| 【発明の名称】 |
ハプテン修飾された腫瘍細胞抽出物及び癌を治療又はスクリーニングするための方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】デイヴィッド バード
【氏名】ローレンス・シー アイゼンローアー
【氏名】エドムンド ラッティム
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| 【要約】 |
【課題】ハプテン修飾された腫瘍細胞抽出物及び癌を治療又はスクリーニングするための方法を提供すること。
【構成】癌細胞もしくは癌細胞膜、またはそのペプチドから調製したハプテン修飾した腫瘍細胞抽出物を含む新規組成物を開示する。本発明は、Ｔ細胞リンパ細胞を刺激し、癌治療に有用であるハプテン修飾された腫瘍細胞抽出物の治療効果量を含む組成物を提供する。さらに治療効果判定を目的とした癌のサイトカイン産生をスクリーニングする方法であって、患者組織サンプルから得たサイトカイン特異的核酸を増幅して検出可能な信号を得る方法も開示する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の、組成物。
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【発明の詳細な説明】【背景技術】
【０００１】
【数１】
【０００２】
【数２】
【０００３】
【数３】
【０００４】
【数４】
【０００５】
【数５】
【０００６】
【数６】
【０００７】
【数７】
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
【０００９】
【化１】
【００１０】
【化２】
【００１１】
【化３】
【００１２】
【化４】
【００１３】
【化５】
【００１４】
【化６】
【００１５】
【数８】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
【数１１】
【００１７】
【数１２】
【００１８】
【数１３】
【００１９】
【数１４】
【００２０】
【数１５】
【００２１】
【数１６】
【００２２】
【数１７】
【００２３】
【数１８】
【００２４】
【数１９】
【００２５】
【数２０】
【００２６】
【数２１】
【００２７】
【数２２】
【００２８】
【数２３】
【００２９】
【数２４】
【００３０】
【数２５】
【００３１】
【数２６】
【００３２】
【数２７】
【００３３】
【数２８】
【００３４】
【数２９】
【００３５】
【数３０】
【実施例】
【００３６】
実施例１
【００３７】
【数３１】
【００３８】
【数３２】
【００３９】
【数３３】
【００４０】
【数３４】
【００４１】
【数３５】
【００４２】
【数３６】
【００４３】
【数３７】
【００４４】
【数３８】
【００４５】
【数３９】
【００４６】
【数４０】
【００４７】
【数４１】
【００４８】
【数４２】
【００４９】
【数４３】
【００５０】
【数４４】
【００５１】
【数４５】
【００５２】
【数４６】
【００５３】
【数４７】
【００５４】
【数４８】
【００５５】
【数４９】
【００５６】
【数５０】
【００５７】
【数５１】
【００５８】
【数５２】
【００５９】
【数５３】
【００６０】
【数５４】
【００６１】
【数５５】
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬおよび黒色腫細胞へのＤＴＨ発現の動態を示す図である。ＤＮＰワクチンで治療した転移性黒色腫患者を、ＤＮＰ修飾ＰＢＬ（ＬＹ）または転移性塊から分離したＤＮＰ修飾黒色腫細胞（ＭＥＬ）で連続的に皮膚試験した。それぞれのバーは、各時点での患者群の平均ＤＴＨ反応を示す。１１９日に、ＰＢＬに対する反応のみを測定した。サンプル規模：０日、１４日、６３日、Ｎ＝８４、１１９日、Ｎ＝５７、１７５日、Ｎ＝４２、２３１日、Ｎ＝３５。
【図２】図２は、ＤＮＰに対する抗体反応を示す図である。各時点で得られた血清を、ＥＬＩＳＡを用いたＤＮＰに対する抗体（総免疫グロブリン）について試験した。滴定は次のように規定した：（サンプルのピークＯＤ）Ｘ（陽性対照のピークＯＤの半分に等しいＯＤを示した希釈の逆数）。
【図３】図３は、ＤＮＰ修飾自己由来リンパ球に対するＰＢＬの増殖性反応を示す図である。ＰＢＬはそれぞれのＤＴＨ反応のピークでＤＮＰワクチンを投与した患者４例から得た。ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ−ＤＮＰ）の増殖能について、非修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ）を対照として細胞を試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図４】図４は、ＤＮＰ修飾リンパ球に対する増殖性反応の動態を示す図である。ＤＮＰワクチンを投与しながら患者ＤＭ２から連続的にＰＢＬを採集した。それらを凍結保存したのち、ＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬ（自己ＬＹ−ＤＮＰ）に対する増殖性反応について同時に全サンプルを試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図５】図５は、ＤＮＰ修飾細胞に対する増殖性反応の特異性を示す図である。非修飾（自己ＬＹ）、ＤＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＴＮＰ）のいずれかの自己由来ＰＢＬ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）またはＤＮＰ修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）のいずれかの培養自己由来黒色腫細胞に対する増殖性反応について、患者２例からのＰＢＬを試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図６】図６は、増殖（ｅｘｐａｎｄｅｄ）Ｔ細胞の特異性分析を示す図である。患者ＤＭ２からのＰＢＬをIL2において増殖させ、自己由来ＤＮＰ修飾Bリンパ芽球細胞で繰り返し刺激した。それらを非修飾（自己ＬＹ）、ＤＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＴＮＰ）のいずれかの自己由来ＰＢＬ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）またはＤＮＰ修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）のいずれかの培養自己由来黒色腫細胞、ならびに同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＰＢＬ（同種異系ＬＹ）に対する増殖性反応について試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図７】図７は、ＤＮＰ修飾自己由来細胞に対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の反応を示す図である。陽性パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）により増殖Ｔ細胞をＣＤ８濃縮群またはＣＤ４濃縮群に分離した。次にそれらを非修飾（自己ＬＹ）、ＤＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＤＮＰ）、またはＴＮＰ修飾（自己ＬＹ−ＴＮＰ）のいずれかの自己由来ＰＢＬ、および非修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）またはＤＮＰ修飾（ＭＥＬ−ＤＮＰ）のいずれかの培養自己由来黒色腫細胞に対する増殖性反応について試験した。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図８】図８は、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す図である。ＤＮＰ反応性Ｔ細胞系（親）、および限界希釈での平板培養により得られた３つの継代培養（２Ｆ８、ＩＤ７、ＩＣ２）を自己由来ＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞と共に１８時間保温した。上清を採集し、γインターフェロン（ＩＦＮ）およびＩＬ４について分析した。
【図９】図９は、抗ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体によるＴ細胞反応の遮断を示す図である。自己由来ＤＮＰ修飾Ｂリンパ芽球細胞で拡張ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し、１８時間後にγインターフェロンについて培養液を分析した。次のうちのいずれか１つで刺激細胞をプレインキュベートした：抗体なし（なし）、非特異的マウスＩｇＧ（非特異的）、モノクローナル抗体Ｗ６／３２（クラスＩ）、またはモノクローナル抗体Ｌ２３４（クラスＩＩ）。
【図１０】図１０は、Ｔ細胞反応のＭＨＣ制限を示す図である。別の患者４例からのＤＮＰ修飾自己由来ＰＢＬおよびＤＮＰ修飾同種異系ＰＢＬに応じた増殖能について増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ６、ＢＷ６）を試験した。同種異系刺激物質のうち３つを図に示したように１つまたはそれ以上のクラスＩ座で適合させ、第４の刺激物質は完全に不適合させた（Ａ２４、Ａ２６、Ｂ４４、Ｂ６３）。６日目に１２５ＩＵＤＲで培養液をパルスした。
【図１１Ａ】図１１は、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞の細胞毒性を示す図である。自己由来（自己）または同種異系クラスＩ不適合（同種）のいずれかの黒色腫細胞を、６時間５２Ｃｒアッセイにおける標的として用いた。エフェクター細胞は拡張ＣＤ８＋、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞であった。図１１Ａ−標的細胞を各濃度のＤＮＢＳまたはＴＮＢＳでハプテン化した。エフェクター：標的細胞比は２０：１であった。
【図１１Ｂ】図１１は、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞の細胞毒性を示す図である。自己由来（自己）または同種異系クラスＩ不適合（同種）のいずれかの黒色腫細胞を、６時間５２Ｃｒアッセイにおける標的として用いた。エフェクター細胞は拡張ＣＤ８＋、ＤＮＰ反応性Ｔ細胞であった。図１１Ｂ−２．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＢＳまたはＴＮＢＳでハプテン化した標的細胞を一連のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でエフェクターと混合した。
【図１２】図１２は、ＤＮＰワクチンおよび非ハプテン化対照ワクチンで治療した手術後数ヶ月において腫瘍が認められない患者の割合を示す図である。
【図１３】図１３は、それぞれ１０画分の５群にプールしたＨＰＬＣ画分を示す図である。ジニトロフェニル修飾黒色腫細胞（ＤＮＰ−ＭＥＬ）またはジニトロフェニル修飾Ｂ細胞（ＤＮＰ−ＬＹ）から誘導したペプチドはプール２において刺激性であった。
【図１４Ａ】図１４は、ＩＦＮγおよびＩＬ１０のｍＲＮＡを発現するＤＮＰワクチン免疫化患者からの炎症性皮下黒色腫結節を示す図である。図１４−１はＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２は皮下病変のＨ＆Ｅ染色切片を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、ＩＦＮγおよびＩＬ１０のｍＲＮＡを発現するＤＮＰワクチン免疫化患者からの炎症性皮下黒色腫結節を示す図である。図１４−１はＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２は皮下病変のＨ＆Ｅ染色切片を示す。
【図１５Ａ】図１５は、ＩＦＮγではなくＩＬ１０のｍＲＮＡを発現する免疫化されていない患者からのリンパ節転移を示す図である。図１５−１は、ＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２はリンパ節転移のＨ＆Ｅ染色切片を示す（４０ＯＸ）。
【図１５Ｂ】図１５は、ＩＦＮγではなくＩＬ１０のｍＲＮＡを発現する免疫化されていない患者からのリンパ節転移を示す図である。図１５−１は、ＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、２＝β−アクチン、３＝ＩＦＮγ、４＝ＩＬ４、５＝ＩＬ１０）により決定されるサイトカインのｍＲＮＡを示し、図１４−２はリンパ節転移のＨ＆Ｅ染色切片を示す（４０ＯＸ）。
【図１６】図１６は、ヒト黒色腫転移において発現したＩＬ１０ ｍＲＮＡのゲルを示す図である。サイトカインのｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ（レーン１＝サイズマーカー、Ｃ＝ＩＬ１０ ｃＤＮＡ対照、１−７＝患者サンプル）により決定された。
【図１７】図１７は、黒色腫細胞により発現されたＩＬ１０ ｍＲＮＡのゲルを示す図である。図１７は、代表的腫瘍生検および誘導細胞系からのＲＴ−ＰＣＲにより発現されるＩＬ１０ ｍＲＮＡを示す（レーン１＝サイズマーカー、２＝ＩＬ１０ ｃＤＮＡ、３＝腫瘍生検、４＝腫瘍系）。
【図１８Ａ】図１８は、非炎症性黒色腫生検のパラフィン切片からのｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲである（Ａ＝１００Ｘ、Ｂ＝４００Ｘ）。
【図１８Ｂ】図１８は、非炎症性黒色腫生検のパラフィン切片からのｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲである（Ａ＝１００Ｘ、Ｂ＝４００Ｘ）。
【００６３】
（配列表）
【００６４】
【数５６】
【００６５】
【数５７】
【００６６】
【数５８】
【００６７】
【数５９】
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９７１７７２４２
【氏名又は名称】トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
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| 【出願日】 |
平成１９年１１月１９日（２００７．１１．１９） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００７８２８２
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
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| 【公開番号】 |
特開２００８−５６７０４（Ｐ２００８−５６７０４Ａ） |
| 【公開日】 |
平成２０年３月１３日（２００８．３．１３） |
| 【出願番号】 |
特願２００７−２９９８６５（Ｐ２００７−２９９８６５） |
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