トップ :: C 化学 冶金 :: C08 有機高分子化合物;その製造または化学的加工;それに基づく組成物

【発明の名称】 植物からポリヒドロキシアルカノエートを単離する方法
【発明者】 【氏名】デイビッド ピー. マーチン

【氏名】オリバー ピー. ピープルズ

【氏名】サイモン エフ. ウィリアムズ

【要約】 【課題】トランスジェニック油料作物植物のような植物からポリヒドロキシアルカノエート(「PHA」)を分離するための方法を提供することを本発明の課題とする。

【解決手段】1つの実施態様では、PHAの単離のために、油料作物植物由来のバイオマスは、例えば、粉砕、破砕、または圧延によりプレプロセスされる。次いで、油を、第1の溶媒(この溶媒中に、油は溶解しかつPHAはあまり溶解しない)を用いてバイオマスから抽出し、油を取り除く。次いで、バイオマスは、第2の溶媒(この溶媒中に、PHAは溶解する)を用いて抽出され、PHAをバイオマスから分離し得る。あるいは、PHA含有バイオマスは、化学的薬剤または生化学的薬剤で処理され、PHAをPHA誘導体に化学的に変換する。次いで、PHA誘導体は、物理的分離プロセスを用いて混合物から分離される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
植物油および粉(meal)を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート(「PHA」)を分離する方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、植物からポリエステルを単離する領域に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)は、環境ストレスに応答して種々の生物により合成される、天然に存在するポリエステルのクラスである。概説のために、非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5;ならびに非特許文献6を参照のこと。
【0003】
PHA生体ポリマーは、それらの側鎖の長さに応じて2つの群に分けられ得る(図1)。短い側鎖を有するもの(図1a)(例えば、ポリヒドロキシブチレート(PHB)、R-3-ヒドロキシ酪酸ユニットのホモポリマー)は、結晶熱可塑性プラスチックであるが、長い側鎖を有するPHA(図1b)は、よりエラストマー性である。前者は、約70年間にわたって公知である(非特許文献7)が、一方、後者の物質は、1980年代初期に最初に同定された。非特許文献8。
【0004】
短側鎖物質は、その早い発見およびその望ましい物理的特性のために、より広範に研究されてきた。天然の熱可塑性プラスチックであるPHAポリマーは、従来のポリマー技術を用いてプロセッシングされ得、そして産業上有用な特性(例えば、土壌中および海洋環境における生分解性、生体適合性、ならびに良好なバリア特性)を有する。これらの特性により、これらの物質は、広範な産業上の適用に有用である。
【0005】
PHAポリマーは、細菌の乾燥細胞重量の90%までを構成し得、これらは細菌細胞内の分散顆粒(discretegranules)として見出される。これらのPHA顆粒は、栄養制限に応答して蓄積し、そして炭素およびエネルギーの保存物質として作用する。異なる経路が、各クラスのこれらのポリマーを産生する微生物により用いられる。短側鎖ポリヒドロキシアルカノエート(SSCPHA)に至る経路には、3つの酵素(チオラーゼ、レダクターゼ、およびPHBシンターゼ(時々ポリメラーゼと呼ばれる))が挙げられる。この経路を用いて、アセチル-補酵素Aの2分子を縮合して、アセトアセチル-補酵素Aを得、続いてこの中間体をR-3-ヒドロキシブチリル-補酵素Aに還元し、続いて重合することにより、ホモポリマーPHBを合成する(図2a)。この経路における最後の酵素(シンターゼ)は、R-4-ヒドロキシ酸ユニットおよびR-5-ヒドロキシ酸ユニットを含むC3〜C5モノマーユニットを適合し得る基質特異性を有する。この生合成経路は、例えば、細菌ZoogloearamigeraおよびAlcaligeneseutrophus中に見出される。
【0006】
長側鎖ポリヒドロキシアルカノエート(LSCPHA)を作製するのに用いられる生合成経路は、未だに部分的に不明であるが、LSCPHAに至るモノマーヒドロキシアシルユニットは、脂肪酸のβ-酸化および脂肪酸経路により誘導される(図2b)と現在考えられている。次いで、これらの経路から得られるR-3-ヒドロキシアシル-補酵素基質は、PHAシンターゼ(これは、C6〜C14の範囲内にあるより大きいモノマーユニットを選択する(favoring)基質特異性を有する)により重合される。例えば、Pseudomonadsにより、長側鎖PHAが産生される。
【0007】
PHAの生合成は、生化学レベルおよび遺伝子レベルの両方において、広範な細菌において研究されており、そして非特許文献9において概説される。最初のPHAシンターゼ遺伝子は1989年に同定されそして特徴付けされた(非特許文献10;ならびにPeoplesand Sinskeyの特許文献1、特許文献2、および特許文献3)ので、多くの他の微生物PHAポリメラーゼが研究され、そしてそれらのDNA配列およびアミノ酸配列が公開されている。非特許文献11。より近年では、Chromatiumvinosum(非特許文献12;ならびに特許文献4)およびThiocystis violacea(非特許文献13)由来の2つのサブユニットPHAシンターゼが記載されている。
【0008】
例えば、Z.ramigeraおよびA.eutrophusにおけるSSCPHAの産生を担う酵素をコードする遺伝子が単離され、そして配列決定されている。非特許文献14;非特許文献15;非特許文献16、ならびに非特許文献17;ならびに非特許文献18。
【特許文献1】米国特許第5,229,279号明細書
【特許文献2】米国特許第5,245,023号明細書
【特許文献3】米国特許第5,250,430号明細書
【特許文献4】国際公開第93/02194号パンフレット
【非特許文献1】Byrom, D.、「MiscellaneousBiomaterials」(D. Byrom編、「Biomaterials」MacMillanPublishers、London、1991、333-359頁中)
【非特許文献2】Hocking、P.J. およびMarchessault, R. H.、「Biopolyesters」(G. J. L. Griffin編、「ChemistryandTechnology of Biodegradable Polymers」、Chapman and Hall、London、1994、48-96頁
【非特許文献3】Holmes,P. A.、「Biologically Produced (R)-3-hydroxyalkanoatePolymers andCopolymers」(D. C. Bassett編、「Developments in Crystalline Polymers」、Elsevier、London、第2巻、1988、1-65頁中)
【非特許文献4】Laffertyら、「MicrobialProduction of Poly-β-hydroxybutyric acid」、H. J.RehmおよびG. Reed編、「Biotechnology」、Verlagsgesellschaft、Weinheim、第66巻、1988、135-176頁
【非特許文献5】MullerおよびSeebach、Angew.Chem. Int. Ed、Engl.、32:477-502(1993)
【非特許文献6】Steinbuchel, A.、「PolyhydroxyalkanoicAcids」、Byrom, D.編、「Biomaterials」、MacMillanPublishers、London、1991、123-213頁
【非特許文献7】LemoigneおよびRoukhelman、Annalesdes Fermentations, 5:527-536(1925)
【非特許文献8】De Smetら、J.Bacteriol.、154:870-878(1983)
【非特許文献9】Steinbuchelら、FEMSMicrobiology Reviews、103:217-230(1992)
【非特許文献10】Peoplesand Sinskey、J. Biol Chem.、264:15298-15303(1989)
【非特許文献11】Steinbuchelら、FEMSMicrobiology Reviews、103:217-230(1992)
【非特許文献12】Liebersgesell,M.およびSteinbuchel, A.、European J. Biochem.、209:135-150(1992)
【非特許文献13】Thiocystis violacea(Liebersgesell, M.およびSteinbuchel, A.、Appl.Microbiol.Biotechnol. 38:493-501(1993)
【非特許文献14】PeoplesおよびSinsky、Prog,Biotechnol. 3:51-56(1987)
【非特許文献15】Peoplesら、J. Biol. Chem.、262:97-102(1987)
【非特許文献16】PeoplesおよびSinsky(1989)、J. Biol. Chem. 264:15298-15303、J.Biol. Chem. 264:15293-15297
【非特許文献17】MolecularMicrobiol. 3:349-357;Slaterら、J. Bacteriol.、170:4431-4436(1988)
【非特許文献18】Schubertら、J.Bacteriol.、170:5837-5847(1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
PHAを産生する微生物は、60%(全乾燥重量)より多くまでPHAを産生し、これらは有機溶媒により容易に抽出され得る。Laffertyら、「MicrobialProductionof Poly-β-Hydroxybutyric Acid」(H. J. RehmおよびG. Reed編、「Biotechnology」、Verlagsgesellschaft、Weinheim、第66巻、1988、135-176頁中)。植物において、PHAの抽出および回収は、大量の植物油の存在とより低い割合のPHAにより、著しく複雑である。これらの複雑化要因のために、植物からのPHAの首尾良い抽出、分離、および回収がより難しくなっている。
【0010】
植物バイオマス(biomass)由来のポリヒドロキシアルカノエートの大規模なプロセシングおよび精製のための方法を開発することが必要とされている。従って、本発明の目的は、植物バイオマス由来のPHAを大規模でプロセシングするための方法を提供することである。本発明の別の目的は、トランスジェニック油料作物植物(oilcropplant)からPHAを単離するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、植物油のような非PHA産生物の回収もまた最大化されるように、油料種子作物植物(oilseedcrop plant)由来の植物バイオマスをプロセッシングするための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、以下を提供する。
(項目1) 植物油および粉(meal)を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート(「PHA」)を分離する方法であって、第1の溶媒を用いて該植物バイオマスを抽出して該バイオマスから該油を本質的に除去する工程、次いで、該植物バイオマスから該PHAを分離する工程を包含する、方法。
(項目2) 前記植物バイオマスが、トランスジェニック植物に由来する、項目1に記載の方法。
(項目3) 前記バイオマスから前記PHAを分離する前に、該PHAを誘導体化する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目4) 前記分離されたPHAが、以下の式を有する1つ以上のユニットを含む、項目1に記載の方法であって:
−OCR(CR)CO−
ここで、nは0または整数であり;そして
ここで、R、R、R、およびRはそれぞれ、炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子からなる群より独立して選択される、方法。
(項目5) 前記分離されたPHAが、前記ユニットの、モノマー、ダイマー、直線状オリゴマーおよび環状オリゴマー、ならびにラクトンからなる群より選択される、項目4に記載の方法。
(項目6) 前記分離されたPHAが、以下からなる群より選択される項目3に記載の方法であって:
次式で定義されるエステル:HOCR(CR)CO
次式で定義されるアミド:HOCR(CR)CONR
次式で定義されるチオエステル:HOCR(CR)COSR
次式で定義される酸:HOCR(CR)COH;
次式で定義されるエーテル:ROCR(CR)CO
次式で定義されるエステル:RCO(CR)CO
次式で定義される不飽和化合物:
C=CR(CR)CO;および
CC(R)=C(R)CO
次式で定義されるジオール:HOCR(CR)CHOH;
次式で定義されるラクトンまたはマクロライド:
【0012】
【化1】



ここで、xは整数である;ならびに
以下の式で定義されるケトンまたはアルデヒド:
【0013】
【化2】



ここで、nは0または整数であり;そして
ここで、R、R、R、R、R、およびRはそれぞれ、炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子からなる群より独立して選択される、方法。
(項目7) 項目1に記載の方法であって、
a)PHAを含有する植物バイオマスを提供する工程;
b)該植物バイオマスをプレプロセシングして、該PHA、油および植物粉を含有する混合物を得る工程;
c)該油が溶解する温度にて、該油は溶解しかつ該PHAはあまり溶解しない第1の溶媒を用いて該混合物から該油を抽出し、該PHAを含有する残留粉混合物を得る工程;および
d)該PHAが溶解する第2の溶媒を用いて、工程c)において得られた該残留粉混合物を抽出し、該バイオマスから該PHAを分離する工程、
を包含する、方法。
(項目8) 項目1に記載の方法であって、
a)PHAを含有する植物バイオマスを提供する工程;
b)該植物バイオマスをプレプロセシングして、該PHA、油および植物粉を含有する混合物を得る工程;
c)該油が溶解する温度にて、該油は溶解しかつ該PHAはあまり溶解しない第1の溶媒を用いて該混合物から該油を抽出し、該PHAを含有する残留粉混合物を得る工程;
d)工程c)において得られたPHAを含有する該残留粉混合物を、少なくとも1つの化学的薬剤または生化学的薬剤で処理して、該PHAを化学的に誘導体化する工程;および
e)工程d)において得られた該残留粉混合物から誘導体化されたPHAを分離する工程
を包含する、方法。
(項目9) 前記工程b)が、以下からなる群より選択される1つ以上のプロセス:乾燥、皮むき、クリーニング、エイジング、秤量、分解、圧ぺん、加圧、圧延、粉砕、クッキング、破砕、沈降、濾過、洗浄、遠心分離分画、および空気分級、を用いて前記植物バイオマスをプレプロセシングする工程を包含する、項目7または8に記載の方法。
(項目10) 前記第2の溶媒が、塩素化された有機溶媒、アルキルカーボネート、アルコール、ヒドロキシ酸、酢酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目7に記載の方法。
(項目11) 前記第2の溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテートからなる群より選択される塩素化された有機溶媒を包含する、項目10に記載の方法。
(項目12) 前記第2の溶媒が、プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート、トリフルオロエタノール、無水酢酸、酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ピリジン、および3より多い炭素原子を有するアルコールからなる群より選択される組成物を包含する、項目7に記載の方法。
(項目13) 前記工程d)において、前記PHAを含有する残留粉混合物が、酸、塩基、界面活性剤、酸化剤、キレート剤、還元剤、求核剤、求電子剤、金属イオン、およびフリーラジカルからなる群より選択される、少なくとも1つの化学的薬剤で処理される、項目8に記載の方法。
(項目14) 前記PHAが、エステル化、エステル交換、加水分解、けん化、アミノリシス、チオリシス、エーテル化、シリル化、付加、脱離、再配列、還元、および縮合からなる群より選択される化学変換により誘導体化される、項目8に記載の方法。
(項目15) 前記生化学的薬剤が酵素である、項目8に記載の方法。
(項目16) 前記酵素が、デポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスホリラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群より選択される、項目15に記載の方法。
(項目17) 前記工程e)において、前記誘導体化されたPHAが、蒸留、抽出、遠心分離、濾過、蒸発、およびクロマトグラフィーからなる群より選択される物理的プロセスにより分離される、項目8に記載の方法。
(項目18) 前記第1および第2の溶媒がそれぞれ、30℃と250℃との間の沸点を有する、項目7または8に記載の方法。
(項目19) 前記分離されたPHA誘導体を沈殿させる工程をさらに包含する、項目7または8に記載の方法。
(項目20) 前記バイオマスが、ダイズ、ワタ、ココナッツ、アメリカホドイモ、ナタネ、ヒマワリの種子、オリーブ、ヤシ、ゴマの種子、アマニ、トウゴマ、ベニバナの種子、タバコ、トウモロコシ、アブラナ、およびジャガイモからなる群より選択される植物供給源に由来する、項目1に記載の方法。
(項目21) 前記分離されたPHAが、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシヘプタノエート、ヒドロキシオクタノエート、ヒドロキシノナノエート、およびヒドロキシデカノエートからなる群より選択される、1つ以上の同じまたは異なるユニットを含む、項目4に記載の方法。
(項目22) 前記分離されたPHAが、3-ヒドロキシ酪酸、4-ヒドロキシ酪酸、クロトン酸、およびそのアルキルエステルからなる群より選択される、項目8に記載の方法。
(項目23) 前記植物バイオマスが、Acinetobacter、Aeromonas、Alcaligenes、Azotobacter、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Chromatium、Flavobacterium、Halobacterium、Pseudomonads、Nocardia、Rhodococcus、Thiocystis、Streptomyces、Streptococcus、およびZoogloeaからなる群より選択される微生物由来の異種PHAシンターゼ遺伝子を含む植物に由来する、項目2に記載の方法。
(項目24) 植物油を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート(「PHA」)を分離する方法であって、該油および該PHAが溶解する温度にて、該油および該PHAが溶解する第1の溶媒を用いて該植物バイオマスを抽出して、該バイオマスから該油および該PHAを本質的に取り出す工程、次いで、該油から該PHAを分離する工程を包含する、方法
(項目25) 前記植物バイオマスが、トランスジェニック油料作物植物に由来する、項目24に記載の方法。
(項目26) 項目25に記載の方法であって、
a)PHAを含有する植物バイオマスを提供する工程;
b)該植物バイオマスをプレプロセシングして、該PHA、油および植物粉の混合物を得る工程;
c)該油および該PHAは溶解し、かつ該粉はあまり溶解しない第1の溶媒を用いて、該混合物から該油および該PHAを抽出する工程;および
d)該油から該PHAを分離する工程;
を包含する、方法。
(項目27) 前記工程d)において、前記PHA−油混合物を化学的薬剤または生化学的薬剤で処理し、それによって該PHAを化学的に誘導体化し、そして誘導体化されたPHAを該油から分離することによって、該PHAが該油から分離される、項目26に記載の方法。
(項目28) 前記溶媒が、塩素化された有機溶媒、アルキルカーボネート、アルコール、ヒドロキシ酸および炭化水素、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(項目29) 前記溶媒が、ヘキサン、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、酢酸、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、およびピリジンからなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(項目30) 前記生化学的薬剤が、PHAデポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒドラターゼ、ホスホリラーゼ、セルラーゼ、およびグルコシダーゼからなる群より選択される酵素である、項目27に記載の方法。
(項目31) 前記分離されたPHAが、アミド、チオエステル、酸、エーテル、エステル、不飽和化合物、ジオール、ケトン、およびアルデヒドからなる群より選択される官能基を含む、項目7、8、26、または27に記載の方法。
(項目32) 前記分離されたPHAが、3-ヒドロキシ酸、4-ヒドロキシ酸、および5-ヒドロキシ酸からなる群より選択される1つ以上のユニットを含む、項目7、8、26、または27に記載の方法。
(項目33) 項目7または26に記載の方法であって、前記分離されたPHAが有機溶媒中にて分離され;ここで、該方法が、該有機溶媒中の該PHAを、界面活性剤を含有する水溶液中にエマルジョン化し、それによりPHAラテックスを形成する工程をさらに包含する、方法。
(項目34) 項目7または26に記載の方法であって、前記分離されたPHAが有機溶媒中にて分離され、ここで、該方法が、該有機溶媒中の該PHAを水溶液中にエマルジョン化する工程、および該溶媒を除去し、それによりPHAラテックスを形成する工程をさらに包含する、方法。
【0014】
(発明の要旨)
ポリヒドロキシアルカノエート(「PHA」)を植物から分離するための方法が提供される。1つの実施態様では、植物油を含むトランスジェニック作物植物に由来する植物バイオマスからPHAを単離するための方法が提供される。この方法は、油およびPHAの両方が植物バイオマスから回収されることを有利に可能にする。1つの実施態様では、PHAを単離するために、油料作物植物に由来するバイオマスは、例えば粉砕、破砕、または圧延によってプレプロセシング(pre-process)される。次いで、油は、第1の溶媒(油はこの溶媒に溶解し、PHAはこの溶媒にあまり溶解しない)を用いてバイオマスから抽出され、油はPHAから分離される。次いで、実質的に油を含まない植物バイオマスは、第2の溶媒(PHAはこの溶媒に溶解する)を用いて抽出され、PHAはバイオマスから分離される。あるいは、PHA含有バイオマスは、化学的薬剤または生化学的薬剤(例えば、酵素)を用いて処理され、PHAはPHA誘導体に化学的に変換される。次いで、誘導体化されたPHAは、例えば物理的分離プロセス(例えば、蒸留、抽出、またはクロマトグラフィー)を用いて、混合物から分離される。好都合なことに、この方法を用いて、植物油、PHA、およびPHA誘導体の全てが、トランスジェニックな油料作物植物のような植物から大規模で回収され得、そして精製され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【0015】
(発明の詳細な説明)
植物油および粉(meal)を含む植物バイオマスからポリヒドロキシアルカノエート(「PHA」)を分離するための方法が提供される。植物バイオマスから単離され得るPHAは、PHAの分解物また他の生成物(例えば、モノマー、ダイマー、オリゴマー、酸、エステル、アミド、およびラクトン)を含み、そしてこれは、バイオマスをプロセシングの間の、化学的、生化学的、または物理的処理から形成され得るか、または植物バイオマス内に生じるプロセスから形成され得る。好ましい実施態様では、PHAは、トランスジェニック油料作物植物に由来するバイオマスから単離される。PHA物質の回収を最大にすることに加えて、バイオマスからの商業的に有用な非PHA生成物の回収もまた最大となる。例えば、油料種子植物の種子からPHAを分離する場合、油および粉もまた単離され得、次いで商業的に使用され得る。
【0016】
(I.PHA単離のための物質)
(A.単離され得るPHA物質)
植物バイオマスから単離され得るPHA物質は、モノマー、ポリマー、およびPHAから誘導される他の生成物(化学的および生物学的に改変された誘導体を含む)を含む。PHA物質は、1つの実施態様では、以下の式Iの1つ以上のユニット(例えば、10〜100,000ユニット、好ましくは、100〜30,000ユニット)を含むものとして定義される:
−OCR(CR)CO−;
ここで、nは0または整数(例えば、1〜15の間)であり、そして好ましい実施態様では、1〜4の間であり;そして
ここで、R、R、R、およびRは、独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基;ハロおよびヒドロキシ置換基;ヒドロキシ基;ハロゲン基;窒素置換基;酸素置換基;ならびに/または水素原子であり得る。
【0017】
本明細書中に定義される、式-(CR)-は、以下の式を含むがそれに限定されないように定義される:
-CR (ここで、nは1である);
-CRCR3'4'- (ここで、nは2である);および
-CRCR3'4'CR"R"- (ここで、nは3である);
ここで,R、R、R3'、R4'、R"、およびR"は、独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基;ハロおよびヒドロキシ置換基;ヒドロキシ基;ハロゲン基;窒素置換基;酸素置換基;ならびに/または水素原子であり得る。従って、式Iは、3-ヒドロキシ酸(n=1)、4-ヒドロキシ酸(n=2)、5-ヒドロキシ酸(n=3)から誘導されるユニットを含む。
【0018】
これらのユニットは、ホモポリマーのように同一であってもよく、あるいはコポリマーまたはターポリマーのように2つ以上の異なるユニットから選択されてもよい。1つの実施態様におけるポリマーは、300ダルトンを超える、例えば、300ダルトンと1,000,000ダルトンとの間、そして好適な実施態様では、10,000ダルトンと3,000,000ダルトンとの間の分子量を有する。1つの実施態様では、PHAホモポリマー(例えば、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、またはポリ乳酸)が単離され得る。さらに、少なくとも2つのヒドロキシアルカノエートのモノマー(例えば、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシヘプタノエート、ヒドロキシオクタノエート、ヒドロキシノナノエート、およびヒドロキシデカノエート)を含むPHAコポリマーまたはターポリマーが、単離され得る。PHA(3-ヒドロキシ酸、4-ヒドロキシ酸、および5−ヒドロキシ酸のモノマー、およびポリマー、ならびに誘導体を含む)もまた単離され得る。
【0019】
PHAポリマーはまた、非ヒドロキシ酸ユニット(例えば、長鎖脂肪酸、アミノ酸、炭水化物、リン含有化合物およびイオウ含有化合物、ならびにグリセリンのようなトリオール)を含んでもよく、またはこれらを含むように改変されてもよい。単離され得るPHA生成物は、バイオマスを物理的、化学的または生化学的に処理した際に形成される誘導体、あるいはヒドロキシ酸モノマー、ダイマー、トリマー、直線状および環状オリゴマー、ならびにラクトンを含むバイオマス内のプロセスによって形成される誘導体を含む。単離され得るPHA誘導体生成物は、ポリヒドロキシアルカノエートまたはポリヒドロキシアルカノエートから誘導されるモノマーの、エステル、ジオール、不飽和化合物、アルデヒド、酸、アルコール、ラクトン、環状および直線状エステル、アミド、およびチオエステルを含む。
【0020】
植物バイオマスから単離され得る代表的なPHA生成物は、以下を含む:
次式で定義されるエステル:HOCR(CR)CO
次式で定義されるアミド:HOCR(CR)CONR
次式で定義されるチオエステル:HOCR(CR)COSR
次式で定義される酸:HOCR(CR)COH;
次式で定義されるエーテル:ROCR(CR)CO
次式で定義されるエステル:RCO(CR)CO
次式で定義される不飽和化合物:
C=CR(CR)CO;および
CC(R)=C(R)CO
次式で定義されるジオール:HOCR(CR)CHOH;
次式で定義されるラクトンまたはマクロライド:
【0021】
【化3】



ここで、xは整数、例えば、1〜10である;ならびに
以下の式で定義されるケトンまたはアルデヒド:
【0022】
【化4】



ここで、nは0または整数であり;そして
ここで、R、R、R、R、R、およびRは、それぞれ独立して、長鎖炭化水素基を含む炭化水素基、ハロおよびヒドロキシ置換基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、窒素置換基、酸素置換基、ならびに水素原子であり;そしてここで、-(CR)-は、上記で定義される通りである。
【0023】
商業的に有用なモノマーPHA生成物(例えば、3-ヒドロキシ酪酸またはクロトン酸、またはそのアルキルエステル(メチル-3-ヒドロキシブタノエート、エチル-3-ヒドロキシブタノエート、プロピル-3-ヒドロキシブタノエートおよびブチル-3-ヒドロキシブタノエートを含む))もまた、単離され得る。PHA由来のヒドロキシ酸モノマーは、より高分子量の形態に加えて、さらなる改変をしてもしなくても商業的に使用され得る価値ある化学物質の供給源である。
【0024】
本明細書中で使用される、用語「PHA物質」または「PHA」または「ポリヒドロキシアルカノエート」は、プロセシングの前にバイオマス中に元来存在する、モノマー、ポリマー、および他のPHAベースの物質、ならびにプロセシングの間に形成される生成物(例えば、植物バイオマス内に生じる分解またはプロセスから形成される生成物、あるいは化学的薬剤または生物学的薬剤でバイオマスを処理して化学的に変換させることにによって形成される誘導体生成物)を意味する。
【0025】
(B.PHAが単離され得る植物供給源)
(植物種)
PHAおよびPHA生成物は、植物(例えば、ダイズ、ワタ、ココナッツ、アメリカホドイモ、ナタネ、ヒマワリの種子、オリーブ、ヤシ、ゴマの種子、アマニ、トウゴマ(castor)、ベニバナの種子、タバコ、およびジャガイモ)由来の植物バイオマスから単離され得る。好ましい実施態様において、バイオマスは、油料作物植物(特に、ナタネ、ヒマワリの種子、ベニバナの種子、アマニ、およびダイズ)に由来し得る。PHAポリマーに加えて、種子作物植物中の植物油が単離され得、そしてプロセシングの間に回収される。植物油は、代表的には、種子の10〜50重量%を構成する。植物油の世界的な需要が考慮されている。植物バイオマスをプロセシングするための方法は、単離される特定のPHAポリマーまたは誘導体の性質に基づいて、および抽出される植物作物および植物成分の型に基づいて適合され得る。
【0026】
(トランスジェニック植物の作製)
トランスジェニック油料作物植物の使用は、多くの利点を提供する。PHA生成のためのトランスジェニック作物植物は、当該分野で利用可能な方法を用いて得られ得る。トランスジェニック植物作物の作製は、石油化学に由来するプラスチックと価格および規模の両方で競争し得るPHAポリマーを生成し得る。トランスジェニック植物由来のPHAポリマーまたはそれらの誘導体は、商業的に有用な形態で植物バイオマスからプロセスされ、そして分離され得る。植物作物におけるPHAの位置(例えば、葉、種子、茎、またはそれらの組合せ)は、植物からのPHAの収率を最大にするために変化され得る。
【0027】
例えば、Z.ramigeraおよびA.eutrophusの短側鎖PHAの生成を担う酵素をコードする遺伝子が、同定され、単離され、そして配列決定されている。PeoplesおよびSinskey,Prog.Biotechnol.3: 51-56 (1987); Peoplesら、J.Biol.Chem., 262:97-102 (1987);PeoplesおよびSinskey (1989), J.Biol.Chem. 264: 15298-15303,J.Biol.Chem. 264:15293-15297、およびMolecular Microbiol. 3: 349-357;Slaterら、J.Bacteriol.,170:4431-4436 (1988);およびSchubertら、J.Bacteriol.,170:5837-5847 (1988)。A.eutrophusにおいて、それらは、短側鎖PHAのシンターゼ、チオラーゼ、およびレダクターゼをそれぞれコードする、オペロンphbC-phbA-phbB遺伝子から見出された。長側鎖PHAについては、Pseudomonas生物のそのシンターゼ酵素が、pha遺伝子座によりコードされると見出された。この遺伝子座は、2つの密接に関連するPHAシンターゼ遺伝子であるphaAおよびphaC、ならびにphaB遺伝子の産物であるデポリメラーゼ遺伝子を含む。
【0028】
トランスジェニック作物種においてPHAポリメラーゼを産生するために使用され得る方法は、米国特許第5,245,023号および同第5,250,430号;WO91/00917;WO92/19747;WO 93/02187;WO 93/02194;WO 94/11519;WO 94/12014;WO94/23027;WO 95/05472;Poirierら、Science,256: 520-523 (1992)、Poirierら、Bio/Technol.,13:142-150 (1995)、およびNawrathら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12760-12764(1994)に記載されている。
【0029】
トランスジェニック作物種を形成するために、PHAシンターゼをコードする遺伝子を微生物から植物細胞に移入して、適切なレベルのPHAシンターゼ酵素の産生を得る。遺伝子は、微生物(例えば、Acinetobacter、Aeromonas、Alcaligenes、Azotobacter、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Chromatium、Flavobacterium、Halobacterium、Pseudomonads、Nocardia、Rhodococcus、Thiocystis、Streptomyces、Streptococcus、またはZoogloea)に由来し得る。さらなるPHA生合成遺伝子(例えば、アセトアセチル-CoAレダクターゼ遺伝子またはPHAシンターゼ酵素の基質を合成するために必要とされる酵素をコードする他の遺伝子)もまた提供され得る。異なる植物組織または細胞小器官における発現は、当業者に公知の方法を用いて制御され得る。GasserおよびFraley,Science,244:1293-1299 (1989)。PHBは、標準的な技術により遺伝子操作された植物系において産生されている。Poirer,Y.ら、Science,256:520-523 (1992); Poirier,Yら、Bio/Technol., 13: 142-150 (1995);およびNawrath,Cら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 91:12760-12764 (1994)。
【0030】
好ましい実施態様において、抽出前の植物バイオマスのPHA含有量は、バイオマスの乾燥重量の少なくとも1重量%、より好ましくはバイオマスの乾燥重量の5〜95重量%、そして別の好ましい実施態様においてバイオマスの乾燥重量の約5〜60重量%、最も好ましくは10〜60%である。好ましくは、PHAの少なくとも24%が、油から分離するプロセスにおいて回収される。
【0031】
(II.植物からのPHAの単離のための方法)
(A.植物バイオマスのプレプロセシング)
PHA含有植物バイオマス(例えば、異種PHAシンターゼ遺伝子を含むトランスジェニック油料作物植物)が栽培され、そして収穫される。植物バイオマスは、PHAポリマーの抽出の前に、当該分野で利用可能な方法(例えば、撹拌、加熱、冷却、圧縮、減圧、超音波処理、遠心分離、および/または放射)を用いてプレプロセシングされ得る。本明細書中で使用する用語「植物バイオマス」は、植物の構成部分(例えば、種子、葉、葉柄および茎)をいう。さらに、植物バイオマスは、乾燥、皮むき、クリーニング、エイジング、秤量、分解、圧ぺん、加圧、圧延、粉砕、クッキング、破砕、沈降、および/または濾過を含む手順の任意の1つ以上の組合せを用いてプレプロセシングされ得る。油を有する植物のプロセシングにおける粉から油を分離するこれらの手順の使用は、「OilCropsof the World」、G.Robblenら編、McGraw-Hill Publishing Company, 1989, 第11章に記載される。さらに、乾式製粉および湿式製粉の両方のアプローチを含むトウモロコシ製粉に使用される方法は、デンプンを含む胚乳から油を含む胚を分離する工程を含有する。これは、例えば、「CornChemistryand Technology」、1994年版、Watson,S.A.およびRamstad,P.E.編、AmericanAssociation ofCereal Chemists Inc.,St.Paul,Minnesotaに記載されるような、遠心分離または空気分級により達成され得る。
【0032】
(B.植物バイオマスの抽出)
PHAのモノマー、ポリマーおよび誘導体は、適切な手段(溶媒抽出および/または溶媒洗浄、水抽出および/または水洗浄、破砕、温度処理、酵素処理、遠心分離、超臨界抽出法、高圧処理および/または減圧処理、クロマトグラフィー、蒸留、融解、あるいはPHA物質の分離を容易にするための試薬を用いた処理を含む)を用いて植物バイオマスから取り出され得る。
【0033】
当該分野で利用可能なプレプロセシング物質から油を抽出する方法、例えば、油エキスペラー(expeller)加圧(ここで、油は、油を含有する物質から機械的に圧搾される)、および前加圧溶媒抽出(ここで、油の一部は、エキスペラーにより取り出され、そして残余物は、炭化水素(例えば、ヘキサン)のような有機溶媒を用いる抽出により取り出される)もまた使用され得る。さらに、二酸化炭素およびプロパンを含む超臨界気体が使用され得る。他の方法として、直接溶媒抽出(ここで、油は、馴化(conditioned)種子から有機溶媒を用いて直接取り出され;プロパン精製により脂肪は分離され;そして脂肪または油の水による加水分解を含む脂肪分解により、グリセロールおよび脂肪酸が生成される)が挙げられる。「OilCropsof the World」、G.Robblenら編、McGraw-Hill Publishing Company, 1989;「LiquidExtraction」、R.Treybal編、McGraw-HillBook,New York,1951;および「World Oilseeds:Chemistry, Technology, and Utilization」、D.K.Salunkheら編、VanNostrand Reinhol,New York,1992。
【0034】
(植物バイオマスからの油の抽出)
植物バイオマスからPHAを単離するための1つの好ましい方法は、図3のフローチャートにおいて例示される。この処理において、PHAを含有する植物バイオマスは、最初に必要に応じて上記に記載したようにプレプロセシングされる。次いで、プレプロセシングされたかまたはプロセシングされていないPHAを含有する植物バイオマスは、油が溶解しかつPHAおよび粉が高度に溶解しない溶媒に抽出されて、PHAを含有する植物バイオマスから大部分のまたは全ての油が取り出される。この溶媒は、油が良好に抽出され、そしてPHAおよび植物粉が低い溶解度により乏しく(poor)抽出されるように選択される。PHA-油-粉の混合物の抽出により、図3のフローチャートにおいて例示されるように、PHAを本質的に含まない油画分(例えば、約10重量%未満のPHAを含む)、および油を本質的に含まないPHA-粉混合物(例えば、約10重量%未満の油を含む)が得られる。次いで、PHA-粉混合物は、PHAが溶解する第2の溶媒で抽出されて、精製されたPHA物質が得られる。あるいは、図3に例示されるように、PHA-粉混合物は化学的または酵素的に処理され、次いでPHA誘導体が粉から単離されて得られる。
【0035】
植物バイオマスから油を抽出するために使用される第1の溶媒は、油を可溶化するその能力に基づいて選択される。好ましくは、油が溶解しかつPHAおよび植物物質が高度に溶解しない溶媒が使用される。適切な溶媒として、炭化水素(例えば、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカン)が挙げられる。本明細書中で使用する用語「溶媒」は、複数の溶媒および溶媒混合物(例えば、炭化水素の混合物)を含む。好ましくは、PHAが1%未満、最も好ましくは0.1%未満まで溶解し、かつ油が10%(w/v、室温)を超えて溶解する、第1の溶媒が選択される。
【0036】
バイオマスからPHAおよび油成分を単離するために、バイオマスのPHAおよび油成分に特徴的な物理的性質および溶解度の差を利用する抽出で使用される溶媒が選択される。単離工程は、特定のPHA、植物宿主、またはPHA/植物宿主の組合せに依存して調製される。例えば、PHBおよびLSCPHAの抽出において、異なる溶媒または溶媒の組合せは、それらの溶解度に基づくPHAを含有するトランスジェニック植物バイオマスからのそれらの抽出で使用される。
【0037】
PHAが、第2の溶媒を用いた処理によりPHA-粉産物から分離される実施態様において、第2の溶媒(図3における溶媒2)は、PHAが良好に抽出され、そして粉がより乏しく抽出されるその能力に基づいて選択される。使用され得る溶媒として、塩素化された(chloronated)有機溶媒(例えば、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテート)を含む複数の溶媒または溶媒混合物が挙げられる。例えば、炭化水素安定化クロロホルムが使用され得る。使用され得る微生物供給源からPHAを抽出するために使用されている他の溶媒として、アルキルカーボネート(例えば、プロピレンカーボネートおよびエチレンカーボネート)、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ピリジン、3を超える炭素原子を有するヒドロキシ酸およびアルコール、ならびにその混合物が挙げられる。Laffertyら、「MicrobialProductionof Poly-β-Hydroxybutyric Acid」、H.J.RehmおよびG.Reed編、「Biotechnology」、Verlagsgesellschaft,Weinheim,66巻、1988、135-176頁。好ましい実施態様において、第2の溶媒は、塩素化された有機溶媒またはアルキルカーボネートである。さらに好ましい実施態様において、第1および第2の溶媒は、室温と400℃との間、より好ましくは30℃と250℃との間の沸点を有する。
【0038】
溶媒抽出工程はまた、超臨界抽出法(この方法では、エチレン、プロピレン、酸化プロピレン、ブタン、または二酸化炭素のような気体が用いられる)を用いて行われ得る。好ましい実施態様において、気体は、-250℃と室温との間、好ましくは-150と-20℃との間の沸点を有する。PHAは、溶解した状態でも抽出され得る。
【0039】
図3のフローチャートに例示される別の実施態様において、PHA-粉混合物を、化学的または生化学的薬剤(例えば、酵素)を用いて処理して、以下に詳細に記載するようにPHAをPHA誘導体に化学的に変える。次いで、PHA誘導体は、必要に応じて、その後の1つ以上の物理的な分離工程(例えば、蒸留、抽出、遠心分離、濾過、またはクロマトグラフィー)を用いて、植物バイオマスから分離される。
【0040】
(PHAおよび油の抽出)
図4のフローチャートに示される別の実施態様において、PHAを含有する植物バイオマスは、必要に応じて最初に上記のようにプレプロセシングされる。次いで、プレプロセシングされたまたはプロセシングされていないPHAを含有する植物バイオマスは、油およびPHAが溶解し、かつ粉が低い溶解度を有する溶媒中に溶媒抽出されて、油およびPHAが植物粉から本質的に取り出される。その結果、例えば、約10重量%未満の油およびPHAは植物粉に残存する。このプロセスに使用される溶媒は、PHAおよび油に対する良好な抽出剤であり、そして粉に対する乏しい抽出剤であるように選択される。次いで、PHA-油産物中のPHA物質は、物理的分離工程(例えば、蒸留)により、またはPHAと油との間における溶解度差のさらなる利用により、油からさらに分離される。
【0041】
あるいは、以下に記載のように(図4に示されるように)、PHA-油産物は、化学的または生物学的処理により改変されて、PHA誘導体(単数または複数)-油産物が提供され得る。後者のPHA誘導体成分は、物理的プロセッシング(蒸留、溶媒抽出、洗浄、沈澱、超臨界抽出法、濾過、およびクロマトグラフィーを含む)により続いて精製され得る。
【0042】
植物バイオマスから油-PHA成分を抽出するために使用され得る溶媒として、塩素化有機溶媒(例えば、クロロホルム、塩化メチレン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、およびジクロロアセテート)、アルキルカーボネート(例えば、プロピレンカーボネートおよびエチレンカーボネート)、トリフルオロエタノール、無水酢酸、ジメチルホルムアミド、エチルアセトアセテート、トリオレイン、酢酸、トルエン、アルコール、ヒドロキシ酸、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、および/またはピリジンが挙げられる。溶媒はまた、炭化水素(例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、またはデカン、あるいはそれらの混合物)からなり得るか、またはこれらを含み得る。好ましい溶媒は、室温と400℃との間、好ましくは30℃と250℃との間の沸点を有する溶媒である。好ましくは、このような溶媒は、少なくとも5%(w/v、室温)のPHAおよび油成分の両方に対する溶解度を有し、そして図1で定義されたPHAの構造に依存して選択される。PHA物質はまた、融解した状態で抽出され得る。溶媒の選択は、バイオマスが得られる植物、ならびに分離されるPHA、誘導体、油の溶解度特性の選択に依存する。
【0043】
図4のフローチャートに例示されるように、抽出されたPHA-油はまた、以下に詳細に記載されるような、化学的または生物学的薬剤(例えば、PHA物質を分解する酵素)を用いた処理によりPHA誘導体-油生成物を形成するための化学的改変により分離され得る。次いで、PHA誘導体は、例えば、物理的プロセス(例えば、蒸留、抽出、遠心分離、超臨界抽出法、分取濾過(preparationfiltration)、および/またはクロマトグラフィー)を用いて、PHA誘導体-油混合物から分離される。
【0044】
本質的に油を含まないPHAのさらなる精製は、当業者に公知の標準的な手順により行われ得る。
【0045】
(III.PHA誘導体の合成)
上記のように、プロセシングの間、バイオマス中のPHA物質は、物質のそれらの単離の前に、物質の単離を容易にするためかまたは所望の誘導体生成物を生成するために、物理的、化学的、または酵素的な誘導体への変換により誘導体化され得る。形成され得るPHA誘導体として、当該分野で利用可能な方法を用いて形成され得る、酸、エステル、オリゴマー、環状オリゴマー、ラクトン、マクロライド、アミド、アミン、チオエステル、ジオール、および不飽和化合物が挙げられる。Griesbeck,A.およびSeebach,D.,Helv.Chim.Acta,70:1320-1325 (1987); Plattner,D.A., Helv.Chim.Acta, 76:2004-2033 (1993);Seebach,D.ら、「Biological-Chemical Preparation of 3-HydroxycarboxylicAcids andTheir Use in EPC-synthesis」、W.BartmannおよびK.B.Sharpless編、「StereochemistryofOrganic and Bioorganic Transformations」VCH, Weinheim,1987,85-126頁、およびSeebach,D.ら、Chimia,44:112-116 (1990);Org.Synth.,71: 39-47 (1992);Angew.Chem.Int.Ed.Eng.,434-435(1992);およびHelv.Chim.Acta, 77: 1099-1123(1994)。PHAポリマーを形成するために使用され得るエステルを誘導体化するためのさらなる方法は、当業者に公知である。
【0046】
バイオマスのプロセシングにおいてPHA物質を改変するために使用され得る化学的薬剤として、例えば、酸、塩基、界面活性剤、キレーター、酸化剤または還元剤、求核剤または求電子剤、金属イオン、水溶液または有機溶液、ならびにフリーラジカルが挙げられる。使用され得る他の化学的薬剤として、過酸化水素、次亜塩素酸塩、オゾン、およびアルキル過酸化物が挙げられる。化学的変換は、例えば、エステル化、エステル交換、加水分解、けん化、アミノリシス、チオリシス、エーテル化、シリル化、付加、脱離、再配列、または縮合ような化学反応であり得る。例えば、植物バイオマス中のPHA開始物質の分子量より少ない分子量を有する誘導体を生成するために化学的薬剤が使用され得る。さらに、PHA物質は、物理的処理(例えば、加熱、冷却、または撹拌)により改変され得る。
【0047】
PHA物質はまた、例えば、バイオマスまたはPHA物質を分解する生物学的薬剤(例えば、酵素)を用いたバイオマス物質(PHA-粉またはPHA-油の混合物)の処理により、プロセシングの間化学的に改変され得る。使用され得る酵素として、PHAデポリメラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒドラターゼ、ホスホリラーゼ、セルラーゼ、および/またはグリコシダーゼが挙げられる。PHAポリマーは、オリゴマー、モノマー、ダイマー、トリマー、または他の誘導体に変換され得る。PHA官能性はまた、非PHA化学官能性に変換されることもある。
【0048】
(IV.適用)
本明細書中に記載されるように単離されたPHAは、広範な種々の異なる適用に使用され得る。1つの実施態様において、単離されたPHAは、ラテックスを形成するために使用され得る。PCTWO91/13207は、ラテックス(すなわち、非結晶性の、無定型の粒子の水性懸濁液)の形態のβ-ヒドロキシブチレートおよびβ-ヒドロキシバレレートのポリマーまたはコポリマーの使用を開示する。ラテックスは、例えば、生分解性かつ再生利用可能なフィルムまたは被覆紙を形成するために使用され得る。PCTWO96/03468は、構築的な被覆におけるPHAラテックスの使用を記載する。精製された結晶性PHAからPHAラテックスを形成するための方法は、PCTWO94/07940に記載されている。この方法において、有機溶媒中のPHAの精製された溶液(これは、本明細書中に記載されるように得られ得る)は、界面活性剤を含む水溶液にエマルジョン化され、無定型ラテックスが形成される。従って、本明細書中に開示される方法は、種々の産業上の適用および生物医学的適用(例えば、PHAラテックス物質の形成)に使用され得る精製されたPHAを提供した。
【0049】
本発明は、以下の非限定的な実施例からさらに理解される。
【実施例】
【0050】
(実施例1:植物バイオマスからのポリヒドロキシブチレートの抽出)
図3に例示されるプロセスを用いて、ヘキサン(溶媒1)を用いた抽出により、植物バイオマスからポリヒドロキシブチレート(PHB)を単離して、油を取り出し、続いて炭化水素安定化クロロホルム(溶媒2)を用いた抽出によりPHBを単離した。
【0051】
約40重量%の油を含むナタネ(32g)のサンプルを、6gのPHB粉末(Ardrich)と混合し、そして電気食物粉砕器を用いて粉砕した。このサンプルは、34重量%の油および16重量%のPHBを含有するトランスジェニック油料種子の代表例である。混合物を、6時間soxhlet装置中で、300mLのヘキサン(溶媒1)を用いて連続的に抽出し、その後サンプルを冷却して有機溶媒相と固形粉とを得た。有機溶媒を濃縮して黄色の油(11.8g、混合物の31重量%)を得た。NMR分析は、この油がPHBを含まないことを示した。この結果は、PHBを含まない油を、PHA含有植物バイオマスから90%より大きな収率で容易に回収し得ることを示した。次いで、固形粉(7.7g)の一部を、22時間soxhlet装置中で、120mLの炭化水素安定化クロロホルム(溶媒2)を用いてさらに抽出した。クロロホルム溶液の蒸発により、1.15gの重さの黄色/白色のプラスチックフィルムが形成した。粗PHBフィルム(227mg)の一部を、3回、ヘキサンの1mL部分で洗浄した。風乾後、PHBフィルム(86mg)は、オフホワイトの色であった。このフィルムのNMR分析は、本質的に純粋なPHBであることを示した。PHBフィルムの回収は、混合物中の元のPHB含有量に基づいて24%の収量を示す。
【0052】
(実施例2:植物バイオマスからのPHB誘導体の抽出)
図3に例示されるプロセスを用いて、ヘキサン(溶媒1)を用いた植物バイオマスの抽出により、植物バイオマスからポリヒドロキシブチレート(PHB)を単離して、油画分を取り出し、続いて化学的処理、次いで誘導体形態のPHBの物理的分離を行った。
【0053】
実施例1からのPHB含有残存粉(2.32g)の一部を、15.5時間、n-ブタノール(25mL)および濃硫酸(0.33mL)と共に加熱還流した。得られた黒色の混合物に、飽和炭酸水素ナトリウム(20mL)、ブライン(20mL)、および酢酸エチル(50mL)を添加した。この混合物を分離漏斗中で振盪し、そして相分離させた。有機相を、セライトのパッドに通して濾過し、ブラインで洗浄し、少量の活性炭で処理し、濾過し、そして暗色の油まで濃縮した。この物質を、減圧下で蒸留した。49〜53℃および0.25torrで蒸留する画分を回収して、わずかに黄色い液体(0.47g)を得た。この物質のNMR分析により、これがブチル3-ヒドロキシブチレートであることを確認した。回収された物質の量は、残存粉に含まれるPHBの量に基づいて誘導体化PHBの46%収率を示す。
【0054】
(実施例3:ナタネからのPHAの抽出)
PHAを、以下のような図4のプロセスを用いて、ナタネからポリマー形態で抽出した。約40重量%の油を含むナタネのサンプル(20g)を、約94%の3-ヒドロキシオクタン酸および約6%の3-ヒドロキシヘキサン酸を含むコポリマーであるPHOの小片(5.43g、Pseudomonasputidaから単離された)と混合し、電気食物粉砕器で粉砕した。このサンプルは、31重量%の油および21重量%のPHOを含むトランスジェニック油料種子の代表例である。混合物を、12時間soxhlet装置中で、300mLのヘキサン(溶媒1)を用いて連続的に抽出した。サンプルを、冷却し、そして濾過して、有機溶媒相および固形粉(風乾後11.02g)を得た。溶媒相を濃縮して、黄色の非常に粘性のゲル様物質(12.92g、混合物の51重量%)を得た。静置すると、この物質は、黄色のプラスチック様固体になった。NMR分析により、この物質はPHOおよびナタネ油を含むことが示された。これらの結果により、PHO油混合物を、PHA含有植物バイオマスから90%を超える収率で容易に回収し得ることが示された。得られたPHA/油混合物は、さらなる精製に適切であった。
【0055】
さらなる精製を以下のように行った。黄色のプラスチック様物質の一部(0.136g、約41重量%のPHO、1.1×0.2cm)を、2mlのn-プロパノールで洗浄した。室温で3日間ゆっくりと回旋した後、上清を取り除き、そして残存固体を、2mlのメタノールで一晩洗浄した。メタノール洗浄液を、プロパノール洗浄液と混合し、そして濃縮して黄色の油(0.0876g)を得た。減圧下での乾燥後の残存固形ポリマー(0.048g)は、半透明でありほとんど無色であった。これは、元のナタネ/PHO混合物からPHOの84%収率を示す。精製されたポリマーのNMR分析により、これが少量のナタネ油を含むPHO(約95%純度)であることが示された。G.C.分析により、ヘキサン抽出により最初に単離された黄色のプラスチック様物質と比較して、主要な混入物は10倍減少したことが示された。
【0056】
(実施例4:植物バイオマスからのPHA誘導体の単離)
実施例3に記載された、さらなる精製の前に得られた黄色のPHO含有プラスチック様物質を、化学的処理および物理的分離により誘導体形態でさらに精製した:実施例3からのヘキサン抽出により単離された部分的に精製されたPHO含有プラスチック物質の一部(2.75g、約40重量%のPHOを含む)を、加熱しながらn-ブタノール(50mL)で溶解した。濃硫酸(0.7mL)を添加し、そして混合物を20時間加熱還流した。室温まで冷却した後、飽和炭酸ナトリウム(4mL)を混合し、混合物をpH紙に対して塩基性にした。反応混合物を濾過し、相を分離し、そして有機層をブライン(2×30mL)で洗浄した。有機相を約10mLまで濃縮し、クロロホルム(50mL)に溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して黄色の油(2.75g)を得た。この物質を減圧下で蒸留した。93〜97℃および0.45torrで蒸留する画分を回収して、透明な無色の液体(0.41g)を得た。回収された物質の量は、プラスチック様開始物質に含まれるPHOの量に基づいて誘導体化されたPHOの25%収率を示す。この物質のNMR分析により、これは約95%純度のブチル3-ヒドロキシオクタノエートであり、そして非常に少量の不飽和物質を含むことが示された。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1】図1aは、短側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの構造を図示したものである。図1bは、長側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの構造を図示したものである。
【図2】図2aは、短側鎖ポリヒドロキシアルカノエートであるポリヒドロキシブチレートの合成のための生合成経路を図示したものである。図2bは、長側鎖ポリヒドロキシアルカノエートの合成のための生合成経路を図示したものである。
【図3】図3は、植物からポリヒドロキシアルカノエートを分離するためのプロセスの1つの実施態様を例示するフローチャートである。
【図4】図4は、植物からポリヒドロキシアルカノエートを分離するためのプロセスの別の実施態様を例示するフローチャートである。
【出願人】 【識別番号】398055233
【氏名又は名称】メタボリックス,インコーポレイテッド
【出願日】 平成20年7月10日(2008.7.10)
【代理人】 【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策

【識別番号】100062409
【弁理士】
【氏名又は名称】安村 高明

【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹


【公開番号】 特開2008−248258(P2008−248258A)
【公開日】 平成20年10月16日(2008.10.16)
【出願番号】 特願2008−180815(P2008−180815)