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【発明の名称】 化合物、製剤用組成物及びこれらを含む診断装置とこれらの利用
【発明者】 【氏名】トルエ アンドレ

【氏名】バウレイン ロージャー
【要約】 【課題】治療剤またはマーカを含む新規の化合物を提供する。

【構成】末端基（Ｗ）とアーム（Ｚ）が結合したリガンド（Ｗ−Ｚ）と、治療剤及びマーカから選択され、リガンド（Ｗ−Ｚ）と結合する成分（Ｍ）とを有する化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）であって、前記結合が化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）の細胞内進入を妨げ、及び／またはマーカ（Ｍ）の発現を抑止し、前記結合がターゲット細胞から分泌される因子によって選択的に開裂されることによりマーカ（Ｍ）の発現またはターゲット細胞への治療剤（Ｍ）の進入が可能になり、末端基（Ｗ）が、血清及び循環血液中での化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）の安定性を維持することを特徴とする化合物である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端基（Ｗ）と、それに結合するアーム（Ｚ）とを含むリガンド（Ｗ−Ｚ）と、治療剤及びマーカから成る群から選択されて前記リガンド（Ｗ−Ｚ）と結合する成分（Ｍ）とを有する化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）であって、
リガンド（Ｗ−Ｚ）におけるアーム（Ｚ）の結合、またはアーム（Ｚ）と成分（Ｍ）との間の結合が化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）の細胞内進入を妨げ、及び／またはマーカ（Ｍ）の発現を抑止し、
前記結合が因子、またはターゲット細胞から分泌される因子によって選択的に開裂されることによりマーカ（Ｍ）の発現またはターゲット細胞への治療剤（Ｍ）の進入が可能になり、
末端基（Ｗ）が、血清及び循環血液中での化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）の安定性を維持することにより、３７℃のヒトの血液中に２時間以上滞留している間に化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）の２０％以下が開裂されることを特徴とする化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）。
【請求項２】
末端基（Ｗ）を哺乳類には存在しないアミノ酸またはサクシニル基から成るグループから選択したことを特徴とする請求項１に記載の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）。
【請求項３】
末端基（Ｗ）がβ−アラニンであることを特徴とする請求項２に記載の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）。
【請求項４】
成分（Ｍ）とリカンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）との間の結合がペプチド結合であることを特徴とする請求項１項から請求項３のいずれか１項に記載の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）。
【請求項５】
リガンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）が少なくとも２つの随意に置換されるアミノ酸から成ることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）。
【請求項６】
リガンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）を、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−，Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−，Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニル−，Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−から成るペプチド配列のグループから選択したことを特徴とする請求項５項に記載の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）。
【請求項７】
成分Ｍが抗炎症剤であることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）。
【請求項８】
成分（Ｍ）がメトトレキサートである請求項７に記載の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）に、製剤上許容できる補薬または賦形剤を含む製剤組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の化合物、製剤用組成物、及びこれらを含む診断装置、並びに癌性腫瘍及び／または炎症反応を診断及び／または治療するための薬剤の製造を目的とするこれらの利用に係わる。
【背景技術】
【０００２】
数年来、アントラサイクリンやビンカアルカロイドのような種々の腫瘍治療剤が開発され、癌の治療に特に効果を上げている。しかし、これらの分子は、生体内で急性毒性、特に骨髄及び粘膜に対する毒性を示すだけでなく、アントラサイクリンの場合には心臓に対して慢性毒性を、ビンカアルカロイドの場合には神経系に対して慢性毒性を示すことが多い。
【０００３】
そこで、腫瘍細胞に対してもっと有効な特異性の高い抗腫瘍剤を開発してこの種の製品の副作用（毒性、非腫瘍細胞の破壊など）を軽減する努力がなされている。
米国特許第４，２９６，１０５号は、随意に置換可能なアミノ酸と結合しているドキソルビシン誘導体を開示しており、この誘導体はドキソルビシンよりも抗腫瘍作用が強く、毒性が低い。
しかし、この誘導体は細胞内活性部位を有し、依然として腫瘍細胞と正常細胞とに進入し易い。
【０００４】
そこで、数年前からプロドラッグの形で新規の治療剤が提案されている。
プロドラッグは、その構造が化学的作用または酵素作用で変化することによってドラッグ（活性治療化合物）に変換できる分子である。
しかし、このプロドラッグにも、この分子を不活性化する酵素を含んでいる血液及び血清中では安定度が低いという特徴がある。
【０００５】
文献ケミカルアブストラクト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ）９７：１５０６３５，ジャーナル オブ メディカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１１７１−１１７４（１９８０）；ドラッグス
Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．（Ｄｒｕｇｓ Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．），Ｖｏｌ．９，ｐｐ．３０３−３１１（１９８３）；ジャーナル オブ メディカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１１６６−１１７０（１９８０）、及び特許出願ＢＥ−８８２．５４１号は、ペプチドアームを介してドラッグと結合するキャリアを含むプロドラッグを記述している。好ましくは、アームは４個のアミノ酸から成り、遊離カルボキシル官能基を介して例えばダウノルビシンのようなアントラサイクリン誘導体の遊離アミン官能基と結合している。
【０００６】
また、このようなプロドラッグのアームは、ターゲット細胞の選択的なエンドサイトーシスを可能にする巨大分子（ＢＳＡ、イムノグロブリンなどのような蛋白質）から成るキャリアと、遊離アミン官能基を介して結合している。
リウマチ疾患のような炎症反応の治療にメトトレキサートを利用できることも公知であるが、その高い毒性がその利用範囲を狭めている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、抗腫瘍性治療剤またはマーカを含む新規の化合物、特に抗腫瘍性治療剤を含み、公知製品よりもすぐれた治療性能を示し、特に癌性腫瘍の治療及び／またはリウマチ疾患のような炎症反応の治療においてすぐれた治療性能を示すプロドラッグを提供することにある。
【０００８】
本発明の具体的な目的は、作用、低い毒性、及び血清と血液中での高い安定性という高度の特異性を示すプロドラッグを得ることにある。
本発明の他の目的は、腫瘍を特徴づけること（腫瘍の診断、進行、腫瘍細胞から分泌される因子の検査など）を可能にするマーカを含む化合物を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、細胞内活性部位（Ａ．Ｓ．）を有し、末端基（Ｗ）と結合するアーム（Ｚ）を含むリガンド（Ｗ−Ｚ）と結合する成分（Ｍ）から成る化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）において、リガンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）と成分（Ｍ）との間の結合が化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）の細胞内進入を妨げ及び／またはマーカ（Ｍ）の発現を抑止し、ターゲット細胞から分泌される因子によって前記結合を選択的に開裂することにより、マーカ（Ｍ）の発現及び／または前記ターゲット細胞への治療剤（Ｍ）の進入を可能にすることができ、末端基（Ｗ）が血清及び循環血液中での化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）に安定性を与えることを特徴とする化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）に係わる。
【００１０】
ターゲット細胞、特に腫瘍細胞及び炎症反応を伴なっている細胞（マクロファージ、単球など）から分泌される因子は、前記細胞から特に細胞外媒質中へ分泌されるプロテアーゼまたはペプチダーゼのような酵素を意味すると考えられる。
従って、これらの酵素は成分（Ｍ）とリガンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）との間に存在する結合を選択的に開裂することによって、（好ましくは前記細胞の領域における）マーカの発現及び／または前記細胞への治療剤の優先的な進入を可能にして前記細胞の破壊及び／またはその増殖の阻止を達成することができる。
【００１１】
末端基（Ｗ）とアーム（Ｚ）との間の結合も、アーム（Ｚ）と成分（Ｍ）との間の結合も、本発明の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）の性質に影響を及ぼさない共有結合ならどのような形でもよい。
マーカ（Ｍ）の発現を抑止するリカンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）とマーカ（Ｍ）との間の結合は、マーカ（Ｍ）の検出及び／または定量を妨げる共有結合を意味すると考えられる。
【００１２】
遊離マーカ（Ｍ）の発現は、当業者に周知の方法または装置、例えば、着色、蛍光、生体発光、化学発光などのほか、場合によっては１種類または２種類以上の中間試薬を併用して検出することができる。
好ましくは、前記マーカをクマリン、７−アミド−４−（トリフルオロメチル）−クマリン、（遊離の形では、ジアゾ化反応後に比色計によって検出できる）パラ−ニトロアニリド、β−ナフチルアミド及び４−メトキシ−β−ナフチルアミドから成るグールプから選択され、リガンド（Ｗ−Ｚ）と結合していなければ蛍光によって検出できる。
【００１３】
血清及び循環血液中において本発明の化合物を安定させる機能を果す末端基（Ｗ）は、血清及び循環血液中における本発明の化合物の開裂を減少または抑止する基、特に血清及び／または循環血液中に存在するプロテイナーゼ及びペプチダーゼによる本発明の化合物の加水分解を減少または抑止する基、特に赤血球と関連するペプチダーゼ及びプロテイナーゼによる加水分解を減少または抑止する基を意味すると考えられる。
具体的には、誤：３７℃のヒトの血液中に２時間以上滞留している間、化合物の２０％以下、好ましくは２％以下が前記酵素によって開裂されても、末端基（Ｗ）は本発明の化合物の安定性を維持する。
【００１４】
好ましくは、この末端基（Ｗ）は、哺乳動物には存在していないアミノ酸（すなわち、哺乳動物によっては遺伝的にコード化され得ないアミノ酸）からなる群またはサクシニル基から選ばれる。
【００１５】
本発明の好ましい実施例では、基（Ｗ）はカルボキシ官能基を介してアーム（Ｚ）と結合する式：ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨで表わされるβ−アラニンである。
アーム（Ｚ）は、成分（Ｍ）との結合がターゲット細胞から分泌される因子によって選択的に開裂されることで前記細胞の領域におけるマーカ（Ｍ）の発現及び／または前記細胞への治療剤（Ｍ）の優先的な進入を許すような化学構造（多糖類、ペプチドなど）であればよい。
【００１６】
本発明では、成分（Ｍ）とリガンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）との間の結合はペプチド結合から成る。好ましくは、アーム（Ｚ）は少なくとも２つの随意に置換可能なアミノ酸から成るペプチドである。
【００１７】
リガンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）は、好ましくは下記のアミノ酸の配列から成る：即ち、カルボキシ官能基を介して成分（Ｍ）と結合するＬ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニルまたはＬ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニルまたはＬ−アラニル−Ｌ−ロイシルから成る。
【００１８】
本発明では、治療剤（Ｍ）として好ましくはブルース エイ．チャブナ（Ｂｒｕｃｅ Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）及びジェリ エム．コリンズ（Ｊｅｒｒｙ Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓ）（カンサケモテラピー，リッピンコット Ｅｄ．ＩＳＢＮ（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｅｄ．，ＩＳＢＮ）０−３９７−５０９００−６（１９９０））によって記述されている治療剤から選択された癌の化学療法に使用されている治療剤か、またはメトトレキサートのような抗炎症剤であり、リガンド（Ｗ−Ｚ）と結合可能な、好ましくはペプチド結合を介してリガンド（Ｗ−Ｚ）の基（Ｚ）と結合可能なものである。
具体的には、治療剤を、アントラサイクリン、葉酸誘導体、ビンカアルカロイド、ミトザントロン、カリケアマイシン、シトシン
アラビノシド（ＡＲＡ−Ｃ）またはアデノシン アラビノシド（ＡＲＡ−Ａ）、リン酸フルダラビン、メルファラン、ブレオマイシン、ミトマイシン、Ｌ−カナバニン、トキソイド、カンプトテシン及びこれらの誘導体、特にＴＯＰＯＴＥＣＡＮ（商品名、９−ジメチル−アミノメチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンヒドロクロリド）、ローダミン１２３や随意に置換または非置換アミノ酸と結合しているそれらの誘導体、特にローダミンイソチオシアネートのようなフルオロクロム誘導体から選択する。アミノ酸における置換は、本発明の化合物（Ｗ−Ｚ−Ｍ）の性質に影響を及ぼさない置換であればよい。
【００１９】
これらの分子の誘導体は、元の分子の治療作用に影響を及ぼさない共有結合を介してリガンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）と結合することを可能にする化学基で変性させられた前記分子を意味する。
本発明の化合物においては、治療剤（Ｍ）を随意に置換または非置換アミノ酸と結合しているアントラサイクリン、特にドキソルビシン（ＤＯＸ）及びダウノルビシン（ＤＮＲ）から成るグループから選択するのが好ましい。
【００２０】
治療剤は、好ましくは次の一般式に対応するものである：
【００２１】
【化１】


【００２２】
式の中で、−Ｒ１は、水素原子またはＯＨ基、−Ｒ２は、水素原子または次式のラジカル：
【００２３】
【化２】


【００２４】
式の中で、−Ｒ３は、水素原子または随意に置換されているアルキルラジカルを表わし、−Ｒ４は、水素原子、またはＲ３と共に３または４個の炭素原子を有するアルキレンラジカルを形成する。
Ｒ２は、好ましくは次式のラジカルであるか、またはその同位体の１つである：
【００２５】
【化３】


【００２６】
本発明の好ましい実施例では、化合物はβ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシルダウノルビシン（以下βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲと略記する）、β−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシルドキソルビシン（以下βＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸと略記する）、β−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニルダウノルビシン（以下βＡｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＤＮＲと略記する）またはβ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニルドキソルビシン（以下βＡｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＤＯＸと略記する）である。
【００２７】
本発明は、本発明の化合物、及び場合によっては製剤上許容できる補薬または賦形剤を含む製剤用組成物にも係わる。
これらの組成物は、例えば、非経口または静脈内投与することができる。非経口投与用の本発明組成物は、特に滅菌溶液、水性または非水性の懸濁液または乳化液の形を取ることができる。製剤上許容できる溶剤または賦形剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル、またはシクロデクストリンを使用できる。これらの組成物は、湿潤剤、乳化剤及び／または分散剤をも含むことができる。
【００２８】
滅菌の方法としては、例えば細菌フィルタを使用したり、組成物に殺菌剤を入れたり、照射したりする種々の方法がある。使用時に滅菌水やその他の滅菌注射液に溶かすことができる滅菌固形組成物の形に製造することもできる。
本発明は、癌性腫瘍の治療効果を高め、持続させるため本発明の化合物と併用できる（ビタミンＣ、酸化防止剤などのような）当業者に公知の補薬をも含むことができる。
患者への本発明化合物の最少投与量は、特にＢｒｕｃｅ Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｎ Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｅｄ．，ＩＳＢＮ ０−３９７−５０９００−６（１９９０））によって記述されている上記抗腫瘍治療剤の投与量またはそれ以上の投与量である。
【００２９】
投与量は、本発明の化合物の調製に使用される治療剤に応じて異なる。
本発明は、癌性腫瘍の治療薬の製造を目的とする本発明の製剤用組成物の利用にも係わり、また、本発明の製剤用組成物を患者に対して特に非経口または静脈内投与することから成る癌性腫瘍の治療方法にも係わる。
【００３０】
本発明はまた、炎症反応、特にリウマチ疾患の治療薬の製造を目的とする本発明の製剤用組成物の利用にも係わり、また、本発明の製剤用組成物、特に治療剤（Ｍ）がメトトレキサートまたはメトトレキサート誘導体である本発明の化合物を含む製剤用組成物を患者に対して特に非経口または静脈内投与することから成る炎症反応、特にリウマチ疾患の治療方法にも係わる。
【００３１】
本発明はまた、本発明の化合物、特にクマリンをマーカとする化合物を含む診断及び／または検査装置にも係わる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、マーカの発現を抑止するか、または正常細胞（Ｎ．Ｃ．）及びターゲット細胞（Ｔ．Ｃ．）への治療剤（Ｍ）の細胞内進入を阻止するリガンド（Ｗ−Ｚ）との結合によって不活性化されているマーカまたは治療剤（Ｍ）、特に抗腫瘍及び／または抗炎症治療剤を製造できるという予想外の発見に基づく。
【００３３】
本発明では、前記ターゲット細胞が腫瘍細胞または抗炎症反応に関与する細胞、特にマクロファージ、単球などのようなリウマチ疾患と関連する細胞である。
予想外の所見として、ターゲット細胞（Ｔ．Ｃ．）はリガンド（Ｗ−Ｚ）のアーム（Ｚ）とマーカ（Ｍ）または治療剤（Ｍ）との間の共有結合を選択的に加水分解することによってマーカ（Ｍ）の発現または前記ターゲット細胞（Ｔ．Ｃ．）への治療剤（Ｍ）の進入を可能にするプロテアーゼやペプチダーゼのような酵素を細胞外媒質中に放出する。ターゲット細胞において、治療剤（Ｍ）は特定の細胞内活性部位（Ａ．Ｓ．）に直接作用するか、または細胞内プロテアーゼの作用下に変性したのち、別の治療剤（Ｍ＊）となり、ターゲット細胞（Ｔ．Ｃ．）を殺すか、またはその増殖を阻止する（図１）。
【００３４】
正常細胞は、生体内に前記酵素を殆ど、または全く放出しないから、本発明の化合物は不活性のままであり、正常細胞に進入しない（図２）。
具体的には、（例えば中間的な発光による）マーカの発現は癌細胞の特徴づけを可能にし、これにより癌診断、腫瘍の進行状況検査、腫瘍細胞からの分泌因子の同定などを改善する。
本願に記載されている化合物は、効果的に投与されるのに必要な条件を満たすから、このような作用メカニズムと合致する。
【００３５】
１．治療剤（Ｍ）：
−細胞内活性部位を有し、
−高度の特異作用を有し、
−リガンド（Ｗ−Ｚ）との共有結合を可能にする化学基を有し、
−所要の化学基が治療剤（Ｍ）の作用にとって重要でなければ、前記共有結合が酵素によって加水分解されたのち、元の完全な状態に回復しなくてもよい。
【００３６】
２．リガンド（Ｗ−Ｚ）との結合は、正常細胞だけでなくターゲット細胞へも治療剤（Ｍ）が細胞内進入するのを阻止する。
３．本発明の化合物は、血清及び血液中で安定性を維持し、赤血球と共に循環するプロテイナーゼ及びペプチダーゼに対して反応しない。
４．治療剤（Ｍ）とリガンド（Ｗ−Ｚ）との間に存在する共有結合は、ターゲット細胞から分泌される酵素によって部分的にまたは完全に減成する。
５．マーカまたは治療剤（Ｍ）に対するリガンド（Ｗ−Ｚ）及びその結合の性質は、ターゲット細胞から分泌される酵素に応じて決定される。
６．化合物は、出発の治療剤よりも生体内での毒性が低い。この毒性低下は、特に骨髄及び粘膜毒性、並びに心臓または神経系毒性のような急性効果に当てはまる。
【００３７】
＜アントラサイクリン誘導体＞
本発明の治療剤（Ｍ）としては、アントラサイクリン誘導体、特にドキソルビシン、ダウノルビシン、４−エピドキソルビシン、４−デメトキシドキソルビシン（イダルビシン）、４′−テトラヒドロピラニルドキソルビシン（ピラルビシン）、カルミノマイシン、エソルビシン及び４′−ヨードドキソルビシンを使用できる。
この場合、リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル官能基を介して治療剤のα−アミノ末端と結合する。
【００３８】
＜葉酸誘導体＞
抗腫瘍治療剤として、葉酸誘導体、特にフィッツパトリック等（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．）（アンチ−カンサー ドラッグ デザイン（Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ））１０，ｐｐ．１−９及びｐｐ．１１−２４（１９９５））によって述べられているようなメトトレキサート（ＭＴＸ）またはその誘導体、例えば、リジン（ε−γ）−ＭＴＸまたはリジン（ε−α）−ＭＴＸ、またはアミノプテリン、特にリジン（ε−γ）−ＡＭＰＴやリジン（ε−α）−ＡＭＰＴも利用できる。
この場合、リガンド（Ｗ−Ｚ）はそのカルボキシル官能基を介して治療剤のα−アミノ末端と結合する。
【００３９】
＜ビンカアルカロイド誘導体＞
本発明のビンカアルカロイド誘導体は、具体的にはビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びナベルビンの誘導体である。
【００４０】
Ａ．位置３における結合
１．リジン（ε）−ｄＡｃＶＣＲを得るためε−アミノ基にリジンを加えることによって形成されるデアセチルビンクリスチン酸。この場合、リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してリジン（ε）−ｄＡｃＶＣＲのα−アミノ基と結合する。
２．デアセチルビンクリスチン酸は、ビンクリスチン（ＮＨ２−アルキル−ＮＨ２）に脂肪族ジアミンを加えることによってＮＨ２−アルキル−ｄＡｃＶＣＲを得、リガンド（Ｗ−Ｚ）をそのカルボキシル末端を介してリジン（ε）−ｄＡｃＶＣＲのα−アミノ基と結合させて形成することもできる。
ビンブラスチン（ＶＢＬ）及びナベルビン（５′−ノルアンヒドロ−ビンブラスチン）誘導体は、ビンクリスチンに関連して上述したのと同じ態様でリガンド（Ｗ−Ｚ）を結合することができる。
【００４１】
Ｂ．位置４における結合
１．Ｖ４−ヘミアスパテート−ビンクリスチンは、ビンクリスチン（Ｖ４）の位置４におけるヒドロキシル基にアスパラギン酸をそのγ−カルボキシル基を介して結合させることによってビンクリスチンから形成される。この場合、リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してＶ４−ヘミアスパテート−ビンクリスチンのα−アミノ基と結合する。
２．Ｖ４−リシルビンクリスチンは、そのα−カルボキシル基を介してリジンをビンクリスチン（Ｖ４）の位置４におけるヒドロキシル基と結合させることによってビンクリスチンから形成される。この場合、リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してＶ４−リシルビンクリスチンのα−アミノ基と結合する。
【００４２】
３．Ｖ４−リシルビンクリスチンは、リジンをそのα−カルボキシル基を介してビンクリスチン（Ｖ４）の位置４におけるヒドロキシル基と結合させることによってビンクリスチンから形成される。この場合、リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してＶ４−リシルビンクリスチンのリジンのε−アミノ基と結合する。リガンド（Ｗ−Ｚ）をＶ４−リシルビンクリスチンのα−及びε−アミノ基の双方と結合させてもよい。
４．Ｖ４−β−アラニルビンクリスチンは、β−アラニルをそのカルボキシル基を介してビンクリスチン（Ｖ４）の位置４におけるヒドロキシル基と結合させることによってビンクリスチンから形成される。この場合、リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してＶ４−β−アラニルビンクリスチンのβ−アラニルのアミノ基と結合する。
ビンクリスチン、ビンデシン及びナベルビン誘導体はビンクリスチンに関して上述したのと同じ態様でリガンド（Ｗ−Ｚ）と結合させることができる。
【００４３】
＜カリケアマイシン誘導体＞
カリケアマイシンから誘導されるＮ−アセチルジメチルヒドラジドは、チオールヒドラジドをカリケアマイシンと反応させることによって得られる。
この場合、リガンド（Ｗ−Ｚ）はそのカルボキシル末端を介してカリケアマイシンから誘導されたＮ−アセチルジメチルヒドラジドと結合する。
【００４４】
＜ミトキサントロン誘導体＞
β−アラニルのカルボキシル官能基をミトキサントロンのヒドロキシル側鎖と結合することによって、ミトキサントロンから誘導されたβ−アラニルを製造する。
この場合、１置換または２置換が可能である。リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してβ−アラニルミトキサントロンのアミノ基と結合する。
【００４５】
＜シトシンアラビノシド（ＡＲＡ−Ｃ）誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してシトシンアラビノシドのアミノ基と結合する。
＜アデノシンアラビノシド（Ａｒａ−Ａ）誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してアデノシンアラビノシドのアミノ基と結合する。
＜リン酸フルダラビン誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してリン酸フルダラビンのアミノ基と結合する。
【００４６】
＜メルファラン誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してメルファランのアミノ基と結合する。
＜ブレオマイシン誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してブレオマイシン、ペプロマイシンまたはリブロマイシンのアミノ基と結合する。
【００４７】
＜ミトマイシン誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してミトマイシンの位置７におけるアミノ基と結合する。
＜Ｌ−カナバニン誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してＬ−カナバニンのα−アミノ基と結合する。
【００４８】
＜タキソイド誘導体＞
タキソールのβ−アラニル誘導体は、β−アラニルのカルボキシル官能基をタキソールの位置７におけるヒドロキシル側鎖と結合させることによって製造される。
タキソールのヒドロキシル基は、反応性であるがタキソールの抗腫瘍作用にとって不可欠ではない（ニカラウ ケイ．シー．等，ケミストリ アンド バイオロジー オブ タキソール（Ｎｉｃａｌａｏｕ Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔａｘｏｌ），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９４），３３，ｐｐ．１５−４４）。
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介してβ−アラニルタキソールのアミノ基と結合する。
リガンド（Ｗ−Ｚ）は誘導体β−アラニルタキソテーレとも結合できる。
【００４９】
＜カンプトテシン誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、そのカルボキシル末端を介して９−アミノカンプトテシンまたは７−アミノメチルカンプトテシンのα−アミノ基と結合する。
本発明を実施例に従って以下に詳しく説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【００５０】
＜例１＞
Ｎ−Ｌ−ロイシルダウノルビシン（Ｌｅｕ−ＤＮＲ）の合成 ＦＭＯＣ（フルオレニルメトキシカルボニル，ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基によってアミン官能基を保護されているＬ−ロイシンと塩基の形のダウノルビシン（ＤＮＲ）とを反応させてカルボキシル基をＩＢＣＦ（クロロホルム酸イソブチル，ｉｓｏｂｕｔｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）で活性化し、次いでアミン基に対する保護を除くことによってＬ−ロイシルダウノルビシンを合成する。
【００５１】
塩基型のＤＮＲは、５００μｌのＤＭＦ（ジメチルホルマミド）に２００ｍｇのダウノルビシンヒドロクロリド（Ｒ．Ｂｅｌｌｏｎ）を溶解させ、これに１．２当量のＮ−メチルモルホリンを添加することによって調製する。
【００５２】
１．２当量のＦＭＯＣ−Ｎ−ロイシン（ＮＯＶＡ ＢＩＯＣＨＥＭ）を５００μｌのＤＭＦ（ジメチルホルマミド）に溶解させ、マイナス２０℃において１．２当量のＮ−メチルモルホリン及び１．２当量のＩＢＣＦを添加する。１５分後、この溶液をＤＮＲ塩基の溶液に添加し、この混合物を暗所で１６時間撹拌する。
【００５３】
１５０ｍｌのエーテル／石油エーテルの１：１混合物（４０−６０℃）中にＦＭＯＣ−Ｎ−Ｌ−ロイシルダウノルビシンを沈殿させ、次いでＮｏ．４グラスフィルターで濾過する。クロロホルムを溶離液としてシリカ（７０−２３０メッシュのシリカ、Ｅ．ＭＥＲＣＫ社のＳｉ−６０）をカラムとするクロマトグラフィで生成物を精製する。残留ＤＮＲを１０％メタノールで溶離する。ＦＭＯＣ−Ｎ−Ｌ−ロイシル−ＤＮＲを含有する画分を回転蒸発器で濃縮し、生成物を５００μｌのＤＭＦ中に取り出す。マイナス２０℃で５当量のジエチルアミン（ＬＡＢ ＳＣＡＮ社製）を添加することによって、保護基を分離する。
【００５４】
１時間後、エーテル／石油エーテルの１：１混合物（４０−６０℃）でＮ−Ｌ−ロイシル−ＤＮＲを沈殿させ、Ｎｏ．４グラスフィルターで濾過する。生成物をクロロホルム／メタノールの４：１容積比混合物中に取り出し、１当量のＨＣｌでジエチルアミンを中和する。
【００５５】
次いで、シリカ（７０−２３０メッシュのシリカ、Ｅ．ＭＥＲＣＫ社のＳｉ−６０）をカラムとするクロマトグラフィでクロロホルムを溶離液とし、さらに１５％のメタノールを含有するクロロホルムを溶離液として生成物を精製する。Ｎ−Ｌ−ロイシル−ＤＮＲを含有する画分を回転蒸発器で濃縮し、生成物を蒸留水中に取り出し、１ＮのＨＣｌでｐＨを７に調節することによってヒドロクロリドを形成する。次いで生成物を変成シリカゲル（ＷＡＴＥＲＳ社のＳｅｐｐａｋ Ｃ１８）で濾過し、メタノールでＮ−Ｌ−ロイシルダウノルビシンヒドロクロリドを溶離して、回転蒸発器で濃縮する。平均的な収率は、７０〜８０％である。
【００５６】
生成物の特性
【００５７】
【表１】


ＴＬＣ Ｒｆ：クロロホルム／メタノール／水（１２０：２０：１容積比）系
ＨＰＬＣ Ｔｒ：ドキソルビシンに対する保持時間、ＨＰＬＣ系：クロロホルム／メタノール／酢酸／０．３ｍＭ ＭｇＣｌ２水溶液（１４４０：４２０：８０：６０容積比）混合物を溶離液とするＳｉ−６０カラム。
【００５８】
＜β−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニンの合成＞
メリフィールド法による固相合成でβ−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニンを製造する（ザ
ケミストリー オブ ポリペプチド，（ピー．ジー．カツオヤニス Ｅｄ．），プレナム プレス，ニューヨーク，ｐｐ．３３６−３６（１９７３），（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，（Ｐ．Ｇ．Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ Ｅｄ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３３６−３６１（１９７３）））。
【００５９】
＜フルオロクロム誘導体＞
リガンド（Ｗ−Ｚ）は、カルボキシル末端を介してローダミン１２３のアミノ基と結合している。
【００６０】
＜β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの合成＞
固相合成によって得られたＦＭＯＣ−β−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニンをＮ−Ｌ−ロイシルダウノルビシンにグラフトすることによって、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを合成する。
【００６１】
ＤＭＦに溶解させたＦＭＯＣ−β−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン（１．５当量）に１．５当量（ｅｑ．）のＮ−メチルモルホリン及び１．５当量のクロロホルム酸イソブチルを加える。マイナス２０℃に１０分間放置したのち、１．５当量のＨＯＢＴを加える。さらに５分後、ＤＭＦに溶解させた１当量のＮ−Ｌ−ロイシルダウノルビシン塩基を添加する。反応後、ＦＭＯＣ−β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲをエーテルで沈殿させ、ジエチルアミンで保護基を分離する。シリカをカラムとするクロマトグラフィでβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを精製し、１Ｎ ＨＣｌを添加してヒドロクロリドを形成する。
【００６２】
＜β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの合成＞
β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの合成に関して上述したのと同様に、固相合成で得たβ−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニンをＮ−Ｌ−ロイシルドキソルビシンにグラフトすることによってβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸを合成する。
この合成においては、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸを形成する場合の本発明化合物の収量をさらに高めるため結合剤（クロロホルム酸イソブチル）の使用を省いてもよい。
【００６３】
＜例２＞
＜ＭＣＦ７／６乳癌細胞から得たならし培地中におけるβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの分解＞
ＭＣＦ７／６細胞から得たならし培地中に２時間にわたり３７℃でβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを培養し、２０〜４０倍に濃縮し、この化合物を消化生成物と共にｐＨ９で抽出し、ＨＰＬＣで分析した（図３）。
【００６４】
【表２】


【００６５】
この表から明らかなように、Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲはエンドペプチダーゼからの主要代謝産物であり、プロドラッグからのその形成は、３７℃で１時間培養したのちほぼ完了する。採用された実験条件下では、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲとＤＮＲとは充分に分離されないから、形成されたＬ−Ｌｅｕ−ＤＮＲがその後ゆっくり加水分解されてＤＮＲになると断言することはできない。
【００６６】
＜例３＞
＜ＭＣＦ７／６乳癌細胞から得たならし培地中におけるβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの分解＞
ＭＣＦ７／６細胞から得たならし培地中で２時間、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸを３７℃で培養し、２０倍に濃縮すると、代謝産物としてＬ−Ｌｅｕ−ＤＯＸ及びＤＯＸだけが得られる。
【００６７】
【表３】


【００６８】
ＭＣＦ７／６細胞から分泌されるペプチダーゼによりＤＮＲプロドラッグよりも緩慢な速度でβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸが加水分解される。ただし、Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＯＸからＤＯＸへの変換は、Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲからＤＮＲへの変換よりもやや広範囲に起こるようである。
【００６９】
＜例４＞
＜ヒト血液中におけるβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの分解＞
β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲと同様に、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸもヒト血液中に３７℃で培養される場合、安定である。即ち、２時間後に加水分解でＬ−Ｌｅｕ−ＤＯＸとなるのはプロドラッグの２％以下であり、これに反して、合成された他の誘導体はヒト血液の存在において急速に加水分解する（表１下方）。
【００７０】
【表４】


【００７１】
＜例５＞
＜ＭＣＦ７／ＡＤＲ乳癌細胞から得たならし培地中におけるβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの分解＞
β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲをアントラサイクリン耐性ＭＣＦ７細胞（ＭＣＦ７／ＡＤＲライン）から得たならし培地中で１時間にわたり３７℃で培養すると、Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲだけが代謝産物として検出される（図４）。
アントラサイクリン感性ＭＣＦ７／６細胞も、アントラサイクリン耐性ＭＣＦ７／６細胞も、本発明化合物を加水分解できるプロテアーゼを分泌する。
【００７２】
＜例６＞
＜ＨｅｐＧ２肝癌細胞から得たならし培地中におけるβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの分解＞
ＨｅｐＧ２肝癌細胞から得たならし培地中で２時間にわたり、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを３７℃で培養すると、主な代謝産物としてＬ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ（全蛍光の２７％）とＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ（８％）とが検出される。ならし培地を構成する細胞数もならし培地の濃度も異なるから、ＭＣＦ７乳癌細胞とＨｅｐＧ２肝癌細胞との加水分解の％を比較することはできない。しかし、定性分析の結果に照らして、ペプチダーゼはＭＣＦ７細胞に特異なものではない。
【００７３】
＜例７＞
＜ＨＴ２９結腸癌細胞から得たならし培地中におけるβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの分解＞
ＨＴ２９結腸癌細胞から得た４０倍濃縮ならし培地中でβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを２時間にわたり３７℃で培養すると、主要な代謝物としてＬ−Ｌｅｕ−ＤＲＲ（全蛍光の８２％）及びＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及び／またはＤＮＲ（３％）が検出される（図５）。
【００７４】
＜例８＞
＜ＭＣＦ７／６腫瘍細胞中でのＤＮＲ，Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びβ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの蓄積＞
１０μｇ当量ＤＮＲ／ｍｌの濃度のβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの存在においてＭＣＦ７／６ヒト乳癌細胞を培養した。種々の経過時間におけるプロドラッグ及びその蛍光性代謝産物の蓄積を、実験室で開発された方法に従って、塩基性ｐＨの生成物として抽出したのち、ＨＰＬＣによって測定した。
【００７５】
細胞タンパクのμｇ／ｍｇで表わされる蓄積量をＤＮＲ，ＤＯＸ，Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びＬ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの蓄積量と比較した。実験室で調製された基準生成物の保持時間を測定することにより代謝産物を識別した。
【００７６】
ＤＮＲは、ＭＣＦ７／６細胞中でほぼ変化しない形で急速に蓄積し、６時間の培養後、最大蓄積量（±１５μｇ／ｍｇの細胞タンパク）に達した。ＤＮＲ蓄積量は、２４時間後まで減少する。主要な細胞内代謝産物は、位置Ｃ１３におけるＤＮＲのケトン官能基が細胞内レダクターゼによって還元されたことに起因するダウノルビシノールである（図６）。
Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲもＭＣＦ７／６細胞によって極めて迅速に蓄積されるが、そのレベルは比較的低く、２４時間の培養後に細胞タンパクで±１４μｇ／ｍｇの限界値に達する。ＤＮＲは経時的に細胞内に形成され、２４時間にわたる培養後には細胞内の全蛍光の１４％に達する（図７）。
【００７７】
ＭＣＦ７／６細胞の存在において２４時間培養されたβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲは、変化しない形でＤＮＲよりもＬ−Ｌｅｕ−ＤＮＲよりもはるかに少ない量が蓄積し、蓄積レベルは細胞タンパクの±１μｇ／ｍｇに過ぎない（図８）。細胞外で形成されるＬ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びＤＮＲは、主として２４時間の培養後に細胞内で検出されるものである。細胞内に検出されるＤＮＲは、２４時間の培養後に全蛍光のほぼ４０％に相当する。
【００７８】
【表５】


【００７９】
表２に示す結果からは、ペプチド鎖の長さが増大すると、細胞膜を通過するＤＮＲのペプチド誘導体の通過が減少することと、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲがＬｅｕ−ＤＮＲの先駆物質であって、細胞外で活性化されることとがわかる。放出されたＬｅｕ−ＤＮＲは細胞内に蓄積し、それ自体が細胞内ＤＮＲ先駆物質となる。
【００８０】
＜例９＞
＜ＭＲＣ５正常細胞におけるＤＮＲ，Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの蓄積＞
１０μｇ当量ＤＮＲ／ｍｌの濃度のβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの存在において、ＭＲＣ５線維芽細胞を培養した。プロドラッグ及びその蛍光性代謝産物の蓄積量を、実験室で開発された方法に従って塩基性ｐＨの生成物を抽出したのち、ＨＰＬＣによって種々の経過時間で測定した。細胞タンパクのμｇ／ｍｇで表わされる蓄積量をＤＮＲ及びＬ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの蓄積量と比較した。実験室で合成された基準生成物の保持時間を測定することによって、代謝産物を同定した。
ＤＮＲは、主としてＭＲＣ５細胞中に変化しない形で蓄積し、蓄積量は６時間後に細胞タンパク±７６μｇ／ｍｇの最大値に達し、主要な代謝産物はダウノルビシノールである（図９）。
【００８１】
Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲは、ＭＲＣ５細胞によっても極めて迅速に蓄積されるが、そのレベルは比較的低く、蓄積量は２４時間の培養後に±４０μｇ／ｍｇの細胞タンパクに相当する最大値に達する。主要な代謝産物は、ＤＮＲ及びＬ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ−ＯＬである（図１０）。
【００８２】
ＭＲＣ５細胞の存在において２４時間培養されたβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲは、ＤＮＲよりもＬ−Ｌｅｕ−ＤＮＲよりもはるかに蓄積量が少なく、そのレベルは細胞タンパク±３．３μｇ／ｍｇに過ぎない（図１１）。
細胞外で形成されたＬ−Ｌｅｕ−ＤＮＲは、主として細胞内で検出される物質である。その蓄積量は、培養時間が２４時間に達するまで線形的に増大する。
【００８３】
これらの結果は、ＭＣＦ７／６細胞で得られた結果を裏づける。即ち、化合物β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲはほとんど細胞内に進入せず（６時間後はＤＮＲ約１／３００）、細胞外形成Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲは主としてＭＲＣ５細胞内に蓄積する（表３）。
【００８４】
【表６】


【００８５】
ＭＣＦ７／６腫瘍ラインでは、化合物β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの存在において２４時間培養したのちに得られる細胞内ＤＮＲレベルは、ＭＲＣ５線維芽細胞におけるレベルの１２倍である。
Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びＤＮＲの存在において細胞を培養すると、細胞内ＤＮＲレベルの比はそれぞれ０．３７及び０．１９に過ぎない。
【００８６】
＜例１０＞
＜ＭＣＦ７／６腫瘍細胞及びＭＲＣ５正常細胞に対するβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの細胞毒性＞
ＤＮＲプロドラック、Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びＤＮＲの細胞毒性を種々の化合物の存在において７２時間増殖させたＭＣＦ７／６及びＭＲＣ５細胞において比較した。
【００８７】
β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ，Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びＤＮＲの細胞毒性を、濃度の異なる種々の化合物の存在において培養され、９６−ウエルディシュで増殖するＭＣＦ７／６細胞で測定した。７２時間後、アントラサイクリンが存在しない状態で細胞を４８時間培養し、ブラッドフォード法によって細胞タンパクを測定することによって細胞毒性を測定する。７００μｇ／ｍｌから０．００３５μｇ／ｍｌまで９つの濃度を使用し、各測定値が６個の値の平均及び標準偏差を表わす。実験点は、細胞の半分が生存する投与量（ＩＣ５０）に対応する変曲点の計算を可能にするＳ字曲線を画くように調整する。
【００８８】
図１２は、ＤＮＲのＩＣ５０が０．０９０±０．００４μｇ／ｍｌであることを示す。Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの存在において７２時間培養された細胞では、ＩＣ５０は１．３０±０．５６μｇ／ｍｌである。β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの場合、ＩＣ５０は２２．００±７．３１μｇ／ｍｌである。
従って、Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲは、アントラサイクリンの存在において７２時間増殖したＭＣＦ７／６ヒト乳癌細胞に対するＤＮＲに比較して、細胞毒性はそれぞれ１／１４及び１／２４４である。
【００８９】
β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ，Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びＤＮＲの細胞毒性を、次第に濃度が高くなる種々の化合物の存在において培養され、９６−ウエルディシュで増殖したＭＲＣ５細胞を対象に測定した。７２時間後、アントラサイクリンが存在しない状態で４８時間培養し、プラッドフォード法で細胞タンパクを測定することによって細胞毒性を測定する。７００μｇ／ｍｌから０．００３５μｇ／ｍｌまで９つの濃度を採用し、６つの値の平均及び標準偏差をそれぞれの測定値とする。細胞の半数が生き残る投与量（ＩＣ５０）に対応する変曲点の算出を可能にするＳ字曲線を画くように実験点を調整する。
【００９０】
図１３は、ＤＮＲのＩＣ５０が０．０１０±０．００６μｇ／ｍｌであることを示す。Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの存在において７２時間培養された細胞に対しては、ＩＣ５０は１．７８±０．２３μｇ／ｍｌである。β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの場合、ＩＣ５０は２３．１４±４．８１μｇ／ｍｌである。
従って、アントラサイクリンの存在において７２時間増殖したＭＲＣ５線維芽細胞に対するＬｅｕ−ＤＮＲ及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの細胞毒性は、それぞれＤＮＲの１／１７２及び１／２２３０である。
【００９１】
腫瘍細胞に対しても線維芽細胞に対しても、ＤＮＲ先駆物質の毒性は親化合物よりもはるかに低い。試験管中で観察されるこの毒性低下が生体内でも観察されるかどうかを確認しなければならない。
【００９２】
＜例１１＞
＜生体内急性毒性＞
β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの毒性をマウスを対象にダウノルビシンの毒性と比較した。医薬品の急性毒性を生体内で検査するには、５０％致死量（動物の５０％に対する致死量、ＬＤ５０）が重要な要素となる。生物学的定数を表わすものではないが、注入薬の急性毒性に関する情報を得る手がかりとなる。ＬＤ５０は、試験薬の量を増やしながら連続５日間にわたり１日１回ずつの注射で腹腔内（ｉ．ｐ．）投与すると共に１回だけの注射で静脈内（ｉ．ｖ．）投与する簡単な試験である。経時的に動物の死亡率をモニターする。
【００９３】
通常は、３０日間に及ぶ観察期間の終りに、投与量の対数に応じて（プロビット目盛りで）％死亡率を線形回帰することによって得られる（オー．ケー．チャン アンド エイ．ダブリュ ヘイ，「プリンシプルズ アンド メソッズ フォア アキュート トキシシティ アンド アイ イリタンシィ」，イン プリンシプルズ アンド メソッズ オブ トキソコロジィ，セコンドエディション．Ｅｄ．バイ エイ．ダブリュ．ヘイズ，ラブン プレス，ニューヨーク，ユエスヱイ（１９８９），ｐｐ．１６９−２２０；ディ．デプレッツ−デ カンペニール アンド エイ．トラウト．「ＤＮＡ−アントラサイクリン
コンプレックシズ．Ｉ．トキシシティ イン マイス アンド ケモテラプリィック アクティビティ アゲインスト Ｌ１２１０ ルーカミア オブ ダウノルビシン−ＤＮＡ アンド アドリアマイシン−ＤＮＡ」，Ｅｎｒ．ジェイ．カンサー，１６（１９８０），ｐｐ．９８１−９８６；エイチ．イー．スキッパー，エル．エイチ．シュミット，ヱイ．ゴールディン アンド ジェイ．エム．ベンディティ．「ア マニュアル オン コンティティブ ドラッグ エバリュエイション イン エクスペリメンタル テュモア システム」，カンサー Ｃｈｅｍａｔｈｅｒ，Ｒｅｐ，１７（１９６２），ｐｐ．１−１７８，（Ｏ．Ｋ．Ｃｈａｎａｎｄ Ａ．Ｗ．Ｈａｙｅ，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｃｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄ ｅｙｅ ｉｒｒｉｔａｎｃｙ”，ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ．ｂｙ Ａ．Ｗ．Ｈａｙｅｓ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８９），ｐｐ．１６９−２２０；Ｄ．Ｄｅｐｒｅｚ−Ｄｅ Ｃａｍｐｅｎｅｅｒｅ ａｎｄ Ａ．Ｔｒｏｕｅｔ．“ＤＮＡ−Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｉ．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｌ１２１０ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｏｆ Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ−ＤＮＡ ａｎｄ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ＤＮＡ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１６（１９８０），ｐｐ．９８１−９８６；Ｈ．Ｅ Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｌ．Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｇｏｌｄｉｎ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｖｅｎｄｉｔｔｉ．“Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｒｕｇ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｕｍｏｒ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．１７（１９６２），ｐｐ．１−１７８））。
【００９４】
ＬＤ５０に達しない場合、マウスの毎回の体重変化も投与薬の急性毒性に関する情報を与えてくれる。
【００９５】
１．材料及び方法
単一種のマウスに対してｉ．ｖ．投与及びｉ．ｐ．投与することによって、これら２種類の薬剤の急性毒性を観察した。（ベルギーのＩＦＦＡ−ＣＲＥＤＯから供給された生後約５週間、平均体重１４．６ｇの非血縁ＳＰＦ−Ｈａｎである）雌のＮＭＲＩマウスを１週間隔離した。注射の前日、マウスと注射による投与量ごとに５匹（β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ）と７匹（ＤＮＲ）のグループに分け、あらためて体重を記録した（平均約２２ｇ）。
【００９６】
注射は朝規則的に行われ（静脈内投与では尾の静脈に１回、腹腔内投与では５日間連続で腹腔に注射）、１．０ｍｌ注射筒と無菌３０Ｇ（ｉ．ｖ．）及び２７Ｇ（ｉ．ｐ．）注射針を使用した。動物の取り扱いは必らず手袋を着用して行われ、動物の保守が毎週規則的に行われた。
【００９７】
β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲは、３０，６０，及び１２０ｍｇ／ｋｇの投与量でｉ．ｖ．注射し、１０，１５，２０，２５，３０，４５及び６０ｍｇ／ｋｇの総投与量でｉ．ｐ．注射した。別の２グループに対しては、１回では３０ｍｇ／ｋｇ、２回では６０ｍｇ／ｋｇの総投与量でβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを再注射し、２回に分けて注射する場合には連続して３０ｍｇ／ｋｇずつ再注射した。
【００９８】
ＤＮＲは、１０，１５，２０，２５，３０及び３５ｍｇ／ｋｇの投与量でｉ．ｖ．注射し、２．０，２．５，３．０及び３．５ｍｇ／ｋｇの投与量でｉ．ｐ．注射した。
注射量がマウスの体重に対して０．１ｍｌ／１０ｇとなるように、生理的食塩水でβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲ及びＤＮＲの溶液を調製した。溶液の濃度を分光測定によって確認した。
【００９９】
注射の日（ＤＯ）からマウスを臨床的にモニターし、死亡したマウスを毎日記録した。マウスの体重をほぼ毎日測定した。遅れて現われる毒性の徴候を容易にスポット分析できるように、観察期間を１カ月以上に延ばした。実験の終了時に生き残ったマウスを、動物実験に関する規定（ディ．ビー．マクレガ，「エシックス イン エクスペリメンツ オン アニマルズ」，イン エクスペリメンツ イン トキシコロジィ，ファーストエディション．Ｅｄ．バイ ディ．アンダーソン アンド ディ．エム．コニング．ザ ロイヤル ササイアティ オブ ケミストリ アンド ザ ユニバシティズ プレス．ベルファスト，アイルランド（１９８８），ｐｐ．５１２−５２２（Ｄ．Ｂ．ＭｃＧｒｅｇｏｒ，“Ｅｔｈｉｃｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｎ ａｎｉｍａｌｓ”，ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｒｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄ．ｂｙ Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｃｏｎｎｉｎｇ．Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ．Ｂｅｌｆａｓｔ，Ｉｒｅｌａｎｄ（１９８８），ｐｐ．５１２−５２２））に従って犠牲にした。
【０１００】
２．結果
＜腹腔内投与の場合の毒性＞
図１４に示すように、ＤＮＲの場合、濃度が高くなるに従って強い毒性が観察され、毒性はマウスの死亡率に反映し、投与量が３．５ｍｇ／ｋｇの場合には７日目（７匹のうち１匹のマウスが死亡）から、投与量が３．０ｍｇ／ｋｇの場合には９日目（７匹のうち２匹のマウスが死亡）から、投与量が２．５及び２．０ｍｇ／ｋｇの場合には１１日目（７匹のうち２匹及び１匹のマウスがそれぞれ死亡）からマウスの死亡となって毒性が顕在化する。
【０１０１】
１２日目（投与量３．５ｍｇ／ｋｇの場合）、１９日目（投与量３．０ｍｇ／ｋｇの場合）、２９日目（投与量２．０ｍｇ／ｋｇの場合）には生き残るマウスは皆無である。２．５ｍｇ／ｋｇを注射されたマウスのうち１匹だけが４３日目まで生き残った。この実験結果は、これまでに報告された結果を裏づけた（Ｄ．Ｄｅｐｒｅｚ−Ｄｅ Ｃａｍｐｅｎｅｅｒｅ ａｎｄ Ａ．Ｔｒｏｕｅｔ．“ＤＮＡ−Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｉ．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｌ１２１０ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｏｆ Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ−ＤＮＡ ａｎｄ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ＤＮＡ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１６（１９８０），ｐｐ．９８１−９８６）。
【０１０２】
図１５から明らかなように、投与量に関係なく、マウスには初期体重の３０％に達する体重減が現われる。この体重減は、３０日目に初期体重を回復した２．５ｍｇ／ｋｇ投与の１匹を除いて回復不能である。
５日間連続して総量で１０〜４５ｍｇ／ｋｇのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを腹腔内投与した場合は、死亡率は０であり、投与量６０ｍｇ／ｋｇの場合、２匹のマウスが２２日目に死亡し、３５日目に３匹目のマウスが死亡した（図１６）。
【０１０３】
総投与量が１０〜４５ｍｇ／ｋｇの場合、体重減は観察されず、むしろ４０日後で±４０％の体重増が観察された（図１７）。体重曲線を分析した結果、著しい変化は認められない。他方、投与量が４５ｍｇ／ｋｇの場合、マウスの平均体重は最初の７日間は安定であり、以後３０日間で２０％だけ体重が増える。総投与量６０ｍｇ／ｋｇの場合、マウスの平均体重は１５日後に±１５％低下する。
【０１０４】
生き残った２匹のマウスは３６日目に初期体重を回復する。
これらのデータから明らかなように、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの投与量６０ｍｇ／ｋｇは、ＬＤ５０に近く、従って、５日間連続して腹腔内投与したあとの急性毒性に関してβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲは、ＤＮＲの少なくとも１／３０である。
【０１０５】
＜静脈内投与に伴なう毒性＞
図１８に示すように、雌ＮＭＲＩマウスにＤＮＲを１回だけ静脈投与する場合、投与量が低ければ（１０，１５及び２０ｍｇ／ｋｇ）死亡率は０である。２５ｍｇ／ｋｇを投与した場合、６匹のマウスが１２，１７，２０，２８，３４及び４２日目にそれぞれ死亡する。ＤＮＲの濃度がさらに高くなると、（３０ｍｇ／ｋｇ投与の場合には７匹のうちの１匹が）７日目に、（３５ｍｇ／ｋｇ投与の場合には７匹のうち２匹が）６日目にそれぞれ死亡する。
【０１０６】
この実験結果はすでに報告されている実験結果（Ｄ．Ｄｅｐｒｅｚ−Ｄｅ Ｃａｍｐａｎｅｅｒｅ ａｎｄ Ａ．Ｔｒｏｕｅｔ．“ＤＮＡ−Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｉ．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｌ１２１０ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｏｆ Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ−ＤＮＡ ａｎｄ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ＤＮＡ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１６（１９８０），ｐｐ．９８１−９８６）と一致する。
【０１０７】
図１９に示す実験結果から明らかなように、平均体重減は７日目に最大となり、この体重減は投与量と共に増大する。３０及び３５ｍｇ／ｋｇの投与で生き残ったマウスは、ＤＮＲを静脈内注射されてから３０日経過しても初期体重を回復しない。
【０１０８】
３０ｍｇ／ｋｇのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを静脈内投与すると、死亡率は０であり、マウスの平均体重は４０日後に±４０％増える（図２０）。実験終了時のマウスの平均体重は、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを同じ量だけ腹腔内投与した場合に観察される平均体重とほぼ同じである。しかし、投与量が６０ｍｇ／ｋｇの場合には、注射から５分後に２匹のマウスが死亡する。この死亡は、注射後の血液量増大があまりに急激に起こるためと考えられる。２日目までやや体重減を示したのち、生き残った３匹のマウスは初期体重を回復し、さらに体重増を示す（４０日後に±３０％）。投与量１２０ｍｇ／ｋｇの場合、投与から７分以内に５匹のマウスが死亡し、臨床的な毒性徴候を示す。
【０１０９】
総投与量６０ｍｇ／ｋｇのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを２回の静脈内３０ｍｇ／ｋｇ注射に分けて２日連続して投与した場合、死亡率は０である。マウスの平均体重変化は、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲを３０ｍｇ／ｋｇだけ１回投与したマウスと２回投与したマウスとの間に相違はない（図２１）。
【０１１０】
３．結論
得られた実験結果に照らして、静脈内投与でも腹腔内投与でも、致死率という点でβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの急性毒性は、ＤＮＲの急性毒性よりもはるかに低い。これらの実験結果は、誘導体β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＮＲの毒性の低下を立証する。
上述した実験と同じ実験をドキソルビシン誘導体で実施した。
【０１１１】
＜例１２＞
＜ＭＣＦ７／６腫瘍細胞及びＭＲＣ５非腫瘍細胞中でのＤＯＸ，Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＯＸ及び−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの蓄積＞
濃度１０μｇ当量ＤＯＸ／ｍｌのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの存在においてＭＣＦ７／６ヒト乳癌細胞及びＭＲＣ５ヒト線維芽細胞系を培養した。実験室で開発された方法で塩基性ｐＨの生成物を抽出したのち、ＨＰＬＣによりプロドラッグ及びその蛍光性代謝物質の蓄積量を種々の経過時間で測定した。細胞タンパクのμｇ／ｍｇで表わされる蓄積量をＤＯＸ及びＬ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの蓄積量と比較した。代謝物質は、実験室で合成された基準物質の保持時間を測定することによって同定した。
【０１１２】
ＤＯＸは、ほとんど変化しない形で主としてＭＣＦ７／６細胞中に蓄積され、６時間後には細胞内レベルが細胞タンパク６．９μｇ／ｍｇに達する（図２３）。
【０１１３】
【表７】


【０１１４】
６時間後におけるＬｅｕ−ＤＯＸ及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸそれぞれの蓄積量は、ＤＯＸの蓄積量の１／６及び１／６９である。β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの存在において細胞を培養したあとでは、ＤＯＸの細胞内蓄積レベルが１／３１となる（図２４及び２５）。
【０１１５】
１０μｇ当量ＤＯＸ／ｍｌの濃度のアントラサイクリンの存在において６時間培養されたＭＲＣ５線維芽細胞において、ＤＯＸはほとんど変化しない形で蓄積し、６時間後に蓄積量は±１１．２μｇ／ｍｇ細胞タンパクのレベルに達する（図２６）。
Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＯＸは、比較的低いレベルで蓄積し、蓄積量は1．４μｇ／ｍｇ細胞タンパクのレベルに達する。主要な代謝産物は、ＤＯＸ（０．３μｇ／ｍｇ細胞タンパク）である（図２７）。
【０１１６】
６時間後におけるβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの蓄積量は、ＤＯＸの蓄積量の１／１１２である。β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの存在において細胞を培養したＤＯＸ蓄積レベルは、１／１１００に低下する（図２８）。
これらの結果に照らして、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸは、ほとんど細胞内に進入せず、細胞内に進入する前に外部媒質中であらかじめ加水分解されてＬｅｕ−ＤＯＸの形となる必要があり、これが細胞内に進入してＤＯＸを生成させることになる（図２２）。
【０１１７】
これらの結果は、活性治療剤の細胞内レベルは、ＤＯＸの場合には腫瘍細胞中のレベルに比較して正常細胞中では２倍になることも示している。他方、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの場合、ＤＯＸの細胞内レベルはＭＲＣ５非腫瘍細胞と比較してＭＣＦ７腫瘍細胞では２２倍となる。
【０１１８】
＜例１３＞
＜ＭＣＦ７／６腫瘍細胞及びＭＲＣ５非腫瘍細胞に対するインビトロ細胞毒性＞
濃度の異なる種々の化合物の存在において培養し、９６−ウエルディッシュで増殖したＭＣＦ７／６及びＭＲＣ５細胞に対するβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸ、Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＯＸ及びＤＯＸの細胞毒性を測定した。７２時間後、アントラサイクリンが存在しない状態で４８時間にわたり細胞を培養し、ブラッドフォード法で細胞タンパクを測定することによって細胞毒性を測定した。７００μｇ／ｍｌから０．００３５μｇ／ｍｌまで９つの濃度を採用し、それぞれの測定値を６個の値の平均及び標準偏差で表わした。細胞の半数が生き残る投与量（ＩＣ５０）に対応する変曲点の算出を可能にするＳ字曲線を画くように実験点を調整した。
【０１１９】
例１２の表は、ＭＣＦ７／６ヒト乳癌細胞に対するＤＯＸ、Ｌ−Ｌｅｕ−ＤＯＸ及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸのそれぞれのＩＣ５０値、即ち、０．００２５，０．０２０及び３．０μｇ／ｍｌを記録したものである。ＭＲＣ５ヒト線維芽細胞系に対しては、この値はそれぞれ０．０１８，０．３０及び１２０μｇ／ｍｌである。
【０１２０】
これらの結果から明らかなように、アントラサイクリンの存在において７２時間増殖した線維芽ＭＣＦ７／６ヒト乳癌細胞に対するＬｅｕ−ＤＯＸ及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの細胞毒性は、ＤＯＸの細胞毒性のそれぞれ１／８及び１／１０００である。アントラサイクリンの存在において７２時間増殖したＭＲＣ５細胞に対しては、Ｌｅｕ−ＤＯＸ及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの細胞毒性はＤＯＸのそれぞれ１／１７及び１／６，７００である。
【０１２１】
ＭＣＦ７腫瘍細胞に対してもＭＲＣ５非腫瘍細胞に対しても、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの毒性は４０倍になる。この毒性は、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸの存在において培養されたＭＣＦ７細胞において観察されたＤＯＸの高い細胞内レベルと同じレベルである（図２９及び３０）。
【０１２２】
本発明の化合物の特徴は、腫瘍細胞を静脈内注射したあとに得られる“白血病”型のモデルに対してよりも、（例えば腫瘍細胞を皮下注射して得られる）固相腫瘍型モデルに対して顕著に作用することである。
腫瘍細胞を皮下注射すると、注射部位に固相腫瘍が形成され、この細胞から分泌される加水分解酵素の局所濃度は高い状態を維持する。腫瘍細胞を静脈内注射すると、この細胞から分泌される加水分解酵素はたちまち血流中に希釈される。
【０１２３】
＜例１４＞
＜インビボ急性毒性＞
ＭＣＦ７／６ヒト乳癌腫瘍を移植された無感覚状態のマウスにβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸを投与すると、マウスの平均体重に著しく影響を及ぼすことなく癌性腫瘍の進行（図３１）が抑制される（図３２）。
これらの実験は、例１１で述べたプロトコルに従って行われた。
【０１２４】
発明者らは、ヒト乳癌細胞の細胞外媒質中へ分泌されてβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＤＯＸを加水分解することができるプロテアーゼをも検出した。このプロテアーゼは、すでに述べたどのプロテアーゼとも一致しないことが確認された。
即ち、仮に“ＣＯＵＭ”と呼称するこの酵素は、例えばＥＤＴＡのような金属キレーターによって抑制することができ、作用するにはコバルトイオンを必要とする金属プロテアーゼである。その最適ｐＨは７．５〜８．０であり、カテプシンである可能性は除外される。
高性能クロマトグラフィ及び硫酸ラウリルの存在における電気泳動により、７０ｋＤを超えるいくつかの分子量帯が観察される。
【０１２５】
図３３は、腫瘍細胞（肺、乳房、卵巣などの癌）、変換細胞（不朽化された、ただし非癌性の正常細胞）、及び正常細胞（線維芽及び筋肉細胞）のホモジネート中に本発明の化合物を含む試験管内でノクマリンの発現測定結果を示す。
従って、本発明の化合物を利用すれば、マーカの発現によって癌性腫瘍を診断することができるから、癌の診断、腫瘍進行の検査、腫瘍細胞から分泌される因子の同定などの精度を高めることができる。
【０１２６】
本発明の化合物は、当業者に公知の種々の試薬から成る診断及び／または検査装置に組み込むことができる。
本発明の診断装置は、患者から組織、細胞または生理的流体サンプルを採取し、遊離マーカ（場合によっては１種類または２種類以上の中間試薬を含む）の発現を可能にする条件下で前記サンプルを本発明の化合物と接触させ、遊離したマーカを検出及び／または定量するステップから成る組織学的または生化学的診断及び／または検査方法に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】本発明の化合物の、ターゲット細胞（Ｔ．Ｃ．）における活性部位（Ａ．Ｓ．）における作用メカニズムを示す。
【図２】本発明の化合物の、正常細胞（Ｎ．Ｃ．）における作用メカニズムを示す。
【図３】ＭＣＦ７／６ヒト乳癌細胞から得たならし培地中でのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンの加水分解を示す（（ａ）は０時点、（ｂ）は２時間の培養後におけるクロマトグラム）。
【図４】ＭＣＦ７／ＡＤＲヒト乳癌細胞から得たならし培地中でのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンの加水分解を示す（（ａ）は０時点、（ｂ）は１時間の培養後におけるクロマトグラム）。
【図５】ＨＴ２９結腸癌細胞から得たならし培地中でのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンの加水分解を示す（（ａ）は０時点、（ｂ）は２時間の培養後におけるクロマトグラム）。
【図６】融合性ＭＣＦ７／６細胞による濃度１０μｇ／ｍｌでのダウノルビシン（ＤＮＲ）の蓄積量を示す。
【図７】融合性ＭＣＦ７／６細胞による濃度１０μｇ当量ＤＮＲ／ｍｌでのＮ−Ｌ−ロイシルダウノルビシン（Ｌｅｕ−ＤＮＲ）の蓄積量を示す。
【図８】融合性ＭＣＦ７／６細胞による濃度１０μｇ当量ＤＮＲ／ｍｌでのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンの蓄積量を示す。
【図９】融合性ＭＲＣ５線維芽細胞による濃度１０μｇ／ｍｌでのダウノルビシン（ＤＮＲ）の蓄積量を示す。
【図１０】融合性ＭＲＣ５線維芽細胞による濃度１０μｇ当量ＤＮＲ／ｍｌでのＮ−Ｌ−ロイシルダウノルビシン（Ｌｅｕ−ＤＮＲ）の蓄積量を示す。
【図１１】融合性ＭＲＣ５線維芽細胞による濃度１０μｇ当量ＤＮＲ／ｍｌでのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンの蓄積量を示す。
【図１２】アントラサイクリンの存在において７２時間培養されたＭＣＦ７／６細胞に対するダウノルビン（ＤＮＲ）、Ｌ−Ｌｅｕ−ダウノルビシン及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンの細胞毒性を示す。
【図１３】アントラサイクリンの存在において７２時間培養されたＭＲＣ５線維芽細胞に対するダウノルビシン（ＤＮＲ）、Ｌ−Ｌｅｕ−ダウノルビシン及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンの細胞毒性を示す。
【図１４】連続５日間にわたり総量２．０〜３．５ｍｇ／ｋｇのダウノルビシン（ＤＮＲ）を腹腔内投与したのち、雌ＮＭＲＩマウスに現われた死亡率を示す。
【図１５】連続５日間にわたり総量２．０〜３．５ｍｇ／ｋｇのダウノルビシンを腹腔内投与された雌ＮＭＲＩマウスの平均体重の変化を示す。体重は、グループごとの平均初期体重の％で表わしてある。
【図１６】連続５日間にわたり総量１０〜６０ｍｇ／ｋｇのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンを腹腔内投与された雌ＮＭＲＩマウスの死亡率を示す。
【図１７】連続５日間にわたり総量１０〜６０ｍｇ／ｋｇのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンを１回投与された雌ＮＭＲＩマウスの平均体重の変化を示す。体重は、グループごとの平均初期体重の％で表わしてある。
【図１８】１０〜３５ｍｇ／ｋｇの投与量でダウノルビシン（ＤＮＲ）を１回静脈内投与された雌ＮＭＲＩマウスの死亡率を示す。
【図１９】１０〜３５ｍｇ／ｋｇのダウノルビシンを静脈内投与された雌ＮＭＲＩマウスの平均体重の変化を示す。体重は、グループごとの平均初期体重の％で表わしてある。
【図２０】３０〜６０ｍｇ／ｋｇのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンを静脈内投与された雌ＮＭＲＩマウスの平均体重の変化を示す。体重はグループごとの平均初期体重の％で表わしてある。
【図２１】３０ｍｇ／ｋｇのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ダウノルビシンを１回静脈投与するか、２日間にわたり３０ｍｇ／ｋｇずつを２回投与した場合に、雌ＮＭＲＩマウスの平均体重に現われた変化を示す。体重は、グループごとの平均初期体重を％で表わしてある。
【図２２】ＭＣＦ７／６細胞から得たならし培地中で起こるβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンからＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン及びＬ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンへの酵素による加水分解の速度を示す。
【図２３】融合性ＭＣＦ７／６細胞による濃度１０μｇ／ｍｌでのドキソルビシン（ＤＯＸ）の蓄積量を示す。
【図２４】融合性ＭＣＦ７／６細胞による濃度１０μｇ／ｍｌでのＬ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの蓄積量を示す。
【図２５】融合性ＭＣＦ７／６細胞による濃度１０μｇ／ｍｌでのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの蓄積量を示す。
【図２６】融合性ＭＲＣ５線維芽細胞による濃度１０μｇ／ｍｌでのドキソルビシン（ＤＯＸ）の蓄積量を示す。
【図２７】融合性ＭＲＣ５線維芽細胞による濃度１０μｇ／ｍｌでのＬ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの蓄積量を示す。
【図２８】融合性ＭＲＣ５線維芽細胞による濃度１０μｇ／ｍｌでのβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの蓄積量を示す。
【図２９】前記アントラサイクリン誘導体の存在において７２時間培養されたＭＣＦ７／６細胞に対するドキソルビシン（ＤＯＸ）、Ｌ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの細胞毒性を示す。
【図３０】前記アントラサイクリン誘導体の存在において７２時間培養されたＭＲＣ５線維芽細胞に対するドキソルビシンの（ＤＯＸ）、Ｌ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシンの細胞毒性を示す。
【図３１】Ｔ−２１の日に無感覚状態のマウスに移植したＭＣＦ７／６ヒト乳腫瘍の平均腫瘍質量において、ドキソルビシン（ＤＯＸ）及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン（スーパーＤＯＸ）の投与に応じて現われた変化を示す。
【図３２】ドキソルビシン（ＤＯＸ）及びβ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ドキソルビシン（スーパーＤＯＸ）の投与によって処置されたマウスの平均体重（ｇ）の変化を示す。
【図３３】本発明の化合物が、腫瘍細胞のホモジネート、形質転換細胞のホモジネート及び正常細胞のホモジネートと共に含まれる試験管内における遊離クマリンマーカの発現を示す（細胞タンパク質１ｍｇにつき遊離したクマリンのモル数）。
【出願人】 【識別番号】５０７１７４８１３
【氏名又は名称】ラ レフィオン バロンネ
【識別番号】５０７１７４８２４
【氏名又は名称】ウニフェルシテ カトリーク デ ルーファイン
【出願日】 平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【代理人】 【識別番号】１０００６６２６７
【弁理士】
【氏名又は名称】白浜 吉治
【公開番号】 特開２００８−６９１７５（Ｐ２００８−６９１７５Ａ）
【公開日】 平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願番号】 特願２００７−３０１８９３（Ｐ２００７−３０１８９３）