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【発明の名称】 細胞の電気生理学的特性分析装置
【発明者】 【氏名】酒井 隆茂

【要約】 【課題】細胞を容易にクランプすることができ、しかも、クランプ後の細胞の外表面に薬品を迅速に行渡らせることができる細胞の電気生理学的特性分析装置を提供することを目的とする。

【構成】液体流路14に細胞60を混入させた細胞外液を流通させ、液体流路14内に設置した細胞クランプ手段によって液体内の細胞60をクランプした状態でその細胞60の電気生理学的特性を分析する細胞の電気生理学的特性分析装置1において、細胞クランプ手段が、液体流路14内に設けられて内部管路23の先端開口部24を液体流路14の上流側に向けたキャピラリ5と、キャピラリ5の内部管路23を介して液体流路14内の液体を吸引し、液体内の細胞60をキャピラリ5の内部管路23の先端開口部24に吸着させる第2吸引ポンプ43とから成る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
液体流路に細胞を混入させた液体を流通させ、前記液体流路内に設置した細胞クランプ手段によって液体内の細胞をクランプした状態でその細胞の電気生理学的特性を分析する細胞の電気生理学的特性分析装置であって、
前記細胞クランプ手段が、前記液体流路内に設けられて内部管路の先端開口部を前記液体流路の上流側に向けたキャピラリと、キャピラリの内部管路を介して前記液体流路内の液体を吸引し、液体内の細胞をキャピラリの内部管路の先端開口部に吸着させる吸引手段とから成ることを特徴とする細胞の電気生理学的特性分析装置。
【請求項2】
前記液体流路の上方にウェルを有し、前記ウェルの底部が前記液体流路のキャピラリの上流側に開口していることを特徴とする請求項1に記載の細胞の電気生理学的特性分析装置。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、液体流路に細胞を混入させた液体を流通させ、液体流路内に設置した細胞クランプ手段によって液体内の細胞をクランプした状態でその細胞の電気生理学的特性を分析する細胞の電気生理学的特性分析装置に関するものである。
【背景技術】
【0002】
近年、細胞膜に含まれるイオンチャンネルの開閉挙動から細胞の電気生理学的特性を調べる研究が進んでおり、創薬分野にも応用されるようになってきている。パッチクランプ法は細胞膜のイオンチャンネルの開閉挙動を解析するための準備として細胞をクランプする方法のひとつであり、内部管路の先端開口部が1μm程度のキャピラリを細胞膜に押し付けた後、軽く吸引して細胞膜をキャピラリに密着させることによって、細胞膜のイオンチャンネルを通る電流を計測できるようにするものである。
【0003】
パッチクランプ法では、クランプされた細胞膜はキャピラリの内部管路の先端開口部に極めて密接に接触し、キャピラリ外部の液体流路に満たされる細胞外液と、キャピラリ内部に満たされる細胞内液との間には極めて高い電気的抵抗が生じる。このような接触状態は一般に「ギガシール状態」と称され、良好なS/N比でイオンチャンネルを通過する電流を記録することができるので、細胞の電気生理学的特性をpA(ピコアンペア)レベルで計測することが可能となる。
【0004】
パッチクランプ法によってギガシール状態を作り出す方法としては、細胞の外径よりも小さい内径を有するテーパ状のキャピラリの内壁に細胞を接触させてクランプさせるもの(特許文献1)や、細胞が混入された液体の流路中に内部管路の先端開口部を流れに対して直交する方向に向けたキャピラリ(吸引チャンネル)を配置し、キャピラリを介して液体を吸引することにより、液体内の細胞をキャピラリの先端開口部に吸着させるようにしたもの(特許文献2)等が知られている。
【特許文献1】特表2004−518109号公報
【特許文献2】特表2004−502936号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、細胞は勿論のこと、キャピラリ自体も非常に微小であるため、実際に細胞のギガシール状態を作り出すのは容易なことではなく、1日に数多くのスクリーニングを行う創薬分野においては、如何にして容易に細胞のギガシール状態を作り出すかが大きな課題である。
【0006】
また、創薬スクリーニングでは試験用の薬品をクランプ後の細胞の外表面に迅速に行渡らせて次々と必要な計測を行っていく必要があるが、特許文献1に開示された方法では、細胞はテーパ状のキャピラリの内壁に接触してクランプされるため、試験用の薬品はキャピラリが詰まらないように少量ずつ送らざるを得ず、必要な計測を短時間で行うことが困難であるという問題点がある。
【0007】
更に、特許文献2に開示された方法では、細胞はキャピラリに対して外部から密着するようにクランプされるため、クランプ後の細胞の外表面に対して薬品を行渡らせることは比較的容易であるが、液体流路内を細胞が流れる方向と細胞を吸い付ける方向とが一致しないことから細胞をクランプすること自体が難しいうえ、細胞をクランプした後であっても、細胞は液体流路内を流れる液体から常時横力を受けることとなるため、クランプ後の
細胞が液体によって流されてしまうおそれがあるという問題点がある。
【0008】
そこで本発明は、細胞を容易にクランプすることができ、しかも、クランプ後の細胞の外表面に薬品を迅速に行渡らせることができる細胞の電気生理学的特性分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
請求項1に記載の細胞の電気生理学的特性分析装置は、液体流路に細胞を混入させた液体を流通させ、前記液体流路内に設置した細胞クランプ手段によって液体内の細胞をクランプした状態でその細胞の電気生理学的特性を分析する細胞の電気生理学的特性分析装置であって、前記細胞クランプ手段が、前記液体流路内に設けられて内部管路の先端開口部を前記液体流路の上流側に向けたキャピラリと、キャピラリの内部管路を介して前記液体流路内の液体を吸引し、液体内の細胞をキャピラリの内部管路の先端開口部に吸着させる吸引手段とから成る。
【0010】
請求項2に記載の細胞の電気生理学的特性分析装置は、請求項1に記載の細胞の電気生理学的特性分析装置において、前記液体流路の上方にウェルを有し、前記ウェルの底部が前記液体流路のキャピラリの上流側に開口している。
【発明の効果】
【0011】
本発明の細胞の電気生理学的特性分析装置では、液体流路内を流通する液体内に混入された細胞をクランプする細胞クランプ手段が、液体流路内に設けられたキャピラリ及びキャピラリの内部管路を介して液体流路内の液体を吸引し、液体内の細胞をキャピラリの先端開口部に吸着させる吸引手段から成るが、キャピラリは内部管路の先端開口部を液体流路の上流側に向けているので、その先端開口部にクランプされた細胞が液体流路を流れる液体によってキャピラリに押し付けられるようにすることができ、クランプした後の細胞が液体によって流されにくくすることができる。また、細胞はキャピラリの先端開口部にキャピラリの外部から密着しているので、クランプ後に液体流路内に供給した薬品を細胞の外表面に迅速に行渡らせることができ、薬品の試験を効率的に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0012】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。図1は本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置の断面側面図、図2は本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置の部分断面平面図、図3は本発明の一実施の形態におけるキャピラリの分解斜視図、図4は本発明の一実施の形態における上下のプレート部材の斜視図である。
【0013】
図1において、本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置(以下、分析装置1と称する)は、ベース部2、ベース部2の上方に設けられた液体流路形成部3、液体流路形成部3の上方に設けられたウェル形成部4から成る。
【0014】
液体流路形成部3は電気絶縁性材料から形成された上側プレート部材11、下側プレート部材12及びプレート保持部材13から成る。上側プレート部材11と下側プレート部材12は上下に重ねられた状態でプレート保持部材13によってベース部2上に保持されている。プレート保持部材13は(すなわち液体流路形成部3の全体は)ベース部2に対して着脱自在であり、プレート保持部材13とベース部2との間に介装されているシール部材3aはプレート保持部材13の下面に固定されている。
【0015】
図1及び図2において、液体流路形成部3の内部には液体流路14が形成されている。この液体流路14の一端側の液体導入部14aはベース部2を垂直に延びて設けられた連
通路2aを介してベース部2の外部に設けられたリザーバ41に繋がっており、液体流路14の他端側の液体排出部14bはベース部2を垂直に延びて設けられた連通路2bを介してベース部2の外部に設けられた第1吸引ポンプ42に繋がっている。
【0016】
図1において、液体流路14内にはキャピラリ5が設けられている。キャピラリ5は電気絶縁性材料から形成された上下のキャピラリ半体21,22が上下に接合されて成り(図3)、内部に内部管路23を有している。この内部管路23は水平方向に延びた水平部23aと水平部23aの一端部から下方に延びた垂直部23bを有して全体としてL字形状に形成されており、水平部23aの先端開口部24は先端側にいくほど内径が小さくなるテーパ状に形成されている。キャピラリ5の先端開口部24の内径は細胞60の直径よりも小さく、約数μm程度であるが、この水平部23aは上側のキャピラリ半体21に設けられた溝部21aと下側のキャピラリ半体22に設けられた溝部22aが上下に合体することによって形成されるため、その工作は比較的容易である。
【0017】
図1において、キャピラリ5の内部管路23の(水平部23aの)先端開口部24は液体流路14の上流側(液体導入部14a側)に向けられており、内部管路23の垂直部23bはベース部2を垂直に延びて設けられた連通路2cを介してベース部2の外部に設けられた第2吸引ポンプ43に繋がっている。キャピラリ5は図1及び図2から分かるように、その上下面を上下のプレート部材11,12に接触させているが、その側面は上下のプレート部材11,12から離間しており、キャピラリ5の側方には細胞60が通過できる隙間14cが形成されている。以下、説明の便宜上、キャピラリ5の先端開口部24が向けられている側を本分析装置1の前方とし、その反対側を本分析装置1の後方とする。
【0018】
図1、図2及び図3において、下側のキャピラリ半体22の上面には導電性の金属板から形成された第1電極部材31が取り付けられている。第1電極部材31の一端側に弧状に曲げ形成されたキャピラリ内電極31aは下側のキャピラリ半体22の溝部22a内(但し先端開口部24よりも内側)に配置されており、第1電極部材31の他端側にリング状に形成されたリード用電極31bは溝部22aの後方(上側のキャピラリ半体21との接合面)に配置されている。
【0019】
図1、図2及び図4において、液体流路形成部3の下側プレート部材12には導電性の金属板から形成された第2電極部材32が取り付けられている。第2電極部材32の一端側に断面コの字状に曲げ形成されたキャピラリ外電極32aは液体流路14の形成面であってキャピラリ5の前方(すなわちキャピラリ5の上流側)に配置されており、第2電極部材32の他端部にリング状に形成されたリード用電極32bは液体流路14の形成面の前方(上側のプレート部材11との接合面)に配置されている。
【0020】
図1において、ウェル形成部4には、すり鉢状のウェル4aが設けられている。ウェル4aの底部、すなわち上側プレート部材11には、液体流路14のキャピラリ5の上流側に開口する細胞供給口15が設けられている。
【0021】
図1において、第1電極部材31のリード用電極31bの中心部を上下に貫通する位置には第1電極ピン33が設けられている。この第1電極ピン33は上下のキャピラリ半体21,22に設けられた貫通穴21b,22b(図3も参照)及び上下のプレート部材11,12に設けられた貫通穴11a,12a(図4も参照)を上下に貫通しており、下端部はプレート保持部材13に、上端部はウェル形成部4にそれぞれ係止されている。そして、第1電極部材31の上端部は液体流路形成部3とウェル形成部4との間に設けられた板状の第1リード部材34を上下方向に貫通してこれと接触している。
【0022】
また、図1において、第2電極部材32のリード用電極32bの中心部を上下に貫通す
る位置には第2電極ピン35が設けられている。この第2電極ピン35は上下のプレート部材11,12に設けられた貫通穴11b,12b(図4も参照)を上下に貫通しており、下端部はプレート保持部材13に、上端部はウェル形成部4にそれぞれ係止されている。そして、第2電極部材32の上端部は液体流路形成部3とウェル形成部4との間に設けられた板状の第2リード部材36を上下方向に貫通してこれと接触している。
【0023】
これら第1電極ピン33と第2電極ピン35は、第1電極部材31と第1リード部材34との間の電通路及び第2電極部材32と第2リード部材36との間の電通路を確保する役割を果たすほか、上下のプレート部材11,12をプレート保持部材13に対して位置決めする役割と、キャピラリ5を上下のプレート部材11,12に対して位置決めする役割とを果たす。
【0024】
上下のプレート部材11,12の後方位置には、ベース部2に固定された第1電極プローブ37が液体流路形成部3を上下に貫通して延びており、この第1電極プローブ37の上端部は第1リード部材34に下方から接触している。また、上下のプレート部材11,12の前方位置には、ベース部2に固定された第2電極プローブ38が液体流路形成部3を上下に貫通して延びており、この第2電極プローブ38の上端部は第2リード部材36に下方から接触している。これら第1電極プローブ37及び第2電極プローブ38はベース部2の外部に設けられた電流測定部30に繋がっており、電流測定部30は両電極プローブ37,38、両リード部材34,35、両電極ピン33,35及び両電極部材31,32を介してキャピラリ5の先端開口部24を挟んで位置するキャピラリ内電極31aとキャピラリ外電極32aの間の電位差によって流れる電流を計測し得るようになっている。
【0025】
リザーバ41内に細胞外液(細胞60を浸す液体)を蓄えるとともに、リザーバ41から液体流路14を経て第1吸引ポンプ42に至る液体の流路内にこの細胞外液を満たし、かつ、キャピラリ5の内部管路23内に細胞内液を満たした状態から第1吸引ポンプ42及び第2吸引ポンプ43を作動させると、リザーバ41内の細胞外液は液体流路14内を通って分析装置1の前方から後方へ移動し、キャピラリ5の側方の隙間14cから液体排出部14bを通って第1吸引ポンプ42側へ流出する(図1中に示す矢印A)。このような状態では、キャピラリ外電極32aとキャピラリ内電極31aとの間に一定の微弱な電位差を印加すると電流測定部30において電流が測定される。
【0026】
上記状態では、液体流路14内の細胞外液は細胞供給口15からウェル4a内に入り込んでおり、そのウェル4a内の細胞外液に細胞60を投入すると、その細胞60は自重によって細胞外液内を沈んだ後、細胞供給口15を通って液体流路14内に入る。そして、第1吸引ポンプ42によって吸引されて液体流路14内を移動している細胞外液の流れに乗って、液体流路14を前方から後方へ移動する。このように液体流路14内を移動する細胞60はキャピラリ5の側方の隙間14cを通り抜けてしまうものが殆どであるが、一部の細胞60はキャピラリ5の内部管路23の先端開口部24に近接したときに第2吸引ポンプ43による吸引力に引き寄せられて、その先端開口部24に吸着される。これにより細胞60はキャピラリ5にクランプされた状態となり、ギガシール状態が実現される。このときキャピラリ5の外部の細胞外液と、キャピラリ5の内部の細胞内液との間には極めて高い電気的抵抗が生じるので、細胞60がギガシール状態となったか否かは、電流測定部30により測定されるキャピラリ外電極32aとキャピラリ内電極31aとの間を流れる電流が急激に減少したことに基づいて検知することができる。
【0027】
ここで、前述のように、キャピラリ5の内部管路23の先端開口部24は先端側(液体流路14の上流側)にいくほど内径が小さくなるテーパ状に形成されており、先端開口部24から内部管路23内に流入する細胞内液の流速を大きくすることができるので、キャ
ピラリ5の先端開口部24に細胞60を吸着させ易く、また先端開口部24に吸着された細胞60を密着状態に(ギガシール状態に)保持するための大きな吸着力を得易い。
【0028】
細胞60がギガシール状態となったら、細胞外液に検査対象である薬品を混入させてその薬品を細胞60の外表面に行渡らせ、細胞60に対して所定の電気生理学的な測定を行って、その特性分析を行う。このような測定・分析を行うにおいて、細胞60の一部を破る必要があるときには、第2吸引ポンプ43の吸引力を増大させるようにすればよい。
【0029】
このように本分析装置1では、液体流路14内を流通する細胞外液に混入された細胞60をクランプする手段(細胞クランプ手段)が、液体流路14内に設けられたキャピラリ5及びキャピラリ5の内部管路34を介して液体流路14内の細胞外液を吸引し、細胞外液内の細胞60をキャピラリ5の先端開口部24に吸着させる吸引手段(第2吸引ポンプ43)から成るが、キャピラリ5は内部管路23の先端開口部24を液体流路14の上流側に向けているので、その先端開口部24にクランプされた細胞60が液体流路14を流れる液体によってキャピラリ5に押し付けられるようにすることができ、クランプした後の細胞60が液体によって流されにくくすることができる。また、細胞60はキャピラリ5の先端開口部24にキャピラリ5の外部から密着しているので、クランプ後に液体流路14内に供給した薬品を細胞60の外表面に迅速に行渡らせることができ、薬品の試験を効率的に行うことができる。
【0030】
また、本分析装置1では、液体流路14の上方に設けられたウェル4aの底部が液体流路14のキャピラリ5の上流側に開口しているので、ウェル4aから細胞60を投入すれば、その細胞60はキャピラリ5の先端開口部24に極めて近い位置に供給されることになる。このため、キャピラリ5の先端開口部24に細胞60を吸着させる確率を高くでき、ギガシール状態の形成率を向上させることができる。
【0031】
また、本分析装置1では、前述のように液体流路形成部3の全体がベース部2に対して着脱自在であるので、リザーバ41、第1及び第2吸引ポンプ42,43、第1及び第2電極プローブ37,38と繋がるベース部2はそのままに、液体流路形成部3のみを交換しながら薬品の試験を連続的に行うことができる。従って、試験に用いる細胞を変える場合は液体流路形成部3ごと交換すればよいので作業効率を向上させることができる。
【0032】
これまで本発明の実施の形態について説明してきたが、本発明は上述の実施の形態に示したものに限定されない。例えば、上述の分析装置1では、液体流路14の上方に設けられたウェル4aから細胞供給口15を介して液体流路14内に細胞60を供給する構成になっていたが、このようなウェル4a及び細胞供給口15は必ずしも設けられていなくてもよく、リザーバ41内に細胞60を混入し、リザーバ41から吸い上げられる細胞外液に乗せて細胞60を液体流路14内に供給するようにしてもよい。
【0033】
更に、本実施の形態では、キャピラリ5とプレート部材11,12を別体としていたが、キャピラリ半体21とプレート部材11を一体的に形成したものと、キャピラリ半体22とプレート部材12を一体的に形成したものとを上下に重ねるようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【0034】
本発明によれば、クランプした後の細胞が液体によって流されにくくすることができる。また、クランプ後に液体流路内に供給した薬品を細胞の外表面に迅速に行渡らせて効率よく薬品の試験を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置の断面側面図
【図2】本発明の一実施の形態における細胞の電気生理学的特性分析装置の部分断面平面図
【図3】本発明の一実施の形態におけるキャピラリの分解斜視図
【図4】本発明の一実施の形態における上下のプレート部材の斜視図
【符号の説明】
【0036】
1 分析装置
2 ベース部
3 液体流路形成部
4 ウェル形成部
4a ウェル
5 キャピラリ
14 液体流路
15 細胞供給口
23 内部管路
24 先端開口部
43 第2吸引ポンプ(吸引手段)
60 細胞
【出願人】 【識別番号】000005821
【氏名又は名称】松下電器産業株式会社
【出願日】 平成18年8月22日(2006.8.22)
【代理人】 【識別番号】100097445
【弁理士】
【氏名又は名称】岩橋 文雄

【識別番号】100109667
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 浩樹

【識別番号】100109151
【弁理士】
【氏名又は名称】永野 大介


【公開番号】 特開2008−48609(P2008−48609A)
【公開日】 平成20年3月6日(2008.3.6)
【出願番号】 特願2006−224881(P2006−224881)