加し、同時にピキア・パストリスなどの微生物を植菌して、適当な温度で培養を行えば、残存するオリゴ糖の除去が可能である。
【0019】
上記で得られた培養終了液から、微生物を除去することにより、高濃度のGG溶液が得られる。微生物の除去は、遠心分離、ろ過などの常法により行なうことができる。微生物を除去した後の溶液は、必要に応じて、活性炭カラムクロマトグラフィー及びイオン交換カラムクロマトグラフィーなどを用いて培地成分等を除去することで、GGの純度を高めることができる。
【実施例】
【0020】
次に本発明の実施例を具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例で使用したピキア・パストリス(Pichia pastoris)は、製品評価技術基盤機構にNBRC No.10777として寄託されている。
【0021】
[GG反応液の調製]
70%(w/w)マルトトリオースシロップ300mlに60%(w/v)グリセロール400ml及びカビ(Asp. niger)由来のα−グルコシダーゼ製剤(トランスグルコシダーゼL−アマノ、天野エンザイム製)2mlを添加後、攪拌しながら40℃で24時間反応させた。次いで70%(w/w)マルトトリオースシロップ300mlを追添し、攪拌しながら40℃で24時間反応させた。この反応液を80℃で10分間加熱して酵素を失活させ、GG反応液を得た。
【0022】
[製造例1]
GG反応液の固形分が7%(w/w)になるように希釈し、これにカビであるリゾプス・ニベウス(Rhizopus niveus)由来のグルコアミラーゼ製剤(グルクザイムAF6、天野エンザイム製)をGG反応液の固形分1g当たりに6、30、60または90Uとなるように添加し、それぞれpH5、40℃で24時間反応させた。
これらの反応液中に存在する三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロールおよびGGを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。HPLCは、カラムにShim−pack SCR101(N)(島津製作所製)を用い、カラム温度は50℃とし、溶出液は水を用い、流速は毎分0.6ml、検出器に示差屈折率計を用いた。
結果は、図1の通りである。図1からグルコアミラーゼ製剤を固形分(基質)1gあたり30U以上であれば十分効果が得られることがわかる。
【0023】
[製造例2]
GG反応液20mlを固形分が30%(w/w)になるように希釈して、カビ(Rhizopus niveus)由来のグルコアミラーゼ製剤(グルクザイムAF6、天野エンザイム製)0.14gを添加して、30℃で24時間反応させ、加水分解液を得た。この加水分解液に栄養培地成分(0.5%ペプトン、0.3%麦芽エキス、0.3%酵母エキス;いずれも最終濃度w/v)を添加して、固形分が最終的に3%(w/v)になるように希釈し、培養液を調製した。酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)を植菌後、30℃で120時間振とう培養を行った。その間の三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロールおよびGGの経時的変化を実施例1と同様に調べた。
結果は図2の通りである。図中、濃度(%)は全固形分量を100%としたときの各成分の濃度の相対的な濃度を示す。図2から明らかな通り、24時間後から培養液中のグルコース、グリセロールが減少し始め、120時間後には殆んどなくなっていることがわかる。
【0024】
120時間後培養した後の培養液をイオン交換カラムクロマトグラフィー及び活性炭カラムクロマトグラフィーに付してGG以外の他の残存成分を除去した。溶出液を減圧濃縮し、固形分70%で純度85%のGGシロップを約3g得た。
【0025】
[製造例3]
GG反応液に栄養培地成分(0.5%ペプトン、0.3%麦芽エキス、0.3%酵母エキス;いずれも最終濃度w/v)を添加して、GG反応液を固形分が5%(w/v)になるように希釈した。この培養液40mlに、リゾプス ニベウス(Rhizopus niveus)由来のグルコアミラーゼ製剤(グルクザイムAF6、天野エンザイム製)を固形分1gに対して60Uとなるように添加し、さらにピキア・パストリス(Pichia pastoris)を植菌し、30℃で振とう培養を行った。72時間後、培養液をHPLCで分析した。GG濃度は約1%でグルコース及びグリセロールは完全に消費されていた。
【0026】
[製造例4]
製造例3で得られた培養液(培養3日目)にGG反応液を、培養液に対し固形分3%(w/v)相当になるように添加し、30℃で振とう培養した。48時間後(培養開始後5日目)にグルコースおよびグリセロールの消費を確認した後、GG反応液を同様に固形分2%相当を添加し、48時間培養した。48時間後(培養開始後7日目)にさらにGG反応液を固形分1.5%(w/v)相当を添加し、72時間培養した。培養開始後の培養液中の各成分の濃度をHPLCで分析したときの経時的な変化は図3の通りである。
図3から分かるように、培養開始後10日目のGG濃度は約2.47%、GG純度は全固形分中約64%であった。
【0027】
[製造例5]
製造例4で得られた培養液を遠心分離により酵母を沈殿させ、上清を常法に従い活性炭クロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフィーで精製した。この溶出液を濃縮し、固形分70%で純度約85%のGGシロップ約1gを得た。
【産業上の利用可能性】
【0028】
本発明は、低褐変性、低メイラード反応性、加熱安定性、非う蝕性、難消化性、高い保湿性を有する甘味物質であるGGを高い純度にかつ工業的に有利に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】製造例1の酵素反応(酵素量6,30,60または90U)で得られる反応液中の各成分(三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロール、GG)をHPLCで分析した結果を示す図である。
【図2】製造例2の培養で得られる培養液中の各成分(三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロール、GG)を経時的にHPLCで分析した結果を示す図である。
【図3】製造例4の培養で得られる培養液中の各成分(三糖類、ニ糖類、グルコース、グリセロール、GG)を経時的にHPLCで分析した結果を示す図である。
【出願人】 【識別番号】594027616
【氏名又は名称】辰馬本家酒造株式会社
【出願日】 平成18年6月28日(2006.6.28)
【代理人】 【識別番号】100077012
【弁理士】
【氏名又は名称】岩谷 龍


【公開番号】 特開2008−5735(P2008−5735A)
【公開日】 平成20年1月17日(2008.1.17)
【出願番号】 特願2006−177962(P2006−177962)