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【発明の名称】 高純度２−メトキシエストラジオールを有する医薬組成物
【発明者】 【氏名】アゴストン，グレゴリー イー．

【氏名】トレストン，アンソニー エム．

【氏名】シャー，ジャムシェッド エイチ．
【要約】 【課題】９８％より高い純度を有する２−ＭＥ２を含む医薬組成物を提供する。

【構成】９８％より高い純度を有する２−メトキシエストラジオールが、合成又は精製法により生成される。エストロゲン性構成成分を欠くこの高純度２−メトキシエストラジオールは、ヒトにおける臨床的使用に特に適している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム硬化症、腫瘍の増殖、固形腫瘍の増殖、腫瘍新脈管形成、血管機能不全、子宮内膜症、網膜症、関節症、炎症性の応答、又は免疫応答から選ばれる、人間又は動物における病気又は体調を治療するための組成物であって、
エストロゲン性又は発がん性作用を有するステロイド不純物を実質的に含有せず、ＨＰＬＣで測定したときに９９．５％より高い純度を有する２−メトキシエストラジオールを含有する組成物。
【請求項２】
０．０３％未満のエストラジオールと０．０２％未満のエストロンを含有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
０．０１％未満のエストラジオールと０．０１％未満のエストロンを含有することを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
０．０２％未満の２−ヒドロキシエストラジオールを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
０．０２％未満の４−ヒドロキシエストラジオールを含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
０．０２％未満の４−メトキシエストラジオールを含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
０．０１％以下のエストラジオール、０．０２％以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％以下の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％以下の４−メトキシエストラジオール、及び０．０１％以下のエストロンを含有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
アテローム硬化症、腫瘍の増殖、固形腫瘍の増殖、腫瘍新脈管形成、血管機能不全、子宮内膜症、網膜症、関節症、炎症性の応答、又は免疫応答から選ばれる、人間又は動物における病気又は体調を治療するための組成物であって、
エストロゲン性又は発がん性作用を有するステロイド不純物を実質的に含有せず、９８．０％より高い純度を有する２−メトキシエストラジオールを含有し、かつ０．０３％未満のエストラジオールと０．０２％未満のエストロンを含有する組成物。
【請求項９】
０．０１％未満のエストラジオールと０．０１％未満のエストロンを含有することを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
０．０１％以下のエストラジオール、０．０２％以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％以下の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％以下の４−メトキシエストラジオール、及び０．０１％以下のエストロンを含有することを特徴とする請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記２−メトキシエストラジオールが９９．０％より高い純度を有することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記病気又は状態が、腫瘍の増殖、固形腫瘍の増殖、腫瘍新脈管形成、又は関節症であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、エストラジオール代謝物質２−メトキシエストラジオールを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連出願］
本出願は、米国特許暫定出願第６０／１５０，２９３号(1999年8月23日提出)に対する優先権を主張する。
【０００３】
［発明の背景］
２−メトキシエストラジオール、１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３，１７β−トリオール−２−メチル−エーテル（２−ＭＥ２）は、主要卵巣エストロゲンであるエストラジオールの内因性代謝物質である。２−ＭＥ２の化学式はＣ19Ｈ26Ｏ3であり、化合物は３０２．４の分子量を有する。２−ＭＥ２は、低エストロゲン性活性を有するが、しかし他の生物学的作用を有することが見出されている。
【０００４】
D'Amato等に対する特許文献１〜３は、２−ＭＥ２を用いた、異常細胞有糸分裂により特性化される哺乳類疾患の治療方法を開示する。望ましくない細胞有糸分裂は、限定されないが、癌、アテローム硬化症、固形腫瘍の増殖、血管機能不全、子宮内膜症、網膜症、関節症、及び異常創傷治癒を含む多数の疾患に特徴的である。さらに細胞有糸分裂は、限定されないが胚の正常発生、黄体形成、子宮内膜の周期性増殖、創傷治癒、及び炎症及び免疫応答を含む、広範な種々の生物学的機能において重要である。
【０００５】
Clarkに対する特許文献４は、眼内圧を下げるための２−ＭＥ２の使用を開示する。２−ＭＥ２はさらに、エストロゲン誘発性下垂体腫瘍新脈管形成を阻害し、非特許文献１に報告されたようにフィッシャー３４４ラットにおける腫瘍増殖を抑制する。
【０００６】
現在、２−ＭＥ２の市販製剤は純度９８％未満であるか、又は医薬的使用に影響を及ぼす望ましくないステロイド夾雑物を含有する。これらの製剤の重要な夾雑物は、エストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、４−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、エストロン、及び２−メトキシエストロンである。現在入手可能な２−ＭＥ２製剤中に見出される、これらの夾雑物の量は、医薬的用途にとって許容不可能である。
【０００７】
ヒトにおける２−ＭＥ２の任意の療法的使用は、高レベルの純度を有する２−ＭＥ２を要する。一般に、治療薬は、夾雑物の負の副作用を回避するために実質的に純粋であることを必要とされる。特に、２−ＭＥ２はエストラジオール及びその他のエストロゲン性代謝物質により中和される作用を有するため、このような夾雑物を実質的に含有しない２−ＭＥ２製剤を有することが極めて重要である。エストラジオール、エストロン及び２−ヒドロキシエストラジオールの夾雑により観察され得る作用は、雌性化、子宮内膜増殖、子宮及び乳癌の危険性増大、性的器官に及ぼす発生性作用、白血球産生の抑制、並びに造血細胞に及ぼす作用のようなエストロゲン性作用を含む。４−ヒドロキシエストラジオール、４−メトキシエストラジオール及びエストラジオールは、既知の突然変異誘発物質及び発ガン物質である。
【特許文献１】米国特許第５，５０４，０７４号、
【特許文献２】米国特許第５，６６１，１４３号
【特許文献３】米国特許第５，８９２，０６９号
【特許文献４】米国特許第５，５２１，１６８号
【非特許文献１】Banerjee,S.K. et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 39, March 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、必要とされるものは、９８％より高い純度であり、かつエストロゲン性又は発癌性作用を有するエストラジオール又はその他のステロイドを実質的に含有しない２−ＭＥ２の組成物である。
【０００９】
さらに必要とされるものは、純度が９９．５％より高い２−ＭＥ２を含有する組成物である。
【００１０】
さらに必要とされるのは、純度が９８％より高く、エストロゲン性又は発癌性作用を有するエストラジオール又はその他のステロイドを実質的に含有しない２−ＭＥ２の製造方法である。
【００１１】
エストラジオール、関連分子、及びその他の夾雑物から２−ＭＥ２を実質的に分離して、９９．５％より高い純度を有する２−ＭＥ２を生じる方法も必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［発明の要旨］
本発明は、９８％より高い純度、さらに好ましくは９９％より高い純度、最も好ましくは９９．５％より高い純度を有する２−ＭＥ２を提供する。２−ＭＥ２製剤は、好ましくは０．０３％未満のエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の４−メトキシエストラジオール、及び０．０２％未満のエストロンを含有する。さらに好ましくは、２−ＭＥ２製剤は、０．０１％又はそれ以下のエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−メトキシエストラジオール、及び０．０１％又はそれ以下のエストロンを含有する。
【００１３】
本発明は、９８％より高い純度、さらに好ましくは９９％より高い純度、最も好ましくは９９．５％より高い純度の２−ＭＥ２の生成方法も提供する。幾つかの実施形態では、本方法は合成技法を包含する。他の実施形態では、本方法は、他の化合物から２−ＭＥ２を分離するための精製技法を包含する。さらにその他の実施形態では、本方法は、本明細書中に記載された合成技法及び精製技法の両方を包含する。
【００１４】
精製技法は、他の化合物から２−ＭＥ２を分離するための液体−固体クロマトグラフィー（ＬＳＣ）の使用を包含する。クロマトグラフィー媒質は、好ましくはシリカである。溶媒系は、非極性溶媒、例えばクロロホルム、及び極性溶媒、例えばメタノールを含む。
【００１５】
したがって本発明の目的は、９８％より高い純度を有する２−ＭＥ２を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、エストラジオール、関連化合物、及びその他の望ましくない不純物を実質的に含有しない２−ＭＥ２を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、合成技法により実質的に純粋な２−ＭＥ２を生成する方法
を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、精製技法により実質的に純粋な２−ＭＥ２を生成する方法を提供することである。
【００１９】
本発明のその他の特徴及び利点は、その好ましい実施形態の以下の説明から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
［本発明の詳細な説明］
本発明は、９８．０％より高い、さらに好ましくは９９．０％より高い、最も好ましくは９９．５％又はそれ以上の純度を有する２−メトキシエストラジオールに向けられる。２−ＭＥ２は、高純度２−ＭＥ２を生成する本明細書中に記載された合成方法又は精製方法により得られる。本明細書中に記載された合成方法は、さらに高純度を有する２−ＭＥ２を生成するために本明細書中に記載される精製方法によっても補足され得る。
【００２１】
「２−メトキシエストラジオール」という用語及び２−ＭＥ２は、本明細書中で特定的に用いられるが、本明細書中に開示された方法は、限定されないが、エストラジオール及びその他の構造的関連ステロイドのような他の化合物の合成又は精製のために用いられ得る、と理解されるべきである。
【００２２】
＜合成方法＞
本発明は、９８．０％より高い、さらに好ましくは９９．０％より高い、最も好ましくは９９．５％又はそれ以上の純度に２−ＭＥ２を合成する方法を提供する。本明細書中に記載された合成方法は、例えば４−メトキシエストラジオール及び４−ヒドロキシエストラジオールのような、エストラジオールのその他の２−及び４−誘導体又は類似体を合成するためにも、小修正で、用いられ得る。
【００２３】
９８．０％より高い純度を有する２−ＭＥ２を調製するために採用され得るいくつかの合成アプローチがある。あるいは、２−ＭＥ２は、９８．０％より高い純度を有するために、以下の精製方法にしたがって精製され得る。これらの異なる合成アプローチは、異なる出発物質及び中間物質を利用し、その結果、異なる収率、副反応及び不純物が得られる。
【００２４】
２つの同様のアプローチは、Rao, P.N. et al., Synthesis, 1977, 168及びChen, S-H et al., Steroids, 1986, 47, 63に教示されているように、出発物質としてエストラジオールを用い、臭素化された中間物質を利用する。第一のアプローチは、図１２に説明されている。エストラジオールのフリーのヒドロキシル基が保護基で保護される。広範囲な保護基が本発明に用いられる。これらの保護基は、限定されないが、アルキル、アリール、アラルキル基、及び１つ又はそれ以上のヘテロ原子を含有するアルキル、アリール、及びアラルキル基を含む。例えば、保護は、ベンジルブロミドのような、アルキルエーテルを生成するためのハロゲン化アルキルを用いて成し遂げられ得る。ヒドロキシル保護のための適切な条件は、ＮａＨ及びＴＢＡＩの存在下での、任意にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような溶媒の存在下での、エストラジオールとハロゲン化アルキルの反応を含む。保護されたエストラジオールは、次に、例えば酢酸の存在下で臭素と反応させられる。臭素化中のフリーのヒドロキシルの保護は、高収率の２−臭素化中間物質を生じる（保護基なしの場合の約２０％に対して約７０％）（Cushman, M. et al., J. Med. Chem. 1997, 40, 2323参照）。
【００２５】
臭素は、次に、銅触媒を用いてメトキシド基に置き換えられる。例えば、臭素化された
中間物質は、ＣｕＩのような銅触媒の存在下でＮａＯＭｅと反応され得る。反応は、好ましくはＤＭＦのような溶媒中で、任意に促進剤の存在下で実行される。許容可能な促進剤は、限定されないが、ベンゾ−１５−クラウン−５のようなクラウンエーテルを含む。
【００２６】
例えば、アルキル部分の接触水素化による保護基の除去は、２−ＭＥ２を生じる。残念ながら、この合成経路は、メトキシル化段階から約１〜２％のエストラジオールの不純物を生じる（水素化物は、メトキシドよりむしろ反応性銅錯体を抑制する）。エストラジオールは、下記のようなクロマトグラフィーにより検出できないレベルに除去され得るか、又はクロロホルム中での連続結晶化により著しく低減される。
【００２７】
臭素化中間物質を利用し、かつ出発物質としてエストラジオールを用いる別の合成方法は、図１３に説明されている。この合成反応では、エストラジオールはヒドロキシル基を最初に保護することなく環臭素化される。臭素は、次に、銅触媒を用い上記と同様の方法でメトキシドに置換される。
【００２８】
別のアプローチでは、エストラジオール又はエストロンは、ニトロ／アミン中間物質を利用する反応図における出発物質として用いられ得る（Cushman, M. et al., J. Med. Chem. 1995, 38, 2041を参照）。これらの合成アプローチは、図１４（エストラジオール出発物質）及び図１５（エストロン出発物質）に説明されている。これらのアプローチでは、フリーのヒドロキシル基が保護される。この保護は、例えばベンジルブロミドのような、アルキルエーテルを生成するためのハロゲン化アルキルを用いて成し遂げられ得る。ヒドロキシル保護の適切な条件は、ＮａＨ及びＴＢＡＩの存在下での、任意にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような溶媒の存在下での出発物質とハロゲン化アルキルの反応を含む。
【００２９】
保護された出発物質は、次に、例えば、硝酸及び酢酸を用いて、又は硝酸及び硫酸を用いてニトロ化され、対応する２−ニトロ生成物を生成する。ニトロ基は、次に、還元される。選択的還元は、接触水素化、例えば、Ｐｄ／Ｃの存在下での水素化、により成し遂げられ、対応する２−アミンを生成する。接触還元は、最適には１時間実行される。ザンドマイヤー条件（亜硝酸及びナトリウムメトキシド）を用いて、２−アミノ基は、２−メトキシ置換基に転換され得る。接触水素化は、保護基を除去して、出発物質がエストラジオールの場合には２−ＭＥ２を、出発物質がエストロンの場合には２−メトキシエストロンを生じる。ホウ水素化ナトリウムによる２−メトキシエストロンの１７−ケト基の還元は、２−ＭＥ２を生じる。
【００３０】
さらに別の方法は、出発物質としてエストラジオールを用い、そして臭素化中間物質を利用する。この合成反応では、エストラジオールは、ヒドロキシル基を初めに保護することなく環臭素化される。臭素化は、例えば、ＴＨＦのような溶媒中で臭素及び酢酸を用いて成し遂げられる。この反応は、複数箇所が臭素化された種類を含む、環上の異なる部位での臭素化を生じる。２−ブロモ−エストラジオールは、次に、例えば、クロマトグラフィー又は結晶化により他の臭素化中間物質から単離することができ、その後、メトキシドで臭素を置換することができる。臭素は、例えば、ＣｕＩのような銅触媒の存在下でナトリウムメトキシド及びメタノールを用い、上記と同様の方法で、メトキシド基に置換され得る。あるいは、中間物質は、反応されて、対応するメトキシドを生成し、その後上記の方法により２−メトキシエストラジオールが単離される。
【００３１】
＜精製方法＞
本発明は、９８．０％より高い、さらに好ましくは９９．０％より高い、最も好ましくは９９．５％又はそれ以上の純度に２−ＭＥ２を精製する方法を提供する。２−ＭＥ２製剤は、好ましくは０．０３％未満のエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の２−ヒ
ドロキシエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の４−メトキシエストラジオール、及び０．０２％未満のエストロンを含有する。最も好ましくは、２−ＭＥ２製剤は、０．０１％又はそれ以下のエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−メトキシエストラジオール、及び０．０１％又はそれ以下のエストロンを含有する。
【００３２】
本発明の精製方法は、極性及び非極性溶媒を含む溶媒系を用いた、シリカのような吸着／分配媒質上での液体クロマトグラフィーを包含する。本明細書中に記載した精製方法は、小さい修正を加えるだけで、例えば、４−メトキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、エストラジオール、エストロン、２−メトキシエストロン、及び４−メトキシエストロンのような、２−ＭＥ２と同様の化合物を精製するためにも用いられ得る。
【００３３】
＜試料＞
精製される試料は、合成されるか又は生物学的供給源から得ることができる。試料は、Sigma-Aldrich Chemicals(St. Louis, Missouri)、Rearch Plus, Inc.(Bayonne, NJ)又はCalbiochem(San Diego, CA)により販売されているような２−ＭＥ２市販製剤であってもよい。試料は、好ましくは少なくとも約５０％純粋、より好ましくは約７５％純粋、さらにより好ましくは約９０％純粋、最も好ましくは約９８％純粋である。試料は、本明細書中に記載された方法の前に、選択的結晶化のような他の精製工程に付され得る。
【００３４】
試料は、好ましくは、さらに以下で説明されるように、負荷溶媒中で、溶解されるか又は溶媒交換される。試料は、好ましくは約０．０１〜２ｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１〜１ｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．０５〜０．２ｇ／ｍｌの範囲の濃度である。
【００３５】
＜クロマトグラフィー媒質＞
シリカは、好ましくはクロマトグラフィー媒質として用いられる。約７０〜４００メッシュのシリカゲルが好ましく、最も好ましくはMerck及びその他の販売元により供給されるような約７０〜２３０メッシュである。媒質は、バッチクロマトグラフィーにおいてバラで用いられ得るし、又はカラムに充填され得る。プレ充填カラム、例えばBiotage(Charlottesville, VA)により販売されているものも用いられ得る。媒質は、以下でさらに考察されるように、媒質への試料の適用前に、適切な溶媒中で平衡されるべきである。
【００３６】
＜カラム寸法＞
本明細書中に記載したクロマトグラフィー法は、バッチ又はカラムクロマトグラフィーを用いて成し遂げられ得る。バッチクロマトグラフィーでは、試料及びクロマトグラフィー媒質は、２−ＭＥ２を媒質に保持させるのに十分な時間、容器中で合わされる。媒質は、次に、好ましくは洗浄溶媒で洗浄される。溶出溶媒は、次に、媒質に適用される。負荷、洗浄及び溶出段階後、溶媒は、例えば濾過により媒質から除去される。
【００３７】
カラムクロマトグラフィーに関しては、適切な寸法を有するカラムにクロマトグラフィー媒質が充填される。カラムは、適切な溶媒で平衡後、カラムの上部又は入り口に試料を適用することにより、試料を負荷される。カラム直径に対する試料容積の比は、最善の結果を得るためには、好ましくは約０．２〜３ｍｌ／ｃｍ、さらに好ましくは約０．５〜１．５ｍｌ／ｃｍであるべきである。
【００３８】
＜溶媒＞
メタノール（ＭｅＯＨ）のような極性溶媒、及びクロロホルム（ＣＨＣｌ3）のような非極性溶媒を含む溶媒系が用いられる。用いられ得るその他の極性溶媒は、限定されない
が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エチルアセテート、イソプロパノール、エタノール、プロパノール、及びそれらの組み合わせを含む。用いられ得るその他の非極性溶媒は、限定されないが、ヘキサン、ジクロロメタン、シクロヘキサン、ペンタン、及びそれらの組み合わせを含む。より具体的には、用いられ得る溶媒系は、ＴＨＦ／ヘキサン、エチルアセテート／ヘキサン、イソプロパノール／ヘキサン、エタノール／ＣＨＣｌ3、プロパノール／ＣＨＣｌ3、イソプロパノール／ＣＨＣｌ3、及びそれらの組み合わせを含む。
【００３９】
試料は、極性溶媒中で可溶性である。多少量、一般的には約１０％、の極性溶媒が、負荷溶媒中で試料を可溶性にさせるために必要とされる。一例として、負荷溶媒は、約１０％までの極性溶媒及び約９０％の非極性溶媒を含む。
【００４０】
試料が媒質に負荷された後、媒質は、媒質から夾雑物を洗い落とすが２−ＭＥ２を溶出しない洗浄溶媒で洗浄され得る。洗浄溶媒は、２−ＭＥ２が沈殿するのを防止するのに十分であるが２−ＭＥ２を溶出するには十分でない極性溶媒を伴う非極性溶媒を主として含む。
【００４１】
試料は、媒質から２−ＭＥ２を溶出するのに十分な極性溶媒を含有する溶出溶媒で溶出される。溶出溶媒は、下記で説明するように、段階勾配として又は線形勾配として適用され得る。
【００４２】
＜カラム条件＞
洗浄及び溶出溶媒は、段階勾配で、又は線形勾配でカラムに適用され得る。好ましい実施形態では、溶媒は、極性溶媒の濃度を増加させる段階勾配を用いて適用され得る。
【００４３】
カラムは、重力を用いて操作され得るか、又はカラムに液体を通させるポンプを用いて操作され得る。カラムが操作される速度は、カラムの容積及び寸法並びにシリカゲル粒径に依存している。一般に、カラムは、約０．５〜５ｍｌ／分の速度で操作され得る。
【００４４】
溶離液は、視覚的に監視され得るか、又は２−ＭＥ２の最大吸光度である約２８８ｎｍの波長で、分光計を用いて監視され得、カラムから溶出する２−ＭＥ２として収集され得る。
【００４５】
カラムは、圧力下で任意に操作され、かつ任意に加熱され得る。順相又は逆相の分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、あるいは高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）技法が用いられ得る。市販の分取クロマトグラフィー装置、例えばBiotage(Charlottesville, VA)により販売されているものも用いられ得る。カラム効率及び／又は速度を改良するためのその他の既知の方法も用いられ得る。
【００４６】
＜試料収集及び処理＞
溶離液は、次に２−ＭＥ２含量及び純度に関して分析される分画として収集され得る。これらの分画は、次に２−ＭＥ２の所望の純度を達成するために併合され得る。分画は、Ｃ−１８カラム（Waters）及び３０：６９：１のアセトニトリル：水：酢酸のアイソクラチック溶媒系を用いた逆相ＨＰＬＣを用いて、純度に関して分析され得る。その他の系、例えばアイソクラチック溶媒系の代わりに溶媒勾配を用いるもの、酢酸ではなくてトリフルオロ酢酸又はギ酸を用いるもの、及びアセトニトリルでなくメタノールを用いるもの、が試料分析に使用され得る。
【００４７】
代わりに、又は組み合わせて、溶離液は、リアルタイムで監視することができ、カラムから所望純度の２−ＭＥ２が溶出したときに試料収集が開始され得る。
【００４８】
溶媒は、真空及び／又はその他の溶媒除去法の使用によりプール分画から除去される。凍結乾燥法及びその他の蒸発法が用いられ得る。
【００４９】
＜好ましい実施形態＞
好ましい実施形態では、媒質は、カラムに充填されるシリカである。試料は、２−ＭＥ２を溶解するのに十分なＭｅＯＨを伴う、一般にＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨが約９０：１０であるＣＨＣｌ3及びＭｅＯＨの混合物中に溶解される。溶出条件は、９９：１のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨから９８：２のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨまでの段階勾配である。
【００５０】
本発明は、本発明の範囲の限定を強いる方向に解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明される。それどころか、本明細書を読めば、種々のその他の実施形態、変形例、及び等価物を採ることができ、それらを、本発明の趣旨及び／又は添付されたクレームの範囲から逸脱することなく当業者に示唆し得ることが明確に理解される。
【実施例】
【００５１】
＜実施例１＞
分析用ＨＰＬＣにより２−ＭＥ２の市販試料を分析して、ある種の夾雑物の全て、即ちエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、４−メトキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、エストロン及び２−メトキシエストロンの純度及び量を測定した。
【００５２】
これらの分析用ＨＰＬＣクロマトグラムは、Ｃ−１８カラム（Waters）及び溶媒勾配（３０分間で２０→５０％アセトニトリル、５分間で５０→８０％アセトニトリル、１％酢酸、残余量の水）を用いる逆相ＨＰＬＣを使用して形成された。２８８ｎｍの波長で溶離液を監視した。この系では、２−ＭＥ２は約２１．５分で溶出し、エストラジオールは約２０．０分で溶出し、エストロンは約２３．２分で溶出し、４−ヒドロキシエストラジオールは約１５．０分で溶出し、４−メトキシエストラジオールは約２０．４分で溶出し、２−ヒドロキシエストラジオールは約１５．４分で溶出し、そして２−メトキシエストロンは約２４．４分で溶出する。
【００５３】
Sigma-Aldrich Chemicals(St. Louis, Missouri)からの試料のクロマトグラムを図１に示す。試料は９９．２％の全体純度を有するが、許容不可能な量である約０．０３４％の夾雑エストラジオールを有する。図２は、図１のクロマトグラムの拡大図である。
【００５４】
図３は、Rearch Plus, Inc.(Bayonne, NJ)から入手した試料のクロマトグラムであり、２−ＭＥ２が９８．６％の純度を有することを示す。自動ピーク算定器及び図４に示した拡大図は、本製剤が、この夾雑物の許容不可能な量である０．０２４％のエストロンを含有することを示す。Rearch Plusから入手した二次バッチ（９７．２％２−ＭＥ２）及びCalbiochem(San Diego,California)からの試料（９１．８％２−ＭＥ２）を含む、試験されたその他の試料は、９８％未満の２−ＭＥ２純度を示した。
【００５５】
下記の表１は、２−ＭＥ２のこれら市販試料の純度及び夾雑物、並びに本発明の精製２−ＭＥ２を示す。
【００５６】
【表１】


【００５７】
＜実施例２＞
直径５５ｃｍ（高さ６０ｃｍ）のガラスカラムに、９０：１０のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ中の６００ｇのシリカゲル（７０〜２３０メッシュ、Merck）を充填した。カラムを１リットルのＣＨＣｌ3で洗浄し、カラムからＭｅＯＨを除去した。
【００５８】
試料は、９０：１０のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ６０ｍｌ中の３．５gの２−ＭＥ２であった。２−ＭＥ２は、PharmEco Labortories, Inc.(Lexington, MA)から入手し、分析用ＨＰＬＣによる測定によれば純度９７．８％であった（図５）。１０．９１７で溶出するピークはエストラジオール（２．２％）である。
【００５９】
Ｃ−１８カラム（Waters）及び３０：６９：１のアセトニトリル：水：酢酸の、２−ＭＥ２及びエストラジオールの良好な分離を提供するアイソクラチック勾配を用いた逆相ＨＰＬＣを用いて、出発物質、カラム分画及びそのプールされた成分の分析用ＨＰＬＣを実施した。２８８ｎｍの波長で溶離液を監視した。
【００６０】
試料は、カラムの頂部に注がれ、カラム体積に入れられた。カラムは、１リットルの９９：１のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨで溶出され、次に１．５Ｌの９８：２のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨで溶出された。各々５０ｍｌの分画を収集し、２−ＭＥ２を含有する１５の分画を、上記の分析用アイソクラチックＨＰＬＣ系を用いて、２−ＭＥ２純度に関して分析した。エストラジオール量を示さなかった９〜１０分画を一緒にプールし、溶媒を蒸発させた。真空下で４時間乾燥後、３．２ｇの黄色／白色結晶を、収率９１％で収集した。
【００６１】
上記のアイソクラチック技法を用いて、分析用ＨＰＬＣによりプールされた分画の純度は９９．９８４％と測定された。そのＨＰＬＣクロマトグラムを図６〜９に示す。図６は、非過剰負荷量の試料７５．６μｇ（５．４μｌ／ｍｌで１４μｌ）を用いて得た。図７は図６のクロマトグラムの拡大図である。自動ピーク検出器は、２−ＭＥ２を１００．０％であると算定したが、しかし、２−ＭＥ２の前に溶出した、小さい未知の不純物ピークが拡大図で認められた。図８は、過剰負荷量の試料２７０μｇ（５．４μｌ／ｍｌで５０μｌ）を用いて得た。図９は図８のクロマトグラムの拡大図である。自動ピーク検出器は、２−ＭＥ２の前及びエストラジオールの後に溶出し０．０１６％であると算定された、小さい未知の不純物ピークと共に、２−ＭＥ２を純度９９．９８４％であると算定した。図９に示した拡大図は、この不純物ピークをより明確に示し、２−ＭＥ２ピークが非常に
滑らかであることを示す。
【００６２】
当該プールを、勾配（２５分間で２０→７０％アセトニトリル、１％酢酸、残余量の水）を用いても分析した。４３．２μｇ（５．４μｌ／ｍｌ試料の８μｌ）を注入した。クロマトグラムを図１０に示す。自動ピーク検出器は、２−ＭＥ２を純度９９．８２５％であると算定した。しかしながら、ブランク実験で２９．４５分で認められた人為的ピークを検討から除外すると、算定純度は９９．９％である。図１１はこのクロマトグラムの拡大図である。１３．４３分での未知の不純物は、０．０１２％であると算定された。エストラジオールが存在する場合、それは未知純度と２−ＭＥ２ピークの間に溶出する。したがってエストラジオールが存在する場合には、それは未知のピークの量の１／３〜１／４以下で存在し得る。したがって、エストラジオール量は、０．００４％以下であると概算された。本製剤は、予測保持時間で任意の測定可能ピークの欠如について実証されるように、０．０２％又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−メトキシエストラジオール、及び０．０１％又はそれ以下のエストロンを含有した。
【００６３】
精製試料は元素分析にもかけられ、その結果を表２に示す。
【００６４】
【表２】


【００６５】
上記の記載内容は説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。上記の記載内容を読めば、多数の実施形態が当業者には明らかになる。したがって、本発明の範囲は、上記の説明に関して確定されるべきでなく、添付されたクレーム、並びにこのようなクレームで表される等価物の全範囲に関して確定されるべきである。特許、特許出願、及び公告を含めた全論文及び参考文献の開示内容は、参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】Sigma Chemical Companyから入手可能な２−メトキシエストラジオール（４５Ｈ４０３３）の逆相ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムである。このグラフは、Sigma社製品が約０．０３４％のエストラジオールを含有することを示す。
【図２】エストラジオール不純物を示す図１のクロマトグラムの拡大図である。
【図３】Research Plusから入手可能な２−メトキシエストラジオール（１０６９９）の逆相ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムである。このグラフは、Research Plus社製品が約０．０２４％のエストロン及び約０．９３％のその他の望ましくないエストロゲンを含有することを示す。
【図４】エストロン不純物を示す図３のクロマトグラムの拡大図である。
【図５】本発明の実施例２における出発物質として用いられる非精製２−メトキシエストラジオールの逆相ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムである。
【図６】実施例２において生成された本発明の２−ＭＥ２のクロマトグラムである。ＨＰＬＣは、非過剰負荷量の試料７５．６μｇ（５．４μｌ／ｍｌで１４μｌ）を用いて実行した。
【図７】図６のクロマトグラムの拡大図である。
【図８】実施例２において生成された本発明の２−ＭＥ２のクロマトグラムである。ＨＰＬＣは、過剰負荷量の試料２７０μｇ（５．４μｌ／ｍｌで５０μｌ）を用いて実行した。
【図９】図８のクロマトグラムの拡大図である。
【図１０】勾配（２５分間で２０→７０％アセトニトリル、１％酢酸、及び残余量の水）を用いて分析された、実施例２からのプール分画のクロマトグラムである。４３．２μｇ（５．４μｌ／ｍｌ試料の８μｌ）を注入した。
【図１１】図１０のクロマトグラムの拡大図である。
【図１２】出発物質としてエストラジオールを用い、臭素、クラウンエーテル、並びにエストラジオールの３−及び１７−位置ヒドロキシル酸素原子上の保護基を用いた、本発明の２−メトキシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す。
【図１３】出発物質としてエストラジオールを用い、保護されていないエストラジオールのＡ環の２−位置の臭素化、及びクラウンエーテルを用いた、本発明の２−メトキシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す。
【図１４】出発物質としてエストラジオールを用い、エストラジオールの３−及び１７−位置ヒドロキシル酸素原子上の保護基、ニトロ化、及びザンドマイヤー反応を用いた、本発明の２−メトキシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す。
【図１５】出発物質としてエストロンを用い、３−位置ヒドロキシル酸素原子上の保護基、ニトロ化、及びザンドマイヤー反応を用いた、本発明の２−メトキシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す。
【図１６】出発物質としてエストラジオールを用い、保護されていないエストラジオールのＡ環の２−位置の臭素化、及びメタノールとの反応を用いた、本発明の２−メトキシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す。
【出願人】 【識別番号】５００５２３９２８
【氏名又は名称】エントレメッド インコーポレイテッド
【出願日】 平成１９年１１月２６日（２００７．１１．２６）
【代理人】 【識別番号】１００１００５４９
【弁理士】
【氏名又は名称】川口 嘉之

【識別番号】１０００９０５１６
【弁理士】
【氏名又は名称】松倉 秀実

【識別番号】１０００８９２４４
【弁理士】
【氏名又は名称】遠山 勉
【公開番号】 特開２００８−６３３４５（Ｐ２００８−６３３４５Ａ）
【公開日】 平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【出願番号】 特願２００７−３０４１４６（Ｐ２００７−３０４１４６）