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【発明の名称】 損傷神経修復のためのフィブリン接着組成物およびその方法
【発明者】 【氏名】ヘンリッチ・チェン

【氏名】シャン−スオ・フアン

【氏名】シェン−コウ・ツァイ
【要約】 【課題】損傷を受けた神経を修復し、および／またはその機能回復を促進する手段の提供。

【構成】フィブリン接着剤と、神経修復と機能回復促進のための有効量の骨髄幹細胞(ＢＭＳＣ)、好ましくはヒト骨髄由来の篩過された幹細胞(ＳＳＣ)を含む組成物。当該組成物は損傷を受けた神経を修復し、および／またはその機能の回復を少なくとも部分的には促進する手段として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリン接着剤と、神経損傷を修復し少なくとも部分的には神経の機能回復を促進する少なくともいずれかひとつの有効量の骨髄幹細胞(ＢＭＳＣ)を含む、損傷神経の機能回復を促進し神経損傷を修復する少なくともいずれかひとつのフィブリン接着組成物。
【請求項２】
ＢＭＳＣが篩過された幹細胞(ＳＳＣ)である、請求項１の組成物。
【請求項３】
ＳＳＣが３μｍ孔の篩で篩過された、請求項２の組成物。
【請求項４】
その有効量が約１０５から１０７のＳＳＣを含む、請求項２の組成物。
【請求項５】
その有効量が約１０６のＳＳＣを含む、請求項４の組成物。
【請求項６】
神経損傷を修復し少なくとも部分的には神経の機能回復を促進する少なくともいずれかひとつの有効量の神経成長因子をさらに含む、請求項１の組成物。
【請求項７】
その神経成長因子がグリア細胞株由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)である、請求項６の組成物。
【請求項８】
その神経成長因子の有効量が組成物中約1 μg/mlから約1000 μg/mlの濃度である、請求項６の組成物。
【請求項９】
その神経成長因子の有効量が組成物中約50 μg/mlの濃度である、請求項７の組成物。
【請求項１０】
神経損傷を修復し少なくとも部分的には神経の機能回復を促進する少なくともいずれかひとつの有効量の神経成長因子をさらに含む、請求項２の組成物。
【請求項１１】
その神経成長因子がグリア細胞株由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)である、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
その神経損傷が局限的脳虚血で引き起こされる、請求項１の組成物。
【請求項１３】
その局限的脳虚血が慢性的な局限的脳虚血である、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
その神経が中枢神経系の神経である、請求項１の組成物。
【請求項１５】
その神経損傷が虚血性脳疾患の結果である、請求項１の組成物。
【請求項１６】
その虚血性脳疾患が、脳梗塞、血栓および中大脳動脈の塞栓の少なくともいずれかひとつよりなる群から選択される、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
使用直前にそのフィブリン接着組成物が新しく調製される請求項１の組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷を受けた神経を修復しその機能回復を促進するための組成物およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経の損傷は通常、外傷や虚血により引き起こされ、その修復は困難である。神経の損傷を受けた脊椎動物は運動障害や麻痺を起こし、死に至ることさえあり得る。脳血流の急激な中断は虚血を生じさせ、長期間の運動障害を伴う脳梗塞や虚血性変化を誘導する〔後記非特許文献１参照〕。中枢神経系(ＣＮＳ)の虚血性傷害後の神経細胞の損失はＣＮＳの修復を困難にする。
種々のげっ歯類およびヒトのＣＮＳ領域から単離された神経幹細胞(ＮＳＣ)が環境および／または外因性の成長因子の影響の下で成体げっ歯類の神経細胞へと分化し得ることが多くの研究により示された〔後記非特許文献２、３参照〕。こうして、ＮＳＣの補充はヒトＣＮＳ治療の有効な戦略と思われる。
【０００３】
ヒトの骨髄由来幹細胞は形態学上不均質である。これらは多分化能を有していて骨芽細胞、含脂肪細胞、軟骨細胞および筋肉等へ分化し、また神経を発生させることもできる〔後記非特許文献４〜７参照〕。最近、ヒトおよびマウスの骨髄幹細胞(ＢＭＳＣ)がレチノイン酸および外皮成長因子または脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)の刺激により、神経前駆体マーカー(ネスチン)、神経特異的核タンパク(ＮｅｕＮ)およびグリア酸性繊維性タンパク(ＧＦＡＰ)を発現することが報告された〔後記非特許文献６参照〕。また移植されたＢＭＳＣが損傷したＣＮＳにおける神経およびグリア系統を識別し得ることも示された〔後記非特許文献８参照〕。その上、ＢＭＳＣの移植が局所性脳虚血ラット〔後記非特許文献９参照〕、外傷性脳損傷ラット〔後記非特許文献１０参照〕およびパーキンソン病マウス〔後記非特許文献１１参照〕の機能回復を改善することが見出された。
【０００４】
これらの発見は、ヒトＣＮＳ細胞治療における細胞源としてＢＭＳＣが有用な役割を果たし得ることを示している。上述した研究においてＢＭＳＣの投与経路は静脈内または脳内注射である。例えば慢性の限局的脳虚血傷害により引き起こされる神経損傷を受けた試験動物で、局所投与されたＢＭＳＣが損傷を受けたＣＮＳ領域に及ぼす効果の報告はない。さらに神経損傷を効果的に修復し、その結果、傷害された神経の機能回復を促進するための手段が依然として求められている。
【非特許文献１】サビッツ等(S.I. Savitz et al.)、2002, Ann. Neurol., 52: 266275.
【非特許文献２】ゲージ(F.H. Gage), 2000, Science 287;14331438.
【非特許文献３】プライス、ウィリアムス(J. Price and B.P. Williams), 2001, Curr. Opin. Neurobiol. 11: 564-567.
【非特許文献４】メゼイ等(E. Mezey et al.), 2000, Science 290: 17791782；
【非特許文献５】メゼイ等(E. Mezey et al.), 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 13641369.
【非特許文献６】サンシェ等(J.R. Sanchez-Ramos et al.), 2000, Exp. Neurol. 164: 247256.
【非特許文献７】ウッドベリー等(D. Woodbury et al.), 2000, J. Neurosci. Res. 61: 364370.
【非特許文献８】サンシェ(J.R. Sanchez-Ramos), 2002, J. Neurosci Res. 69: 880-893.
【非特許文献９】チェン等(J. Chen et al.), 2000, Neuropharmacology 39;711-716.
【非特許文献１０】ルー等(D. Lu et al.), 2001, J. Neurotrauma 18: 813-819.
【非特許文献１１】リー等(Y. Li et al.), 2001, Neurosci Lett, 316: 67-70.
【発明の開示】
【０００５】
本発明の目的は、神経損傷を効果的に修復するための方法および組成物を提供することであり、その結果として、少なくとも部分的には損傷神経の機能回復を促進することである。
従って、第一の側面では、本発明は神経損傷を修復するためのフィブリン接着組成物に関し、これはフィブリン接着剤と神経損傷の修復に有効な量の骨髄幹細胞(ＢＭＳＣ)を包含する。本発明のより好ましい態様では、該フィブリン接着組成物は損傷神経の機能回復を少なくとも部分的には促進するために有効な量の神経成長因子をさらに含んでいてもよい。
【０００６】
さらなる側面では、本発明は対象における神経損傷を修復する方法に関し、該方法は、フィブリン接着剤と神経損傷の修復に有効な量のＢＭＳＣを含むフィブリン接着組成物の提供と、該組成物の損傷神経への局所適用を包含する。本発明のより好ましい態様では、該フィブリン接着組成物は損傷神経の修復するために有効な量の神経成長因子をさらに含んでいてもよい。
【０００７】
よりさらなる側面では、本発明は対象における損傷神経の機能回復を促進する方法に関し、該方法は、フィブリン接着剤と損傷神経の機能回復を少なくとも部分的には促進するために有効な量のＢＭＳＣを含むフィブリン接着組成物の提供と、該組成物の損傷神経への局所適用を包含する。本発明のより好ましい態様では、該フィブリン接着組成物は損傷神経の機能回復を少なくとも部分的には促進するために有効な量の神経成長因子をさらに含んでいてもよい。
【０００８】
本発明は神経損傷の修復および／または損傷を受けた神経の機能回復の促進のためのフィブリン接着組成物に関するものであり、フィブリン接着剤および神経損傷の修復および／または少なくとも部分的には損傷を受けた神経の機能回復の促進に有効な量の骨髄幹細胞(ＢＭＳＣ)を含む。
本発明に従うと、ＢＭＳＣは神経への分化能を有する骨髄由来の幹細胞で神経細胞の再生には最適の材料と考えられている。好ましくは、本発明で使用されるＢＭＳＣはヒト骨髄由来の篩過された幹細胞(ＳＳＣ)である。
【０００９】
ＳＳＣはその異なる大きさに基づいて成長し、均一な細胞群を発生させるための特異的な表面マーカーを発現する。これは一次ＢＭＳＣ株の不均一な細胞群発生を避けるため細胞選別を用いて行う。ＳＳＣは不均一なＢＭＳＣ群よりも大きな再構築の可能性を持っている。本発明のより好ましい態様では、ＳＳＣはヒト骨髄よりその細胞のサイズと接着能に基づき、パーコール(Percoll)のグラディエント分離とより小さな細胞を除外するための３μm孔の篩い〔ハング等(S.C. Hung et al.), 2002, Stem Cells 20: 249258; その開示を参考のためここで援用する〕により均一な細胞群として単離される
【００１０】
本発明に従うと、ＳＳＣはフィブリン接着組成物に添加する前に神経分化を誘導することができる。この誘導はＳＳＣを抗酸化剤のβ-メルカプトエタノールやレチノイン酸で処理することにより行うことができる。これは試験管内(in vitro)で幹細胞の神経分化誘導にしばしば用いられる〔ハング等(S.C. Hung et al.), 2002, Stem Cells 20: 522-529; その開示を参考のためここで援用する〕。本発明のより好ましい態様では、ＳＳＣは神経栄養因子、例えばグリア細胞株由来の神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド(ＰＡＣＡＰ)、および／またはジブチリルｃＡＭＰ(ｄｂｃＡＭＰ)により誘導される。同時継続中の米国特許出願、No.10/873,640(2004年６月23日出願、公開No. 20050287665；その開示を参考のためここで援用する)に記載のとおりである。
【００１１】
ここで使用される「有効な量」の語はＢＭＳＣの量、そして任意で本発明のフィブリン接着組成物中の神経成長因子の量をいい、神経損傷を受けた対象に適用される場合は望まれる効果、即ち、対象における神経損傷の修復、および／または少なくとも部分的には損傷を受けた神経の機能回復の促進を達成する量をいう。有効な量は当業者によってここでする開示により過度の実験を行うことなく容易に決定できる。好ましくは、本発明において標的部位に適用されるＢＭＳＣの有効な量は細胞数で約１０５から約１０７である。より好ましくは細胞数で約１０６である。好ましい、そしてより好ましい神経成長因子の濃度は、ＢＭＳＣとともに使用される場合、以下に説明する。
【００１２】
本発明で使用される「フィブリン接着剤」の語は、フィブリノーゲンと他の試薬により生成される、生体適合性がありかつ生分解性の生成物をいう。フィブリン接着剤は神経外科を含む種々の外科領域で接着剤として習慣的に用いられている。例えば、Beriplast P(商標)(ドイツ、ZLB ベーリング)の商標で売られている市販品を入手できる。
本発明で使用されるフィブリン接着剤は好ましくは三種の成分；フィブリノーゲン、アプロチニンおよび２価のカルシウムイオンを提供するカルシウム源（例えば、塩化カルシウム、炭酸カルシウム等）を含有する。このフィブリン接着剤を適用するためには、最初にフィブリノーゲンをアプロチニンと混合し、さらに外科領域でカルシウム源と混合して接着性包帯を生成する。
【００１３】
ＢＭＳＣを含むフィブリン接着剤を作るためには、外科領域でカルシウム源と混合する前にＢＭＳＣをフィブリノーゲンおよびアプロチニンと混合することができる。
本発明のフィブリン接着組成物において、フィブリノーゲンの濃度は好ましくは約10 mg/mlから約1000 mg/mlの範囲で、より好ましくは約100 mg/ml；アプロチニンの濃度は約10 KIU/mlから約500 KIU/mlの範囲でより好ましくは約200 KIU/ml；そしてカルシウム源として用いる塩化カルシウムの濃度は約1 mMから約100 mMの範囲でより好ましくは約8 mMである。
本発明のフィブリン接着組成物は、フィブリン接着成分（ここでフィブリン接着剤という）およびＢＭＳＣに加えて、さらに神経成長因子の有効量を含んでもよい。本発明組成物において使用される神経成長因子は、限定はされないが、グリア細胞株由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、トランスフォーミング成長因子β、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、およびニューロトロフィン〔例えば、神経成長因子(ＮＧＦ)、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５等〕から選択することができる。最も好ましくは、この神経成長因子はグリア細胞株由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)である。
【００１４】
本発明に従うと、フィブリン接着組成物におけるこの神経成長因子の濃度は好ましくは、組成物中約 1μg/mlから約1000μg /mlの範囲であり、より好ましくは約50 μg/mlである。
本発明のフィブリン接着組成物はあらゆる種類の神経損傷の修復およびあらゆる神経系、即ち、中枢神経系、末梢神経系、交感神経系、および副交感神経系を含み、その損傷の機能回復の促進に適している。好ましくは、その損傷を受けた神経系は中枢神経系である。本発明の態様では神経損傷は限局的な脳虚血(ＦＣＩ)により引き起こされる。より好ましい態様では、当該損傷は慢性的な限局的脳虚血により引き起こされる。
【００１５】
ここで使用される「神経損傷の修復」その他文法的にこれと等価な他の語は、神経の損傷を受けた対象の病態の改善をいい、「損傷神経の機能回復」の語は、少なくとも部分的には損傷した神経の生理学的機能の回復をいう。例えば、ＦＣＩにより引き起こされる神経損傷では梗塞総体積および運動障害の減少は損傷神経の修復およびその機能の回復の兆候である。本発明に従う動物モデルにおいては、運動障害の減少とは平衡、協調運動および握力の改善を含む。
【００１６】
ここで使用される単数形の単語は、文脈の記述から明らかでない限り、複数の指示を含む。例えば、損傷神経(a damaged nerve)はひとつまたはそれより多い損傷神経を含む。
ここで使用される「対象」の語は哺乳類、即ち、イヌやネコ等のペット動物、マウスやラット等の実験用動物、ウマ、ウシ等の家畜、そして好ましくはヒトを含む。
本発明のフィブリン接着組成物は損傷した神経に対して局所的に適用することができる。この局所適用は神経が局所投与に対してあらわにされている外科手術中にシリンジを用いて神経を含む部位を覆うことにより実施できる。
【００１７】
本発明に従う方法は、慢性的な神経損傷の修復および損傷神経の機能回復促進に必要な長期間の効果を発揮する。加えて、１回限りの本発明組成物の局所適用は望まれる機能回復の効果を十分達成することができる。好ましくは、この方法はさらにそのフィブリン接着組成物を使用直前に新しく調製することを包含する。
本発明の組成物および方法は種々の神経損傷に関連する疾患（限定はされないが例えば虚血脳疾患を含む）の治療に用いることができる。好ましくは、その虚血脳疾患は脳梗塞、血栓、および中大脳動脈(ＭＣＡ)の塞栓を含む。
【実施例】
【００１８】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらは限定的というより、説明目的で提供される。
動物
以下の実験は、米国の国立衛生研究所が発行する実験動物の使用と世話のためのガイド(ＮＩＨ発行、No.85-23、1996年改訂)に従っている。体重300 gから350 gの雄性ロングエバンス(Long-Evans)ラット(国立実験動物育種研究センター)を以下の実験で使用した。動物は昼夜周期(12:12)の温度(24±1℃)および湿度(55±5％)管理された室内で飼育した。水および食餌は自由に与えた。
【００１９】
篩過された幹細胞(ＳＳＣ)
以下の実験で用いたＳＳＣは記述の方法〔ハング等(S.C. Hung et al.), 2002, 上記〕によりヒト骨髄幹細胞より単離した。要約すると、健常な提供者の腸骨稜から吸引した骨髄をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄し、1.073 g/mlのパーコール溶液(シグマ社)上に負荷して900 × gで30分間遠心分離した。ダルベッコの修飾イーグル培地低グルコース(ＤＭＥＭ-ＬＧ)に、10%ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)、ペニシリン100 U/ml、ストレプトマイシン100 mg/ml、およびアムホテリシンＢ 0.25 μg/mlを添加してこれに細胞を懸濁し、３μm孔のプレート（Transwell System, Corning）を含む10 cmのプラスチック製培養皿中、１０６単核細胞／cm２の濃度でプレート化した。最初にプレート化してから７日後、孔のあるプレートに接着したＳＳＣを回収して、6,000 細胞/cm２でプレート化し細胞が80％以上のコンフルエンスに達するまで１：３の比で二次培養した。
【００２０】
未分化ＳＳＣを10% ＦＢＳ添加のＤＭＥＭ-ＬＧで培養した。培地を含む血清中で成長したＳＳＣが80％のコンフルエンスに達したら、そのＳＳＣを密度4,000 細胞/cm２で播種してＧＤＮＦ(20 ng/ml, ＲＢＩ、米国マサチューセッツ州ナティック)を含む血清培地(ＩＴＳ培地)中４８時間処置し、それから血清枯渇で５時間から３日間処理し分化を誘導した。ＩＴＳ培地は56% ＤＭＥＭ−ＬＧ（ライフ・バイオテック）、40% ＭＣＤＢ−２０１培地(シグマ)、および1× ITS培地添加物（シグマ）を含んでなり、該添加物はインスリン1 mg/ml、ヒト・トランスフェリン0.55 mg/ml、亜セレン酸ナトリウム0.5 μg/ml、デキサメタゾン(シグマ) 10 nM、およびアスコルビン酸(シグマ) 10 μMを含む。
統計
以下の実験で得られたデータは平均±標準誤差(S.E.M.)で表す。対照および処置群との間のラットの梗塞体積および行動不足スコアの差は一元配置分散分析(ANOVA)および続く、対応のない、両側ｔ検定で統計的解析をした。Ｐ値＜0.05が統計的に有意と考えた。
【００２１】
実施例１
一般的な脳梗塞および梗塞体積の解析
ハング等の方法〔ハング等(S.S. Huang et al.), 2001, Free Radic. Biol. Med. 30: 643-649, その開示を参考のためここで援用する。〕を修飾して実施した。要約すると、外科措置中、各雄性ロングエバンス・ラットに亜酸化窒素／酸素／ハロタン(69%:30%:1%)を吸引させて麻酔した。手術中ラットの体温は直腸プローブにより、サーボ制御の加熱パッドで37±0.5℃に維持した。腹部尾動脈にカニューレを挿入し、心拍および平均動脈圧(ＭＡＢＰ)をスタータム(Statham) P23 XL 変換器で連続してモニターし、グールドRS-3400生理学的記録計(Gould, クリーブランド、オハイオ州、米国)で表示した。血液pH、PO2およびPCO2は血液試料を血液ガス分析器(GEM-5300 I.L. CO、米国)で試験した。測定は片側の中大脳動脈(ＭＣＡ)閉鎖の前、最中および直後に行った。
【００２２】
限局的な脳虚血(ＦＣＩ)梗塞をＭＣＡ領域の右側部大脳皮質で作製した。正中線前頸部切開により共通の両頸動脈をあらわにした。動物を側臥位において右外眼角と前耳介の間の中間点で皮膚切開を行った。側頭部筋肉を引っ込めて、頬骨と側頭鱗骨の結合部において生理食塩水で冷却したドリル(ドレメル・マルチプロ+5395, Dremel com.、米国)を用いて小さな頭蓋骨切除術(径3 mm)を施した。解剖用顕微鏡(OPMI-1, ZISS、ドイツ)を用いて細い鉗子で硬膜を開き、右ＭＣＡを10-0モノフィラメント・ナイロン紐で結紮した。それから共通の両頸動脈を微細動脈瘤クリップで１時間閉塞させた。該クリップを除いた後、動脈内で血流の再開が目視された。
【００２３】
ＦＣＩ傷害の１週間後、任意の順番にてラットを四つの処置群のひとつに割り当てた；(a)偽手術群：ＭＣＡ結紮以外は上記と同じ外科手術を行った動物、(b)対照群：フィブリン接着剤を局所適用した動物、(c)ＳＳＣ単独群：ＳＳＣ(１０６細胞)局所適用、および(d)ＳＳＣ(１０６細胞)-フィブリン接着剤群：ＳＳＣ(１０６細胞)を含むフィブリン接着剤局所適用。全例において局所適用はシリンジを用い、神経を含む領域をＳＳＣを含む、または含まない接着剤で覆うことにより行った。
【００２４】
この実験で使用し、またＣＮＳ組織の接着剤として習慣的に使用されているフィブリン接着剤〔Beriplast P(商標)、ZLB ベーリング、ドイツ〕は、使用前にフィブリノーゲン(100 mg/ml)とアプロチニン溶液(200 KIU/ml)を混合して調製された。それからその溶液を塩化カルシウム(8 mM)と外科領域で混合し接着性包帯を生成する。脳梗塞組織へ局所適用される溶液の最終体積は20 μlであった。
１時間の局限的脳虚血と５週間の再灌流の後、ラットを麻酔して速やかに断頭し死亡させた。脳を除去してＭＣＡの組織構造、出血や感染の兆候を目視検査してから、冷却した生理食塩水に１０分間沈め、脳マトリクススライサー〔JACOBOWITZ Systems, Zivic-Miller Laboratories INC、アリソンパーク、米国〕を用いて標準的な冠状切片(各厚さ2 mm)に切断した。切片を生体染色色素、塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム(2%ＴＴＣ、シグマ、米国)中に、暗所、37℃で30分間おき、続いて室温で終夜10%ホルマリン液中においた。ＴＴＣ染色〔チェン等(S.T. Chen et al.), 1986, Stroke 17: 738-743〕により明確に視覚化された梗塞組織の輪郭と左右の脳半球の輪郭が、画像解析器(カラーイメージスキャナー、エプソン)を使用して各切片の後面に示され、画像解析システム（AIS ソフトウェア、Imaging research INC、カナダ）と結合してパーソナルコンピュータ(AMD K6-2 3D 400)上で作動させた。反対側の脳半球から非傷害の同側脳半球領域を控除することで梗塞領域を測定した。梗塞体積は、切片あたりの梗塞領域の総和に切片の厚みを乗じて計算した。外科手術者およびイメージ解析実施者には各動物の処置を教えなかった。
【００２５】
ＳＳＣ-フィブリン接着剤群、ＳＳＣ単独群および対照群において、右ＭＣＡ閉塞の領域から再現可能な脳梗塞が得られた。対照群の梗塞体積(145.8±10.1 mm３)と比較して、ＳＳＣ-フィブリン接着剤群におけるＦＣＩ傷害後５週の最後の梗塞体積は有意に減少した(88.1±13.8 mm３, P<0.05)がＳＳＣ単独群では認められなかった(152.0±21.9 mm３)（図１）。
結果は、ＦＣＩ傷害の後脳梗塞組織に対してフィブリン接着剤とともにＳＳＣを局所適用すると、梗塞の総体積が対照群およびＳＳＣ単独群と比較してそれぞれ40%および42%減少することを示した（図１）。
【００２６】
実施例２
行動試験
ＦＣＩ傷害を与えたラットにＳＳＣを投与してから１、２、３および４週間後、ロータロッド試験および握力試験により行動測定を行った。
ロータロッド試験
ラット虚血傷害に続く運動障害を評価するため、加速ロータロッドを用いた〔ハム等(R.J. Hamm et al.), 1994, J. Neurotrauma 11: 187-196〕。加速ロータロッドの横木にラットを置いて動物がロータロッド上に留まる時間を測定した。速度は５分間の間に4 rev/minから40 rev/minへゆっくりと上昇させた。各動物が横木から落下したときの時刻を秒単位で記録した。各動物につき連続３回の試験をした。
【００２７】
図２は四群のロータロッド試験の結果を示す。動物がロータロッドに留まる時間は、外科手術前の４群の間に有意差はなかった。虚血のない偽手術動物はＦＣＩ傷害の後、他の群よりも有意に長い時間ロータロッド上に留まった。
【００２８】
握力試験
この握力試験はベルテリとミラの方法の変法である〔ベルテリとミラ(J.A. Bertelli and J.C. Mira), 1995, J. Neurosci. Methods 58: 151-155〕。握力の評価のため、針金の棒を通常の電子秤に結合した。片足ずつ、両方の前足を試験した。試験しない前足は粘着テープで包み一時的に握ることができないようにし、試験する前足はフリーにした。ラットに棒を持たせ、動物がグリップを離すまで力を加えつつその尾を持って吊り下げ、握力を記録した。
四群の握力試験に対する効果を図３に示す。四群中、右ＭＣＡ閉塞前のラット左前足握力、および右ＭＣＡ閉塞前後のラット右前足握力の平均握力に有意差はない。握力の平均値は対照群、ＳＳＣ単独群およびＳＳＣ-フィブリン接着剤群においてそれぞれ基準線に対し、ＳＳＣ投与一週間後で59%、53%および75%、しかしＳＳＣ適用四週間後では58%、63%および94%(対照群に対してp<0.05)であった。これらの結果はＳＳＣ-フィブリン接着剤の投与がＦＣＩ傷害後のラットの握力改善に関連していることを示した。
【００２９】
実施例３
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)解析
ＦＣＩ傷害５週間後の神経再生およびＳＳＣ分化の確認のため、ヒト・グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ＨＧ３ＰＤＨ)を用いたＲＴ-ＰＣＲ解析を行った。
製造者(Qiagen; Valencia, CA; http://www.qiagen.com)の記載に従いＲＮイージー精製系を利用して、各群の半数の動物の脳から総ＲＮＡを調製した。オリゴ-ｄＴプライマーの存在下、42℃でモロニーのマウス白血病ウィルス逆転写酵素を用いて総ＲＮＡ(１μg)を逆転写した。ＨＧ３ＰＤＨ遺伝子につき、公になっているｃＤＮＡ配列からデザインした次の特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った；
【００３０】
センス 5′-GGCTGGGACTCATGGAGAT-3′ (配列番号 NO:1)
アンチセンス 5′-CGGGTAAGTCGTTGAGAAAG-3′ (配列番号 NO:2)
次のプライマーを用いてネストＰＣＲを行った；
センス 5′-TCTTGGAGAGCTGTGGTGTTG-3′(配列番号 NO:3)
アンチセンス 5′-GTTACCTGAAAGGACTGC-3′ (配列番号 NO:4)
加熱プロフィールは95℃１分間、60℃１分間、および72℃２分間とした。増幅サイクルはすべて35とした。起こり得るゲノムＤＮＡの汚染を排除するためＰＣＲを逆転写のない反応にも適用した。増幅した相補的ＤＮＡを3.5%ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に供し銀染色により視覚化した。
【００３１】
ＦＣＩ傷害後５週間の再灌流で、フィブリン接着剤中のＳＳＣ(細胞数１０６)を局所適用した動物(ＦＣＩ傷害の一週間後に適用；ＳＳＣ-フィブリン接着剤群)の脳中にＨＧ３ＰＤＨが見出された。しかしながら、対照群およびＳＳＣ単独群にはＨＧ３ＰＤＨは見られなかった（図４）。
上記実施例に示すとおり、ＳＳＣを含むフィブリン接着組成物の虚血脳への局所投与は慢性的ＦＣＩ傷害の後四週間の末には有意にＭＣＡ閉塞ラットの梗塞体積を減少させ、また運動能力を有意に改善させる一方、対照群では慢性的な局限的脳虚血後のラットで神経保護効果は示されなかった。データは、本発明のフィブリン接着組成物がＭＣＡ閉塞からの脳虚血の治療と、運動機能の回復の促進に有効であることを示す。
【００３２】
実施例４
ＳＳＣおよびＧＤＮＦを含むフィブリン接着組成物
以下の試験は、ＳＳＣのみならずＧＤＮＦをも含むフィブリン接着組成物の治療効果を調べるために行った。
梗塞体積解析
実施例１に記載の通り、ＧＤＮＦ-フィブリン接着剤群、ＳＳＣ-フィブリン接着剤群、ＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤群および対照群の右ＭＣＡ閉塞領域から、再現性のある脳梗塞が得られた。ＧＤＮＦ-フィブリン接着剤群およびＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤群においては、1 mgのＧＤＮＦ〔RBI, Natick(登録商標)、マサチューセッツ州、米国〕をフィブリノーゲンとアプロチニンを含む溶液と混合し、そしてそれぞれさらにＳＳＣと混合しまたは混合しなかった。上記実施例１に記載の通り、種々の群の接着剤を局所的に神経に投与した。
図５は１時間のＭＣＡ閉塞および５週間の再灌流の後における、ＴＴＣ染色により評価した梗塞体積を示す。ＧＤＮＦ-フィブリン接着剤群、ＳＳＣ-フィブリン接着剤群およびＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤群の梗塞体積は、対照群と比較して有意に減少した。各試験群は６匹のラットで構成した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較した。
【００３３】
ロータロッド試験
ロータロッド試験は実施例２と同様にして行った。図６は五つの群のロータロッド試験の結果を示す。結果はロータロッド試験に充てられた時間（秒）で示す。動物がロータロッド上に留まった時間は外科手術前には五群の間に有意差はなかった。虚血のない偽手術動物はＦＣＩ傷害後の他の群よりも有意に長時間、ロータロッド上に留まった。
【００３４】
握力試験
握力試験は実施例２と同様にして行った。五群のＦＣＩ傷害後のラットの(A)右前肢(B)左前肢の握力試験の効果を図７に示す。「０週」はＧＤＮＦ、ＳＳＣまたはＧＤＮＦ＋ＳＳＣを局所適用した時を示す。五群の間において、右ＭＣＡ閉塞前のラット左前肢または右ＭＣＡ閉塞前後のラット右前肢の平均握力に有意差はなかった。ＧＤＮＦ-フィブリン接着剤群、ＳＳＣ-フィブリン接着剤群およびＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤群において、ラット左前肢の握力はＧＤＮＦ、ＳＳＣまたはＧＤＮＦ＋ＳＳＣの投与から１週間、２週間、３週間および４週間後、対照群と比較して優位に増加した。各試験群は６匹のラットで構成した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較した。
上記の結果はＧＤＮＦ、ＳＳＣまたはＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤の局所投与がＦＣＩ傷害後のラット握力改善と関連していることを示した。
【００３５】
ウィショウ(Whishaw)到達試験
ＦＣＩ傷害による神経損傷の機能回復を促進する、ＳＳＣ＋ＧＤＮＦを含むフィブリン接着組成物の能力をさらに調べるためウィショウ到達試験を行った。
ウィショウ到達試験はコルブとシオーの変法である〔コルブとシオー(B. Kolb and J. Cioe), 2000, Neuropharmacology 39(5): 756-64〕。訓練と試験のためラットの食餌を制限して体重85％とした。端から端まで9 mm離れた2 mmの格子で構成される前面と床のある試験用ケージ(10×18×10 cm 高さ)内に各動物を入れた。幅4-cm、深さ5-cmのトレイに45 mgのペレット状餌を入れてそれぞれの箱の前に取り付けた。ラットは格子の隙間から前肢を伸ばして、餌をつかみ引き入れる必要がある。トレイはランナー上に取り付けられ、ケージから0.5cm引っ込められていて、ラットは餌をケージ内にすくい取ることができない。もし、動物がペレットをトレイ外にかき取ろうとすればペレットは隙間に落ちてしまう。ラットが肢をトレイ内に伸ばし、餌のペレットに触れたときにのみ、その試みをスコア化する。ラットが肢をトレイ内に伸ばしてもペレットに触れないときは、スコア化しない。
【００３６】
ＦＣＩ傷害後の五群のラットのウィショウ到達試験に及ぼす効果を図８に示す。「０週」はＧＤＮＦ、ＳＳＣまたはＧＤＮＦ＋ＳＳＣを局所適用した時を示す。ＧＤＮＦ-フィブリン接着剤群およびＳＳＣ-フィブリン接着剤群において、右ＭＣＡ閉塞前後のラットの試験で有意差はない。ＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤群においては、試験ラットのスコアはＧＤＮＦ＋ＳＳＣの投与から１週間、２週間、３週間および４週間後、対照群と比較して有意に増加した。各試験群は６匹のラットで構成した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較した。
先にその開示を具体的に援用しなかった刊行物は、ここで参考のために援用する。
その広い発明概念から逸脱することなく上記の態様に変化を加え得ることは当業者により十分理解される。それ故、本発明は開示された個々の態様に限定されることなく、特許請求の範囲に記載された本発明の精神及び範囲の範疇における変法を含むことを意図すると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム(ＴＴＣ)生体染色による、中大脳動脈(ＭＣＡ)閉塞の１時間後および再灌流５週間後に評価した梗塞体積を示す。篩過幹細胞(ＳＳＣ)-フィブリン接着剤群の梗塞体積は対照群およびＳＳＣ単独群と比較して有意に減少した。各実験群はラット６匹より構成した。結果は平均±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と、#, p<0.05はＳＳＣ単独群と比較した。
【００３８】
【図２】図２は、局限的脳虚血(ＦＣＩ)傷害後のラットに対するロータロッド試験におけるＳＳＣの効果を示す。結果はロータロッド試験上に留まった時間(秒)で表す。虚血のない偽手術動物は他の群よりも有意に長い時間ロータロッドに留まった。「０週」はＳＳＣが局所投与された時を表す。ＳＳＣ-フィブリン接着剤群において、ラットがロータロッド上に留まった時間はＳＳＣの投与から１週間、２週間、３週間および４週間後、対照群およびＳＳＣ単独群と比較して有意に増加した。各試験群は６匹のラットで構成した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較し、#, p<0.05はＳＳＣ単独群と比較した。
【００３９】
【図３】図３は図３Ａと図３Ｂよりなり、ＦＣＩ傷害後のラット右前肢(図３Ａ)および左前肢(図３Ｂ)の握力に及ぼすＳＳＣの効果を示す。「０週」はＳＳＣが局所投与された時を表す。四群の右前肢握力の間に有意差はなかった。ＳＳＣ-フィブリン接着剤群において、ラットの左前肢握力はＳＳＣの投与から１週間、２週間、３週間および４週間後、対照群およびＳＳＣ単独群と比較して有意に増加した。各試験群は６匹のラットで構成した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較した。#, p<0.05はＳＳＣ単独群と比較した。
【００４０】
【図４】図４はヒト・グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ＨＧ３ＰＤＨ)についての代表的なＰＣＲ解析結果を示す。フィブリン接着剤中のＳＳＣ（細胞数１０６）をＦＣＩ傷害の１週間後に局所投与した動物でＦＣＩ傷害の後５週間の再灌流を行った。陽性対照はＳＳＣより抽出したヒトＤＮＡ60 pgである。３回の試験を実施してその代表例を示す。
【００４１】
【図５】図５はＭＣＡ閉塞１時間および再灌流５週間後にＴＴＣ生体染色により評価した梗塞体積を示す。グリア細胞株由来栄養因子(ＧＤＮＦ)-フィブリン接着剤群、ＳＳＣ-フィブリン接着剤群、およびＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤群の梗塞体積は、対照群と比較して有意に減少した。各試験群は６匹のラットで構成した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較した。
【００４２】
【図６】図６はＦＣＩ傷害後のラットのロータロッド試験においてＳＳＣ＋ＧＤＮＦが及ぼす効果を示す。結果はロータロッド試験に費やされる時間(秒)で表す。手術前において動物がロータロッド上に留まる時間は五群の間に有意差はなかった。虚血のない偽手術群はＦＣＩ傷害後の他の群よりも有意に長い時間ロータロッド上に留まった。
【００４３】
【図７】図７は図７Ａと図７Ｂよりなり、ＦＣＩ傷害後のラットの右前肢(図７Ａ)および左前肢(図７Ｂ)の握力に及ぼすＳＳＣ＋ＧＤＮＦの効果を示す。「０週」はＧＤＮＦ、ＳＳＣおよびＳＳＣ＋ＧＤＮＦが局所投与された時を示す。五群の間において、右ＭＣＡ閉塞前のラット左前肢、または右ＭＣＡ閉塞前後のラット右前肢の握力に有意差はなかった。ＧＤＮＦ-フィブリン接着剤群、ＳＳＣ-フィブリン接着剤群、およびＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤群においては、ラット左前肢の握力はＧＤＮＦ、ＳＳＣまたはＳＳＣ＋ＧＤＮＦの投与２、３、および４週間後、対照群と比較して有意に増加した。各試験群は６匹のラットで構成した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較した。
【００４４】
【図８】図８は図８Ａと図８Ｂよりなり、ＦＣＩ傷害後のラットの右前肢(図７Ａ)および左前肢(図７Ｂ)のウィショウ到達試験に及ぼすＳＳＣ＋ＧＤＮＦの効果を示す。「０週」はＧＤＮＦ、ＳＳＣおよびＳＳＣ＋ＧＤＮＦが局所投与された時を示す。ＧＤＮＦ-フィブリン接着剤群およびＳＳＣ-フィブリン接着剤群において、右ＭＣＡ閉塞前後のラットの試験に有意差はなかった。ＧＤＮＦ-ＳＳＣ-フィブリン接着剤群においては、ラットのテストのスコアは、ＳＳＣ＋ＧＤＮＦの投与１、２、３、および４週間後、対照群と比較して有意に増加した。各試験群は６匹のラットで構成した。結果は平均値±ＳＥＭで表し、*, p<0.05は対照群と比較した。
【出願人】 【識別番号】５０７０９９２１７
【氏名又は名称】ヘンリッチ・チェン
【氏名又は名称原語表記】Ｈｅｎｒｉｃｈ Ｃｈｅｎｇ
【出願日】 平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【代理人】 【識別番号】１０００６８５２６
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 恭生

【識別番号】１００１００１５８
【弁理士】
【氏名又は名称】鮫島 睦

【識別番号】１０００７６５２１
【弁理士】
【氏名又は名称】坪井 有四郎

【識別番号】１００１３８９００
【弁理士】
【氏名又は名称】新田 昌宏
【公開番号】 特開２００８−６３３２３（Ｐ２００８−６３３２３Ａ）
【公開日】 平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【出願番号】 特願２００７−１９４６１６（Ｐ２００７−１９４６１６）