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【発明の名称】 急速ゲル化生体適合性ポリマー組成物
【発明者】 【氏名】ウォレス， ドナルド ジー．

【氏名】コーカー， ジョージ ティー． ザ サード

【氏名】シュローダー， ジャクリーン アン

【氏名】クルーズ， グレゴリー エム．

【氏名】リー， ウーンザ エム．

【氏名】マロニー， マルセー エム．
【要約】 【課題】一緒に混合された場合、急速に共有結合を形成するツーパートポリマー組成物に関する。

【構成】一緒に混合された場合に、迅速に反応して投与部位にてマトリクスを形成する、２成分ポリマー組成物を開示する。このような組成物は、１分未満のゲル時間を示す。このような組成物は、組織への急速な接着およびゲル形成が所望される場合の組織関連の様々な用途に使用するために特に適切である。特に、これらは、止血を促進する際、薬物送達のため、組織接着を行う際、組織増強を提供する際、および外科的癒着の防止において、組織シーラントとして有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボ投与のための生体適合性二成分ゲル形成組成物であって、該組成物が、以下：
式、化合物1−（ＳＨ）mで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル基含有化合物を含む第１成分であって、ここでｍ≧２である、第１成分；および
式、化合物2−Ｙnで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル反応性基含有化合物を含む第２成分であって、ここでＹはスルフヒドリル反応性基であり、そしてここで、ｎ≧２である、第２成分、
を含み、
ここで、該第１成分または第２成分の少なくとも１つがポリアルキレンオキシドであり、そしてここで、該スルフヒドリル基および該スルフヒドリル反応性基が一緒に混合される場合、該成分は互いに反応して、それらの間で共有結合を形成して、１分未満でゲルを形成する、組成物。
【請求項２】
組織を処置するための方法における使用のためのキットであって、該キットが、以下：
（ａ）式、化合物1−（ＳＨ）mで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル基含有化合物を含む第１成分であって、ここで、ｍ≧２である、第１成分を含む容器；および
（ｂ）式、化合物2−Ｙnで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル反応性基含有化合物を含む第２成分であって、ここで、Ｙはスルフヒドリル反応性基であり、そしてここで、ｎ≧２である、第２成分を含む容器；および
（ｃ）第２成分を、組織部位に第１成分と同時にまたは引き続いて投与することにより該スルフヒドリル基および該スルフヒドリル反応性基を互いに反応させて、それらの間で共有結合を形成し、１分未満でゲルを形成することを示す説明書、
を包含し、ここで、該第１または第２成分の少なくとも１つがポリアルキレンオキシドである、
キット。
【請求項３】
一分未満のゲル化時間を有する、インビボ投与のための生体適合性の二成分ゲル形成組成物であって、該組成物が、以下：
酸性のｐＨを有する液体媒体中のポリアルキレンオキシド−（ＳＨ）4；および
８と１０．５との間のｐＨを有する緩衝液中のポリアルキレンオキシド−Ｙ4であって、ここで、Ｙはスクシンイミジルである、ポリアルキレンオキシド−Ｙ4、
を含む、組成物。
【請求項４】
１分未満のゲル化時間を有する、インビボ投与のための生体適合性２成分ゲル形成組成物であって、該組成物が、以下：
ポリアルキレンオキシド−（ＳＨ）12；および
ポリアルキレンオキシド−Ｙ12であって、ここで、Ｙはスクシンイミジル基またはマレイミジル基である、ポリアルキレンオキシド−Ｙ12、
を含む、組成物。
【請求項５】
インビボ投与のための生体適合性二成分ゲル形成組成物であって、該組成物が、以下：
式、コア−（ＳＨ）mで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル基含有ポリアルキレンオキシドを含む、酸性ｐＨを有する緩衝溶液中の第１成分であって、ここで、ｍ≧２である、第１成分；および
アルカリ性ｐＨを有する緩衝溶液、
を含み、
ここで、該成分が一緒に混合される場合、該スルフヒドリル基が互いに反応して、それらの間に共有結合を形成し、１分未満でゲルを形成する、組成物。
【請求項６】
インビボ投与のための生体適合性ゲル形成組成物であって、該組成物が、以下：
式、化合物1−（ＳＨ）mで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル基含有化合物であって、ここで、ｍ≧２である、スルフヒドリル基含有化合物；
式、化合物2−Ｙnで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル反応性基含有化合物であって、ここでＹはスルフヒドリル反応性基であり、そしてここで、ｎ≧２である、スルフヒドリル反応性基含有化合物；および
コラーゲン、を含み、
ここで、該スルフヒドリル基含有化合物または該スルフヒドリル反応性基含有化合物のいずれか少なくとも一方が、ポリアルキレンオキシドであり、ここで該スルフヒドリル基および該スルフヒドリル反応性基が互いに反応して、それらの間に共有結合を形成し得る、組成物。
【請求項７】
インビボ投与のための生体適合性ゲル形成組成物であって、該組成物が、以下：
（ａ）酸性ｐＨを有する第１成分であって、該第１成分が、以下：
（ｉ）式、化合物1−（ＳＨ）mで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル基含有化合物であって、ここでｍ≧２である、スルフヒドリル基含有化合物；
（ｉｉ）式、化合物2−Ｙnで与えられる少なくとも１つのスルフヒドリル反応性基含有化合物であって、ここでＹはスルフヒドリル反応性基であり、そしてここで、ｎ≧２である、スルフヒドリル反応性基含有化合物；および
（ｉｉｉ）コラーゲン、
を含む、第１成分；ならびに
（ｂ）８と１０．５との間のｐＨを有する緩衝液を含む第２成分、を含み、
ここで、該スルフヒドリル基含有化合物または該スルフヒドリル反応性基含有化合物のいずれか少なくとも一方が、ポリアルキレンオキシドである、組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、一緒に混合される場合に迅速に共有結合を形成するツーパート（ｔｗｏ−ｐａｒｔ）ポリマー組成物に関する。このような組成物は、組織に対する迅速な接着およびゲル形成が所望される場合の種々の組織関連適用における使用のために特に十分に適切である。特に、それらは、組織密封材として、ホメオスタシスの促進において、薬物送達のために、組織接着の効率化において、組織の増強の提供において、および手術での接着の予防において有用である。
【背景技術】
【０００２】
組織工学におけるポリマー組成物、特に合成ポリマーからなる組成物の使用は、現在、広範に認識されている。多くの天然に由来する組成物とは対照的に、合成ポリマー組成物は、所定の物理学的特性（例えば、ゲルの強度）および生物学的特性（例えば、分解能）を示すように処方され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
種々の組織工学適用において、液体として投与され得るが、その後に投与部位でヒドロゲルを形成する組成物を使用することが所望される。このようなインサイチュでヒドロゲルを形成する組成物は、種々の異なるデバイスからの液体として投与されるために、使用することがより簡便であり、そして予め形成されないために任意の部位への投与により適合する。インサイチュでヒドロゲル形成を促進するために使用され得る多くの異なる機構が、記載されている。例えば、水溶性コポリマープレポリマーおよびポリエチレングリコールの光活性化混合物が、ヒドロゲルの障壁および薬物放出マトリクスを作製するために記載されている。別のアプローチにおいて、冷水に溶解するが、体温にて組織に接着する不溶性ヒドロゲルを形成する、ＰｌｕｒｏｎｉｃおよびＰｏｌｏｘａｍｅｒのブロックコポリマーが、設計されている（Ｌｅａｃｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１６２：１３１７〜１３１９（１９９０））。ポリマー化可能なシアノアクリレートもまた、組織接着剤としての使用について記載されている（Ｅｌｌｉｓら、Ｊ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１９：６８〜７２（１９９０））。なお別のアプローチにおいて、一緒に混合された場合に、互いにおよび露出した組織表面と共有結合を形成するツーパート合成ポリマー組成物が、記載されている（ＰＣＴ ＷＯ９７／２２３７１（これは、米国特許出願第０８／７６９，８０６号に対応する））。ツーパート組成物に関する同様のアプローチにおいて、タンパク質および二重官能性架橋剤の混合物が、組織接着剤としての使用について記載されている（米国特許第５，５８３，１１４号）。
【０００４】
インサイチュヒドロゲル形成組成物を設計する場合に遭遇する１つの困難性は、ゲルの形成を増強するためにこの組成物を最適化することにより、投与部位での組織炎症が悪化し得るということである。この効果についての可能性のある説明は、迅速にゲルを形成し得る高度に反応性の組成物の成分が組織表面に有害に影響し得るということである。
【０００５】
本発明の組成物は、迅速なゲル化を提供するために処方されており、そしてまた、投与部位にて、以前に記載されている組成物よりもより組織の炎症を引き起こさない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般に、一緒に混合された場合に、迅速に反応して投与部位にてマトリクスを形成する、２成分ポリマー組成物を開示する。このような組成物は、１分未満のゲル時間を示す。本発明の１つの局面において、この成分のうちの一方は、スルフヒドリル含有化合物である。本発明の別の局面において、両方の成分は、複数の官能基を含み、そしてこれら化合物の少なくとも一方は、３以上の官能基を含む。このことは、３次元ポリマーマトリクスの形成に十分な反応性を保障する。好ましくは、両方の化合物は、４以上の官能基を含む。組成物を極めて素早く反応させるために、両方の化合物は、１２個の官能基を含む。
【０００７】
本発明の１つの局面において、これら化合物の少なくとも一方および好ましくは両方は、ポリマーである。ポリマー化合物の非反応性部分は、その「コア」といわれる。適切なポリマーコアは、合成ポリマー、ポリアミノ酸、およびポリサッカリドである。好ましい実施形態において、このコアは、ポリアルキレンオキシドであり、そしてより好ましくは、これは、ポリエチレングリコールである。
【０００８】
これらの化合物の分子量は、所望の適用に依存して変動し得る。ほとんどの場合、この分子量は、約１００〜１００，０００モル重量、より好ましくは約１，０００〜約２０，０００モル重量である。コア材料がポリエチレングリコールである場合には、化合物の分子量は、約７，５００〜約２０，０００モル重量であり、そしてより好ましくは、それらは、約１０，０００モル重量である。
【０００９】
化合物の一方のみがポリマーである場合、他方は、多官能性活性化有機低分子である。適切な有機低分子としては、官能性活性化スクシンイミジル化合物およびマレイミジル化合物が挙げられる。
【００１０】
本発明の２つの化合物を一緒に反応させることによって形成される連結基は、一方の化合物のスルフヒドリル基中の硫黄原子と、例えば、他の化合物のスフルヒドリル反応基中の炭素原子または硫黄原子との間で形成される共有結合である。この連結は、チオエステル、チオエーテルまたはジスルフィドであり得るが、チオエステル連結が好ましい。
【００１１】
本発明の別の局面において、化合物はさらに、ポリマーコアと官能基との間の鎖伸長剤（ｃｈａｉｎ ｅｘｔｅｎｄｅｒ）を含む。このような鎖伸長剤は、官能基の反応性を活性化または抑制し得、そしてまた、加水分解または分解のための部位を提供するために使用され得る。適切な鎖伸長剤としては、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（ホスホエステル）、および酵素により切断可能なペプチド基が挙げられる。
【００１２】
本発明の組成物は、１分未満、およびより好ましくは３０秒未満、および最も好ましくは１５秒未満のゲル時間にて、ゲルを形成する。得られるゲルの強度（すなわち、弾性率またはＧ'）は、この組成物が採用される適用に依存するが、好ましくは、軟ゲルについては約１０2〜１０4ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2の間であるか、またはより硬いゲルについては約１０5〜１０8の間である。
【００１３】
本発明の組成物の２つの反応性成分に加えて、任意の材料（グリコサミノグリカン、タンパク質（例えば、コラーゲン）、薬物、細胞、ホメオスタシス剤、遺伝子、ＤＮＡ、治療剤、抗生物質、増殖因子など）もまた、含まれ得る。
【００１４】
本発明の組成物は、投与部位に液体形態または固体形態にて適用される。それらを予め混合された不活性のものとして供給して、次いで投与部位にてそれらを活性化することもまた可能である。
【００１５】
本発明の別の局面において、組織の密着、接着の予防、生物学的に活性な薬剤の送達のためのプラットフォームの提供、または組織の増強の目的のために組織を処置するための方法が、提供される。この方法は、所望の医学的効果を生じさせるために、投与部位において本明細書中上記の２成分を一緒に混合する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、投与部位にて一緒に混合される場合にマトリクスを形成するツーパートポリマー組成物に関する。この組成物の各成分は、一般に、組織部位に別々に投与される。次いで、投与部位にて一緒に混合されたすぐ直後において、この組成物は、十分な接着強度かつ粘着強度でゲルを形成して、適所に固定される。
【００１７】
（定義）
以下の定義は、本発明の好ましい実施形態の種々の局面をさらに記載するために提供される。
【００１８】
用語「ゲル」とは、液体と固体との間の物質の状態をいう。それ自体、「ゲル」は、液体のいくつかの特性（すなわち、この形状は、弾力性に富みかつ変形能がある）、および固体のいくつかの特性（すなわち、この形状は、２次元表面に対して３次元を維持するに十分に分散性である）を有する。従って、「ゲル化時間」（本明細書中で「ゲル時間」ともいわれる）とは、組成物が適度な応力下で非流動性になるために必要とされる時間をいう。これは、一般に、１分未満にて１０2ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2以上のゲル強度（Ｇ'）を達成するものとして示される。
【００１９】
用語「粘着強度」は、本発明の組成物が、物理的応力または環境的条件に供された場合にインタクトなままである（すなわち、破断、分裂または分解しない）能力をいう。粘着強度は、時折、「破裂強度」の関数として測定される。
【００２０】
用語「粘着強度」とは、本発明の組成物が、物理的応力または環境的条件に供された場合に、投与部位にて組織に接着したままであり得る能力をいう。
【００２１】
用語「ポリマー」とは、一緒に連結されている個々の化学部分（同じであっても異なっていてもよいが、好ましくは同じである）からなる分子をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ポリマー」とは、末端間が連結されて直線状分子を形成する個々の化学部分、および分岐（例えば、「複数のアーム（ａｒｍ）」または「星型形状」）構造の形態において一緒に連結した個々の化学部分をいう。
【００２２】
用語「生体適合性」とは、本発明の組成物が、有意な炎症および線維症または他の有害な組織応答を誘発することなく組織に適用される能力をいう。
【００２３】
用語「合成ポリマー」とは、天然に存在せず、かつ化学合成または組換え合成によって生成されるポリマーをいう。それ自体、天然に存在するタンパク質（例えば、コラーゲン）および天然に存在するポリサッカリド（例えば、ヒアルロン酸）は、特に除かれる。タンパク質（例えば、合成コラーゲン）および糖質（例えば、合成ヒアルロン酸）ならびにそれらの誘導体が、含まれる。
【００２４】
用語「活性化合成ポリマー」は、対応する反応パートナー（例えば、スルフヒドリル−反応基）と反応して、共有結合を形成し得る、少なくとも１個の官能基（例えば、スルフヒドリル基）を有するか、または有するように化学的に改変させた合成ポリマーをいう。用語「多官能性活性化」は、２以上の求核基または求電子基を有する合成ポリマーをいう。多官能性活性化合成ポリマーのタイプは、二官能性活性化ポリマー、三官能性活性化ポリマー、四官能性活性化ポリマー、およびスター型活性化ポリマー（４以上の官能基を有する）を含む。
【００２５】
（組成物の成分）
本発明の２部の組成物は、２つの異なる化合物（各々組成物の別々の部分を含み、この少なくとも１つはポリマーである）を含み、互いに反応して、共有結合で架橋したゲルマトリクスを形成する。このようにして、これらは、別々に容易に投与され、そして投与部分にゲルを迅速に形成し得る。
【００２６】
本発明の組成物において、各成分は、本明細書中において他に記載されるような他の最適な成分と共に、２つの別々の部分の１つ、または組成物の「成分」中に存在する。２つの反応化合物およびこれらが共に混合される場合に形成するゲルマトリクスは、以下の式Ｉによって示され得る。
【００２７】
化合物1−（ＳＨ）m＋化合物2−Ｙn→化合物ｄ1−Ｚ−化合物2 （Ｉ）
化合物ｄ1は、化合物ｄ2と反応する複数（ｍ≧２）のスルフヒドリル基（ＳＨ）を有し、この化合物ｄ2は、複数（ｍ≧２）のスルフヒドリル反応基（Ｙ）を有する。スルフヒドリル基はまた、「スルフヒドリル反応基」であることが理解されるべきである。なぜならば、スルフヒドリル基は、特定の条件下で互いに反応することが周知であるからである。互いに混合する場合、２つの化合物は、共有結合（Ｚ）を介して相互に結合し得る。例示の目的のみのために図１に示されるように、化合物ｄ1と化合物ｄ2との間に単結合のみが形成される。しかし、ｍ＋ｎ≧５である場合、２つの成分のおおよその比が、本明細書中において他に記載されるように利用され、この２つの化合物は、互いに複数の結合を形成し、３次元のポリマーマトリクスを生じる。好ましくは、両方の化合物は、４個以上の官能基を含む。なぜならば、このような多官能基により、全体としてより強い凝集強度を有するゲルマトリクスを生じるからである。特定の好ましい実施形態において、この化合物の各々は、四官能性活性化される。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、化合物は、各々１２個の官能基を有する。このような化合物は、第１の四官能性活性化ポリマーを第二の四官能性活性化ポリマーと反応させることから形成され、ここで２つの化合物の各々の官能基は、反応対であり、そして互いに反応して「１２原子」官能性活性化ポリマーを形成する。このような「１２原子」化合物の例は、ドデカ−スルフヒドリル−ＰＥＧ、５０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．であり、これは、４つの（外部）４官能性スルフヒドリル−ＰＥＧ分子に連結される、コア４官能性スクシンイミドエステルＰＥＧから構成される。このようなポリマーは、４官能性活性化ポリマー出発物質の分子量に依存して、１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．〜１００，０００ｍｏｌ．ｗｔ．を超える大きさの範囲にわたる。
【００２９】
多官能性ポリマーの他のタイプは、慣用的な合成法を使用して容易に合成され得る。しかし、処理は、反応基の立体的な障害を避けるために、一定の原子長を有する多原子生成物を生成するように行われるべきである。従って、本発明での使用のために適切な活性化ポリマーは、種々の幾何学的な形状および構成を有し得る。
【００３０】
（化合物コア）
上記のように、化合物の個々は、複数の官能基（スルフヒドリル基またはスルフヒドリル反応基のいずれか）を有する。この化合物の非反応性残基は、「コア（ｃｏｒｅ）」であると考えられる。２つの化合物の少なくとも１つは、有効なゲルマトリクスを形成するためにポリマーコアを有さなければならない。この化合物の一方が、ポリマーコアを有する場合、もう一方の化合物は、複数のスルフヒドリル反応基を有する小さな有機分子であり得る。しかし、最適のために、両方の化合物が同じまたは異なるポリマーコアを有することが好ましい。
【００３１】
このポリマーコアは、合成ポリアミノ酸、ポリサッカリド、または合成ポリマーであり得る。好ましいポリマーコア物質は、合成親水性ポリマーである。適切な合成親水性ポリマーとしては、特に、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド（（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n）、ポリプロピレンオキシド（（ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2Ｏ）n）またはポリエチレン／ポリプロピレンオキシドの混合物（（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−（ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2Ｏ）n））が挙げられる。特に好ましい合成親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、これは、約１００〜約１００，０００ｍｏｌ．ｗｔ．、より好ましくは、約１，０００〜約２０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．の範囲内の分子量を有する。よりさらに好ましくは、このポリマーコアがポリエチレングリコールである場合、約７，５００〜約２０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．の範囲内の分子量を有する。より好ましくは、このポリエチレングリコールは、約１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．の分子量を一般に有する。
【００３２】
多官能性活性化ポリアルケンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）は、市販されており、これはまた、公知の方法を使用して容易に調製される。例えば、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの２２章；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２）；およびＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｔａｌｏｇ，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ（１９９７−１９９８）を参照のこと。組織シーラントとしての使用のために、活性化ポリマーの好ましい組み合わせは、以下の通りである：スルフヒドリル反応基含有化合物は、４官能性ＰＥＧ、ペンタエリスリトールポリ（エチレングリコール）エーテルｔｅｔｒａ−スクシンイミジルグルタラート（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）であり；そしてスルフヒドリル基含有化合物は、４官能性ＰＥＧ、ペンタエリスリトールポリ（エチレングリコール）エーテルｔｅｔｒａスルフヒドリル（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）である。両方の場合において、これらの「４原子」ＰＥＧは、ペンタエリスリトールのエトキシ化によって形成され、４個の鎖の各々は、約２，５００ｍｏｌ．ｗｔ．であり、次いで、４個の原子の各々上に官能基を導入するために誘導体化される。また好ましくは、ペンタエリスリトールの代わりにジグリセロールから重合体化された類似のポリ（エチレングリコール）様化合物である。
【００３３】
反応化合物の１つのみがポリマーコアを含む場合、他の反応化合物は多官能性活性小有機分子である。このような化合物としては、二官能性ジスクシンイミジルエステルおよび二マレイミジル化合物、ならびに他の周知の市販化合物（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）が挙げられる。さらに、当業者は、慣用的な有機化学の技術を使用して低分子量の多官能性反応化合物を容易に合成し得る。このような化合物は、図２に示され、この化合物は、各原子がＮ−ヒドロキシル−スクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）でキャップされ、４つのグルタレートに連結されたペンタエリスリトールである。類似の化合物は、イノシトール（放射６原子）、ラクチトール（９原子）またはソルビトール（直鎖６原子）から合成され得る。エンドキャップ反応基は、ＮＨＳの代わりに、まさに簡単なものとしてスルフヒドリル、マレイミジル、ビニルスルホンなどであり得る。ポリマーまたは小分子は、ＮＨＳおよびＳＨ、マレイミジルおよびＳＨなどのような組成物中に反応対が存在する限り、いずれかの反応末端基を有し得る。
【００３４】
（反応基およびマトリクス結合）
本発明において、結合Ｚは、スルフヒドリル基含有化合物中の硫黄原子と、例えばスルフヒドリル反応基含有化合物中の炭素原子および硫黄原子との共有結合を含む。従って、この結合は、チオエステル、チオエーテル、ジスルフィドなどであり得る。広範のスルフヒドリル−反応基およびスルフヒドリル基と反応する場合に形成する結合の型は、化学文献において周知である。例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、２１〜３７頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌｏｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；およびＬｕｎｄｂｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版，６章，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｌｏｒｉｄａ（１９９１）を参照のこと。
【００３５】
最も良い適用には、スルフヒドリル基と反応してチオエステル結合を形成するスルフヒドリル反応基が、好ましい。このような化合物としては、図１に示され、特に、図１に示される構造に対応する括弧内の数字の以下の化合物が挙げられる：混合無水物（例えば、ＰＥＧ−グルタリル−アセチル−無水物（１）、ＰＥＧ−グルタリル−イソバレリル−無水物（２）、ＰＥＧ−グルタリル−ピバリル−無水物（３）およびＢｏｄａｎｓｚｋｙの２３頁に示されるような関連化合物）；リンのエステル誘導体（例えば、構造（４）および（５））；ｐ−ニトロフェノール（６）、ｐ−ニトロチオフェノール（７）、ペンタフルオロフェノール（８）、構造（９）のエステル誘導体、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙの３１〜３２頁および表２に示されるような関連する活性エステル；置換ヒドロキシアミンのエステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシ−フタルイミド（１０）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１１）、およびＮ−ヒドロキシ−グルタルイミド（１２）、ならびにＢｏｄａｎｓｚｋｙの関連する構造）；表３；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１３）、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−ベンゾトリアジン−４−オン（１４）および３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−４−オンのエステル；カルボニルイミダゾールの誘導体；ならびにイソシアネート。これらの化合物に関して、補助試薬は、例えば、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドのような結合形成を容易にするために使用され得、カルボキシル基（すなわち、グルタレートおよびスクシネート）とスルフヒドリル基との結合を容易にするために使用され得る。
【００３６】
チオエステル結合を形成するスルフヒドリル反応化合物に加えて、他のタイプの結合を形成する種々の他の化合物が、利用され得る。例えば、メチルイミデート誘導体を含む化合物は、スルフヒドリル基を有するイミド−チオエステル結合を形成する。あるいは、以下のスルフヒドリル基とジスフィド結合を形成するスルフヒドリル反応基が、使用され得る：例えば、オルトピリジルジスルフィド、３−ニトロ−２−ピリデンスルフェニル（ｐｙｒｉｄｅｎｅｓｕｌｆｅｎｙｌ）、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）、メタン−チオスルフェートの誘導体、および２，４−ジニトロフェニルシステイニルジスルフィド。このような場合において、補助試薬（例えば、過酸化水素、またはアゾジカルボン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル）は、ジスルフィド結合の形成を容易にするために使用され得る。
【００３７】
さらに別のクラスのスルフヒドリル反応基は、スルフヒドリル基とチオエステル結合を形成する。このような基は、特に、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミドおよび他のマレイミド（デキストランマレイミド、モノ−ブロモ−ビマン（ｂｉｍａｎｅ）および関連化合物を含む）、ビニルスルホン、エポキシド、Ｏ−メチル−イソウレアの誘導体、エチレンイミン、アジリジン、ならびに４−（アミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンズオキサゾールが挙げられる。
【００３８】
（鎖伸長剤）
官能基は、化合物コアに直接結合され得るか、またはこの官能基は、鎖伸長剤によって直接結合され得る。このような鎖伸長剤は、当該分野で周知である。例えば、ＰＣＴ ＷＯ９７／２２３７１を参照のこと。これには、本発明の組成物中で鎖伸長剤としての使用のために適切な「連結基」を開示する。鎖伸長剤は、分子間の直接的な結合の形成に関連する立体障害の問題を回避するために使用される。あるいは、鎖伸長剤を、いくつかの多官能性活性化化合物と共に連結して、大きな分子を生成するために使用し得る。特に好ましい実施形態において、鎖伸長剤は、投与後の組成物および得られるゲル形態の分解特性を変えるために使用され得る。例えば、鎖伸長剤は、工業的に活性化されたポリマーの１方または両方に取り込まれ得、加水分解を促進し、加水分解を阻止し、酵素分解部位を提供する。鎖伸長剤はまた、スルフヒドリルおよびスルフヒドリル反応基の活性を活性化または抑制し得る。例えば、スルフヒドリル基の１または２個の炭素内の電子吸引基は、低い求核性のために、結合の効果が減少すると期待される。炭素とカルボニル炭素の二重結合は、この効果を有すると予測される。いずれかのパートナーの嵩高い隣接の基は、立体障害のために結合速度が減少されると予測される。グルタリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルの反応性カルボニルに隣接する電子吸引基は、スルフヒドリルパートナーとより反応性のカルボニル炭素を生成すると予想される。
【００３９】
鎖伸長剤は、分解部位（すなわち、加水分解可能な部位）を提供し得る。加水分解可能な鎖伸長剤の例としては、特に、α−ヒドロキシ酸（例えば、乳酸およびグリコール酸）；ポリ（ラクトン）（例えば、カプロラクトン、バレロラクトン（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、γ−ブチルラクトンおよびｐ−ジオキサノン）；ポリ（アミノ酸）；ポリ（無水物）（例えば、グルタレートおよびスクシネート）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（オルトカルボネート）（例えば、トリエチレンカルボネート；およびポリ（ホスホエステル）が挙げられる。非分解性鎖伸長剤は、特に、スクシンイミド、プロピオン酸およびカルボキシメチルが挙げられる。例えば、ＰＣＴ ＷＯ９９／０７４１７を参照のこと。酵素学的に分解可能な鎖伸長剤の例としては、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（これは、コラーゲンによって分解される）；およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（これは、プラスミンによって分解される）が挙げられる。
【００４０】
（ゲル強度およびゲル化時間）
本発明の組成物は、適切な強度および迅速なゲル化時間を示すように処方される。弾性率「Ｇ」は、ゲル強度の好ましい尺度である。組織シーラントとしての使用のための好ましい組成物は、約１０3〜１０8ｄｙｎ／ｃｍ2、より好ましくは１０4〜１０7ｄｙｎ／ｃｍ2のゲル強度を達成し得る。止血剤としての使用または癒着防止のための好ましい組成物は、軟性ゲルが所望される場合、少なくとも１０2〜１０4ｄｙｎ／ｃｍ2のゲル強度、またはより硬いマトリクスが所望される場合、１０5〜１０8ｄｙｎ／ｃｍ2のゲル強度を有する。
【００４１】
好ましい処方物のゲル化時間は、６０秒未満、より好ましくは３０秒未満、そして最も好ましくは１５秒未満である。速いゲル化時間は、処置されるべき部位における最大量の物質および十分な機械特性を確実する。
【００４２】
（任意の組成物成分）
反応性化合物に加えて、本発明の組成物はまた、他の成分を含み得、これは、二成分組成物の成分の１つまたは両方に含まれ得るか、または別々に投与され得る。１実施形態において、これらの化合物は、それらが一緒に混合された後に、反応化合物の１つまたは両方に架橋することによってマトリクス自体に共有結合によって組み込まれ得る。別の実施形態において、本化合物が反応性化合物のいずれかと非反応性である場合、本化合物は、それが混合後、マトリクス形成化合物と物理的にまたはイオン的に結合し、従ってマトリクス自体の一部となるような様式で、投与され得る。
【００４３】
加えられ得る追加の化合物は、グリコサミノグリカンおよびタンパク質である。適切なグリコサミノグリカンとして、特に、ヒアルロン酸、キチン、硫酸コンドロイチンＡ、ＢまたはＣ、硫酸ケラチン、ケラタン硫酸およびヘパリン、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。別の実施形態において、タンパク質は種々の目的のために加えられ得る。例えば、コラーゲンはマトリクスの生体適合性（例えば、細胞による潜在的コロニー化、創傷治癒の促進など）を改良し得る。コラーゲンおよび任意のアミノ基含有タンパク質はまた、他のマトリクス成分と共にマトリクスに架橋することによって、マトリクスの構造完全性に寄与する。特に、ＰＥＧ−スクシンイミジルエステルが使用される場合、コラーゲンによって形成されたアミド結合は、スクシンイミジルエステルとスルフヒドリルとの反応によって形成された結合より、加水分解に対してより安定である。
【００４４】
適切なタンパク質として、特に、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチンおよびアルブミン、ならびにそれらのペプチドフラグメントが挙げられる。特に、コラーゲンが好ましく、このコラーゲンは、非繊維状コラーゲン、微繊維状コラーゲンまたは繊維状コラーゲンの形態であり得る。ウシ真皮またはヒト胎盤から単離された、または組換えＤＮＡ法によって調製されたＩ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンが、適している。適切なコラーゲンおよびコラーゲン誘導体の説明については、ＰＣＴ ＷＯ９０／０５７５５を参照のこと。組成物にコラーゲンを加える場合、沈殿を避けるために他の組成物成分の濃度を調節することが重要であることを理解するべきである。
【００４５】
組成物に加えられ得る追加の成分として、抗生物質、成長因子、止血タンパク質（例えば、トロンビン、フィブリン、フィブリノーゲン、血液因子など）、細胞、遺伝子、ＤＮＡなどが挙げられる。
【００４６】
（組成物処方）
本発明の組成物は、２つの別個の部分または「成分」を含み、これらは液体形態または固体液体であり得る。好ましい実施形態において、両方の成分は、液体であり、その結果、各々は投与の部位に別々に容易に投与され得る。さらに、成分の１つは、乾燥粉末形態であり得、これは、液体形態である第２の成分と、各々が組織上に別々に噴霧される場合、または組織部位で混合されることによって、混合される。両方の成分が、投与の部位において緩衝液と混合される粉末として、その部位に送達されることも可能である。
【００４７】
代替の実施形態において、両方の成分は、単一の水性媒体中で共に混合され得、ここで両方の成分とも、例えば低ｐＨ緩衝液中で非反応性である。その後、それらは、迅速に反応しかつゲルを形成した後に、高ｐＨ緩衝液と共に組織部位上に噴霧され得る。この実施形態は、実施例９に記載される。
【００４８】
組成物成分の各々における反応性化合物の濃度は、必ず、多くの因子に依存する。例えば、組成物成分が各々４−アームＰＥＧ（すなわち、ＰＥＧ−ＰＥＧ組成物）である場合、混合前の二成分の各々の２０〜２５重量％濃度は、混合後、およそ１０5〜１０6ｄｙｎ／ｃｍ2の弾性率「Ｇ'」を有するゲルを生じ、これは、外科用シーラントとしての使用に適切である。メチル化したコラーゲンおよび４−アームスクシンイミジルＰＥＧを、それぞれ濃度２〜４％および０．２〜０．４％で使用することによって、１０〜１５％のＰＥＧ−ＰＥＧゲルに匹敵する凝集強度を有するゲルを生じる。成分の１つとしてアルブミンを使用する場合、３０％以上の濃度は、同様の凝集強度を達成する。各成分における化合物の適切な濃度、および任意の成分の適切な濃度、および従って、最終ゲルマトリクス中のマトリクス成分の相対濃度は、慣用的実験を使用して、所望のゲル化時間およびゲル強度を達成するために、容易に最適化され得る。上記の好ましい４つのアームＰＥＧを使用する場合、合成ポリマーは、一般に２〜５０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、１０〜２５％の濃度で存在する。
【００４９】
本発明の組成物の液体成分は、液体媒体に活性化された合成ポリマー（乾燥形態であるか、または濃縮溶液として）を加えることによって、各々別々に調製される。適切な液体媒体として、緩衝水溶液（例えば、０．５〜３００ｍＭの濃度の、一塩基性リン酸ナトリウム／二塩基性リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム、グルタメートまたはアセテート）が挙げられる。一般的に、スルフヒドリル−反応性ＰＥＧは、約５〜６のｐＨを有する水または希釈緩衝液中で、調製される。スルフヒドリル−ＰＥＧ成分を調製するための約８〜１０．５のｐＫを有する緩衝液は、スルフヒドリル−ＰＥＧ／ＳＧ−ＰＥＧの混合物を含む組成物の速いゲル化時間を達成するために有用である。これらには、カーボネート、ボレート、およびＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）が挙げられる。これに対して、マレイミジルＰＥＧおよびスルフヒドリル−ＰＥＧの組み合わせを使用する場合、スルフヒドリルＰＥＧを調製するために使用される液体媒体について、約５〜９のｐＨが好ましい。活性的に出血する組織部位への止血適用のための特に好ましい組成物は、第１成分としてのマレイミジルＰＥＧおよびスクシンイミジルＰＥＧの混合物、および第二成分としてのスルフヒドリルＰＥＧを含む。このような組成物は、マレイミジルＰＥＧのみまたはスクシンイミジルＰＥＧのみを単独で有する組成物と比較した場合、向上した生分解性および優れたゲル化時間を有するゲルを生成する。
【００５０】
２つ（またはそれ以上）の組成物成分の各々について使用される緩衝水溶液のｐＨは、送達プロセスを妨害する瞬時のゲル化をもたらすことなく、迅速なゲル化を導く最終ｐＨを達成するための慣用的な最適化を使用して調製されるべきである。例えば、アミノＰＥＧおよびスルフヒドリルＰＥＧの両方は、求核性を高めるために塩基性ｐＨを必要とする。ゲル化時間に及ぼすｐＨの影響は、以下の実施例で議論される。
【００５１】
（使用および投与）
本発明の組成物は、一般に、組成物の２つの個々の成分が、最初の時間に投与の部位で、または投与直前に、互いに接触するような様式で、投与の部位に送達される。従って、本発明の組成物は、好ましくは、２つの成分を別々に送達することが可能である装置を使用して、投与の部位に送達される。このような送達システムは、通常、二区画の単一出口または二重出口の噴霧デバイスを含む。あるいは、この２つの成分は、任意の型の制御可能な押出しシステムを使用して別々に送達され得るか、あるいは別々のペースト、液体または乾燥粉末の形態で手動で送達され得、そして投与の部位で手動で一緒に混合される。二成分組織シーラント／止血剤の送達のために適応される多くのデバイスは、当該分野で周知であり、本発明の実施においても使用され得る。
【００５２】
本発明の組成物を送達するなお別の方法は、不活性な形態で液体または粉末として、２つの反応性成分（または、ジスルフィド結合を形成するために設計されるスルフヒドリル含有成分の場合は単一の反応性成分）を調製することである。次いで、このような組成物は、組織部位への適用後、または活性因子を適用する直前に、活性化され得る。１実施形態において、活性因子は、一旦混合されると組成物を活性化するｐＨを有する緩衝溶液である。投与までは低ｐＨに維持され、次いでゲル化を開始するために適用部位において高いｐＨ緩衝液と混合されるスルフヒドリル含有ＰＥＧ組成物を記載する実施例１２を参照のこと。
【００５３】
本発明の組成物は、種々の異なる薬学的適用において使用され得る。一般的に、本明細書中に記載される組成物は、合成ゲルマトリクスが現在利用されている任意の組織工学適用における使用のために適用され得る。例えば、本発明の組成物は、組織シーラントとして、組織増強において、組織修復において、組織癒着防止において、表面修飾において、および薬物／細胞／遺伝子送達適用において、有用である。当業者は、本明細書に記載される原理および周知の科学的原理に基づく、既知のゲル強度およびゲル化時間を有する任意の組成物を用いて使用するための適切な投与プロトコルを容易に決定し得る。幾つかの特定の適用のより詳細な記載は、以下に与えられる： （組織シーラントおよび接着剤）
好ましい適用において、本明細書中に記載される組成物は、ガス、液体または固体の漏れを防ぐためにコーティング層またはシーリング層を必要とする医用状態に使用され得る。本方法は、１）血流を停止または最小化するために血管および／または他の組織または器官をシールするために；２）空気の漏れを停止または最小にするために胸部組織をシールするために；３）便または組織内容物の漏れを停止または最小化するために胃腸管または膵臓組織をシールするために；４）尿の漏れを停止または最小化するために膀胱または尿管をシールするために；５）ＣＳＦの漏れを停止または最小化するために硬膜をシールするために；および６）漿膜流体（ｓｅｒｏｓａｌ ｆｌｕｉｄ）の漏れを停止するために皮膚または漿膜組織をシールするために、損傷した組織または器官に両方の成分を適用する工程を包含する。
【００５４】
これらの組成物はまた、小さな血管組織、神経組織または皮膚組織のような組織を一緒に接着するために使用され得る。この材料は、１）一組織の表面にこの材料を適用し、次いで第２の組織が第１の組織に対して迅速にプレスされ得ることによって使用され得るか、または２）組織を近接並置させ、次いで材料を適用することによって使用され得る。
【００５５】
（外科的接着）
好ましい適用は、患者における外科的手順後の癒着の形成を軽減する方法である。本方法は、両方の成分を一緒に噴霧するか、または事前に混合された成分を適用することによって、損傷された組織または器官に材料を適用する工程を包含する。これら成分は、一緒に反応して、組織表面上でヒドロゲルを形成する。医用手順は、婦人科学的適用、腹部の適用、神経外科的適用、心臓の適用、および整形外科的適用を含む。
【００５６】
（ドラッグデリバリー）
好ましい適用は、患者に生物学的に活性な物質を局所的に適用する方法である。この活性物質は、二成分と組み合わせて送達され得、その結果、この材料はインサイチュで、または予備形成された移植片として形成され得る。この活性物質は、拡散制御されたプロセスを通して放出され得るか、または成分に共有結合され、その結果、生じるヒドロゲル分解物として放出され得る。
【００５７】
この生物学的に活性な物質は、任意の種々の有機物質および無機物質（タンパク質、炭水化物、および核酸を含む）であり得る。具体的な例として、酵素、抗生物質、抗腫瘍剤、サイトカイン、局所麻酔剤、ホルモン、抗脈管形成剤、抗体、神経伝達物質、精神活性薬物、再生器官に影響を及ぼす薬物、および治療用オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５８】
（移植片の改変）
好ましい適用は、移植片の表面特性に影響を及ぼすために、または組織表面に移植片を接着するのを補助するために、移植片にコーティングを適用する方法である。成分のコートは、１）血管移植片、ステントに適用され、これらのデバイスからの血液または漿膜流体の漏れを最小化または停止し得；２）カテーテルまたは胸部移植片に適用され、過剰の繊維形成を軽減または停止し得；３）人工パッチまたは人工メッシュに適用され、過剰の繊維形成を最小化し得、そして組織表面に移植片を接着することを補助し得る。
【００５９】
（細胞または遺伝子の送達）
組成物の好ましい適用は、カプセル化し、それによって細胞または遺伝子（これらは、天然供給源由来の物質または合成ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの個々のアンチセンス形態を含む）を所望の部位に送達することである。この細胞は、間葉性幹細胞、上皮細胞および神経外胚葉細胞を含む。この細胞は、本来、同種であるか、または異種であり得る。
【実施例】
【００６０】
（実施例１ 二成分組織シーラント組成物の調製）
ａ．第１の成分
ペンタエリスリトールポリ（エチレングリコール）エーテルテトラ−スクシンイミジルグルタレート（「ＳＧ−ＰＥＧ」）（分子量１０，０００）を、０．５ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．０に、２０％ｗ／ｖの濃度で溶解する。（この溶液は、活性エステルの加水分解に対する敏感さに起因して水性媒体中で不安定であり、そして調製後１時間以内に使用されるべきである）。
【００６１】
ｂ．第２の成分
ペンタエリスリトールポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスルフヒドリル（分子量 １０，０００）を。３００ｍＭリン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（「Ｐ／Ｃ緩衝液」）（ｐＨ９．６）に２０％ｗ／ｖの濃度で溶解する。Ｐ／Ｃ緩衝液を以下のように調製する：３００ｍＭの一塩基リン酸ナトリウムを、３００ｍＭの炭酸ナトリウムと混合してｐＨ９．６を達成する。最終モル濃度は、約１１７ｍＭのリン酸塩および１８３ｍＭの炭酸塩である。この溶液は水性媒体中で安定であるが、ジスルフィドヘの酸化を防ぐために、溶液の酸素への曝露を防ぐように注意するべきである。ｐＨは、特定の組成物には好ましいが、８〜１０．５のｐＨは、本発明の実施における使用に適切であると概して考えられる。
【００６２】
（実施例２ 動脈の外科的シーリング）
ニュージーランドシロウサギの右頸動脈を露出する。これらのウサギを２００Ｕ／ｋｇのヘパリンで処置し、そして血管を非外傷性血管クランプを使用して近位および遠位でクランプする。２７Ｇの針を使用して頸動脈に穿刺を作成する。コントロールのウサギを、止血が達成されるまでタンポナーデで処置する。処置されたウサギについては、実施例１に記載されるように調製された組成物の２つの成分の各々約０．５ｍＬを、二成分噴霧器（Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ，Ｈｅｍａｅｄｉｃｓ，Ｍａｌｉｂｕ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して瑕疵部位に送達する。この材料を３０秒間凝固させた後、クランプを取り外し、そして止血の時間と血液損失を測定する。コントロールウサギの動脈はまた、一貫性のために３０秒間クランプしたままにする。表１に結果を示す。
（表１）
処置との相関としての血液損失および止血の時間
【００６３】
【表１】


【００６４】
上記の結果は、この組成物が穿刺した動脈からの血液損失の量および止血の時間をかなり減少させるということを例示する。
【００６５】
（実施例３ ｅＰＴＦＥ移植片の外科的シーリング）
４８０秒より長い活性化された凝固時間を達成するために、イヌをヘパリンで処理する。これらのイヌの左腸骨（ｉｌｉａｃ）を露出し、そして遠位および近位に配置された非外傷性血管クランプを使用して分離する。この動脈の５ｃｍの部分を切除し、そして同じ直径のｅＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｈｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ））移植片と置き換える。吻合の完了の前に、この移植片を２７Ｇ注射針を使用して脱気した。実施例１に従って調製された組成物の２つの成分の各々約３．０ｍＬを二成分噴霧器（Ｃｏｈｅｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して瑕疵部位に送達する。この材料を３０秒間凝固させた後、クランプを取り外し、そして止血の時間と血液損失を測定する。材料の適用を除いて、この手順を左腸骨に繰り返した。右腸骨は、タンポナーデ処置のみを受けた。これらの結果を表２に示す。
（表２）
処置との相関としての血液損失および止血の時間
【００６６】
【表２】


【００６７】
上記の結果は、この組成物が血液損失の量およびｅＰＴＦＥ吻合からの止血の時間をかなり減少させるということを例示する。
【００６８】
（実施例４ チオエステル連結組成物の増強された生体適合性）
６個までの皮下ポケットを、ニュージーランドシロウサギの背部上に作成する。実施例１に記載される組成物の成分の各々約１．０ｍＬを、液体処方物用の二成分噴霧器（Ｃｏｈｅｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはエキソビボでゲル化した処方物用のへらを使用して瑕疵部位に送達する。格付け表を表３に示し、そして結果を表４に示す。
（表３）
生体適合性実験のための格付け表
【００６９】
【表３】


【００７０】
（表４）
生体適合性実験の結果



【００７１】
【表４】


【００７２】
実験ＡおよびＢは、繊維状コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および外科的コントロールの中度の異物応答および組織学的応答を示す。実験Ｃは、アミノ−ＰＥＧで作製されたヒドロゲルに対する重篤な応答を示す。応答は、ヒドロゲルの粘稠なカプセル化および膿瘍形成からなる。実験Ｄのように、アミノ−ＰＥＧをスルフヒドリル−ＰＥＧで置き換えることにより、ヒドロゲルの生体適合性はかなり改善される。実験Ｅは、エキソビボでのアミノヒドロゲルの形成工程およびモノ−ＳＧ ＰＥＧ（分子量５０００）溶液中でヒドロゲルをインキュベートする工程を包含する。インキュベーションの間に、モノ−ＳＧ ＰＥＧは、ヒドロゲル網状組織上に存在する遊離のアミンと反応し、それによりポリマー網状組織上の遊離のアミンの量を減少させる。この処理は、ヒドロゲルの生体適合性を増強する。実験Ｆは、エキソビボでスルフヒドリルヒドロゲルを形成する工程およびモノ−ＳＧ ＰＥＧ（分子量５０００）の溶液中でヒドロゲルをインキュベートする工程を包含する。インキュベーションの間に、ジ−アミノＰＥＧは、ヒドロゲル網状組織上に存在するＳＧ基と反応し、それによりポリマー網状組織上の遊離のアミンの量を増加させる。この処理は、ヒドロゲルの生体適合性を減少させる。従って、これらの結果は、アミノ処方物と比較してスルフヒドリル処方物の増強された生体適合性を示す。
【００７３】
（実施例５ ゲル時間に対する緩衝液および反応性基の効果）
本明細書中に記載される組成物の所望の特徴は、迅速にゲル化を達成する能力である。この実施例において、ゲル化の速度論に対する緩衝液強度および組成物の効果が調べられる。全ての実験について、実施例１に記載される四官能化ＳＧ ＰＥＧを、０．５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解し、そして実施例１に記載のテトラスルフヒドリルＰＥＧまたは等量のテトラ−アミノＰＥＧを表５に列挙される緩衝液に溶解する。
（表５）
アミノ処方物およびスルフヒドリル処方物での炭酸塩緩衝液に対するリン酸塩緩衝液の効果


【００７４】
【表５】


【００７５】
実験ＡおよびＢは、リン酸塩緩衝液中のアミノ処方物およびスルフヒドリル処方物におけるゲル時間の差異を示す。この緩衝液において、ゲル化速度の増大は、アミノ処方物と比較してスルフヒドリル処方物で観察される。実験ＣおよびＤは、炭酸塩緩衝液中のアミノ処方物およびスルフヒドリル処方物におけるゲル化時間の差を示す。示されるように、ゲル時間の減少は、炭酸塩緩衝液中のスルフヒドリル処方物について観察される。好ましいＰ／Ｃ緩衝液において３秒のゲル時間が観察される。
【００７６】
（実施例６ 血流測定）
第１の成分（四官能性スルフヒドリル−ＰＥＧ、分子量１０，０００）を、実施例１にしたがって調製し、そしてＰ／Ｃ緩衝液に懸濁した。第２の成分（四官能性ＳＧ−ＰＥＧ、分子量１０，０００）を実施例１に従って、０．５ｍＭホスフェート（ｐＨ６．０）中で調製した。これら２つの成分（各０．６ｍｌ）を、接合物およびカニューレを有する二重シリンジデバイスに充填した。カニューレは混合要素を含有した。溶液を混合し、そして生じた混合物をＲｈｅｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｆｌｕｉｄｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ８５００（Ｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の平行プレートセルに直ぐ移した。上部プラテンは２５ｍｍの直径を有し、そして上部および下部の平行プレートの間隔は１．５ｍｍであった。
【００７７】
ゲル化は処方物を混合して直ちに開始した。機器を始動させ、そしてＧ'およびＧ''（それぞれ、弾性係数および粘性係数）を１％のひずみおよび１ラジアン／秒で測定した。１分未満でＧ'は、軟性ゴム状材料に特徴的なほぼ１０4ダイン／ｃｍ2であった。Ｇ'は、１５分以内にプラトーになり始め、そしてその後１時間より長く非常に緩やかに上昇しつづけた。Ｇ''は、１０2ダイン／ｃｍ2のオーダーであり、そして徐々に低下した。これらの結果は、迅速ゲル化材料と一致する。未反応の出発材料についてのＧ'およびＧ''は、約１〜１０ダイン／ｃｍ2であった。これらの結果を図３に示す。
【００７８】
この実験において、血流計は約５０ダイン／ｃｍ2より小さいＧ'およびＧ''を正確に定量することができない。さらに、ゲル化は、非常に速く起きるので、混合物は所望の空間の３０〜９５％を充填するだけである（プレートを取り囲むゲル化流体が存在するが、プレートの間には存在しない）。これらの制限を有するが、時間の関数としての弾性係数（Ｇ'）および粘性係数（Ｇ''）の測定が、なおなされ得、そしてゲル化の速度論に従い得る。この実験に示されるように、１分未満で１０2ダイン／ｃｍ2より大きいＧ'は、迅速なゲル化を示す。
【００７９】
（実施例７ スルフヒドリル−ＰＥＧおよびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）を使用するゲル時間に対する緩衝液の効果）
５０ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）４アーム（分子量１０，０００）四官能性ＳＧ−ＰＥＧを、５０ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）４アーム（分子量１０，０００）四官能性スルフヒドリル−ＰＥＧと混合して、全ての試験を行った。異なる緩衝液を使用して、そしてゲル化する時間を記録した。ＳＧ−ＰＥＧを、全ての試験について０．５ｍＭのホスフェート（ｐＨ６．０）中に溶解した。スルフヒドリル−ＰＥＧを以下に与えられる緩衝液中にｐＨ９．６で溶解し、そしてゲル化の時間を記録した。
（表６）
ゲル化時間に対する緩衝液の効果
【００８０】
【表６】


【００８１】
*（３［１，１−ジメチル−２−ヒドロキシ−エチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−スルホン酸
示されるように、８と１０．５との間のｐＫを有する緩衝液（ホウ酸塩、８：１；炭酸塩１０．３；ＡＭＰＳＯ、９．０）およびそれらの混合物が適切である。
【００８２】
（実施例８ スルフヒドリル−反応性ＰＥＧ）
いくつかの異なる処方物のゲル化特性を、以下に記載する：
８ａ：（二官能性マレイミジル−ＰＥＧ（分子量３４００）（ＭＡＬ−ＰＥＧ）のテトラ−スルフヒドリルＰＥＧ（分子量１０，０００）でのゲル化）０．５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中のＭＡＬ−ＰＥＧの２０％（ｗ／ｖ）溶液を、等容量の１５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の２０％（ｗ／ｖ）テトラ−スルフヒドリルＰＥＧと素早く混合した。ゲル化は、１５秒で起こった。ゲルは１分以内に堅く、ゴム状の固体になった。
【００８３】
８ｂ：（二官能性ヨードアセトアミドＰＥＧ（分子量３４００）（「ＩＡＭ−ＰＥＧ」）のテトラ−スルフヒドリルＰＥＧ（分子量１０，０００）でのゲル化）ＩＡＭ−ＰＥＧを０．５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中に２０％（ｗ／ｖ）で溶解し、そしてＰ／Ｃ緩衝液リン酸−炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中のテトラ−スルフヒドリルＰＥＧの２０％（ｗ／ｖ）溶液と素早く混合した。ゲル化は４０秒未満で起こった。堅いゲルが２分以内に形成した。
【００８４】
８ｃ：（テトラ−スルフヒドリルＰＥＧ（分子量１０，０００）の希釈過酸化水素水でのゲル化）テトラ−スルフヒドリルＰＥＧのＰ／Ｃ緩衝液中の２０％（ｗ／ｖ）溶液を等容量の０．１％（ｗ／ｖ）過酸化水素水と混合した。ゲル化は１５秒で起こった。堅いゲルが２分未満で形成した。
【００８５】
（実施例９）
（ＰＥＧ組成物中に組み込まれたトロンビンの血液凝固活性）
この実験は、活性トロンビンタンパク質を含有する吐血性ＰＥＧゲルが組織上に形成され得ることを示す。
【００８６】
９ａ：テトラスルフヒドリルＰＥＧゲル中に組み込まれたトロンビンは、過酸化水素と共にゲル化した。２０ｍｇのテトラスルフヒドリルＰＥＧ（１，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）を８０μｌのＰＣ緩衝液に溶解し、そして０．７２Ｍ 塩化ナトリウム中、８８５０ＮＩＨ単位／ｍｌでの１１μｌのウシトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｏｐｉｃａｌ，ＵＳＰ，Ｇｅｎｔｒａｃ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を添加した。次いで、テトラスルフヒドリルＰＥＧおよびトロンビンのこの溶液を、１．５ｍｌプラスチック管において速やかに撹拌することによって、水中で０．１％（ｗ／ｖ）の過酸化水素１００μｌと混合した。この混合物は、スルフヒドリル基のジスルフィド結合への酸化に起因して４０秒未満でゲル化した。１．５分後、このゲルは硬く弾性のある固体であった。２００μｌのウサギ血漿を、このゲルの上に重ねた。この血漿は、クエン酸塩加血液から分離され、そして約１１ｍＭ クエン酸塩を含んでいた。添加の直前に、このクエン酸塩加血漿を、８μｌの０．５Ｍ 塩化カルシウムの添加によって再石灰化して、約２０ｍＭのカルシウム濃度を達成した。この再石灰化した血漿は、ＰＥＧゲル上に重ねた１．５分後に、フィブリン血餅を形成することが観察された。凝固反応は、ＰＥＧゲル中の活性トロンビンの存在を示す証拠と考えられた。
【００８７】
コントロール研究がなされる場合、トロンビンを有さない第２の酸化スルフヒドリルＰＥＧゲルは、２０分が経過するまでウサギ血漿を凝固させない。さらなるコントロールとして、再石灰化したウサギ血漿を、同一プラスチック管の中に保持すると；これは１３分後に自然と凝固する。従って、トロンビンを有さないスルフヒドリルＰＥＧゲルが、コントロール再石灰化血漿より速く血液を凝固させることはない。
【００８８】
類似の実験が、テトラスルフヒドリルＰＥＧおよびテトラＳＧ−ＰＥＧならびにトロンビンを用いて試みられた際、血漿の凝固時間の向上は観測されなかった。血漿の凝固は、２５分以上遅れた。この結果は、ＳＧ−ＰＥＧが、おそらくＰＥＧをトロンビンのリシン側鎖に結合することによって、そしてその酵素活性を阻害することによって、トロンビンを不活性化したことを示す、と解釈される。
【００８９】
９ｂ：ＬＡＭ−ＰＥＧ／スルフヒドリルＰＥＧゲル中に組み込まれたトロンビン。２０ｍｇのテトラスルフヒドリルＰＥＧ（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）を、上記９ａのように、１１μｌのトロンビンと共に８０μｌのＰＣ緩衝液に溶解する。２０ｍｇのＩＡＭ−ＰＥＧを、８０μｌの０．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解する。この２つの溶液を、１．５ｍｌプラスチック管において速やかに混合する。この混合物は、３０秒未満のゲル化時間を有し、そして１．５分までには弾性のあるゲルである。再石灰化したウサギ血漿（２００μｌ）をこのゲルの上に重ねると、このゲルの上に重ねてから２分未満で、この血漿中にフィブリン血餅が形成する。トロンビンを有さないコントロール反応は、ＰＥＧゲルの上に重ねてから１８分以上後にフィブリン血餅を形成する。トロンビン含有サンプル中でのフィブリン血餅の迅速な形成は、ＰＥＧゲル中の活性トロンビンの存在を示す証拠と考えられる。
【００９０】
９ｃ：ＮＥＭ−ＰＥＧ／スルフヒドリルＰＥＧゲル中に取り込まれたトロンビン。２０ｍｇのテトラスルフヒドリルＰＥＧ（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）を、上記９ａのように、１１μｌのトロンビンと共に８０μｌの１５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に溶解する。２０ｍｇのＮＥＭ−ＰＥＧを、０．５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解する。この２つの溶液を、プラスチック管において速やかに混合する。ゲル化は１５秒で生じる。１５μｌのＰ／Ｃ緩衝液をＰＥＧゲルの上に重ねて、ｐＨを７〜９に調節する。次いで、２００μｌの再石灰化したウサギ血漿を添加する。フィブリン血餅は、血漿の添加から１．５分後に形成した。トロンビンを有さないコントロールゲルは、フィブリン血餅を３０分後に形成した。再び、トロンビンを有するＰＥＧゲル中でのフィブリン血餅の迅速な形成は、活性トロンビンの存在を示す証拠と考えられる。
【００９１】
９ｄ：トロンビンを有する積層ゲルのゲル化。トロンビンが添加され得、そして活性を維持し得るＳＧ−ＰＥＧおよびスルフヒドリルＰＥＧからゲル処方物を提供するために、「ゲル積層（ｇｅｌ ｌａｙｅｒｉｎｇ）」技術を使用し得る。まず、実施例１に従って調製した、２０％固体のテトラスルフヒドリルＰＥＧおよびテトラＳＧ−ＰＥＧゲルを、実施例２に記載されるようにシート上に噴霧する。このシートは、生理食塩水で水和された粗い繊維質のコラーゲンであり、これは組織表面を刺激する。全容積は、約０．５ｍｌである。この処方物は、１８〜１５秒でゲル化する。１６秒で、全ゲル混合物、全容積約０．５ｍｌのうちテトラスルフヒドリルＰＥＧ、ジマレイミジルＰＥＧ（共に２０％固体）およびトロンビン（７００ＮＩＨ単位／ｍｌ）の第２ゲル混合物を、第１ゲルの上に噴霧する。この第２ゲル層は、約２分でゲル化する。第１ゲルが噴霧された３分後に、上記のように調製した０．４ｍｌの再石灰化ウサギ血漿をＰＥＧゲルの上に重ねた。この血漿は、ＰＥＧゲル上に重ねられた１．５分後に凝固する。トロンビンがないコントロールに比較してこのように早い時間でのフィブリン血餅の形成は、ＰＥＧゲル中の活性トロンビンを示す証拠と考えられる。
【００９２】
（実施例１０）
（粉末状処方物を使用するゲル化）
１０ｍｇの粉末状テトラＳＧ ＰＥＧ（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）を１枚の重し紙（ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ ｐａｐｅｒ）の表面上に噴霧する。１０ｍｇのテトラスルフヒドリルＰＥＧ（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）を、８０μｌのＰ／Ｃ緩衝液に溶解する。スルフヒドリルＰＥＧ溶液を、Ｈａｅｍｅｄｉｃｓ（Ｍａｌｉｂｕ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）スプレーヘッドを用いて１ｃｃシリンジ中に装填し、そして重し紙上のＳＧ−ＰＥＧ上に噴霧する。噴霧された液体は、撹拌も混合もされない。それは、２７秒でゲル化し始め、そして２分までには硬い弾性のある層を形成する。この試験は、粉末形状の成分もまた本発明における使用に適切であることを示す。
【００９３】
（実施例１１）
（コラーゲン含有組成物）
メチル化コラーゲンを以下のプロセスによって調製する：ウシ革質部コラーゲンを、ペプシンを用いて可溶化し、そして米国特許第４，２３３，３６０号に記載されるように精製する。この精製され、可溶化されたコラーゲンは、０．２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中への中和によって沈澱する。この沈澱物を、７０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで遠心分離によって単離する。この物質を２日間乾燥し、次いで粉末化する。ＨＣｌを（０．１Ｎまで）含む乾燥メタノールを添加し（４０ｍｌ）、そして４日間撹拌する。コラーゲンを、酸性メタノールから分離し、真空乾燥し、そして照射によって滅菌する。最終生成物を、ｐＨ３〜４で水に溶解する。
【００９４】
シーラントとしての送達のために、１０ｍｇのメチル化コラーゲン、１００ｍｇの四官能性スルフヒドリルＰＥＧ（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）および１００ｍｇの四官能性ＳＧ ＰＥＧ（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）を、１ｍｌの最終体積までｐＨ３〜４で水に溶解する（第１成分）。第２成分は、１ｍｌのＰ／Ｃ緩衝液である。各成分をシリンジに入れて、混合し、そして実施例１に記載されるようにデュアルシリンジ送達システムを用いて所望の試験部位上に噴霧する。塗布された混合物は、３秒未満でゲル化する。
【００９５】
このゲルの接着性および粘着性を、破裂試験において調べる。この試験を、円圧力計装置（ＰＳＩ−Ｔｒｏｎｉｘ，Ｍｏｄｅｌ ＰＧ５０００，Ｔｕｌａｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にて行う。この装置は、圧力線によって、直径２ｍｍの中央オリフィスを有する円形の試料プレートに接続されている。シーラント処方物をプレート上に噴霧して、オリフィスをシールする。処方物の組織への結合を促すために、試料プレートには粗い繊維質コラーゲンの円形シートが固定されている。このシートは、シートを貫き、そして試料プレートのオリフィスから２〜３ｍｍずらされている、２ｍｍの孔を有する。破裂強度は、生理食塩水を５ｍｌ／分の流速でこのシーラントゲルに通すために必要な圧力の関数として測定される。
【００９６】
この結果を、以下で表７に与える。
【００９７】
【表７】


【００９８】
両方の処方物が３秒未満のゲル化時間を有する。上記に示されるように、コラーゲンの処方物への付加は、破裂強度を増強する。
【００９９】
（実施例１２）
（「１２アーム」ＰＥＧ化合物の合成）
１２アームの求電子性ＰＥＧ化合物を、１ｍｏｌの４アームスルフヒドリルＰＥＧ（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）および４ｍｏｌの４アームＳＧ−ＰＥＧ（１０，０００ｍｏｌ．ｗｔ．）から形成する。得られる化合物を、図４ａに示す。示されるように、この化合物の中心は、ペンタエリトリトールＰＥＧエーテルテトラスルフヒドリルであり、そして末端官能基はスクシンイミドである。官能基が互いに反応性であって化学結合を形成する限り、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）基であるＸは、他の求核性基（例えば、ＮＨ2など）で置換され得、そしてスクシンイミジル基であるＹは、他の求電子性基（例えば、マレイミド、カルボニルイミダゾール、またはイソシアナート）で置換され得る。この方法はまた、４モルの４アームスルフヒドリルＰＥＧを１モルの４アームＳＧ−ＰＥＧと反応させることによって図４ｂに示される１２アーム求核性ＰＥＧ化合物を調製するために使用される。それらの各４アーム中間体に由来するこれらの化合物の調製物もまた図５に示される。このような反応は、活性化ＰＥＧ生成物の異種集合（１２本未満のアームを有するものもあれば、１２本より多いアームを有するものもある）を生じることが理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、「１２アーム」ＰＥＧはまた、各分子上に平均約１２本のアームを有するこのような異種反応生成物をいう。
【０１００】
１２ａ：１２アームスルフヒドリルＰＥＧ
８ｇのペンタエリトリトール（ポリエチレングリコール）エーテルテトラスルフヒドリルを、１００ｍＬの塩化メチレンおよび１００ｍＬのトリエチルアミンの混合物中に溶解した。４０ｍＬの塩化メチレン中の２ｇのペンタエリトリトール（ポリエチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジルグルタレートを、撹拌しながら、室温で、アルゴン下で、一晩ゆっくりと添加した。溶媒を除去し、そしてその生成物を、エタノール中での再結晶によって単離し、乾燥した。
【０１０１】
１２ｂ：１２アームスクシンイミジルＰＥＧ
２ｇのペンタエリトリトール（ポリエチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジルグルタレートを、５０ｍＬの塩化メチレン中に溶解した。１０ｍＬの塩化メチレン中の０．５ｇのペンタエリトリトール（ポリエチレングリコール）エーテルテトラアミンを、撹拌しながら、室温で、アルゴン下で、一晩ゆっくりと添加した。溶媒を除去し、そしてその生成物を、エタノール中での再結晶によって単離し、乾燥した。
【０１０２】
これらの２つの化合物を、実施例１２に記載されるように破裂強度について試験すると、これらは、１５０ｍｍＨｇより大きい破裂強度および２秒未満のゲル化時間を示した。
【０１０３】
上記のシステムに対して、その基本的な技術から逸脱することなく多くの改変がなされ得る。本発明は、１つ以上の特定の実施形態を参照してかなり詳細に記載されてきたが、当業者は、本出願において具体的に開示された実施例は変更されるが、これらの改変および改良は以下の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲および精神を越えないことを理解する。本出願に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもこれらの刊行物、特許、または特許出願の各々が明確にそして個々に示されて本明細書中に参考として援用されるように、本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、種々のスルフヒドリル反応基の構造を示し、ここで「Ｒ」は、反応基が付着する化学構造を示す。
【図２】図２は、低分子量の多官能性反応化合物の構造を示す。
【図３】図３は、反応性四官能性ポリエチレングリコールの混合物のゲル化のレオメトリック（ｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃ）測定を示す。
【図４】図４は、実施例１３に記載されるような「１２アーム」スルフヒドリル反応性又はスクシンイミジル反応性ＰＥＧ化合物を示す。
【図５】図５は、実施例１３に記載されるような「４アーム」中間体からの２つの「１２アーム」ＰＥＧ化合物の形成を示す。
【出願人】 【識別番号】５０６４１４５８７
【氏名又は名称】アンジオデバイス インターナショナル ゲーエムベーハー
【出願日】 平成１９年８月２１日（２００７．８．２１）
【代理人】 【識別番号】１０００８２００５
【弁理士】
【氏名又は名称】熊倉 禎男

【識別番号】１０００８４００９
【弁理士】
【氏名又は名称】小川 信夫

【識別番号】１０００８４６６３
【弁理士】
【氏名又は名称】箱田 篤

【識別番号】１０００９３３００
【弁理士】
【氏名又は名称】浅井 賢治

【識別番号】１００１１４００７
【弁理士】
【氏名又は名称】平山 孝二
【公開番号】 特開２００８−２９８５５（Ｐ２００８−２９８５５Ａ）
【公開日】 平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願番号】 特願２００７−２１５０１６（Ｐ２００７−２１５０１６）