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【発明の名称】 微生物計測システム
【発明者】 【氏名】衣川 昭徳

【氏名】堀切 茂俊

【氏名】梨本 一男

【要約】 【課題】従来の微生物検出方法において、検体中にいた微生物が、生きているか、死んでいるものかがわからないという課題と、従来の方法では、蛍光スペクトルを取得する必要があるため、蛍光スペクトル取得ために鏡を複数枚用いた干渉光学系のような複雑な仕組みが必要であるという課題があり、この課題を解決する検体中の微生物の生死がわかる、検出構成の簡単な微生物検出方法を用いた微生物計測システムを提供を目的とする。

【構成】第1の励起光源1と、第2の励起光源2と、第1の分光フィルター3と第2の分光フィルター4と、撮影手段5と、撮影された蛍光画像から発光点検出手段12と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分類する発光点分別手段13と、発光点の個数を計測する発光点計測手段14と、発光点の個数を表示する機能を備えたパソコンと15を備えて構成される微生物計測システム。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
微生物を蛍光染色試薬用いて蛍光染色し、微生物の蛍光発光した画像を用いて微生物を検出、計測する装置において、全ての微生物を染色する総菌蛍光試薬と、死んだ微生物を染色する死菌蛍光試薬とを用いて染色した検体を蛍光させるための2種類の励起光源と、蛍光発光した発光点の蛍光を分離するための2種類の分光フィルターと、蛍光画像を撮影するための撮影手段と、前記2種類の励起光源と前記2種類の分光フィルターの組み合わせにより励起光波長より長い波長のみを通す分光フィルターを介して撮影される3種類の蛍光画像から蛍光発光点を検出する発光点検出手段と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分別する発光点分別手段と、分別した発光点を計測する発光点計測手段とを備えて微生物の個数を計測する微生物計測システム。
【請求項2】
3種類の蛍光画像における発光点の検出手段を撮影画像の輝度値により行うようにした請求項1記載の微生物計測システム。
【請求項3】
3種類の蛍光画像において、発光点の座標のずれを補正する発光点位置補正手段を備えた請求項1または2のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項4】
微生物を捕集する手段にろ過フィルターを用いた請求項1乃至3のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項5】
微生物をろ過したろ過フィルターを保持した構造体を装着可能とした請求項1乃至4のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項6】
2種類の励起光を、LEDとした請求項1乃至5のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項7】
2種類の励起光を、青色光と、緑色光とした請求項1乃至5のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項8】
2種類の分光フィルターを緑色光を通過させる分光フィルターと、赤色光を通過させるフィルターとした請求項1乃至7のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項9】
撮影手段をCCDカメラとした請求項1乃至8のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項10】
蛍光画像の撮影前に撮影素子のノイズ画像を撮影する請求項1乃至9のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項11】
微生物を捕集した捕集面を、複数箇所撮影するようにした請求項1乃至10のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項12】
微生物捕集用フィルター表面に金属蒸着を施した請求項1乃至11のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項13】
画像撮影面積と、微生物を捕集したフィルター全体の面積の比により1フィルターあたりの微生物数を推測する微生物数推測手段Aを備えた請求項1乃至12のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項14】
捕集したサンプルの量から1mlあたりの微生物の個数を推測する微生物数推測手段Bを備えた請求項1乃至13のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項15】
捕集する前に希釈したサンプルの希釈割合から、希釈前のサンプル中の微生物の個数を推測する微生物数推測手段Cを備えた請求項1乃至14のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項16】
捕集した微生物の蛍光染色を捕集したろ過フィルター上で行うようにした請求項1乃至15のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項17】
微生物の計測結果に異常があれば、警告音を発生させる警告発生手段を備えた請求項1乃至16のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項18】
染色試薬による染色の順番を、総菌蛍光試薬による染色を施した後、死菌蛍光試薬による染色を施すようにした請求項1乃至17のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項19】
染色試薬による染色の順番を、死菌蛍光試薬による染色を施した後、総菌蛍光試薬による染色を施すようにした請求項1乃至18のいずれかに記載の微生物計測システム。
【請求項20】
染色試薬による染色を、総菌蛍光試薬と死菌蛍光試薬を混合した試薬による染色とした請求項1乃至19のいずれかに記載の微生物計測システム。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光染色を施した微生物の蛍光画像を取得し、その蛍光画像を使って微生物を検出し、微生物の数を計測する計測システムに関する。
【背景技術】
【0002】
従来この種の微生物の検出方法としては特許文献1に示されたものが知られている。
以下この種の微生物検出方法について説明していく。
【0003】
この方法は、1種類のDNA結合性蛍光色素を用いて、染色した試料中の微生物を含む蛍光スペクトル画像より、各ピクセルについて蛍光スペクトルを取得し、取得した試料の蛍光スペクトルの波形成分と、対照微生物蛍光スペクトル、夾雑物蛍光スペクトル、及びバックグラウンド蛍光スペクトルの波形成分とを比較して微生物の存在を検出する微生物検出方法が記載されている。
【特許文献1】特開2002−291499号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、上記特許文献1のような従来の微生物検出方法では、微生物の存在は把握できても、検体中にいた微生物が、生きているか、死んでいるものかがわからないことと、蛍光スペクトルを取得する必要があるため、蛍光スペクトル取得のために鏡を複数枚用いた干渉光学系のような複雑な仕組みが必要であるという課題があり、検体中に存在している微生物が生きているものか、死んでいるものかを明確させることと、検出のための仕組みを簡単にすることすなわち構造を簡単にすることが要求されている。
【0005】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、微生物の生死を判別するために2種類の蛍光試薬で染色し、分光フィルターによる蛍光分離を行う機能を備えることで、生物の生死を判定し、構造の簡単な微生物検出方法による微生物計測システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の微生物計測システムは、上記目的を達成するため、検体中の微生物を、2種類のDNA結合性蛍光染色試薬を用いて蛍光染色し、微生物の蛍光発光した画像を用いて微生物を検出、計測する装置において、全ての微生物を染色する総菌蛍光試薬と、死んだ微生物を染色する死菌蛍光試薬とを用いて染色した検体を蛍光させるための2種類の励起光源と、蛍光発光した発光点の蛍光を分離するための2種類の分光フィルターと、蛍光画像を撮影するための撮影手段と、前記2種類の励起光源と前記2種類の分光フィルターの組み合わせにより励起光波長より長い波長のみを通す分光フィルターを介して撮影される蛍光画像から蛍光発光点を検出する発光点検出手段と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分別する発光点分別手段と、分別した発光点を計測する発光点計測手段とを備えて微生物の個数を計測する構成としたものである。
【0007】
この構成により、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物を判別でき、装置構成の簡単な微生物計測システムを提供できる。
【0008】
また他の手段は、発光点の検出手段を撮影画像の輝度値で行う構成としたものである。
【0009】
この構成により、発光点が数値化された微生物計測システムが提供できる。
【0010】
また、他の手段は、3種類の撮影された蛍光画像における発光点の座標のずれを補正する位置補正手段を備えた構成としたものである。
【0011】
この構成により、発光点を正確に把握することができ、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物を精度よく計測できる微生物計測システムが提供できる。
【0012】
また他の手段は微生物を捕集する手段にろ過フィルターを用いた構成としたものである。
【0013】
この構成により、微生物を静止状態で計測できる微生物計測システムを提供できる。
【0014】
また他の手段は微生物をろ過したろ過フィルターを保持した構造体を装着可能とした構成としたものである。
【0015】
この構成により、微生物をろ過したフィルタ−を微生物計測のための計測装置への取り付けが容易である微生物計測システムを提供できる。
【0016】
また他の手段は、2種類の励起光をLEDとした構成としたものである。
【0017】
この構成により、電源回路構成の簡単な微生物計測システムを提供できる。
【0018】
また他の手段は、2種類の励起光を青色光と、緑色光とした構成としたものである。
【0019】
この構成により、緑色蛍光と、赤色蛍光を発生させることができる微生物計測システムを提供できる。
【0020】
また他の手段は、2種類の分光フィルターを緑色光を通過させる分光フィルターと、赤色光を通過させる分光フィルターとした構成としたものである。
【0021】
この構成により、緑色の蛍光の分離と、赤色の蛍光の分離ができる微生物計測システムを提供できる。
【0022】
また他の手段は、撮影手段をCCDカメラとした構成としたものである。
【0023】
この構成により、蛍光発光点を画像として取り込むことが可能な微生物計測システムが提供できる。
【0024】
また、他の手段は、蛍光画像の撮影前に撮影素子のノイズ画像を撮影する構成としたものである。
【0025】
この構成により、ノイズに影響されにくい計測ができる微生物計測システムが提供できる。
【0026】
また他の手段は、微生物を捕集した捕集面を、複数箇所撮影する構成としたものである。
【0027】
この構成により、微生物計測結果の推測値の精度を高めた微生物計測システムが提供できる。
【0028】
また、他の手段は、微生物捕集用フィルター表面に金属蒸着を施した構成としたものである。
【0029】
この構成により、励起光による反射の影響を受けにくい微生物計測システムが提供できる。
【0030】
また、他の手段は、画像撮影面積と、微生物を捕集したフィルター全体の面積の比により1フィルターあたりの微生物数を推測する微生物数推測手段Aを備えた構成としたものである。
【0031】
この構成により、フィルター全体の面積を計測せずに、1フィルターあたりの微生物の個数を推測できる微生物計測システムが提供できる。
【0032】
また、捕集したサンプルの量から1mlあたりの微生物の個数を推測する微生物数推測手段Bを備えた構成としたものである。
【0033】
この構成により、サンプル全体から、計測された微生物の個数の比較するレベルを統一できる微生物計測システムが提供できる。
【0034】
また、他の手段は、捕集する前に希釈したサンプルの希釈割合から、希釈前のサンプル中微生物の個数を推測する微生物数推測手段Cを備えた構成としたものである。
【0035】
この構成により、計測したサンプル全体の微生物の個数を推測できる微生物計測システムが提供できる。
【0036】
また、他の手段は、捕集した微生物の蛍光染色を捕集したフィルター上で行うようにした構成としたものである。
【0037】
この構成により、溶液中に染色試薬を投入する必要がないため、試薬を少量で試薬濃度を高い状態で染色できる微生物計測システムが提供できる。
【0038】
また、他の手段は、微生物の計測結果が規定値以上であれば、警告音を発生する機能を有する構成としたものである。
【0039】
この構成により、計測結果が規定値以上であることを、音声で知ることができる微生物計測システムが提供できる。
【0040】
また、他の手段は、染色試薬による染色の順番を、総菌試薬による染色を施した後、死菌試薬による染色を施した構成としたものである。
【0041】
この構成により、試薬による染色性を高めることのできる微生物計測システムが提供できる。
【0042】
また、他の手段は、染色試薬による染色の順番を、死菌試薬による染色を施した後、総菌試薬による染色を施した構成としたものである。
【0043】
この構成により、試薬の種類による染色性を高めることのできる微生物計測システムが提供できる。
【0044】
また、他の手段は、染色試薬による染色を、総菌試薬と死菌試薬を混合した試薬による染色とした構成としたものである。
【0045】
この構成により、染色手順の簡単な、微生物計測システムが提供できる。
【発明の効果】
【0046】
本発明の微生物計数装置によれば、計測を行うサンプル中から検出した微生物が、生きているか死でいるかを判別することできるという効果と、蛍光スペクトルをとるための鏡を用いた光学干渉系といた複雑な仕組みのいらない構造の簡単な微生物検出方法が実現できるという効果を有する微生物計測システムを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0047】
本発明の請求項1記載の発明は、微生物を蛍光染色試薬用いて蛍光染色し、微生物の蛍光発光した画像を用いて微生物を検出、計測する装置において、全ての微生物を染色する総菌蛍光試薬と、死んだ微生物を染色する死菌蛍光試薬とを用いて染色した検体を蛍光させるための2種類の励起光源と、蛍光発光した発光点の蛍光を分離するための2種類の分光フィルターと、蛍光画像を撮影するための撮影手段と、前記2種類の励起光と、前記2種類の分光フィルターの組み合わせにより3種類の蛍光画像を撮影し、撮影した蛍光画像から蛍光発光点を検出する発光点検出手段と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分別する発光点分別手段と、分別した発光点を計測する発光点計測手段とを備えたものであり、鏡を利用した干渉光学系といった複雑な仕組みを必要しない構造の簡単な微生物検出方法が実現でき、染色試薬による総ての微生物の蛍光発光画像と、死んだ微生物の蛍光発光画像と検体中の自家蛍光異物の発光画像を区別して撮影できるという作用を有する。
【0048】
また、請求項2記載の発明は、3種類の蛍光発光画像の同一発光点を検出する手段を撮影画像の輝度値で行う構成としたことで、発光点の数値化が行えるという作用を有する。
【0049】
また、請求項3記載の発明は、3種類の蛍光画像において、光の屈折による発光点の座標のずれを補正する機能を備えたことで、発光点の位置ずれをなくすことができ、同一発光点を精度よく検出できるという作用を有する。
【0050】
また、請求項4記載の発明は、微生物を捕集する手段にろ過フィルターを用いたことで、微生物をろ過フィルター上に固定できるという作用を有する。
【0051】
また、請求項5記載の発明は、微生物をろ過したろ過フィルターを保持した構造体を装着可能としたことで、微生物を含んだ検体を微生物計測装置に容易に装着できるという作用を有する。
【0052】
また、請求項6記載の発明は、微生物計測装置に備えた2種類の励起光を、LEDとしたことで、低電流で蛍光発光させることができるという作用を有する。
【0053】
また、請求項7記載の発明は、微生物計測装置に備えた2種類の励起光を、青色LEDと、緑色LEDとしたことで、2種類の蛍光試薬を発光させることができるという作用を有する。
【0054】
また、請求項8記載の発明は、微生物計測装置に備えた2種類の分光フィルターを緑色光を通過させる分光フィルターと、赤色光を通過させる分光フィルターとしたことにより、蛍光発光成分のみを分離できるという作用を有する。
【0055】
また、請求項9記載の発明は、撮影手段をCCDカメラとしたことにより、撮影画像を電子データとして、加工ができるという作用を有する。
【0056】
また、請求項10記載の発明は、蛍光画像の撮影前に撮影素子のノイズ画像を撮影するようににたことで、撮影した蛍光画像上の撮像素子の影響によるノイズが除去できるという作用を有する。
【0057】
また、請求項11記載の発明は、微生物を捕集した捕集面を、複数箇所撮影するようにしたことにより、微生物を捕集した面を複数箇所計測できるという作用を有する。
【0058】
また、請求項12記載の発明は、微生物捕集用フィルター表面に金蒸着を施したことにより、フィルター表面の蛍光発光を抑えることができるという効果を有する。
【0059】
また、請求項13記載の発明は、画像撮影面積と、微生物を捕集したフィルター全体の面積の比により1フィルターあたりの微生物数を推測する微生物数推測手段Aを備えたことにより、微生物の捕集面であるフィルター表面全域の撮影計測を行わなくても、ろ過した検体の微生物の数が推測できるという作用を有する。
【0060】
また、請求項14記載の発明は、捕集したサンプルの量から1mlあたりの微生物の個数を推測する微生物数推測手段Bをそなえたことにより、他のサンプルとの計測結果の比較をしやすくできるという作用を有する。
【0061】
また、請求項15記載の発明は、捕集したサンプルの希釈割合から希釈する前の微生物の個数を推測する微生物数推測手段Cを備えたことにより、他のサンプル中に含まれる微生物の総数がわかるという作用を有する。
【0062】
また、請求項16記載の発明は、捕集した微生物の蛍光染色を捕集したフィルターの上で行うようにしたことにより、蛍光染色試薬の濃度を変えずに染色できるという作用を有する。
【0063】
また、請求項17記載の発明は、微生物の計測結果の異常があれば、警告音を発生する機能を有するようにしたことにより、計測結果異常の認知性をよくできるという作用を有する。
【0064】
また、請求項18記載の発明は、染色試薬による染色の順番を総菌染色試薬による染色を施した後に、死菌染色試薬による染色を施すようにしたことにより、総菌染色試薬の染色性を向上させることができるという作用を有する。
【0065】
また、請求項19記載の発明は、染色染色試薬による染色の順番を死菌染色試薬による染色を施した後に、死菌染色試薬による染色を施すようにしたことにより、死菌染色試薬の染色性を向上させることができるという作用を有する。
【0066】
また、請求項20記載の発明は、染色試薬による染色を総菌染色試薬と死菌染色試薬を混合させた染色として染色するようにしたことで、染色の時間を短縮できるという作用を有する。
【0067】
(実施の形態1)
図1は、本発明の実施の形態1の微生物計測システムの構成図の一例である。
【0068】
図1に示すように、微生物計測システムは、蛍光発光させるための第1の励起光源1と、第2の励起光源2と、励起光と蛍光発光を分離するための第1の分光フィルター3と第2の分光フィルター4と、蛍光画像を撮影する撮影手段5と、検体から発する蛍光を集光する対物レンズ6と、蛍光染色した検体と、検体を設置するためのステージ7と、ステージを移動させるための駆動部8と、励起光と蛍光発光を分離するための第1の分光フィルター3と第2の分光フィルター4とを切り替えるための分光フィルター切り替え手段9と、を制御するための制御基板10とを備えた微生物計測装置本体11と、制御基板10に光源の点等命令や、蛍光画像の撮影命令、フィルターの切り替え命令等の制御信号と、撮影された画像から発光点を検出する発光点検出手段12と、検出した発光点を、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分類する発光点分別手段13と、発光点の個数を計測する発光点計測手段14と、発光点の個数を表示する機能を備えたパソコン15を備えて構成されている。
【0069】
また、この構成おける微生物計測システムの機能は、総菌蛍光試薬と死菌蛍光試薬で蛍光染色を施した検体に、第1の励起光源1による励起光を照射し、第1の分光フィルター3を介して蛍光画像Aを撮影し、撮影後、第2の分光フィルター4に切り替えて、蛍光画像Bを撮影し、次に励起光を第2の励起光源2に切り替えて、第2の励起光源2による励起光を照射し、第2の分光フィルター4を介して蛍光画像Cを撮影し、これらの蛍光画像A、蛍光画像B、蛍光画像Cは、発光点検出手段12により、発光点が検出され、検出された発光点は、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分別する発光点分別手段13により分別され、分別された発光点を、計測する発光点計測手段14により、生きた微生物、死んだ微生物、微生物の総数、夾雑物数を算出するようにしたものである。
【0070】
また、この構成における、撮影手段5は、CCDイメージセンサーを用いたカメラまたは、MOSイメージセンサーなどを用いたカメラを用いる。
【0071】
第1の励起光源1としては、紫外LEDと紫外光のみを透過させるフィルターを組み合わせた紫外光励起光源、青色LEDと青色光のみを通過させるフィルターを組み合わせた青色光励起光源、第2の励起光源2としては、青色LEDと青色光のみを通過させるフィルターを組み合わせた青色光励起光源、緑色LEDと緑光のみを通過させる緑色光励起光源などを用いて構成される。
【0072】
本実施例では、第1の励起光源1、第2の励起光源2をともにLEDとしたが、LEDの代わりに、レーザーを用いることも可能である。
【0073】
第1の分光フィルター3は、青い光のみを通す青色分光フィルター、緑の光のみを通す緑色分光フィルター、第2の分光フィルター4は、緑の光のみを通す緑色分光フィルター赤の光のみを通す赤色分光フィルターなどが用いられ、第1の励起光源1、第2の励起光源2と第1も分光フィルター3、第2の分光フィルター4の組み合わせ例としては、第1の励起光源1に青色光励起光源、第1の分光フィルター3に、緑色分光フィルター、第2の励起光源2に緑色光励起光源、第2の分光フィルター4に、赤色分光フィルターを用いた方式や、他の例としては、第1の励起光源1に紫外光励起光源、第1の分光フィルター3に青色光分光フィルター、第2の励起光源2に青色光励起光源、第2の分光フィルター4に緑色分光フィルターを用いた方式などがある。
【0074】
また、励起光は、組み合わせた分光フィルターが通過する波長成分の光を出さないように設計されており、分光フィルターは、組み合わせた励起光源の励起光成分を通過できないように設計されている。例えば、具体的には次のような波長特性を持った、励起光、分光フィルターとなる。青色光励起光源は、450nm〜490nmの波長の光を照射する励起光源であり、紫外光励起光源は、350nmから400nmの間の光を照射する励起光源であり、緑色光励起光源は、490nmから540nmの光を照射する励起光源である。また、分光フィルターは、青色分光フィルターは、410nm〜490nmの光を通過させる特性をもち、緑色光分光フィルターは、500nm〜560nmの波長の成分を通過させる特性をもち、赤色光分光フィルターは、570nm〜700nmの波長成分を通過させる特徴をもつ分光フィルターとする構成もある。
【0075】
本例に出てくる第1の分光フィルター3と第2の分光フィルター4の切り替えについては、分光フィルター切り替え手段9で行われ、分光フィルター切り替え手段9は、ソレノイドコイルなどの電磁磁石を用いて、非通電時は、第1の分光フィルター3とし、通電磁は、第2の分光フィルター4と切り替わるように働く。
【0076】
制御基板10については、第1の励起光源1、第2の励起光源2、撮影手段5、分光フィルター切り替え手段9などの電源の供給や、それぞれの部位のオン、オフを制御するよう働くものである。
【0077】
発光点検出手段12の一例としては、撮影された蛍光画像の輝度値により行う。発光点の輝度値が規定の輝度値以上の画素の集合体として検出するようにすることで、実現できる。例えば輝度値の規定値を10とし、10以上の画素の集合体を1発光点として検出することで行われる。
【0078】
発光点の発光点分別手段13の一例としては、青色励起光で全ての微生物が緑色発光する蛍光染色試薬と、緑色励起光で死んだ微生物のみが赤色発光する蛍光染色試薬を用いて検体を染色し、第1の励起光源1を青色光励起光源として検体を蛍光させ、第1の分光フィルター3に青色光分光フィルター用いて蛍光画像Aを撮影し、続けて、第1の励起光源1を用い、分光フィルターを切り替えて、第2の分光フィルター4とし、第2の分光フィルター4に赤色光分光フィルターを用いて、蛍光画像Bを撮影し、続けて、励起光を第2の励起光源2に切り替えて、第2の励起光源2を緑色光励起光源として、前記第2の分光フィルター4を介して撮影し、蛍光画像Cを取得する。
【0079】
この時、蛍光染色試薬としては、総菌蛍光試薬としてSYTO24、SYTO9、死菌蛍光試薬としては、SYTOX・ORENGE、プロピディウムイオダイドなどを用いることができる。
【0080】
この場合、蛍光画像Aに写っている発光点を、全ての微生物として計測し、蛍光画像Bに写っている発光点を夾雑物として計測し、蛍光画像Cに写っている発光点を死んだ微生物として計測する。蛍光画像Aの発光点数から、蛍光画像Cの発光点数を差し引くことで、生きた微生物を分別することができる。
【0081】
画像から、発光点を計測する発光点計測手段14としては、発光点検出手段により検出された発光点と、発光点分別手段13により分別された微生物、夾雑物の個数を各蛍光画像ごとにたしていくことで行われる。
【0082】
また、この計測結果の表示機能は、パソコン15に付属される、または機能としてもっている液晶画面で行われる。
【0083】
また、ステージ7を駆動する駆動部8の役目は、撮影される蛍光画像の視野が、検体全体の一部であるため、検体全体を撮影するために、検体を一定の距離動かすことにある。この構成を備えたことにより、複数枚の蛍光画像を撮影することができる。
【0084】
このようにして、微生物の検出を鏡を用いた干渉光学系という複雑な仕組みではなく、2種類の光源、カメラ、2種類の分光フィルターという簡単な構成で行え、かつ、生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物に分離でき、また、検体中の生きた微生物、死んだ微生物、夾雑物の個数を計測することができる微生物計測システムが提供できる。
【0085】
(実施の形態2)
実施の形態1と同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【0086】
図2は、本発明の実施の形態2の微生物計測システムの構成図の一例である。図2に示すように、図1に対して、発光点位置補正手段16を追加した構成としたものである。
【0087】
発光点位置補正手段16としては、次のような方法で実現される。撮影された蛍光画像Aと蛍光画像Bと、蛍光画像Cを第1の励起光源1、第2の励起光源2それぞれで蛍光し、第1の分光フィルター3、第2の分光フィルター4それぞれを介しても、蛍光を撮影することができる蛍光粒子を用いて蛍光画像撮影、蛍光画像A、蛍光画像B、蛍光画像Cを撮影し、各蛍光画像のずれを画像を重ねることにより座標のずれを検出し、ずれの分だけの座標の移動をする位置補正を行い、蛍光画像A、B、Cのうちのどれかに座標をあわせるように補正を行う。このように蛍光画像A、B、Cの位置補正をすることで、蛍光染色した検体の蛍光画像を撮影した時に、それぞれの画像の座標に撮影されていない点があれば、その蛍光点が撮影されている蛍光画像によって、発光点は菌か生菌か死菌か夾雑物かを判断できる。
【0088】
この時の位置補正手段は、蛍光画像Aと蛍光画像Cだけで行うことも可能である。
【0089】
また、ここで使用する蛍光粒子は、モリテックス社のR0100などがよい。
【0090】
また、検体を作成する場合に微生物をろ過して行うが、ろ過する時にフィルターを用いる。このろ過フィルター17は、一例として、穴径が0.4μmのものを使用する。この穴径とすることで、より小さな微生物も捕集し、計測することが可能となる。
【0091】
また、ろ過フィルター17の穴径を0.4μm程度の小さな穴径とすることで、ろ過フィルター17上に染色用試薬をのせることができ、ろ過フィルター上で微生物の蛍光染色が行うことができるようになる。
【0092】
また、ろ過フィルター17に金属薄膜を蒸着することで、ろ過フィルター17面の自家蛍光を押さえることができ、蛍光画像の発光点と、ろ過フィルター17面との輝度の差がつき、より蛍光を認識しやすい構成が実現できる。
【0093】
この時、使用する金属としては、金、チタン、銅など自家蛍光しにくい金属がよい。蒸着薄膜の厚みとしては、ろ過フィルター17自体の自家蛍光を押さえるために、30nm以上とすることが望ましい。ただ、薄膜の厚みを厚くしていくとろ過フィルター17のコストアップにつながるため、自家蛍光が押さえられる、最も薄い膜厚にすることが最適な膜厚となる。
【0094】
また、微生物の蛍光染色方法としては、次の3通りで実施することができる。全微生物を染色する総菌蛍光試薬と、死んだ微生物を染色する死菌蛍光試薬により、染色する順序を、第1の方法として、総菌蛍光試薬を微生物をろ過したろ過フィルター17上に適量のせて染色したのち、一旦総菌蛍光試薬をろ過し、次に同様な手順で適量の死菌蛍光蛍光試薬で染色を行う。計測時に総菌をよりはっきり画像として捕らえたい場合は、先に総菌蛍光試薬で染色することで、全微生物が染色されやすく、より強い蛍光発光をすることができるため、第1の方法がよい。
【0095】
この場合適量とは、約100μlである。
【0096】
第2の方法としては、死菌蛍光試薬を微生物をろ過したろ過フィルター17上に適量のせて染色したのち、一旦死菌蛍光試薬をろ過し、次に同様な手順で適量の総菌蛍光試薬で染色を行う。計測時に死菌をよりはっきり画像として捕らえたい場合は、先に死菌蛍光試薬で染色することで、死んだ微生物が染色されやすく、より強い蛍光発光をすることができるため、第2の方法がよい。
【0097】
この場合の適量とは、約100μlである。
【0098】
第3の方法としては、総菌蛍光染色と死菌蛍光染色を同時に行う方法である。微生物をろ過したろ過フィルター17上に総菌蛍光染色と死菌蛍光染色を同時に若しくは、それぞれの試薬をろ過せずに適量のせて染色する方法である。この方法では、試薬の染色時間を前記第1の方法、第2の方法に比べて半分にすることが可能であるという特徴がある。次に同様な手順で適量の総菌蛍光試薬で染色を行う。できるだけ早く計測を行いたいときは、第3の方法がよい。
【0099】
この場合の適量とは、約50μlである。このときの各試薬の濃度は、第1、第2の方法に対して、2倍の濃度とするのがよい。
【0100】
このような構成にすることで、小さな微生物が捕集でき、蛍光発光をきれいに捕らえられることすなわち蛍光を認識しやすくできることで、実施の形態1に記載した微生物計測システムより、計測精度の向上した微生物計測システムが提供できる。
【0101】
(実施の形態3)
実施の形態1または2と同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【0102】
図3は、本発明の実施の形態3のろ過フィルター17を保持した構造体とをろ過フィルター保持部18を装着可能としたステージ7の構成図の一例である。
【0103】
ろ過フィルター保持部18はろ過フィルター17を挟み込む構造と、ろ過フィルター17を保持する構造と、ろ過フィルター保持部18の位置を決める構造を備えて構成され、ステージ7は、ろ過フィルター17を受け止める構造と、ろ過フィルター保持部18を受け止める構造と、ろ過フィルターの保持部18の位置を決めるための突起部をはめ込む溝を備えたステージ7から構成される。ろ過フィルター保持部18の受け止め部は、ろ過フィルター保持部18が装着された場合、ろ過フィルター17がろ過フィルター受け止め部で受け止められた時、ろ過フィルター保持部18とろ過フィルター受け止め部は、ろ過フィルターの平面度を上げるために、少し隙間があき直接は当たらない構造としている。その隙間は10μmから200μmである。
【0104】
こうすることで、検体と、カメラの間を一定に保つことができ、安定したピント精度の画像を取得することができ、計測精度を安定させることができる。
【0105】
実施の形態1と同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【0106】
(実施の形態4)
実施の形態1乃至3のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。
【0107】
図4は、本発明の実施の形態4の微生物計測システムの構成図の一例である。図4に示すように、図2に対して、ノイズ画像撮影手段19及びノイズ画像除去手段20を追加した構成としたものである。
【0108】
ノイズ画像撮影手段19は、パソコン15からの信号により、励起光を照射せずに撮影手段5によりノイズ画像を取得することで行われる。
【0109】
この時、撮影手段5により撮影された画像の露光時間は、蛍光画像撮影時よりも長い時間とする。例えば6秒の蛍光画像撮影時間であれば、ノイズ画像撮影手段19は、10秒の露光時間とする。このようにすることにより、撮影手段5から発生する画像上の一定したノイズを撮影することができ、蛍光画像A、B、C、と比較することで、蛍光画像上のノイズを特定することができる。
【0110】
また、ノイズ除去手段20は、撮影した蛍光画像とノイズ画像撮影手段19で撮影した前記ノイズ画像を比較し、前記ノイズ画像に存在するノイズ発光点を、前記蛍光画像から削除することで、行われる。削除する方法の一例としては、蛍光画像と、ノイズ画像を重ね合わせ、画像同士を減算する方法等で行われる。
【0111】
このように、ノイズ画像を撮影し、蛍光画像からノイズの発光点を除去することで、計測制度の高い、微生物計測システムが提供できる。
【0112】
(実施の形態5)
実施の形態1乃至4のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図5は、本発明の実施の形態5の微生物計測システムの構成図の一例である。図4に示すように、図4に対して、ろ過フィルター17全体の面積と計測した蛍光画像の面積比から微生物数を推測する微生物数推測手段A21を追加した構成としたものである。
【0113】
本構成による微生物推測手段A21は、次のようにして実現される。
【0114】
ろ過フィルター17全体の面積をあらかじめ、パソコン15から入力しておき、撮影した蛍光画像の面積との比を計算し、撮影した蛍光画像の全面積中の微生物数を計測し、計測した結果にろ過フィルター17の全面積と、撮影全面積の比を掛け合わせろ過フィルター17全面積中の全微生物数を計算することで行われる。
【0115】
計算式としては、次のようになる。
【0116】
全微生物数(ろ過フィルター17全面積中)
=(ろ過フィルター17全面積/蛍光画像撮影全面積)*蛍光画像撮影全面積中の微生物計測数
このような方法で、ろ過フィルター17全面積の微生物数を推測することができるようにすることで、検査対象の検体中の微生物に個数を、ろ過フィルター17全面積を計測しなくても、わかるため、迅速に検査検体中の微生物数を把握することができる微生物計測システムが提供できる。
【0117】
(実施の形態6)
実施の形態1乃至5のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図6は、本発明の実施の形態6の微生物計測システムの構成図の一例である。図6に示すように、図5に対して、1ml中の微生物数を推測する微生物数推測手段B22を追加した構成としたものである。
【0118】
本構成による微生物推測手段B22は、次のようにして実現される。
【0119】
ろ過する検体の量をあらかじめ、パソコン15から入力しておき、計測結果を推測したろ過フィルター17全面積中の微生物数をろ過したろ過量から、1mlあたりの量に換算するよう計算することで行われる。
【0120】
計算式としては、次のようになる。
【0121】
1mlあたりの微生物数
=(ろ過フィルター17全面積中の微生物数の推測値)*(1ml/ろ過量ml)
このような計算にて1mlの微生物数を推測することにより、いろんな検体の混入量を一定の基準で評価することができ、微生物の混入量の比較が容易な微生物計測システムが提供できる。
【0122】
(実施の形態7)
実施の形態1乃至6のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図7は、本発明の実施の形態7の微生物計測システムの構成図の一例である。図7に示すように、図6に対して、採取サンプル中の微生物数を推測する微生物数推測手段C23を追加した構成としたものである。
【0123】
本構成による微生物推測手段C23は、次のようにして実現される。
【0124】
採取したサンプルを希釈して使用する場合、希釈した割合(希釈倍率)を、計測前にパソコン15に入力しておき、計測結果を推測したろ過フィルター17全面積中の微生物数をろ過したろ過量から、1mlあたりの量に換算し、その結果を希釈割合倍する計算をすることで行われる。
【0125】
計算式としては、次のようになる。
【0126】
採取サンプルの微生物数
=(ろ過フィルター17全面積中の微生物数の推測値)*(1ml/ろ過量ml)*希釈倍率
このような計算にて採取したサンプル内の微生物数を推測でき、このようにサンプルの中の微生物数がわかることで、そのサンプルの微生物汚染状況を、直接確認することができる微生物計測システムが提供できる。
【0127】
(実施の形態8)
実施の形態1乃至7のいずれかと同一部分は、同一番号を付し、詳細な説明は省略する。図8は、本発明の実施の形態8の微生物計測システムの構成図の一例である。図8に示すように、図7に対して、警告発生手段24を追加した構成としたものである。
【0128】
本構成による警告発生手段24は、次のようにして実現される。
【0129】
発光点計測手段14、微生物数推測手段A21、微生物数推測手段B22、微生物数推測手段C23により計測された微生物数は、あらかじめ、異常と判定できる数値をパソコン15より入力し、例えば、微生物数上限値を超えた場合、または、規定発光点面積上限値を超えた場合に、警告発生手段24により、パソコン15から警告音を発生させたり、パソコン15の画面に異常を知らせるメッセージを表示することにより行われる。
【0130】
たとえば、この場合の微生物数上限値は、30万個とすると、微生物数推測A21.微生物推測手段B22、微生物推測手段C23のそれぞれの微生物推測手段に応じて30万個を超えたか超えてないかで、異常を判断し、各手段に応じた警告表示を音声や画面で行うようようにする。
【0131】
このように警告発生手段24を備えることで、計測結果に異常があった場合速やかに異常を確認することができ、サンプルに対する対応が早くすることが可能な、微生物計測システムが提供できる。
【産業上の利用可能性】
【0132】
本発明の計測システムは、蛍光染色を施した微生物の蛍光画像を取得し、その蛍光画像を使って微生物を検出することができ、食品工場、医薬品工場、病院などでの、細菌、真菌などの微生物検出などの用途にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【0133】
【図1】本発明の実施の形態1の微生物計測システムの構成図
【図2】本発明の実施の形態2の微生物計測システムの構成図
【図3】本発明の実施の形態3のフィルター装着構造の構成図
【図4】本発明の実施の形態4の微生物計測システムの構成図
【図5】本発明の実施の形態5の微生物計測システムの構成図
【図6】本発明の実施の形態6の微生物計測システムの構成図
【図7】本発明の実施の形態7の微生物計測システムの構成図
【図8】本発明の実施の形態8の微生物計測システムの構成図
【符号の説明】
【0134】
1 第1の励起光源
2 第2の励起光源
3 第1の分光フィルター
4 第2の分光フィルター
5 撮影手段
6 対物レンズ
7 ステージ
8 駆動部
9 分光フィルター切り替え手段
10 制御基板
11 微生物計測装置本体
12 発光点検出手段
13 発光点分別手段
14 発光点計測手段
15 パソコン
16 発光点位置補正手段
17 ろ過フィルター
19 ノイズ画像撮影手段
20 ノイズ画像除去手段
21 微生物数推測手段A
22 微生物数推測手段B
23 微生物数推測手段C
24 警告発生手段
【出願人】 【識別番号】000005821
【氏名又は名称】松下電器産業株式会社
【出願日】 平成18年6月29日(2006.6.29)
【代理人】 【識別番号】100097445
【弁理士】
【氏名又は名称】岩橋 文雄

【識別番号】100109667
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 浩樹

【識別番号】100109151
【弁理士】
【氏名又は名称】永野 大介


【公開番号】 特開2008−5754(P2008−5754A)
【公開日】 平成20年1月17日(2008.1.17)
【出願番号】 特願2006−179141(P2006−179141)