| 【発明の名称】 |
コルチコステロイド誘導オステオペニアの処置法 |
| 【発明者】 |
【氏名】ブライアン・エイチ・ビッカリー
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| 【要約】 |
【課題】哺乳動物におけるコルチコステロイド誘導オステオペニアの予防および処置に有用な、パラチロイドホルモンＰＴＨ、パラチロイドホルモン関連ペプチドＰＴＨｒｐの合成ポリペプチド類似体、ＰＴＨまたはＰＴＨｒｐの生理活性のある切断同族体または類似体、およびそれらの医薬的に許容され得る塩類を提供する。
【構成】アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）が親水性アミノ酸（Ｈａａ）および脂質親和性アミノ酸（Ｌａａ）から選択され、配列：Ｈａａ（Ｌａａ Ｌａａ Ｈａａ Ｈａａ）２ Ｌａａ の順で並んでいる、パラチロイドホルモンＰＴＨ、パラチロイドホルモン関連ペプチドＰＴＨｒｐの合成ポリペプチド類似体、ＰＴＨまたはＰＴＨｒｐの生理活性のある切断同族体または類似体、およびそれらの医薬的に許容され得る塩類を提供する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルチコステロイド誘導オステオペニアの処置法であって、アミノ酸残基(２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基(２２−３１）が親水性アミノ酸(Ｈaa）および脂質親和性アミノ酸（Ｌaa）から選択され、配列：
Ｈaa (Ｌaa Ｌaa Ｈaa Ｈaa)２ Ｌaa
の順で並んでいる、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）、パラチロイドホルモン関連ペプチド（ＰＴＨrp）の合成ポリペプチド類似体、またはＰＴＨまたはＰＴＨrpの生理的に活性な切断同族体または類似体、またはそれらの塩の各有効量を、それを必要とする対象者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項２】
アミノ酸残基（２２−３１）の配列が、配列番号８５、８６、２６、２７、２８、２９および３０から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドの有効量が、約０.００２μgポリペプチド／患者体重kg／日ないし約１０μgポリペプチド／患者体重kg／日である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）が親水性アミノ酸（Ｈaa）および脂質親和性アミノ酸（Ｌaa）から選択され、配列：
Ｈaa (Ｌaa Ｌaa Ｈaa Ｈaa)２ Ｌaa
の順で並んでいる、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）、パラチロイドホルモン関連ペプチド（ＰＴＨrp）の合成ポリペプチド類似体、またはＰＴＨまたはＰＴＨrpの生理的に活性な切断同族体または類似体、またはそれらの塩の各有効量、および医薬的に許容され得るキャリアーからなる、コルチコステロイド誘導オステオペニアの予防または処置用の医薬組成物。
【請求項５】
アミノ酸残基（２２−３１）の配列が、配列番号８５、８６、２６、２７、２８、２９および３０から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ポリペプチドの有効量が、約０.００２μg／患者体重kgないし約１０μg／患者体重kgである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）が親水性アミノ酸（Ｈaa）および脂質親和性アミノ酸（Ｌaa）から選択され、配列：
Ｈaa (Ｌaa Ｌaa Ｈaa Ｈaa)２ Ｌaa
の順で並んでいる、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）、パラチロイドホルモン関連ペプチド（ＰＴＨrp）の合成ポリペプチド類似体、またはＰＴＨまたはＰＴＨrpの生理的に活性な切断同族体または類似体、またはそれらの塩の各約１μgないし約１０００μg、および医薬的に許容され得るキャリアーからなる、コルチコステロイド誘導オステオペニアの処置用の用量ユニットの医薬組成物。
【請求項８】
アミノ酸残基（２２−３１）の配列が、配列番号８５、８６、２６、２７、２８、２９および３０から選択される、請求の範囲第７項に記載の組成物。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
発明の背景
a）発明の分野
本発明は、パラチロイドホルモンおよびパラチロイドホルモン関連ペプチドのある種の新規類似体の治療上有効量の投与によるコルチコステロイド誘導オステオペニアの処置法に関する。
【背景技術】
【０００２】
b）関連技術の記載
骨粗鬆症は、代謝性骨疾患の最も一般的な形態であり、徴候的骨折段階の骨減少（オステオペニア）と考えることができる。骨粗鬆症は、多くの根元的疾患から続発的に起こり得るが、全ケースの９０％が特発性であると思われる。閉経後の女性は、特に、特発性骨粗鬆症の危険がある（閉経後またはI型骨粗鬆症)。特発性骨粗鬆症の高い危険性のあるその他のグループは、男女いずれかの年輩者である（老人性またはII型骨粗鬆症）。骨粗鬆症は、コルチコステロイド使用、固定または長期間のベッド療養、アルコール中毒、糖尿病、性腺毒性化学療法、過プロラクチン血症、神経性食欲不振、原発性および続発性無月経、および卵巣摘出にも関連している。
【０００３】
様々な形態の骨粗鬆症において、機械的不全の点に到達した骨減少の結果である骨折が、頻繁に起こる。閉経後骨粗鬆症は、手首および背骨の骨折を特徴とするのに対し、大腿骨頸骨折は、老人性骨粗鬆症の方の顕著な特徴であるようである。
【０００４】
骨粗鬆症において骨が減少する機構は、骨格が再生するプロセスの不均衡に関連すると考えられている。このプロセスは、骨改変（リモデリング）と呼ばれる。これは、一連の別個の活性ポケットで起こる。これらのポケットは、骨吸収部位としての所定の骨表面上の骨マトリックス内に自発的に現れる。破骨細胞（骨溶解性または骨吸収性の細胞）は、一般に一定寸法の骨の一部の吸収を担う。この吸収プロセスの次に、骨芽細胞（骨形成細胞）が現れ、次いで、破骨細胞が残した腔に新たな骨を補充するのである。
【０００５】
健康な成人対象者では、破骨細胞および骨芽細胞が形成される速度は、骨形成および骨吸収が均衡であるような速度である。しかしながら、骨粗鬆症では、骨リモデリングプロセスの不均衡が生じ、骨は形成されるよりも早い速度で減少することになる。この不均衡は、加齢につれてほとんどの個体である程度起こるが、閉経後骨粗鬆症または卵巣摘出後の骨粗鬆症では、非常に深刻であり、より若い年齢で起こる。
【０００６】
Adachi等は、Seminars in Arthritis and Rheumatism,22:6,375-84（１９９３年６月）において、コルチコステロイド誘導骨粗鬆症の病態生理学に関する多くの相反するデータにもかかわらず、骨形成における相対的減少および骨吸収における相対的増加があることが全体的に同意されたと報告している。骨折および骨壊死をもたらす骨減少は、コルチコステロイド療法の結果、頻繁に起こる。骨減少がコルチコステロイド療法の最初の６ないし１２カ月以内に迅速に起こり、また骨減少速度とコルチコステロイド用量との間に緊密な関係があるらしいという証拠がある。人間は、同程度にコルチコステロイドの作用を受け易い。骨折および骨壊死の推定罹病率は、３０から５０％の範囲である。
【０００７】
骨粗鬆症の処置は、更なる骨減少の遅延またはより望ましくは骨量の正味増加の産出のいずれかを目標として多くの試みがなされてきた。エストロゲンおよびビスホスホネート類などのある種の薬剤類は、骨粗鬆症における更なる骨減少を遅らせるようである。骨減少を遅らせる薬剤類は、骨吸収継続時間と骨形成継続時間が相違するため、骨量を増大(３ないし７％オーダー)するように見える場合もある。しかしながら、この見かけの増大は、時間制限されており、進行性ではなく、また"リモデリング空間”の低減に起因する。更に、吸収と形成が緊密に関係しているため、骨吸収を妨げる処置は、結局、骨形成も妨げることになる。
【０００８】
パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）による処置が骨ターンオーバー増大および陽性カルシウム均衡の両方を導くことが示唆されている。しかしながら、ヒトの臨床治験では、海綿骨（trabecular bone）の増加が皮質骨（cortical bone）の減少により相殺されるので骨全体での正味増加はないことが示された。
【０００９】
Hefti等は、Clinical Science 62,389-396(1982)において、ｂＰＴＨ（１−８４）またはｈＰＴＨ（１−３４）のいずれかを毎日皮下投与すると、骨正常雌ラットおよび骨粗鬆症成体雌ラットにおける個々の骨の全身カルシウムおよび骨灰重量を増大することを報告している。
【００１０】
Liu等は、J.Bone Miner.Res.6:10,1071-1080(1991)において、成体雌ラットの卵巣摘出により、骨芽細胞および海綿破骨細胞数の顕著な増大を伴い、近位脛骨の骨幹端における海綿骨割合の４７％の減少がもたらされたことを指摘している。ｈＰＴＨ（１−３４）の毎日皮下注射は、海綿骨の減少を完全に一変させ、模擬操作対照の海綿骨量を上回る海綿骨量をもたらした。
【００１１】
Hock等は、J.Bone Min.Res.7:1,65-71(1992)において、ｈＰＴＨ（１−３４）を健康成体雄ラットに１２日間毎日皮下注射したところ、海綿骨および皮質骨カルシウムおよび乾燥重量を増大したことを報告している。全骨量、海綿骨容量、海綿骨厚および数、および骨芽細胞表面が増大した。
【００１２】
哺乳類パラチロイドホルモン、例えば、ヒト（ｈＰＴＨ）、ウシ（ｂＰＴＨ）、およびブタ（ｐＰＴＨ）は、８４アミノ酸残基の単一ポリペプチド鎖であり、分子量およそ９５００を有する。生物学的活性は、最低限必要とされると思われる残基（１−３４）を有するＮ−末端部分に関連する。
【００１３】
ヒトＰＴＨのＮ−末端セグメントは、ウシおよびブタのホルモンのＮ−末端セグメントとは、それぞれほんの３および２アミノ酸残基で異なる。
ｈＰＴＨ（１−３４）：
【化１】
ｂＰＴＨ（１−３４）：
【化２】
ｐＰＴＨ（１−３４）：
【化３】
【００１４】
ＰＴＨの主な機能は、細胞外流体中のＣa２＋濃度を一定に維持するように働く適応変化を誘導することである。ＰＴＨは、腎臓において、カルシフェジオールからカルシトリオールへの変換を刺激するのと同時に尿からのＣa２＋の尿細管(tubular）再吸収を増大させるように作用し、腸からのＣa２＋吸収を担う。優れた作用の１つは、骨からのＣa２＋移動を促進することである。ＰＴＨは、骨において、Ｃa２＋およびリン酸塩の再吸収速度を増大させるように作用する。ＰＴＨは、破骨細胞による骨再吸収速度を刺激し、間葉細胞から破骨細胞への分化速度を増大させ、さらに後者の細胞の半減期を延ばす。ＰＴＨ作用の延長に伴い、骨形成骨芽細胞数もまた増大するため、骨ターンオーバーおよびリモデリング速度が上昇する。しかしながら、個々の骨芽細胞は、正常よりも低活性であるようである。
【００１５】
Rosenblatt等は、米国特許第４,４２３,０３７号、第４,９６８,６６９号および第５,００１,２２３号において、Ｎ−末端（１−６）アミノ酸の欠失およびＰhe７、Ｍet８．１８、およびＧly１２の選択的置換により得られたＰＴＨアンタゴニスト類を開示している。報告されたところでは、Ｔyr３４−ＮＨ２はこれらの化合物類の活性および安定性を増強した。
【００１６】
パラチロイドホルモン関連ペプチド（ＰＴＨrp）、１４０＋アミノ酸タンパク質、およびそれらのフラグメントは、ＰＴＨの主な生物学的作用を再現する。ＰＴＨrpは、ヒトおよび動物腫瘍の多く、およびその他の組織により同化され、悪性疾患の高カルシウム血症における役割を果すことができる。ｈＰＴＨrp（１−３４）の配列は、下記のとおりである：
【化４】
【００１７】
ｈＰＴＨとｈＰＴＨrpとの配列相同性は、主にＮ末端１３残基に限られており、そのうちの８残基が同一であって、ｈＰＴＨの(２５−３４)受容体結合領域の１０アミノ酸のうち１つのみが、ｈＰＴＨrpに保存される。Cohen等は、J.Biol.Chem.266:3,1997-2004(1991)において、ＰＴＨ(１−３４)とＰＴＨrp(１−３４)の配列の多く、特に領域(５−１８)および(２１−３４)は、α−らせん構造をとることを示し、ただし、この構造が生理学的条件下でカルボキシル末端についても同様であるのかどうか多少の疑問は残るとしている。このような二次構造は、脂質相互作用、受容体相互作用、および／または構造安定性に関して重要であり得る。
【００１８】
我々は、骨粗鬆症罹病対象を含む哺乳動物対象者の骨量の回復のための改良治療剤の開発を目的としてＰＴＨおよびＰＴＨrpの類似体を合成した。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
本発明は、コルチコステロイド誘導オステオペニアの処置法を提供するものであり、その方法は、アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）が親水性アミノ酸（Ｈaa）および脂質親和性アミノ酸（Ｌaa）から選択され、配列：
Ｈaa (Ｌaa Ｌaa Ｈaa Ｈaa)２ Ｌaa
の順で並んでいる、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）、パラチロイドホルモン関連ペプチド（ＰＴＨrp）の合成ポリペプチド類似体、またはＰＴＨまたはＰＴＨrpの生理的に活性な切断同族体または類似体、またはそれらの塩の有効量を、それを必要とする対象者に投与することを含む。
【００２０】
一実施態様では、アミノ酸残基の配列（２２−３１）は、配列番号８５、８６、２６、２７、２８、２９および３０から選択される。ポリペプチドの有効量は、約ポリペプチド０.００２μg／患者体重kg／日から約ポリペプチド１０μg／患者体重kg／日である。
【００２１】
また、アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）が親水性アミノ酸（Ｈaa）および脂質親和性アミノ酸（Ｌaa）から選択され、配列：
Ｈaa (Ｌaa Ｌaa Ｈaa Ｈaa)２ Ｌaa
の順で並んでいる、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）、パラチロイドホルモン関連ペプチド（ＰＴＨrp）の合成ポリペプチド類似体、またはＰＴＨまたはＰＴＨrpの生理的に活性な切断同族体または類似体、またはそれらの塩の有効量、および医薬的に許容され得るキャリアーからなる、コルチコステロイド誘導オステオペニアの予防または処置用の医薬組成物も提供する。
【００２２】
一実施態様では、その医薬組成物を、アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）が親水性アミノ酸（Ｈaa）および脂質親和性アミノ酸（Ｌaa）から選択され、配列：
Ｈaa (Ｌaa Ｌaa Ｈaa Ｈaa)２ Ｌaa
の順で並んでいる、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）、パラチロイドホルモン関連ペプチド（ＰＴＨrp）の合成ポリペプチド類似体、またはＰＴＨまたはＰＴＨrpの生理的に活性な切断同族体または類似体、またはそれらの塩の約１μgから約１０００μg、および医薬的に許容され得るキャリアーからなる、コルチコステロイド誘導オステオペニアの処置用の用量ユニットで提供する。
【００２３】
この配列タイプの具体的な例示態様をＰＴＨ、ＰＴＨrp、およびＰＴＨおよびＰＴＨrpの生理的に活性な切断類似体および同族体中に挿入すると、得られたポリペプチドは、有効な骨リモデリング剤である。
一態様では、本発明は、アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）の配列が：
ａ）
【化５】
配列中、
Ｘaa１およびＸaa４は、独立して、Ｇlu、Ｇlu(ＯＣＨ３)、Ｈis、またはＰheであり；Ｘaa２はＬeuまたはＰheであり；Ｘaa５はＬysまたはＨisであり；Ｘaa７およびＸaa１０は、独立して、ＬeuまたはIleであり；Ｘaa８がＡla、ＡrgまたはＧluであり；さらにＸaa９がＬysまたはＧluである（配列番号８５)；好ましくは、
【化６】
配列中、
ＸaaはＧluまたはＡrgである（配列番号２６）；
ｂ）
【化７】
配列中、
Ｘaa１およびＸaa４は、独立して、Ｇlu、Ｇlu(ＯＣＨ３)、Ｈis、またはＰheであり；Ｘaa２はＬeuまたはＰheであり；Ｘaa８がＧlu、ＬysまたはＬys(COCH２PEGX）であり、PEGXが分子量１００ないし１０,０００のポリ(エチレングリコールメチルエーテル)基である（配列番号８６)；好ましくは、
【化８】
配列中、
ＸaaはＧlu、Ｌys、またはＬys(COCH２PEGX）であり、PEGXが分子量１００ないし１０,０００のポリ(エチレングリコールメチルエーテル)基である（配列番号２７）；
ｃ）
【化９】
（配列番号２８）；
ｄ）
【化１０】
（配列番号２９）；
ｅ）
【化１１】
（配列番号３０）；
から選択される、ＰＴＨの類似体、ＰＴＨrp、およびＰＴＨおよびＰＴＨrpの生理的に活性な切断類似体および同族体、またはそれらの塩類によるコルチコステロイド誘導オステオペニアの処置法を提供する。
【００２４】
その他の態様では、本発明は、アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）の配列が：
ａ）
【化１２】
配列中、
Ｘaaは、Ｇlu、またはＡrgである（配列番号２６)；
ｂ）
【化１３】
配列中、
Ｘaaは、Ｇlu、ＬysまたはＬys(COCH２PEGX）であり、PEGXが分子量１００ないし１０,０００のポリ(エチレングリコールメチルエーテル)基である（配列番号２７）；
ｃ）
【化１４】
（配列番号２８）；
ｄ）
【化１５】
（配列番号２９）；
ｅ）
【化１６】
（配列番号３０）；
から選択される、ＰＴＨの類似体、ＰＴＨrp、およびＰＴＨおよびＰＴＨrpの生理的に活性な切断類似体および同族体、またはそれらの塩類の医薬組成物を提供する。
【００２５】
また、上記化合物類と医薬的に許容され得るキャリアーを混合することからなる、医薬組成物の製法も提供する。
【００２６】
図面の簡単な説明
図１は、本発明のＰＴＨrp（１−３４）類似体のＤＮＡ配列およびそれをコードする合成遺伝子の酵素制限部位を表す。
図２は、ＰＴＨrp（１−３４）類似体遺伝子を組み込むプラスミドの製造の概要である。
図３は、ＰＴＨrp（１−３４）類似体遺伝子の２コピーを組み込むプラスミドの製造の概要である。
図４は、ＰＴＨrp（１−３４）類似体遺伝子の４コピーを組み込むプラスミドの製造の概要である。
【００２７】
発明の詳細な説明
略号および定義
多様な共通のヌクレオチド塩基およびアミノ酸についての１文字または３文字略号は、Pure Appl.Chem.31,639-645(1972)および40,277−290(1974)およびIUPAC-IUB 生化学命名委員会にて推奨されているとおりである。その１文字または３文字略号は次の通りである：
【表１】
【００２８】
略号は、特にＤ−またはＤ,Ｌ−を指定しない限りＬ−アミノ酸を表す。ある種のアミノ酸、例えばグリシンは、天然のものも天然以外のものもアキラルである。ペプチド配列は全て、左側をＮ−末端アミノ酸、右側をＣ−末端アミノ酸として表す。
【００２９】
本明細書で使用した更にその他のアミノ酸および化合物の略号は：
【表２】
【００３０】
“親水性アミノ酸(Ｈaa)”は、ペプチド結合形成に必要なもの以外に少なくとも１つの親水性官能基を有するアミノ酸を表し、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、およびそれらの同族体である。
【００３１】
“脂質親和性アミノ酸(Ｌaa)”は、非電荷の脂肪族または芳香族アミノ酸を表し、例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、またはバリン、およびそれらの同族体である。
【００３２】
本発明の目的には、アラニンは、"両親媒性"、即ち、親水性または脂質親和性のいずれかとして作用できるものとして分類する。
【００３３】
“ＰＴＨまたはＰＴＨrpの生理的に活性な切断同族体または類似体”は、ＰＴＨまたはＰＴＨrpで見られる完全なアミノ酸より少ない配列を有するが、しかし、類似の生理学的応答を誘起するポリペプチドを表す。切断ＰＴＨまたはＰＴＨrpは、類似の生理学的応答を誘起するのに、ＰＴＨまたはＰＴＨrpと完全に相同である必要はない。ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨrp（１−３４）がこのグループの好ましい代表物であるが、これに限定されない。
【００３４】
“両親媒性α−らせん”は、アミノ酸がらせん軸に沿って配向した向かい合わせの極性および非極性面を持つα−らせん構造をとる、ある種のペプチドによって示される二次構造を表す。対象となるポリペプチドがα−らせん構造をとる可能性は、適切なピッチの“シファー−エドマンソン車輪（Schiffer-Edmundson wheel)"(M.SchifferおよびA.B.Edmundson,Biophys.J.7,121(1967))の構築およびらせんに境界線を描く円筒の反対面に親水性および脂質親和性残基のセグリゲーション（分離）に注目することによりある程度まで探求できる。あるいは、円偏光二色性分光分析またＸ線回析データなどの経験的証拠もまた、所定のポリペプチド中のα−らせん領域の存在を示すのに利用できる。理想的なα−らせんは、１ターン当たり３.６アミノ酸残基を有し、隣接する側鎖とは弧１００°離れている。Eisenberg等は、Nature 299:371-374(1982)およびProc.Nat.Acad.Sci.USA 81:140-144(1984)において、疎水性度とらせん車輪を組み合わせて両親媒性らせんの概念を定量している。平均疎水性モーメントは、らせんを構成する成分アミノ酸の疎水性のベクトル和として定義される。下記のアミノ酸の疎水性は、Eisenberg（1984)により“コンセンサススケール”として報告されたものである：
Ile 0.73；Phe 0.61；Val 0.54；Leu 0.53；Trp 0.37；
Met 0.26；Ala 0.25；Gly 0.16；Cys 0.04；Tyr 0.02；
Pro -0.07；Thr -0.18；Ser -0.26；His -0.40；Glu -0.62；
Asn -0.64；Gln -0.69；Asp -0.72；Lys -1.10；Arg -1.76。
【００３５】
１ターン当たり３.６残基（または側鎖間１００°弧（＝３６０°／３.６）を有する理想的なα−らせんの疎水性モーメント、μＨは：
μＨ＝[(Σ ＨＮsinδ(Ｎ−１))２＋（Σ ＨＮcosδ(Ｎ−１)）２]１／２
式中、ＨＮは、第Ｎ番目のアミノ酸の疎水性値であり、その和は、周期律δ＝１００°の配列のＮ個のアミノ酸から算出する、
から計算できる。疎水性モーメントは、μＨをＮで割って＜μＨ＞を得ることにより１残基当たりの平均疎水性モーメントとして表現し得る。１００°±２０°での＜μＨ＞値が約０.２０またはそれ以上であれば、両親媒性らせん形成を示唆している。ｈＰＴＨrp（２２−３１）およびｈＰＴＨ（２２−３１）の＜μＨ＞値は、それぞれ０.１９および０.３７である。
【００３６】
Cornett等は、J.Mol.Biol.,195:659-685(1987)において、両親媒性を予想するものとして"両親媒性指数”を導入することにより両親媒性α−らせんの研究を更に進めている。彼らは、知られている全てのα−らせんの約半分が両親媒性であること、およびその優勢頻度は１００°よりむしろ９７.５°であり、１ターン当たりの残基数が３.６よりも３.７に近いと結論した。このような改良理論は、科学的に興味深いが、Eisenberg等の基本的アプローチでも、特に、両親媒性α−らせんを形成するような配列を最初から設計している場合には所定の配列を両親媒性として分類するのには十分である。
【００３７】
置換両親媒性α−らせんアミノ酸配列は、天然ポリペプチドの所定のセグメントの配列との相同性を欠くことがあるが、生理学的環境下で類似の二次構造、即ち、反対の極性および非極性面を有するα−らせんを誘導する。天然アミノ酸配列の代替配列での置換は、変化させた元のポリペプチドの生理活性、安定性、またはその他の特性に有益な影響を与えることもある。このような配列の設計および選択に関するガイダンスは、なかでもJ.L.Krstenansky等，FEBS Letters 242:2,409-413(1989)およびJ.P.Segrest等，Proteins:Structure,Function,and Genetics 8:103-117(1990)によって提供されている。
【００３８】
本発明の１０アミノ酸両親媒性α−らせんは、式：
Ｈaa (Ｌaa Ｌaa Ｈaa Ｈaa)２ Ｌaa
式中、上記定義のとおり、各Ｈaaは親水性アミノ酸のグループから選択され、各Ｌaaは脂質親和性アミノ酸のグループから選択される、
を有する。理想的なα−らせん構造をとる場合、残基１、４、５、８および９は、互いに約１４０°弧以内のらせんの面（Ａ）に沿って分布し、一方、残基２、３、６、７および１０は、らせんのもう一方の面（Ｂ）上の反対の１４０°弧を占める。好ましくは、一方の面上の残基は全て、同一極性であるが、もう一方の面上の残基は全て反対極性である、即ち、面Ａが全て親水性であるならば、面Ｂは全て脂質親和性であり、逆もまた同じである。当業者ならば、本発明のらせんが、
Ｈaa (Ｌaa Ｌaa Ｈaa Ｈaa)２ Ｌaa
と記載されていても、その逆の配列、
Ｌaa (Ｈaa Ｈaa Ｌaa Ｌaa)２ Ｈaa
もまた、残基分布基準に合致し、かつ本発明のらせんと均等な記述子であることを認識するであろう。
【００３９】
アラニンは両親媒性α−らせんのいずれかの面に容易に存在できるので、アラニンを親水性または脂質親和性アミノ酸のいずれかの代わりに使用することができるのだが、Ａla１０は両親媒性α−らせんを形成しない。一般に、プロリン、システインおよびチロシンは使用されない；しかしながら、配列中にそれらが存在することや、またはその他の無作為エラー、例えば、脂質親和性面上の親水性残基は、そのセグメントの残りのアミノ酸が親水性面−脂質親和性面境界に実質的に順応する限り、黙許できる。配列が、本発明の配列であるために十分に両親媒性であるかどうかを測定する便利な方法は、上記の平均疎水性モーメントを計算することである。１００°±２０°での１残基当たりのピーク平均モーメントが約０.２０を越える場合、その配列は、両親媒性らせんを形成するであろうし、本発明の配列である。
【００４０】
例えば、Ｘaa＝Ｇluである配列番号２６の場合、１００°での１残基当たりの平均疎水性モーメントは、下記のように計算する：
【表３】
この配列では、平均ピーク疎水性モーメントは、９２°で起こり、０.４８の値を有する。
【００４１】
この概念をパラチロイドホルモンおよびパラチロイドホルモン関連ペプチドに適用すると、領域（７−１６）および（２２−３１）のいずれかまたは両方がα−らせん二次構造を示すことができ、生物学的活性を損失したり、または免疫反応を誘引することなく、類似の構造的傾向を有する非相同性配列で置換できる。
【００４２】
好ましい実施態様
一態様では、本発明は、アミノ酸残基（２２−３１）が両親媒性α−らせんを形成しており、該残基（２２−３１）の配列が：
ａ）
【化１７】
配列中、
Ｘaa１およびＸaa４は、独立して、Ｇlu、Ｇlu(ＯＣＨ３)、Ｈis、またはＰheであり；Ｘaa２はＬeuまたはＰheであり；Ｘaa５はＬysまたはＨisであり；Ｘaa７およびＸaa１０は、独立して、ＬeuまたはIleであり；Ｘaa８がＡla、ＡrgまたはＧluであり；さらにＸaa９がＬysまたはＧluである（配列番号８５）；好ましくは、
【化１８】
配列中、
ＸaaはＧluまたはＡrgである（配列番号２６）；
ｂ）
【化１９】
配列中、
Ｘaa１およびＸaa４は、独立して、Ｇlu、Ｇlu(ＯＣＨ３)、Ｈis、またはＰheであり；Ｘaa２はＬeuまたはＰheであり；Ｘaa８がＧlu、ＬysまたはＬys(COCH２PEGX)であり、PEGXが分子量１００ないし１０,０００のポリ(エチレングリコールメチルエーテル)基である（配列番号８６）；好ましくは、
【化２０】
配列中、
ＸaaはＧlu、Ｌys、またはＬys(COCH２PEGX）であり、PEGXが分子量１００ないし１０,０００のポリ(エチレングリコールメチルエーテル)基である（配列番号２７）；
ｃ）
【化２１】
（配列番号２８）；
ｄ）
【化２２】
（配列番号２９）；
ｅ）
【化２３】
（配列番号３０）；
から選択される、ＰＴＨの類似体、ＰＴＨrp、およびＰＴＨおよびＰＴＨrpの生理的に活性な切断類似体および同族体、またはそれらの塩類を提供する。
その他の態様では、本発明は、配列：
【化２４】
配列中：
Ｘaa１は、無いかまたはＡlaであり；
Ｘaa２は、無いかまたはＶalであり；
Ｘaa３は、無いかまたはＳerであり；
Ｘaa４は、無いかまたはＧluまたはＧlu(ＯＣＨ３)であり；
Ｘaa５は、無いかまたはＨisまたはＡlaであり；
Ｘaa６は、無いかまたはＧlnであり；
Ｘaa７は、無いかまたはＬeuであり；
Ｘaa１０およびＸaa１７は、独立してＡspまたはＡsp(ＯＣＨ３)であり；
Ｘaa１１は、Ｌys、Ａrg、またはＬeuであり；
Ｘaa１３は、Ｌys、Ａrg、Ｔyr、Ｃys、Ｌeu、Ｃys(ＣＨ２ＣＯＮＨ(ＣＨ２)２ＮＨ(ビオチニル))、Ｌys(７−ジメチルアミノ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンキソピラン−４−アセチル)、またはＬys(ジヒドロシンナモイル)であり；
Ｘaa２０は、ＡrgまたはＬeuであり；
Ｘaa１９およびＸaa２１は、独立してＬys、Ａla、またはＡrgであり；
Ｘaa２２−３１は、配列番号２６、２７、２８、２９または３０から選択され；
Ｘaa３２は、Ｈis、Ｐro、またはＬysであり；
Ｘaa３３は、無いかまたはＰro、Ｔhr、Ｇlu、またはＡlaであり；
Ｘaa３４は、無いかまたはＰro、Ａrg、Ｍet、Ａla、hＳer、hＳerラクトン、Ｔyr、Ｌeu、または１,４−ジアミノブチリルラクタムであり；
Ｘaa３５は、無いかまたはＰro、Ｇlu、Ｓer、Ａla、またはＧlyであり；
Ｘaa３６は、無いかまたはＡla、Ａrg、またはIleであり；
Ｘaa３７は、無いかまたはＡrg、Ｔrp、または３−(２−ナフチル)−Ｌ−アラニンであり；
Ｘaa３８は、無いかまたはＡlaまたはhＳerであるか、またはＸaa３８−４２は、Ｔhr Ａrg Ｓer Ａla Ｔrpであり；
Termは、ＯＲまたはＮＲ２であり、各Ｒは独立してＨ、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルまたはフェニル(Ｃ１−Ｃ４)アルキルである、
およびそれらの医薬的に許容され得る塩類で示される、ＰＴＨの類似体、ＰＴＨrp、およびＰＴＨおよびＰＴＨrpの生理的に活性な切断類似体および同族体、またはそれらの塩類を提供する。
【００４３】
更にその他の態様では、本発明は、式（I）：
【化２５】
Ｘaa５はＨisまたはＡlaであり；
Ｘaa１１およびＸaa１３は独立してＬys、ＡrgまたはＬeuであり；
Ｘaa１９およびＸaa２１は独立してＬys、ＡlaまたはＡrgであり；
Ｘaa２２−３１は：
ａ）
【化２６】
配列中、
ＸaaはＧluまたはＡrgである（配列番号２６）；
ｂ）
【化２７】
配列中、
ＸaaはＧlu、Ｌys、またはＬys(COCH２PEGX）であり、PEGXが分子量１００ないし１０,０００のポリ(エチレングリコールメチルエーテル)基である（配列番号２７）；
ｃ）
【化２８】
（配列番号２８）；
ｄ）
【化２９】
（配列番号２９）；
ｅ）
【化３０】
（配列番号３０）；
から選択され；
Ｘaa３２は、ＨisまたはＬysであり；
Ｘaa３３は、Ｔhr、Ｇlu、またはＡlaであり；
Ｘaa３４は、Ａla、hＳer、Ｔyr、またはＬeuであり；
Termは、Ｇly Ａrg Ａrg、ラクトン、ＯＨまたはＮＲ２、ここで各Ｒは、Ｈまたは(Ｃ１−Ｃ４)アルキルである、
およびそれらの医薬的に許容され得る塩類（式I）で示される、生理的に活性な切断同族体ｈＰＴＨrp（１−３４）のポリペプチド類似体を含む。
【００４４】
本発明のより具体的な態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号２６であるような式（I）のポリペプチドを含み、その場合、１００°での＜μＨ＞は０.４５を越える。本発明の更により具体的な態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号２６であり；Ｘaa１１およびＸaa１３が両方Ｌysであり；Ｘaa１９およびＸaa２１が両方Ａrgであるような式（I）のポリペプチドを含む。代表的なポリペプチドには、これに限定されないが：
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
がある。
【００４５】
本発明の別の態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号２６であり；Ｘaa１１およびＸaa１３が両方Ｌysであり；Ｘaa１９およびＸaa２１の一方がＡrgであり、他方がＡlaであるような式（I）のポリペプチドを含む。この亜属の代表的なポリペプチドには、これに限定されないが：
【化３８】
【化３９】
がある。
【００４６】
本発明の別の態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号２６であり；Ｘaa１１およびＸaa１３の一方がＬeuであり、他方がＬysであり；Ｘaa１９およびＸaa２１が両方Ａrgであるような式（I）のポリペプチドを含む。この亜属の代表的なポリペプチドには、これに限定されないが：
【化４０】
がある。
【００４７】
本発明のその他の態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号２７であるような式（I）のポリペプチドを含み、その場合、１００°での＜μＨ＞は０.５０を越える。本発明の更なる態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号２７であり；Ｘaa１１およびＸaa１３が両方Ｌysであるか両方Ａrgであり；Ｘaa１９およびＸaa２１が両方Ａrgであるような式（I）のポリペプチドを含む。代表的なポリペプチドには、これに限定されないが：
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
がある。
【００４８】
本発明の別の態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号２８であるような式（I）のポリペプチドを含み、その場合、１００°での＜μＨ＞は約０.２５である。この亜属の代表的なポリペプチドには、これに限定されないが：
【化４６】
がある。
【００４９】
本発明の別の態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号２９であるような式（I）のポリペプチドを含み、その場合、１００°での＜μＨ＞は約０.２８である。この亜属の代表的なポリペプチドには、これに限定されないが：
がある。
【００５０】
本発明の別の態様は、Ｘaa２２−３１が配列番号３０であるような式（I）のポリペプチドを含み、その場合、１００°での＜μＨ＞は約０.２９である。この亜属の代表的なポリペプチドには、これに限定されないが：
【化４７】
がある。
【００５１】
本発明の更にその他の態様では、式（II）：
【化４８】
Ｘaa１は、ＳerまたはＡlaであり；
Ｘaa７は、ＬeuまたはＰheであり；
Ｘaa８は、ＭetまたはＮleであり；
Ｘaa１６は、ＡsnまたはＳerであり；
Ｘaa１８は、Ｌeu、Ｍet、またはＮleであり；
Ｘaa１９は、ＧluまたはＡrgであり；
Ｘaa２１は、ＶalまたはＡrgであり；
Ｘaa２２−３１は、配列番号２６、２７、２８、２９および３０から選択され；
Ｘaa３４は、ＰheまたはＴyrであり；
Termは、ＯＨまたはＮＲ２、ここで各Ｒは、Ｈまたは(Ｃ１−Ｃ４)アルキルである、およびそれらの医薬的に許容され得る塩類（式II）で示される、生理的に活性な切断同族体ｈＰＴＨ（１−３４）のポリペプチド類似体を含む。代表的なポリペプチドには、これに限定されないが：
【化４９】
【化５０】
がある。
【００５２】
本発明の更にその他の態様では、驚くべきことに、３４アミノ酸以下のＰＴＨおよびＰＴＨrpの同族体および類似体もまた強力な骨リモデリング剤であることが分かった。これらの化合物は、一般式：
【化５１】
である。
【００５３】
代表的なポリペプチドには、これらに限定されないが：
化合物４１：AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH２（配列番号５５)
【化５２】
物理データ
m.p. 142.8-166.1℃ [α]Ｄ２５ -53.80（C 0.38, H２O)
FAB (Ｃ１７３Ｈ２９５Ｎ５５Ｏ４９）: [Ｍ＋Ｈ]＋ 3929
AAA: Asx 2.0 (2) Glx 5.7 (6) Ser 1.8 (2)
His 3.0 (3) Gly 1.1 (1) Ala 0.9 (1)
Arg 2.8 (3) Val 1.2 (1) Ile 0.9 (1)
Leu 7.4 (8) Lys 4.4 (4) Pro 0.9 (1)
化合物４２：AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH２（配列番号５６)
【化５３】
物理データ
m.p. 161.0-177.0℃ [α]Ｄ２５ -61.97（C 0.19, H２O)
FAB (Ｃ１６７Ｈ２８８Ｎ５２Ｏ４８）: [Ｍ＋Ｈ]＋ 3792.0
AAA: Asx 2.2 (2) Glx 5.9 (6) Ser 1.9 (2)
His 2.1 (2) Gly 1.1 (1) Ala 1.0 (1)
Arg 3.0 (3) Val 1.1 (1) Ile 1.0 (1)
Leu 7.9 (8) Lys 4.3 (4) Pro 0.9 (1)
がある。
【００５４】
当業者ならば、１００°±２０°での平均疎水性モーメント約０.２０以上を有するアミノ酸配列を位置（２２−３１）に挿入する条件で、本明細書に記載したものの所望の特性を有するポリペプチド類似体の多くの置換物を合成できることを認識するであろう。
【００５５】
ポリペプチドの古典的合成
本発明のポリペプチドは、固相合成については、J.M.StewartおよびJ.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed.,Pierce Chemical Co.,Rockford,Illinois(1984)およびJ.Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides,Vol.2,Academic Press,New York,(1973)に、液相合成についてはE.SchroderおよびK.Lubke,The Peptides,Vol.1,Academic Press,New York,(1965)に記載のような方法により合成できる。
【００５６】
一般には、これらの方法は、伸長ペプチド鎖への保護アミノ酸の連続添加を含む。通常、第１アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかと、あらゆる反応性側鎖基を保護する。この保護アミノ酸を次いで、不活性固体支持体に結合させるか、または溶液に利用するかし、配列における次のアミノ酸もまた適切に保護しておき、これをアミド結合形成に従う条件下で加える。所望のアミノ酸全てを適切な配列に結合させた後、保護基および固相支持体を除いて粗ポリペプチドを得る。ポリペプチドを脱塩し、好ましくはクロマトグラフィーにより精製して最終生成物を得る。
【００５７】
約４０以下のアミノ酸を有する生理的に活性な切断ポリペプチドの類似体の好ましい製法には固相ペプチド合成がある。この方法では、α−アミノ（Ｎα）機能およびあらゆる反応性側鎖を酸または塩基感受性基により保護する。保護基は、ペプチド結合形成条件に安定であるが、実在のポリペプチド鎖に影響をあたえぜすに容易に除去可能であるべきである。適切なα−アミノ保護基には、これらに限定されないが、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂoc)、ベンジルオキシカルボニル（Ｃbz)、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａmoc)、イソボルニルオキシカルボニル、α,α−ジメチル−３,５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆmoc)などがあり、好ましくは、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂoc）である。適切な側鎖保護基には、これらに限定されないが：アセチル、ベンジル（Ｂzl)、ベンジルオキシメチル（Ｂom)、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル（Ｃl-z)、２,６−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、イソプロピル、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル（Ｔos）、トリメチルシリル、およびトリチルがある。
【００５８】
固相合成では、Ｃ−末端アミノ酸をまず、適切な樹脂支持体に結合させる。適切な樹脂支持体は、試薬やステップワイズ濃縮および脱保護反応の反応条件に対して不活性であり、並びに使用した媒質に不溶性であるような物質である。市販の樹脂の例には、反応性基で修飾したスチレン／ジビニルベンゼン樹脂、例えば、クロロメチル化コ−ポリ−(スチレン−ジビニルベンゼン)、ヒドロキシメチル化コ−ポリ−(スチレン−ジビニルベンゼン)などがある。ベンジル化ヒドロキシメチル化フェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂が好ましい。化合物のＣ−末端がアミドであるとき、好ましい樹脂は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミノ−コ−ポリ(スチレン−ジビニル−ベンゼン)樹脂である。
【００５９】
ＰＡＭ樹脂への結合は、高い温度で、例えば、約４０℃から６０℃の間、好ましくは約５０℃で、約１２から７２時間、好ましくは約４８時間、エタノール、アセトニトリル、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）など中、Ｎα−保護アミノ酸、好ましくはＢoc−アミノ酸のアンモニウム塩、セシウム塩、トリエチルアンモニウム塩、１,５−シセアザビシクロ−[５.４.０]ウンデケ−５−エン塩、テトラメチルアンモニウム塩、または類似の塩と、好ましくはＤＭＦ中セシウム塩と、樹脂を反応させることにより達成され得る。
【００６０】
Ｎα−Ｂoc−アミノ酸は、例えば、ジクロロメタンまたはジメチルホルムアミド、好ましくはジクロロメタンなどの溶媒中、約２から約２４時間、好ましくは約２時間、約１０℃から５０℃の温度、好ましくは２５℃でＮ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(ＤIＣ)／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢt)媒介カップリング法によりベンズヒドリルアミン樹脂に結合させることができる。
【００６１】
保護アミノ酸のカップリングは、当分野でよく知られた方法により、典型的には、自動ペプチド合成機にて首尾よく実施できる。トリエチルアミンまたは類似塩基の中性化に続き、各保護アミノ酸を好ましくはおよそ１.５ないし２.５倍モル過剰で導入し、カップリングを不活性の非水性、極性溶媒、例えば、ジクロロメタン、ＤＭＦ、またはそれらの混合物、好ましくはジクロロメタン中、周辺温度で実施する。代表的なカップリング剤は、Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ)、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピル−カルボジイミド（ＤIＣ）またはその他のカルボジイミドであり、単独か、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢt)、Ｏ−アシルウレア、ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰyＢop)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、その他のＮ−ヒドロキシイミド、またはオキシムの存在下のものである。あるいは、保護アミノ酸活性エステル(例えば、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、など)または対称無水物を使用してもよい。
【００６２】
固相合成の最後に、完全に保護されたペプチドを樹脂からはずす。樹脂支持体の結合がベンジルエステル型のものであれば、約−１０℃から５０℃の間の温度、好ましくは約２５℃で、約１２から２４時間の間、好ましくは約１８時間、アルキルアミドＣ−末端をもつペプチドの場合はアルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンを用いるアミノリシスにより、または、非置換アミドＣ−末端をもつペプチドの場合は、例えば、アンモニア／メタノールまたはアンモニア／エタノールを用いるアミノリシスにより切断を行うことができる。ヒドロキシＣ−末端をもつペプチドは、ＨＦまたはその他の強力な酸性脱保護法により、またはケン化により切断できる。あるいは、このペプチドは、例えばメタノールによるエステル転移反応（トランスエステリフィケーション）、続く、アミノリシスまたはケン化により樹脂からはずすことができる。保護ペプチドは、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製できる。
【００６３】
側鎖保護基は、アニソールまたは他のカルボニウムイオンスカベンジャーの存在下でアミノリシス産物を、約−１０℃から＋１０℃の間の温度、好ましくは約０℃で、約１５分から２時間の間、好ましくは約１.５時間、例えば、無水液体フッ化水素で処理し、フッ化水素／ピリジン複合体で処理し、トリス(トリフルオロアセチル）ボロンおよびトリフルオロ酢酸で処理することにより、水素およびパラジウム炭素またはポリビニルピロリドンで還元することにより、または、液体アンモニア中ナトリウム、好ましくは液体フッ化水素およびアニソールで還元することにより、ペプチドからはずすことができる。
【００６４】
ベンズヒドリルアミン樹脂上のペプチドの場合、樹脂切断および脱保護工程は、上記のように液体フッ化水素およびアニソールを利用して一段階で組み合わせることができる。
【００６５】
溶液を脱塩（例えば、BioRad AG-3（登録商標）アニオン交換樹脂を用いて）でき、ペプチドを下記の型のいずれかまたは全てを採用する一連のクロマトグラフィー工程により精製できる：アセテート形弱塩基性樹脂でのイオン交換；非誘導化コ−ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)、例えば、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤでの疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロースでのイオン交換クロマトグラフィー；例えば、セファデックス（登録商標）Ｇ−２５での分配クロマトグラフィー；逆流分布；またはオクチル−またはオクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）結合相カラムパッキングでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に逆相ＨＰＬＣ。
【００６６】
従って、本発明のその他の態様は、適切な樹脂支持体上に保護アミノ酸を連続的に縮合させ、保護基と樹脂支持体をはずし、さらに生成物を精製して、上記のように（２２−３１)位のアミノ酸が両親媒性α−らせんペプチド配列を形成する、ＰＴＨおよびＰＴＨrpの生理的に活性な切断同族体および類似体、好ましくはＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨrp（１−３４）を得ることを含んでなる、ポリペプチドおよびそれらの医薬的に許容され得る塩類の製法に関する。
【００６７】
ポリペプチドの組換え合成
あるいは、本発明のポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび発現させることにより、製造することもできる。この方法では、所望のＤＮＡ配列を含むプラスミドを製造し、これを適切な宿主微生物、典型的には、Ｅ．coliなどの細菌、またはサッカロマイセス・セレビジエなどの酵母に挿入して、宿主微生物がプラスミドの、故に本発明のポリペプチド類似体をコードするｃＤＮＡの多数のコピーを産生するように誘導する。
【００６８】
まず、選択したＰＴＨまたはＰＴＨrp類似体をコードする合成遺伝子は、続く変化を助長するために常用の制限酵素切断部位を用いて設計する。米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号においてMullisが教示しているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてその配列を増幅できる。
【００６９】
増幅させた合成遺伝子を単離し、その中に遺伝子の４コピーをタンデムに挿入することができる、Ｔrp ＬＥプラスミドなどの適切なプラスミドにライゲートできる。Ｔrp ＬＥプラスミドの製造は、米国特許第４,７３８,９２１号およびヨーロッパ特許公開第０２１２５３２に記載されている。Ｔrp ＬＥプラスミドは、一般に、Ｔrp Ｅプラスミドの８−１０倍以上のタンパク質を産生する。次いで、多くのコピー遺伝子をＥ．coliまたはＳ．セレビジエなどの適切な宿主内で発現させることができる。
【００７０】
ここに使用した特異的発現ベクターは、下記のエレメントを含有するＴrp ＬＥ１８ Ｐrot（Ile３、Ｐro５）であった：アンピシリン耐性遺伝子およびプラスミド複製起点を含有するｐＢＲ３２２フラグメント（ＥcoＲI−ＢamＨI)；trpプロモーターおよびtrpＥ遺伝子を含有するＥcoＲI−ＳacIIフラグメント；ＨIＶプロテアーゼ（Ile３、Ｐro５）遺伝子フラグメント（ＳacII−ＨindIII)；ｂＧＲＦ遺伝子フラグメント（ＨindIII−ＢamＨI)；およびＥ．coli ropc遺伝子由来の転写ターミネーター。ＨIＶプロテアーゼおよびｂＧＲＦ遺伝子フラグメントは、重要ではなく、所望ならば他のコード配列に置き換えてもよい。
【００７１】
発現多量体融合タンパク質は、安定な封入体（inclusion bodies）へと細胞内的に蓄積し、残りの細胞性タンパク質から遠心分離により分離できる。単離した融合タンパク質を単量体ＰＴＨまたはＰＴＨrp類似体に変換し、カチオン交換および／または逆相ＨＰＬＣにより精製できる。
【００７２】
クローニング、増幅、発現および精製の別法は、当業者には明らかである。代表的な方法は、Maniatis等、Molecular Cloning,a Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に開示されている。
【００７３】
有用性および投与
本発明のポリペプチドは、骨量の減少により現れる哺乳動物の様々な症状の予防および処置に有用である。特に、本発明の化合物類は、ヒトでの骨粗鬆症およびオステオペニアの予防的および治療的処置にも望ましい。
【００７４】
一般に、本発明のポリペプチドまたはそれらの塩類は、１日当たり約０.００２から１０μg／kg体重の間の量、好ましくは、約０.０４から約０.２量μg／kg体重の量で投与する。５０kgのヒト女性患者の場合、有効成分の毎日用量は、約０.１から約５００μgs、好ましくは約２.０から約１００μgsである。ウマ、イヌ、および家畜などのその他の哺乳動物では、より高用量を必要とする場合もある。この投与量は、最も効果的な結果に到達するのに必要とされるのに合わせて、常用の医薬組成物にて単回投与により、複数適用により、または制御放出により、輸送でき、好ましくは注射により毎日１またはそれ以上の回数である。
【００７５】
正確な用量および組成物、および最も適切な輸送法の選択は、とりわけ、選択したポリペプチドの薬理学的特性、処置する症状の性質および深刻さ、レシピエントの体調および精神的鋭敏さに影響される。
【００７６】
コルチコステロイド誘導オステオペニアでは、ポリペプチドの必須用量は、より高用量のコルチコステロイドの場合、より多いであろう。
【００７７】
代表的な輸送法には、経口、非経口（皮下、筋肉内、および静脈内を含む)、直腸、口内（舌下を含む)、肺、経皮、および経鼻がある。
【００７８】
医薬的に許容され得る塩類は、毒性の副作用なく、元のポリペプチドの所望の生物学的活性を保持する。このような塩類の例は、（ａ）無機酸類、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸および同等物により形成される付加塩類；および有機酸類、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモイン（pamoic）酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクチュロン酸および同等物などにより形成される塩類；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、および同等物などの多価金属カチオンにより；またはＮ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成される有機カチオンにより形成される塩基付加塩；または（ｃ）(ａ)と(ｂ)の組み合わせ、例えば、タンニン酸亜鉛塩および同等物、がある。
【００７９】
本発明の更なる態様は、有効成分として本発明のポリペプチド、またはそれらの医薬的に許容され得る塩を医薬的に許容され得る非毒性キャリアーと組み合わせて含む医薬組成物に関し、かかる組成物は、非経口（皮下、筋肉内、または静脈内）投与用に、特に液体溶液または懸濁液の形態で；または経口または口内投与用に、錠剤またはカプセルの形態で；肺または経鼻投与用に、特に粉末、点鼻液、またはエアロゾルの形態で；さらに、直腸または経皮投与用に製造できる。
【００８０】
組成物は、適宜、用量ユニット形態で投与でき、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA.(1985)に記載のように医薬分野ではよく知られた方法のいずれかにより製造できる。非経口投与用製剤は、賦形剤として滅菌水または食塩水、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール類、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール類、植物性油、水素化ナフタレン、および同等物を含有できる。経鼻投与用製剤は、固体であってよく、賦形剤、例えば、ラクトースまたはデキストランを含有してもよく、また、点鼻液または計量スプレーの形態で使用するための水性または油状溶液であってもよい。口内投与の場合、典型的な賦形剤には、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、プレゼラチン化澱粉、および同等物があるる
【００８１】
経鼻投与用に製剤化する場合、約０.２から１５重量パーセントの間の範囲、好ましくは約０.５から４重量パーセントの間の範囲、より好ましくは約２重量パーセントの量の、例えば、グリココール酸、コール酸、タウロコール酸、エトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸グリコデオキシコール酸、シクロデキストリン類、および同等物などの界面活性剤の酸により鼻粘膜からの吸収を高めることができる。
【００８２】
所望の放出期間に十分な有効成分を含有する制御放出システムの単一投与により、本発明の化合物類を被験体へ長期間にわたり、例えば、１週間から１年の間、輸送することができる。様々な制御放出システム、例えば、モノリシックまたは貯蔵型マイクロカプセル、デポット・インプラント、浸透性ポンプ、小胞、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン導入装置、およびその他の注射投薬形態が本目的に利用できる。有効成分の輸送が望まれる部位の位置測定は、いくつかの制御放出装置の更なる特徴であり、これは、ある種の異常の処置に有利なことを証明できる。
【００８３】
制御放出製剤の一形態は、Kent, Lewis, Sanders,およびTice、米国４,６７５,１８９の先駆的研究に記載のように、ゆっくりと分解する非毒性の非抗原性ポリマー、例えば、コポリ(乳酸／グリコール酸）に分散させるかまたはカプセル封入させたポリペプチドまたはその塩を含有する。この化合物類、または好ましくはそれらの比較的不溶性の塩類は、コレステロールまたはその他の脂質マトリックスペレット、またはシラストマー・マトリックス・インプラントに製剤化することができる。更に緩慢放出、デポット・インプラントまたは注射製剤は当業者には自明である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978およびR.W.Baker,Controlled Release of Biologically Active Agents,John Wiley & Sons,New York,1987参照。
【００８４】
下記の具体的な実施例は、本発明の代表的な化合物の合成および試験を例示説明する意図のものであり、請求の範囲を限定するものと解釈すべきではない。実施例において、"m.p."は融点であり、"［α]Ｄ２５"は指定の溶媒中の所定濃度での２５℃での光学活性であり、"ＦＡＢ"は、高速原子衝突質量分析であり、"ＡＡＡ"は、アミノ酸分析であり、実測値の後のかっこ内は予測値である。アミノ酸分析は、製造元推薦プトロコールに従い、Hewlett-Packard AminoQuant Analyzerにて行った。一次アミノ酸はｏ−フタルアルデヒドで誘導体化し、二次アミノ酸はＦmocで誘導体化した。誘導体化アミノ酸の蛍光検出を定量化に用いた。保護アミノ酸は、Applied Biosystems Inc.(Foster City,CA)から入手した。
【実施例】
【００８５】
実施例I
化合物１（配列番号７）は、Applied Biosystems Model 430A自動ペプチド合成機を用いて、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂上で固相法により０.５mmolスケールで製造した。α−アミノ基は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂoc）で保護した。側鎖保護基は：Ａsp、Ｇlu、およびＳerではベンジル（Ｂzl)；Ａrgではトシル（Ｔos)；Ｈisではベンジルオキシメチル（Ｂom）；およびＬysでは２−クロロベンジル（Ｃl-z）であった。Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＣＣ／ＨＯＢt）を用いてStewartおよびYoung（前掲）に従い、アミノ酸を連続的にカップリングした。各アミノ酸カップリング後、ペプチドを、Ｎ−メチルピロリドン中、無水酢酸およびジイソプロピルエチルアミンの混合物を用いてアセチル化した。完成したペプチドを、アニソール（２.５ml）の存在下−１０℃で３０分間、および０℃で６０分間、無水ＨＦ（２５ml）を用いて側鎖保護基の脱保護を同時に行いながら樹脂から切断した。ＨＦを真空蒸発させた後、残渣を無水エーテルで洗浄し、粗ペプチドを１０％酢酸で抽出した。１０％酢酸抽出物を凍結乾燥させて、粗生成物９００mgsを得た。ペプチドを０.１％ＴＦＡ中、２２−４５％ＣＨ３ＣＮの勾配を用いる中圧ＯＤＳ逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を３つの画分に溶出させ、これを濃縮および凍結乾燥させて、純度＞９８％の白色固体１３０mgsを得た。
【００８６】
化合物１:
AVSEHQLLHDKDKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH２（配列番号７）
【化５４】
物理データ： m.p. 150-159℃ [α]Ｄ２５ -34.88°（c 0.16, H２O）
ＦＡＢ（Ｃ１７５Ｈ３００Ｎ５６Ｏ５１）：［Ｍ＋Ｈ]＋ 4005.5
AAA: Asp, 1.9(2); Glu, 5.6(6); Ser, 1.6(2); His, 2.7(3); Gly 1.0(1);
Thr，0.9(1); Ala, 1.9(2); Arg, 2.8(3); Val, 1.0(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 7.3(8); Lys, 4.0(4).
同様に、化合物２、５〜１８、２１〜２７、２９〜３６、３８〜４８、５０〜５４、５８〜６４および６６〜７０を、ヒドロキシル末端ポリペプチドの合成に必要とされるＰＡＭ樹脂を用いて、製造し、特性化した。
【００８７】
化合物２:
AVSEHQLLHDKDKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH（配列番号６）
【化５５】
物理データ： m.p. 154-170℃ [α]Ｄ２５ -49.35°（c 0.46, H２O）
ＦＡＢ（Ｃ１７５Ｈ３０Ｎ５７Ｏ５０）：［Ｍ＋Ｈ]＋ 4005.0
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 5.9(6); Ser, 1.7(2); His, 2.9(3); Gly 1.1(1);
Thr，1.0(1); Ala, 1.9(2); Arg, 3.0(3); Val, 1.2(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 7.8(8); Lys, 4.2(4).
【００８８】
化合物５:
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH（配列番号１５)
【化５６】
物理データ: m.p. 147-165℃ [α]Ｄ２５ -49.17°（c 0.66, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７５Ｈ２９９Ｎ５９Ｏ５２）:［Ｍ＋Ｈ]＋ 4061
AAA: Asp, 2.1(2); Gly, 6.1(6); Ser, 1.8(2); His, 3.1(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 5.0(5); Val, 1.0(1)；Ile, 0.9(1);
Leu, 7.7(8); Lys, 1.9(2).
【００８９】
化合物６:
AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH（配列番号１６)
【化５７】
物理データ: m.p. 150-170℃ [α]Ｄ２５ -48.65。 (c 0.54, H２O)
ＦＡＢ (Ｃ１７５Ｈ２９９Ｎ６３Ｏ５２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4118.O
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 6.1(6); Ser, 1.8(2); His, 3.2(3); Gly, 1.2(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 6.9(7); Val, 1.0(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 7.8(8).
【００９０】
化合物７:
AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH（配列番号１７)
【化５８】
物理データ: m.p. 177-182℃ [α]Ｄ２５ -46.17° (c 0.14, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７６Ｈ３０４Ｎ６４Ｏ５０): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4117
AAA: Asp, 2.0(2); Glu, 4.8(5); Ser, 1.8(2); His, 3.2(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 0.9(1); Ala, 1.9(2); Arg, 6.7(7); Val, 1.0(1); Ile, 1.0(1);
Lys, 7.7(8); Lys, 0.9(1).
【００９１】
化合物８:
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH (配列番号５)
【化５９】
物理データ: m.p. 147-165℃ [α]Ｄ２５ -49.17° (c 0.66, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７６Ｈ３０５Ｎ５９Ｏ４９): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4033.0
AAA: Asp, 2.0(2); Glu, 4.8(5); Ser, 1.8(2); His, 2.7(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 0.9(1); Ala, 2.0(2); Arg, 3.9(4); Val, 1.0(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 7.9(8); Lys, 4.0(4).
【００９２】
化合物９:
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKGRR-OH (配列番号１０)
【化６０】
物理データ: m.p. 158-160℃ [α]Ｄ２５ -44.76° (c 0.1, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８９Ｈ３２６Ｎ６４Ｏ５５): [Ｍ]＋ 4375.0
AAA: Asp, 2.0(2); Glu, 5.9(6); Ser, 1.7(2); His, 2.9(3); Gly, 2.3(2);
Thr, 1.0(1); Ala, 1.9(2); Arg, 5.0(5); Val, 1.2(1); Ile,1.0(1);
Leu, 7.8(8); Lys, 4.3(4).
【００９３】
化合物１０:
AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH (配列番号１４)
【化６１】
物理データ: m.p. 170-175℃ [α]Ｄ２５ -31.59° (c 0.54, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７４Ｈ３００Ｎ５２Ｏ５１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3936.0
AAA: Asp, 2.0(2); Glu, 6.0(6); Ser, 1.8(2); His, 2.0(2); Gly, 1.2(1)；
Ala, 3.0(3); Arg, 2.8(3); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1); Leu, 9.9(10);
Lys, 3.0(3).
【００９４】
化合物 1 1:
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH２（配列番号１１)
【化６２】
物理データ: m.p. 172-174℃ [α]Ｄ２５ -43.29° (c 0.2, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７９Ｈ３１１Ｎ５５Ｏ５２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4065.8
AAA: Asp, 2.2(2); Glu, 7.7(7); Ser, 1.7(2); His, 2.0(2); Gly, 1.0(1);
Ala, 1.0(1); Arg, 3.0(3); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1); Leu,9.3(9);
Lys, 5.1(5).
【００９５】
化合物１２:
AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH２ (X=Nle,配列番号２３)
【化６３】
物理データ: m.p. 178℃ [α]Ｄ２５ -36.88° (c 0.4, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８２Ｈ２９５Ｎ５０Ｏ５１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4001.6
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 6.5(6); Ser, 2.7(3); His, 3.1(3); Gly, 1.1(1);
Ala, 1.0(1); Arg, 1.0(1); Tyr, 0.8(1); Val, 2.0(2); Phe,1.0(1);
Ile, 0.9(1); Leu＋Nle, 8.5(7＋2); Lys, 3.1(3).
【００９６】
化合物１３:
AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH２ (X=Nle,配列番号２４)
【化６４】
物理データ: m.p. 260℃ [α]Ｄ２５ -37.02°（c 0.2, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８４Ｈ３０４Ｎ５６Ｏ４９): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4084
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 5.5(5); Ser, 2.6(3); His, 3.1(3); Ala, 1.0(1);
Gly, 1.1(1); Arg, 3.2(3); Tyr, 1.0(1); Val, 1.0(1); Phe, 1.0(1);
Ile, 1.0(1); Leu, 9.0(9); Lys, 3.0(3).
【００９７】
化合物１４:
AVSEHOLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH２ (配列番号２０)
【化６５】
物理データ: m.p. 190-225℃ [α]Ｄ２５ -56.58° (c 0.36, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１６１Ｈ２７２Ｎ５４Ｏ４９): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3747.0
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 4.9(5); Ser, 1.7(2); His, 2.6(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 7.6(7); Arg, 2.8(3); Val, 1.2(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 6.6(6); Lys, 1.9(2).
【００９８】
化合物１５:
AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH２（配列番号１２)
【化６６】
物理データ: m.p. 170-180℃ [α]Ｄ２５ -48.19° (c 0.2, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７２Ｈ２９３Ｎ５３Ｏ５１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3919.0
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 6.1(6); Ser, 1.7(2); His, 3.1(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 3.0(3); Arg, 2.1(2); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.0(8); Lys, 4.4(4).
【００９９】
化合物１６:
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH２（配列番号１３)
【化６７】
物理データ: m.p. 190-195℃ [α]Ｄ２５ -50.50° (c 0.4, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７２Ｈ２９３Ｎ５３Ｏ５１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3919.0
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 6.0(6); Ser, 1.8(2); His, 3.1(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 3.0(3); Arg, 2.1(2); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 7.5(8); Lys, 4.2(4).
【０１００】
化合物１７:
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH２（配列番号２１)
【化６８】
物理データ: m.p. 195-204℃ [α]Ｄ２５ -67.11° (c 0.3, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１６３Ｈ２８０Ｎ５４Ｏ５０): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3796.O
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 2.9(3); Ser, 6.8(7); His, 3.1(3); Gly, 1.2(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 3.0(3); Val, 1.0(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.2(8); Lys, 2.0(2).
【０１０１】
化合物１８:
AVSEHQLLHDRGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH２ (配列番号２２)
【化６９】
物理データ: m.p. 200-207℃ [α]Ｄ２５ -60.26° (c 0.6, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７４Ｈ２８４Ｎ５６Ｏ５０): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3960.0
AAA: Asp, 2.9(3), Glu, 3.5(4); Ser, 1.4(2); His, 2.6(3); Gly, 0.9(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 4.0(4); Arg, 3.0(3); Tyr, 0.9(1); Val, 1.9(2);
Phe, 1.1(1); Ile, 0.9(1); Leu, 3.6(4); Lys, 4.1(4).
【０１０２】
化合物２１:
AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH２ (配列番号３５)
【化７０】
物理データ: m.p. 148-155℃ [α]Ｄ２５ -45.97 (c 0.26, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８４Ｈ３０４Ｎ５６Ｏ４９): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4084
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 5.0(5); Ser, 2.7(3); His, 3.0(3); Gly, 1.0(1);
Ala, 0.9(1); Arg, 3.1(3); Tyr, 0.9(1); Val, 1.0(1); Phe, 0.9(1);
Ile, 0.9(1); Leu, 9.3(9); Lys, 3.2(3).
【０１０３】
化合物２４:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号３８)
【化７１】
物理データ: m.p. 175-182℃ [α]Ｄ２５ -49.99（c 0.47, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７５Ｈ２９９Ｎ４９Ｏ５１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3906.5
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 6.5(6); Ser, 1.8(2); His, 3.1(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.1(2); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1); Leu, 9.1(9);
Lys, 6.5(6).
【０１０４】
化合物２５:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH２ (配列番号３９)
【化７２】
物理データ: m.p. 136.5-153.5℃ [α]Ｄ２５ -32.57 (c O.13, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７５Ｈ３００Ｎ６０Ｏ５１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4060.8
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 6.2(6); Ser, 1.8(2); His, 3.2(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.1(2); Arg, 5.2(5); Val, 1.1(1); Ile, 1.1(1);
Leu, 8.4(8); Lys, 2.2(2).
【０１０５】
化合物２６:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-OH (配列番号４０)
【化７３】
物理データ: m.p. 125.8-127.2℃ [α]Ｄ２５ -54.62 (c 0.23, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８０Ｈ３０６Ｎ６０Ｏ５３): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4158.O
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 6.2(6); Ser, 1.8(2); His, 2.9(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 5.1(5); Val, 1.0(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.0(8); Lys, 2.1(2); Pro, 1.1(1).
【０１０６】
化合物２７:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH (配列番号４１)
【化７４】
物理データ: m.p. 106-137.3℃ [α]Ｄ２５ -39.55 (c 0.67, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８９Ｈ３２６Ｎ６８Ｏ５５): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4430.5
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 5.9(6); Ser, 1.6(2); His, 2.7(3); Gly, 2.2(2);
Thr, 1.0(1); Ala, 1.8(2); Arg, 7.3(7); Val, 0.8(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.1(8); Lys, 2.1(2).
【０１０７】
化合物２９:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH２（配列番号４３)
【化７５】
物理データ: m.p. 160-172℃ [α]Ｄ２５ -49.85（C 0.34，H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８１Ｈ３０４Ｎ５６Ｏ５２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4096.9
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.6(6); Ser, 1.7(2); His, 3.1(3); Gly, 1.1(2);
Thr, 0.9(1); Ala, 0.9(2); Arg, 3.0(3); Tyr, 0.9(1); Val, 1.0(1);
Ile, 1.0(1); Leu，7.7(8)；Lys, 4.4(4).
【０１０８】
化合物３０:
AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号４４)
【化７６】
物理データ: m.p. 130-171℃ [α]Ｄ２５ -40.65（C 0.34，H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７８Ｈ２９７Ｎ５５Ｏ５２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4039.4
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.5(6); Ser, 1.8(2); His, 3.4(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 2.9(3); Tyr, 0.8(1); Val, 1.0(1);
Ile, 0.9(1); Leu，7.9(8)；Lys, 3.4(3).
【０１０９】
化合物３１:
AVSEHQLLHD KGCSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号４５)
【化７７】
物理データ: m.p. 140-160℃ [α]Ｄ２５ -44.48（C 0.25，H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７２Ｈ２９３Ｎ５５Ｏ５１Ｓ１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3979
AAA: Asx＋Cys, 3.0(2＋1); Glx, 5.6(6); Ser, 1.7(2); His, 3.0(3);
Gly, 1.0(1); Thr, 0.9(1); Ala, 1.9(2); Arg, 2.5(3); Val, 1.0(1);
Ile, 0.9(1); Leu，7.5(8)；Lys, 3.3(3).
【０１１０】
化合物３２:
AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号４６)
(X=Cys(CH２CONH(CH２)２NH(ビオチニル))
【化７８】
物理データ: m.p. (測定せず) [α]Ｄ２５ (測定せず)
ＦＡＢ（Ｃ１８６Ｈ３１６Ｎ５９Ｏ５４Ｓ２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4306.6
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 6.1(6); Ser, 1.8(2); His, 3.8(3); Gly, 1.0(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 3.1(3); Val, 1.1(1); Ile, 0.9(1);
Leu，8.3(3)；Lys, 3.3(3).
【０１１１】
化合物３３:
AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号４７)
(X=Lys(7-ジメチルアミノ-2-オキソ-2H-1-ベンキソピラン-4-アセチル))
【化７９】
物理データ: m.p. 135-205℃ [α]Ｄ２５ -26.92 (c 0.104, 50%水性HOAc)
ＦＡＢ（Ｃ１８８Ｈ３１１Ｎ５７Ｏ５４): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4233
AAA: Asx, 1.9(2); Glx, 6.3(6); Ser, 1.7(2); His, 3.2(3); Gly, 1.0(1);
Thr, 1.1(1); Ala, 2.0(2); Arg, 3.2(3); Val, 1.1(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.2(8); Lys, 4.5(4).
【０１１２】
化合物３４:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG-OH (配列番号４８)
【化８０】
物理データ: m.p. 92.1-146.6℃ [α]Ｄ２５ -40.76 (c 0.34, H２0)
ＦＡＢ（Ｃ１７７Ｈ３０２Ｎ５６Ｏ５３): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4062.O
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.7(6); Ser, 1.8(2); His, 3.0(3); Gly, 2.2(2);
Thr, 0.9(1); Ala, 1.9(2); Arg, 2.8(3); Val, 1.2(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 7.5(8); Lys, 4.2(4).
【０１１３】
化合物３５:
AVSX１HQLLHX２ KGKSIQX２LRR RX１LLX１KLLX１K LHA-OH (配列番号４９)
【化８１】
物理データ: m.p. (測定せず) [α]Ｄ２５ -21.96 (c 0.132, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８１Ｈ３１１Ｎ５５Ｏ５２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4089.0
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 6.3(6); Ser, 1.8(2); His, 3.3(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 3.1(3); Val, 1.1(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.0(8); Lys, 4.2(4).
【０１１４】
化合物３６:
AVSX１HQLLHX２ KGKSIQX２LRR RX１LLX１KLLX１K LHA-OCH３ (配列番号５０)
（X１=Glu(OCH３)；X２=Asp(OCH３))
【化８２】
物理データ: m.p. (測定せず) [α]Ｄ２５ -46.80 (c 0.07, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８２Ｈ３１３Ｎ５５Ｏ５２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4103
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 6.2(6); Ser, 1.4(2); His, 3.0(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.1(1); Ala, 1.7(2); Arg, 3.2(3); Val, 0.6(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.0(8); Lys, 4.1(4).
【０１１５】
化合物３８:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH (配列番号５２)
【化８３】
物理データ: m.p. 152.1-186.5℃ [α]Ｄ２５ -55.91 (c 0.33, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８０Ｈ３０６Ｎ５６Ｏ５３): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4102.6
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.6(6); Ser, 1.7(2); His, 2.9(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 0.9(1); Ala, 1.9(2); Arg, 2.9(3); Val, 1.2(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 7.7(8); Lys, 4.3(4).
【０１１６】
化合物３９:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH (配列番号５３)
【化８４】
物理データ: m.p. 120-148.2℃ [α]Ｄ２５ -52.78 (c 0.47, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７７Ｈ３０１Ｎ５５Ｏ５２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4031.0
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.5(6); Ser, 1.8(2); His, 2.9(3); Gly, 1.0(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 0.9(1); Arg, 2.9(3); Val, 1.2(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 7.5(8); Lys, 3.6(3); Pro, 0.9(1).
【０１１７】
化合物４０:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-NH２ (配列番号５４)
【化８５】
物理データ: m.p. 133.9-155.1℃ [α]Ｄ２５ -54.22 (c 0.37, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７７Ｈ３０２Ｎ５６Ｏ５１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4030.7
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.6(6); Ser, 1.9(2); His, 2.9(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 0.9(1); Ala, 0.9(1); Arg, 2.8(3); Val, 1.2(1); Ile, 1.1(1);
Leu, 7.8(8); Lys, 4.2(4); Pro, 0.9(1).
【０１１８】
化合物４１:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH２ (配列番号５５)
【化８６】
物理データ: m.p. 142.8-166.1℃ [α]Ｄ２５ -53.80 (c 0.38, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７３Ｈ２９５Ｎ５５Ｏ４９): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3929
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.7(6); Ser, 1.8(2); His, 3.0(3); Gly, 1.1(1);
Ala, 0.9(1); Arg, 2.8(3); Val, 1.2(1); Ile, 0.9(1); Leu, 7.4(8);
Lys, 4.4(4); Pro, 0.9(1).
【０１１９】
化合物４２:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH２（配列番号５６)
【化８７】
物理データ: m.p. 161.0-177.0℃ [α]Ｄ２５ -61.97 (c 0.19, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１６７Ｈ２８８Ｎ５２Ｏ４８): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3792.0
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 5.9(6); Ser, 1.9(2); His, 2.1(2); Gly, 1.1(1);
Ala, 1.0(1); Arg, 3.0(3); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1); Leu, 7.9(8);
Lys, 4.3(4); Pro, 0.9(1).
【０１２０】
化合物４３:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH（配列番号５７)
【化８８】
物理データ: m.p. 181-202℃ [α]Ｄ２５ -45.14 (c 0.19, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１９５Ｈ３２６Ｎ６２Ｏ５６): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4435.2
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.8(6); Ser, 2.8(3); His, 2.8(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 0.9(1); Ala, 1.9(2); Arg, 3.7(4); Ile, 0.9(1); Leu, 7.5(8);
Lys, 4.3(4); Trp, 0.9(1).
【０１２１】
化合物４４:
AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH（配列番号５８)
【化８９】
物理データ: m.p. 130-132.2℃ [α]Ｄ２５ -46.66 (c 0.195, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ２１６Ｈ３６５Ｎ８１Ｏ６２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 5088.8
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 6.0(6); Ser, 2.7(3); His, 3.0(3); Gly, 2.2(2);
Thr, 2.1(2); Ala, 3.0(3); Arg, 10.5(10); Val, 0.9(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.2(8); Trp, 1.0(1).
【０１２２】
化合物４５:
AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH２ (配列番号５９)
【化９０】
物理データ: m.p.158-174℃ [α]Ｄ２５ -43.57 (c 0.53, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ２１６Ｈ３６６Ｎ８２Ｏ６１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 5087.4
AAA: Asx, 1.9(2); Glx, 5.6(6); Ser, 2.6(3); His, 3.3(3); Gly, 2.1(2);
Thr, 2.0(2); Ala, 2.9(3); Arg, 10.1(10); Val, 0.9(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.3(8); Trp, 1.1(1).
【０１２３】
化合物４６:
AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH（配列番号６０)
(X=Lys(ジヒドロシンナモイル))
【化９１】
物理データ: m.p. 165.4-175.2℃ [α]Ｄ２５ -40.43 (c 0.20, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ２２５Ｈ３７４Ｎ８０Ｏ６２): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 5191
AAA: Asx, 2.1(2), Glx, 6.3(6); Ser, 2.8(3); His, 3.2(3); Gly, 2.1(2);
Thr, 2.0(2); Ala, 3.2(3); Arg, 9.9(9); Val, 1.0(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.6(8); Lys, 1.1(1); Trp, 1.1(1).
【０１２４】
化合物４７:
AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH２（配列番号６１)
(X=ノルロイシン)
【化９２】
物理データ: m.p. 140-160℃ [α]Ｄ２５ -56.88 (c 0.16, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８０Ｈ２８７Ｎ５５Ｏ５８): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3989.8
AAA: Asx, 3.0(3); Glx, 2.9(3); Ser, 3.7(4); His, 2.8(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 0.9(1); Ala, 1.9(2); Arg, 2.0(2); Tyr, 1.0(1); Val, 1.7(2);
Phe, 0.9(1); Ile, 0.9(1); Leu＋Nle 5.8(2＋4); Lys, 3.4(3);
Trp, 1.1(1).
【０１２５】
化合物４８:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTMA-NH２（配列番号６２)
【化９３】
物理データ: m.p. 140-210℃ [α]Ｄ２５ -47.75 (c 0.178, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８０Ｈ３０９Ｎ５７Ｏ５２Ｓ１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4135.0
AAA: Asx, 2.3(2); Glx, 6.6(6); Ser, 1.4(2); His, 3.2(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 3.1(3); Val, 0.9(1); Met, 1.1(1);
Ile, 1.0(1); Leu, 8.8(8); Lys, 4.4(4).
【０１２６】
化合物５０:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号６４)
【化９４】
物理データ: m.p. 136.5-156.8℃ [α]Ｄ２５ -49.89 (c 0.24, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８２Ｈ３００Ｎ５６Ｏ４９): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4056.O
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 5.0(5); Ser, 1.9(2); His, 3.3(3); Gly, 1.0(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.1(2); Arg, 3.1(3); Val, 1.0(1); Phe, 2.0(2);
Ile, 0.9(1); Leu, 7.2(7); Lys,3.5(4).
【０１２７】
化合物５１:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLHKLLEK LHTA-NH２（配列番号６５)
【化９５】
物理データ: m.p. 80.7-141.0℃ [α]Ｄ２５ -55.38 (c 0.23, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７６Ｈ３００Ｎ５８Ｏ４９): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4012.8
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 4.9(5); Ser, 1.8(2); His, 4.3(4); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 3.1(3); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.1(8); Lys, 3.9(4).
【０１２８】
化合物５２:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEK LHTA-NH２（配列番号６６)
【化９６】
物理データ: m.p. 134.3-157.9℃ [α]Ｄ２５ -50.72 (c 0.45, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７５Ｈ２９５Ｎ５７Ｏ５１): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4012.8
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 5.9(6); Ser, 1.8(2); His, 4.2(4); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.0(2); Arg, 3.0(3); Val, 1.1(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.1(8); Lys, 3.1(3).
【０１２９】
化合物５３:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH２（配列番号６７)
【化９７】
物理データ: m.p. 142.7-159.8℃ [α]Ｄ２５ -54.01 (c 0.21, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７３Ｈ２９８Ｎ５６Ｏ４９): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 3946.0
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 4.9(5); Ser, 1.8(2); His, 3.1(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 3.1(3); Arg, 3.1(3); Val, 1.0(1); Ile, 1.9(2);
Leu, 7.0(7); Lys, 4.3(4).
【０１３０】
化合物５４:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEE IHTA-NH２（配列番号６８)
【化９８】
物理データ: m.p. 138-185℃ [α]Ｄ２５ -50.17 (c 0.14, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７４Ｈ２９５Ｎ５５Ｏ５３): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4005
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 7.1(7); Ser, 1.7(2); His, 2.8(3); Gly, 1.0(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.1(2); Arg, 3.1(3); Val, 1.1(1); Ile, 1.7(2);
Leu, 7.1(7); Lys, 2.7(3).
【０１３１】
化合物５８:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-NH２（配列番号７２)
【化９９】
物理データ: m.p. 158-163℃ [α]Ｄ２５ -46.06 (c 0.17, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１９５Ｈ３２７Ｎ６３Ｏ５５): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4434.8
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.5(6); Ser, 2.7(3); His, 3.1(3); Gly, 1.0(1);
Ala, 1.8(2); Arg, 4.0(4); Thr, 0.9(1); Val, 0.9(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 7.5(8); Lys, 3.9(4); Trp, 1.0 (1).
【０１３２】
化合物５９:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAX-OH（配列番号７３)
【化１００】
物理データ: m.p. 156-162℃ [α]Ｄ２５ -44.44(c 0.189, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１９７Ｈ３２８Ｎ６２Ｏ５５): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4445.6
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 5.5(6); Ser, 2.8(3); His, 2.9(3); Gly, 1.0(1);
Ala, 2.0(2); Arg, 4.0(4); Thr, 0.9(1); Val, 1.0(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 7.5(8); Lys, 4.2(4); Nal, 1.1(1).
【０１３３】
化合物６０:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH（配列番号７４)
【化１０１】
物理データ: m.p. 159-164℃ [α]Ｄ２５ -50.94 (c 0.29, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１９２Ｈ３２０Ｎ６０Ｏ５５): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4349.O
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.6(6); Ser, 2.7(3); His, 3.2(3); Gly, 1.0(1);
Ala, 3.1(3); Arg, 2.8(3); Thr, 1.0(1); Val, 1.1(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 7.6(8); Lys, 4.0(4); Trp, 1.0(1).
【０１３４】
化合物６１:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH（配列番号７５)
【化１０２】
物理データ: m.p. 155-210℃ [α]Ｄ２５ -46.15 (c 0.12, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１９５Ｈ３３４Ｎ６２Ｏ５８): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4475.8
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 6.9(7); Ser, 1.7(2); His, 3.2(3); Gly, 1.1(1);
Ala, 3.1(3); Arg, 4.0(4); Thr, 0.9(1); Val, 1.1(1); Ile, 1.9(2);
Leu, 8.1(8); Lys, 4.1(4).
【０１３５】
化合物６２:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH（配列番号７６)
【化１０３】
物理データ: m.p. 186-218℃ [α]Ｄ２５ -52.73（c 0.265, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１９２Ｈ３２９Ｎ６１Ｏ５７): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4404.4
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 6.6(7); Ser, 1.9(2); His, 3.4(3); Gly, 1.1(1);
Ala, 2.0(2); Arg, 3.8(4); Thr, 1.0(1); Val, 1.1(1); Ile, 1.7(2);
Leu, 7.9(8); Lys, 4.0(4).
【０１３６】
化合物６３:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH（配列番号７７)
【化１０４】
物理データ: m.p. 169-205℃ [α]Ｄ２５ -50.78（c 0.51, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８６Ｈ３１７Ｎ５７Ｏ５６): ［Ｍ＋Ｈ]＋ 4248.0
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 6.8(7); Ser, 1.8(2); His, 3.3(3); Gly, 1.0(1);
Ala, 2.0(2); Arg, 3.0(3); Thr, 1.0(1); Val, 1.0(1); Ile, 1.8(2);
Leu, 7.8(8); Lys, 3.6(4).
【０１３７】
化合物６４:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH（配列番号７８)
【化１０５】
物理データ: m.p. 199-205℃ [α]Ｄ２５ -52.47 (c 0.41, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８０Ｈ３０６Ｎ５６Ｏ５５): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4135.0
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 6.6(7); Ser, 1.9(2); His, 3.3(3); Gly, 1.1(1);
Ala, 2.0(2); Arg, 2.9(3); Thr, 1.0(1); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.2(8); Lys, 3.8(4).
【０１３８】
化合物６６:
SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号８０)
【化１０６】
物理データ: m.p. 134.2℃ [α]Ｄ２５ -48.12 (c 0.36, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１６７Ｈ２８６Ｎ５４Ｏ４９): [Ｍ＋Ｈ]＋ 3834.4
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.7(6); Ser, 1.7(2); His, 2.9(3); Gly, 1.0(1);
Thr, 0.9(1); Ala, 1.0(1); Arg, 2.8(3); Ile, 0.9(1); Leu, 7.4(8);
Lys, 4.3(4).
【０１３９】
化合物６７:
LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号８１)
【化１０７】
物理データ: m.p. 128.5-184.5℃ [α]Ｄ２５ -6.53 (c 0.69, MeOH)
ＦＡＢ（Ｃ１４８Ｈ２５９Ｎ４７Ｏ４１): [Ｍ＋Ｈ]＋ 3353
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 4.1(4); Ser, 0.9(1); His, 2.1(2); Gly, 1.0(1);
Thr, 0.9(1); Ala, 1.0(1); Arg, 3.0(3); Ile, 1.0(1); Leu, 8.1(8);
Lys, 4.2(4).
【０１４０】
化合物６８:
LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH２（配列番号８２)
【化１０８】
物理データ: m.p. 165-210℃ [α]Ｄ２５ -36.05 (c 0.12, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１４２Ｈ２４８Ｎ４６Ｏ４０): [Ｍ＋Ｈ]＋ 3239.0
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 3.9(4); Ser, 0.9(1); His, 1.9(2); Gly, 1.0(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 1.0(1); Arg, 2.9(3); Ile, 0.9(1); Leu, 6.8(7);
Lys, 4.2(4).
【０１４１】
化合物６９:
SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH（配列番号８３)
【化１０９】
物理データ: m.p. 150-210℃ [α]Ｄ２５ -18.0 (c 0.64, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ２０８Ｈ３５１Ｎ７９Ｏ６０): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4918.6
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 6.2(6); Ser, 2.8(3); His, 3.1(3); Gly, 2.2(2);
Thr, 2.2(2); Ala, 2.2(2); Arg, 10.4(10); Ile, 1.0(1); Leu, 8.0(8);
Trp, 1.1(1)
【０１４２】
化合物７０:
LLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH（配列番号８４)
【化１１０】
物理データ: m.p. 150-210℃ [α]Ｄ２５ -41.70 (c 0.36, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８９Ｈ３２４Ｎ７２Ｏ５２): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4437.14
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 4.1(4); Ser, 1.9(2); His, 2.0(2); Gly, 2.1(2);
Thr, 2.0(2); Ala, 2.1(2); Arg, 9.7(10); Ile, 0.9(1); Leu, 7.4(8).
側鎖環化類似体（化合物５７）を、Ｎα−Ｂoc−Ｎε−Ｆmoc−ＬysおよびＮα−Ｂoc−Ｎγ−Ｆmoc−Ａspを１３位および１７位にそれぞれ配置した以外は上記の通りにして合成した。Ｂocアミノ酸合成が完了したら、樹脂を、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで室温で３０分間処理した。その樹脂を濾過し、ＤＭＦ、ＭeＯＨおよびＣＨ２Ｃl２で洗浄した。樹脂（１.１g）をＰyＢＯＰ ２５０mgを含有するＤＭＦ １０ml中に懸濁した。ＤIＥＡを用いてｐＨを８−９に調節し、樹脂を１時間撹拌した。その樹脂を濾過し、ＤＭＦおよびＣＨ２Ｃl２で洗浄し、次いで、ＤＭＦに再懸濁させた。ＰyＢＯＰ １２５mgを用いて結合を繰り返した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ、ＭeＯＨおよびＣＨ２Ｃl２で洗浄し、乾燥させた。次いで、樹脂をＨＦで処理し、ペプチドを上記のとおり精製した。
【０１４３】
化合物５７:
【化１１１】
【化１１２】
物理データ: m.p. 142.5-163.5℃ [α]Ｄ２５ -34.31 (c 0.17, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７５Ｈ２９８Ｎ５６Ｏ５０): [Ｍ＋Ｈ]＋ 3986.4
AAA: Asx, 1.9(2); Glx, 5.9(6); Ser, 1.8(2); His, 3.2(3); Gly, 1.1(1);
Ala, 2.0(2); Arg, 3.0(3); Thr, 1.0(1); Val, 1.1(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.0(8); Lys, 4.0(4).
【０１４４】
実施例II
[Met３４，Ala３５］化合物１、AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEK-LLEKLHTMA-NH２（配列番号２５)を、実施例Iの方法に従い製造および精製した。このポリペプチドは、以下のようにホモセリンラクトンに変換させた。精製ペプチド（１６０mg）を４４％ギ酸（４ml）に溶解した。この溶液を、４４％ギ酸（４ml）中予め混合しておいたシアノゲンブロミド（７００mg）およびフェノール（１.６mg）の溶液と０℃で合わせた。この溶液を０℃で２時間、更に室温で２時間撹拌した。生成物の形成はＨＰＬＣにより監視した（Ｖydac(登録商標)Ｃ−１８、３００Å、４.６×２５０mm、１.２ml／分の流速、０.１％ＴＦＡ中２５−４５％アセトニトリル勾配で１０分）。反応は４時間以内に完了した。試料の半分を濃縮して分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖydac(登録商標)Ｃ−１８、０.１％ＴＦＡ中２５−４５％アセトニトリル勾配）により精製した。ホモセリンラクトンペプチド画分を集め、凍結乾燥させて、純度＞９５％の白色固体、化合物４の２８mgを得た。
【０１４５】
化合物４
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX (X=hSerlac、配列番号９)
【化１１３】
物理データ:
m.p. 138-142℃ [α]Ｄ２５ -50.66° (c 0.1, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７６Ｈ２９９Ｎ５５Ｏ５２): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4017.61
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 6.1(6); Ser, 1.8(2); His, 3.0(3); Thi, 1.1(1);
Ala, 1.1(1); Arg, 2.7(3); Val, 1.0(1); Ile, 1.0(1); Leu, 8.2(8);
Lys, 3.8(4); Gly 1.09(1); hSer, 1.09(1).
同様に、化合物６５をこの方法に従い製造した。
【０１４６】
化合物６５:
AVSEIQFX１HN KGKHLSSX１ER VEWLRKKLQD VHNX２（配列番号７９)
（X1=L-ノルロイシン；X2=ホモセリンラクトン）
【化１１４】
物理データ: m.p. 166-176℃ [α]Ｄ２５ -52.22 (c 0.25, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８０Ｈ２８８Ｎ５４Ｏ５０): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4008.6
AAA: Asx, 3.1(3); Glx, 4.8(5); Ser, 2.9(3); His, 2.9(3); Gly, 1.1(1);
Ala, 1.1(1); Arg, 2.0(2); Val, 2.7(3); Phe, 1.0(1); Ile, 1.0(1);
Leu＋Nle, 5.9(4＋2); Lys, 2.8(3).
【０１４７】
実施例III
ホモセリンアミドを製造するために、粗hＳerラクトン類似体、化合物４を濃縮し、メタノール中飽和ＮＨ３ ２５mlで処理した。溶液を０℃で２時間、更に室温で１６時間撹拌した。反応はＨＰＬＣ（Ｖydac(登録商標)Ｃ−１８、３００Å、４.６×２５０mm、１.２ml／分の流速、０.１％ＴＦＡ中２５−４５％アセトニトリル勾配）で監視し、１８時間以内に完了した。溶液を濃縮して分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖydac(登録商標)Ｃ−１８、０.１％ＴＦＡ中２５−４５％アセトニトリル勾配）により精製した。ホモセリンアミドペプチド画分を集め、凍結乾燥させて、純度＞９８％の白色固体、化合物３の３０mgを得た。
【０１４８】
化合物３
AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NH２ (X=hSer、配列番号８)
【化１１５】
物理データ:
m.p. 138-142℃ [α]Ｄ２５ -45.97° (c 0.25, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７６Ｈ３０２Ｎ５６Ｏ５２): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4033.9
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 6.1(6); Ser, 1.6(2); His, 2.8(3); Gly, 0.97(1);
hSer, 0.97(1); Thi, 1.0(1); Ala, 1.0(1); Arg, 2.9(3); Val, 1.0(1);
Ile, 1.0(1); Leu, 7.6(8); Lys, 3.9(4).
【０１４９】
化合物２２:
AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH２（配列番号３６)
（X=ホモセリン）
【化１１６】
物理データ: m.p. 69.4-128℃ [α]Ｄ２５ -43.93 (c 0.15, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７９Ｈ３０２Ｎ５６Ｏ４９): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4022.9
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 4.9(5); Ser, 2.6(3); His, 2.8(3); Gly, 1.0(1);
Ala, 1.0(1); Arg, 3.0(3); Val, 1.0(1); Phe, 1.0(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.8(9); Lys, 3.4(3).
【０１５０】
化合物２３:
AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH２（配列番号３７)
（X=ホモセリン）
【化１１７】
物理データ: m.p. 87.1-142.1℃ [α]Ｄ２５ -52.14 (c 0.41, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７９Ｈ３０３Ｎ５７Ｏ４９): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4038
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 4.9(5); Ser, 2.7(3); His, 2.8(3); Gly, 1.0(1);
hSer, 1.0(1); Ala, 1.0(1); Arg, 3.0(3); Val, 1.1(1); Phe, 0.9(1);
Ile, 0.9(1); Leu, 7.9(8); Lys, 3.7(4).
【０１５１】
化合物２８:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH２（配列番号４２)
（X=ホモセリン）
【化１１８】
物理データ: m.p. 80℃ [α]Ｄ２５ -48.64 (c 0.09, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１９３Ｈ３３４Ｎ７０Ｏ５６): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4530.0
AAA: Asx, 2.2(2); Glx, 6.1(6); Ser,1.7(2); His, 3.0(3); Gly, 1.9(2);
hSer, 1.0(1); Thr, 1.0(1); Ala, 2.1(2); Arg, 7.2(7); Val, 0.8(1);
Ile, 1.0(1); Leu, 8.4(8); Lys, 2.1(2).
ホモセリンアルキルアミド類は、同様にして、ホモセリンラクトンを過剰の対応するアルキルアミンを含有するＤＭＦに溶解することにより、ホモセリンラクトンから製造した。室温で数日撹拌後（反応は分析用ＨＰＬＣにより監視した）、混合物を蒸発乾固させ、ペプチドを分取ＨＰＬＣにより精製した。代表的なホモセリンアルキルアミド類は、化合物５５および５６である。
【０１５２】
化合物５５:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH２CH３（配列番号６９)
(X=ホモセリン)
【化１１９】
物理データ: m.p. (測定せず) [α]Ｄ２５ (測定せず)
ＦＡＢ（Ｃ１７８Ｈ３０６Ｎ５６Ｏ５２): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4063.O
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 5.8(6); Ser, 1.7(2); His, 3.1(3)；Gly, 0.9(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 0.9(1); Arg, 3.0(3); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1);
Leu, 8.4(8); Lys, 3.7(4); hSer, 0.9(1).
【０１５３】
化合物５６:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH２CH２C６H５（配列番号７０)
(X=ホモセリン)
【化１２０】
物理データ: m.p. (測定せず) [α]Ｄ２５ (測定せず)
ＦＡＢ（Ｃ１８４Ｈ３１０Ｎ５６Ｏ５２): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4138.8
AAA: Asx, 2.0(2); Glx, 5.9(6); Ser, 1.7(2); His,2.9(3); Gly, 0.9(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 0.9(1); Arg, 3.0(3); Val,1.0(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.0(8); Lys, 4.1(4); hSer, 0.9(1).
【０１５４】
実施例IV
Ｎα−Ｂoc−Ｎγ−Ｆmoc−Ｌ−２,４−ジアミノ酪酸のセシウム塩をメリーフィールド樹脂（ＤＭＦ、５０℃、４８時間）に結合させ、実施例IにおけるようなＢoc−Ａla樹脂の代わりに固相合成に使用した。合成が完了したら、ペプチドをＤＭＦ中２０％ピペリジンで室温で３０分間処理して側鎖Ｆmoc保護基を除去した。保護ペプチドが自発的に環化してラクタムとなり、それによって樹脂から切り離された。溶液を樹脂から濾過し、油状物が残るまで真空蒸発させた。残渣を実施例Iにおけるように液体ＨＦで処理して、粗非保護ペプチドを得た。このペプチドを実施例Iにおけるように処理し、精製した。
【０１５５】
化合物４９:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX（配列番号６３)
（X=L-２,４−ジアミノブチリルラクタム）
【化１２１】
物理データ: m.p. 161-181℃ [α]Ｄ２５ -48.38 (c 0.25, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１７６Ｈ３００Ｎ５６Ｏ５１): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4016.8
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 6.3(6); Ser, 1.7(2); His, 3.3(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.0(1); Ala, 2.1(2); Arg, 2.9(3); Val, 0.9(1); Ile, 0.9(1);
Leu, 8.0(8); Lys,3.8(4).
【０１５６】
実施例Ｖ
実施例II由来のホモセリンラクトン類似体の水性溶液をブタ肝臓エステラーゼ（Sigma Chemical Company，St.Louis,MO）で処理した。ラクトンのＣ−末端ホモセリンへの加水分解は、分析用ＨＰＬＣにより監視した。加水分解が完了したと判断されたら、実施例Iにおけるようにその物質を分取ＨＰＬＣにより精製した。
【０１５７】
化合物３７:
AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-OH（配列番号５１)
(X=ホモセリン)
【化１２２】
物理データ: m.p. (測定せず) [α]Ｄ２５ (測定せず)
ＦＡＢ（Ｃ１７６Ｈ３０１Ｎ５５Ｏ５３): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4035.1
AAA: Asx, 2.1(2); Glx, 5.9(6); Ser, 2.0(2); His, 3.1(3); Gly, 0.8(1);
hSer, 0.8(1); Thr, 1.0(1); Ala, 1.0(1); Arg, 3.0(3); Val, 1.3(1);
Ile, 1.0(1); Leu, 8.1(8); Lys,3.8(4).
【０１５８】
実施例VI
実施例Iに従い、保護ペプチド樹脂BocAVS(Bzl)E(OBz)H(Bom)QLLHD(OBzl)R(Ts)GR(Ts)S(Bzl)IQD(OBz)LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLE(OBzl)R(Ts)LLK(Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAMを０.３５mmol規模で合成した。Ｎα基はすべてｔ−ブトキシカルボニル（Ｂoc）で保護し、側鎖保護基は指示通りであった。合成完了後、ペプチド樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ピペリジン５０mlで室温で３０分間処理してリジンのフルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）保護基をはずした。続いて、樹脂をＤＭＦ、ＭeＯＨ、ＣＨ２Ｃl２で洗浄し、乾燥して、部分的保護ペプチド１.６gを得た。部分的保護ペプチド０.８g（０.１７５mmol）を、ＤＭＦ２０ml中、ベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰyＢop）０.１６g（０.３mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤIＥＡ）０.０６７g（０.５２５mmol）の存在下、メトキシジ(エチレンオキシ)酢酸［ＰＥＧ(２)ＣＨ２ＣＯＯＨ］０.４４g（０.３mmol）を用い、室温で５時間、リジン上でアシル化した。５時間後、樹脂を濾過し、続いてＤＭＦ、ＭeＯＨおよびＣＨ２Ｃl２で洗浄した。アシル化工程は、樹脂のニンヒドリン処理結果が陰性になるまで２回繰り返した。最終ペプチドは、実施例Iにおけるように側鎖保護基の除去および精製により樹脂から切り離した。化合物１９の１００mgsが得られた。
【０１５９】
化合物１９
AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH（配列番号１８)
【化１２３】
物理データ:
m.p. 145-195℃ [α]Ｄ２５ -44.60°(c 0.2, H２O)
ＦＡＢ（Ｃ１８３Ｈ３１６Ｎ６４Ｏ５４): [Ｍ＋Ｈ]＋ 4276.2
AAA: Asp, 2.1(2); Glu, 5.0(5); Ser, 1.6(2); His, 2.9(3); Gly, 0.9(1);
Thr, 1.9(2); Arg, 7.1(7); Val, 1.1(1); Ile, 1.0(1); Leu, 8.0(8);
Lys, O.9(1).
【０１６０】
実施例VII
ペプチドを、２−メトキシポリル(エチレン−オキシ)酢酸[ＰＥＧ(5000)ＣＨ２ＣＯ２Ｈ]をアシル化剤として使用した以外は実施例IVと同様にして合成し、切り離し、精製した。部分的保護ペプチド０.８g（０.１７５mmol）から純粋な化合物２０を３００mgs得た。
【０１６１】
化合物２０
AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH（配列番号１９)
【化１２４】
物理データ:
m.p. 105℃ [α]Ｄ２５ -22.95°（c 0.11, 50％水性HOAc)
AAA: Asp, 2.0(2); Glu, 4.8(5); Ser, 1.6(2); His, 2.6(3); Gly, 1.1(1);
Thr, 1.1(1); Arg, 7.3(7); Val, 0.8(1); Ile, 0.9(1); Leu, 8.3(8);
Lys, 1.1(1); Ala,1.8(2).
【０１６２】
実施例ＶIII
ｈＰＴＨrp（１−３４）類似体遺伝子の合成
図１に示したヌクレオチド配列および酵素制限部位をもつｈＰＴＨrp（１−３４）類似体化合物４（配列番号９）をコードする合成遺伝子を設計した。必須オリゴデオキシヌクレオチドは、Sinha等、Nucleic Acid Research 12,4539-4557(1984）のホスホルアミダイト法を用いてＤＮＡ合成機（Milligen/Biosearch）により製造した。脱保護後、粗オリゴヌクレオチドを分取１５％ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動により精製した。オリゴヌクレオチドをＵＶで位置付けし、ゲルから摘出し、Waters C18 Sep-pak（登録商標）カートリッジで脱塩し、凍結乾燥させた。
【０１６３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を、"ＧeneＡmp"ＤＮＡ増幅キット（Perkin-Elmer Cetus）由来のＴaqポリメラーゼを含む試薬を用いてPerkin-Elmer Cetus熱循環器にて、９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で３分の２５サイクルで実施した。
２つの重複するオリゴヌクレオチドである８８量体（２μg)、ＰＴＨ３（配列番号３１）：
【化１２５】
およびアンチセンス９０量体（２μg）、ＰＴＨ４（配列番号３２）：
【化１２６】
をｈＰＴＨrp（１−３４）類似体遺伝子の鋳型ＤＮＡ配列として製造した。２つのフランキングプライマー、ＰＴＨＰＣＲ１：
【化１２７】
およびＰＴＨＰＣＲ２：
【化１２８】
を利用して、遺伝子全体をＰＣＲにより増幅した。増幅ＤＮＡ生成物を４％ＮuＳieve（登録商標）アガロースゲルでのゲル電気泳動により精製した。合成ｈＰＴＨrp（１−３４）類似体遺伝子を含有する、長さおよそ１５０塩基のバンドをゲルから摘出し、およそ２００ngのＤＮＡをElu-Quik（登録商標）ガラスゲルＤＮＡ抽出（Schleicher & Schuell，Keene，NH）により単離した。
【０１６４】
実施例IＸ
ｈＰＴＨrp(１−３４)１類似体遺伝子の分子クローニング
実施例ＶIのｈＰＴＨrp（１−３４）類似体遺伝子をサブクローンするために、増幅ＤＮＡ２００ngを単離し、制限酵素Ｈind IIIおよびＳac IIにより切断した。図２に示したように、ＤＮＡを、予めＨind IIIおよびＳac IIで切断しておいたＴrpＬＥ １８ Ｐrot（Ile３，Ｐro５）プラスミド２μgにライゲートさせた。
【０１６５】
次いで、ｈＰＴＨrp（１−３４）類似体遺伝子の１コピーを含有する得られたプラスミド、ＴrpＬＥ １８ ｈＰＴＨrp（１−３４）１をコンピーテントなＥ．coli ＨＢ １０１細胞（CLONTECH,Palo Alto,CA）に形質転換させた。形質転換体をＰＣＲ分析にかけ、その挿入を確認した。形質転換細胞コロニーを選択し、水２００μl中で５分間煮沸し、２μlを、その挿入物にフランクしている２つのプライマーを用いてＰＣＲにかけた。次いで、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて分析し、ｈＰＴＨrp（１−３４）遺伝子挿入物の１コピーの存在を確認した。次いで、ＴrpＬＥ １８ ｈＰＴＨrp（１−３４）１構築物を、ベンダーのDye Deoxy Terminator Sequencingキットを用いて、自動ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystemms Model 373A，Foster City,CA）でのＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１６６】
実施例Ｘ
ｈＰＴＨrp(１−３４)類似体遺伝子の多数コピーを含有する
Ｔrp ＬＥ １８ベクターの構築
唯一(unique)のＮheIおよびＸbaI制限部位は、ｈＰＴＨrp(１−３４)類似体遺伝子配列の始めと終わり近くに位置している。これらの２つの部位は、異なる配列を認識するが同一の一本鎖付着末端を生じるので、Ｔrp ＬＥ １８ベクター内での多数コピーｈＰＴＨrp(１−３４)遺伝子の構築を可能にするものである。
【０１６７】
タンデムの反復ｈＰＴＨrp(１−３４)配列を構築する方法は、図３に概略している。別の反応において、その遺伝子の単一コピーを含有するプラスミドＴrp ＬＥ １８ｈＰＴＨrp(１−３４)１ ５μgをＢamＨI＋ＮheIおよびＸbaI＋ＢamＨIで切断した。各消化物から、ｈＰＴＨrp(１−３４)類似体遺伝子を含有するフラグメント約３００ngを単離した。これら２つのフラグメントを混合し、ライゲートさせて、Ｔrp ＬＥ １８ ｈＰＴＨrp(１−３４)２プラスミドを形成した。このプラスミドを用いて、コンピーテントなＥ．coli ＨＢ １０１細胞を形質転換させた。１％アガロースゲルでの形質転換ＰＣＴ産物のサイジングを用いて２コピーのｈＰＴＨrp(１−３４)遺伝子挿入物が存在することを測定した。２コピーの遺伝子を含有するＴrp ＬＥ １８ｈＰＴＨrp(１−３４)２を、次いで、ＤＮＡ配列決定により確認した。２つのｈＰＴＨrp(１−３４)遺伝子が正確に融合したので、ＮheIおよびＸbaI部位をその接合点で除去した。これにより、タンデム遺伝子とフランキングしている残りのＸbaIおよびＮheI部位を唯一（ユニーク）にする。
この方法を繰り返すことにより、図４に示したように、ｈＰＴＨrp(１−３４)遺伝子の４コピーを含有する最終のプラスミドＴrp ＬＥ １８ｈＰＴＨrp(１−３４)４を構築した。Ｔrp ＬＥ １８ｈＰＴＨrp(１−３４)４の配列は、ＤＮＡ配列分析により、正確であることが分かった。
【０１６８】
実施例ＸI
Ｔrp ＬＥ １８ｈＰＴＨrp(１−３４)４の発現および精製
Ｔrp ＬＥ １８ｈＰＴＨrp(１−３４)４の導入
アンピシリン５０μg／mlおよびトリプトファン１００μg／mlを含有するＬＢ培地５０mlのスターター培養物、出典明示により本明細書の一部としたJ.H.Miller,"Experiments in Molecular Genetics,"p.431(1972)、にＴrp ＬＥ １８ｈＰＴＨrp(１−３４)４プラスミドを含有するＥ．coli細胞を接種し、Ａ５５０約６になるまで勢いよく撹拌しながら３７℃で一晩、生育させた。産生用のＬＢ培地２リットルを予め３７℃に加温し、スターター培養物２０mlに与えて、Ａ５５０を約０.０６にした。この培養物を次いで、Ａ５５０約０.６から０.８の間まで勢いよく撹拌しながら生育させ、それから１０mg／mlのインドールアクリル酸（IＡＡ）溶液２mlを加えた。十分に通気しながら約１６時間、最終Ａ５５０約６（典型的には、４から１０の間）まで生育を続けさせた。細胞を遠心分離により濃縮し、５０mＭトリス−ＨＣl、ｐＨ７.５、０.１mＭＥＤＴＡ緩衝溶液（トリス緩衝液） ５００mlに再懸濁させた。
この懸濁液を、オーバーヒートを避けるため最大能力の５０％で操作したHeat Systems-Ultrasonics,Inc.モデル２２０Ｆソニケーター（３/４"ホーン装備）を用いて超音波処理した。
導入の度合いを測定するために、細胞全体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｔrp ＬＥ １８ ｈＰＴＨrp(１−３４)４構築物由来の遺伝子産物が予測ＭＷ約１７,０００の主要バンドとして観察された。これは、全細胞タンパク質の１０％程度と思われる。
融合タンパク質の単離
細胞溶解物を約３６００×gで１５分遠心分離して、Ｔrp ＬＥ １８ ｈＰＴＨrp(１−３４)４融合タンパク質をペレット状にし、上清は捨てた。ペレットをトリス緩衝液２００ml（典型的には４０−５０Ａ５５０／ml）に再懸濁した。
【０１６９】
実施例ＸII
融合タンパク質のプロセッシングおよびホモＳerラクトンｈＰＴＨrp(１−３４)ペプチドの精製
ｈＰＴＨrp(１−３４)多量体融合タンパク質にフランキングするメチオニン残基のＣＮＢrでの切断により、所望のホモＳerラクトンｈＰＴＨrp(１−３４)ポリペプチドが放出され、これを下記のように精製した。
融合タンパク質のＣＮＢr処理
洗浄したＴrp ＬＥ １８ ｈＰＴＨrp(１−３４)４融合タンパク質のペレットを７０％ギ酸６０ml中で穏やかに撹拌しながら再懸濁した（約２０mg／ml総タンパク質；典型的には、１０００Ａ５５０ユニットの細胞由来の物質を３mlに溶解する）。２、３滴のオクタノールを加え、その溶液に２０分間、Ｎ２を通気させた後、ＣＮＢr５.５gを加えた。この反応を２５℃で６時間進行させ、その後、等容量の５０：５０ ＭeＯＨ：Ｈ２Ｏを試料と混合し、続いて、それを回転蒸発により除去した。このプロセスを２ないし４回繰り返し、大部分のギ酸およびＣＮＢrを実質的に除去した。それから、試料を蒸発乾固させ、水２００mlに再溶解し、貯蔵のために凍結乾燥させた。
ホモＳerラクトンｈＰＴＨrp(１−３４)の精製
ＣＮＢr切断上清をＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６.５で２４時間、何度も替えながら透析した。透析中、ｐＨは６.５に維持した。透析後、沈澱物を高速遠心により除去した。上清をゲルマン０.４５μフィルター装置（Acrodisc 4184）により透明にした。
【０１７０】
カチオン交換クロマトグラフィー
最初の精製は、Bio-Gel TSK-SP-5PW ＨＰＬＣカラム（２１.５×１５０mm）でのカチオン交換クロマトグラフィーにより行った。流速８ml／分および高度に精製したホモＳerラクトンｈＰＴＨrp(１−３４)ペプチドの収量をおよそ１２mgにするためのクロマトグラフィー条件は：
１．５０mＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６.５でカラム平衡化
２．透明化上清１０mlの充填(培養ブロスおよそ１.５Ｌまたは封入物２.４g)
３．ベースラインが安定するまで５０mＭ ＮaＣlを含有する５０mＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６.５でカラム洗浄
４．９０mＭ ＮaＣlを含有する５０mＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６.５でカラム溶出
約４５分間、画分を集める
５．プールおよび貯蔵の前に、Ｃ１８ＨＰＬＣにより９０mＭ ＮaＣl画分をホ モＳerラクトンｈＰＴＨrp(１−３４)含量について分析
【０１７１】
逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
逆相Ｐoros Ｒ／Ｈ ４.６×１００mmカラム（Perseptive Biosystems,Cambridge,MA）を最終精製工程に使用した。クロマトグラフィー条件は下記の通りである：
【表４】
ホモＳerラクトンｈＰＴＨrp(１−３４)、化合物４の保持時間は、およそ２.９４３分であった。精製ペプチドは、質量分析により測定したところ純度およそ９８％であった。
【０１７２】
実施例ＸIII
総括的にGunness-HeyおよびHock,Metab.Bone Dis.5:177 181(1984)の方法に従い、本発明の化合物を卵巣摘出ラットの骨量に対するその効果について評価した。 成体スプラーグ−ダウレイ雌ラットを環境に順応させ、体重グループで分け（ｎ＝９、１０または１２)、左右の卵巣摘出（ＯＶＸ）、または模擬手術を行った。投与は、手術後１７日で開始し、２０日間続けた。試験化合物は２％ラット血清／食塩水媒体で１日に１回、皮下投与した。
【０１７３】
投与２０日後、ラットを屠殺し、右大腿骨を摘出した。大腿骨を半分に切り、遠位半分大腿骨（distal half femures）（ＤＨＦ）を更に、ドリルを使って、海綿骨（ＴＢ）と皮質骨（ＣＢ）に分けた。カルシウムを抽出し、Calcetteカルシウム分析機により測定し、mg／ＤＨＦ／１００g体重における平均骨Ｃaとして現した。
【０１７４】
２つの試料のｔ検定を用いて、ＯＶＸおよび模擬グループを比較した。一方向ＡＮＯＶＡを用いてＯＶＸグループを比較し、続いて、フィッシャーのＬＳＤ多重比較により、各処置グループと媒体を比較した。
【０１７５】
卵巣摘出は、主に、海綿骨からの実質的な骨全体の減少を誘導した。骨全体のカルシウムは、模擬手術対照よりも４７ないし５４％低かった。
８０μg／kg／日でのｂＰＴＨ(１−３４)およびｈＰＴＨrp(１−３４)は、統計的に、処置ＯＶＸラットについて骨全体のカルシウムをそれぞれ５３から９５％および１８から４０％の範囲で有意に増大させたが、しかし、皮質骨カルシウムの有意な増大はなかった。
【０１７６】
本発明の化合物を８０μg／kg／日で投与すると、骨全体のカルシウムが６６から１３８％まで増大し、海綿骨のカルシウムが８７から１２８％まで増大した。皮質骨カルシウム、海綿骨厚、および骨体積は、非処置ＯＶＸ対照でも有意に増大した。
このアッセイでは、下記の化合物を試験した：
【表５】
【０１７７】
同様の研究にて、卵巣摘出ラットに５、１０および２０日間、４０μg／kg／日投与した結果は、下記である：
【表６】
【０１７８】
実施例ＸIＶ
成熟ニュージーランド・ホワイト雌ウサギ（Hazelton Research Products,Inc.,３.６kg，ｎ＝９−１１／処置グループ）に、媒体をまたはプレドニソン０.１５mg／kgを１３カ月毎日注射した。骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を二次元エネルギーＸ線吸光光度計（Hologic Model QDR-1500W,Hologic, Inc.,Waltham,MA）により測定し、骨代謝の生化学的マーカーを追跡した。９カ月後、サブグループには、更に、化合物１（配列番号７）を０.０５、０.１５、または０.５μg／kg／日、皮下投与した。２カ月後、用量を０.５、３および１０μg／kg／日に上げた。プレドニソン処置の結果、迅速な初期減少（２−４カ月）、続いて残りの研究期間、安定なＢＭＤをもたらした。１２.４±１.３％、１８.１±１.９％、および１１.８±２.５％のベースラインからのＢＭＤの最終的な減少は、腰部脊椎Ａ／Ｐ面、側部面、および遠位大腿骨において観察された。大腿部骨幹ではより少ない減少（７.８±２.２％）が観察された。初期用量を低くしても、これらの特徴は変わらなかった。３０−６０日後、プレドニソンを与え続けた動物に化合物１ １０μg／kg／日を与えると、全ての部位で、媒体単独で１２カ月処置した対照ウサギで観察された値と有意に相異しない値までＢＭＤを回復した。血清オステオカルシンは、プレドニソン処置ウサギにおいてベースライン５０±８ng／mlから６.４倍低下したが、化合物１ １０μg／kg／日を同時に与えることにより正常に戻った。
【０１７９】
配列表
（１） 一般的情報：
（i） 特許出願人：
（Ａ） 名称：シンテックス（ユー・エス・エー）インコーポレイテッド
（ii） 発明の名称：コルチコステロイド誘導オステオペニアの処置法
（iii） 配列の数：８６
（iv） 連絡先
（Ａ）名宛人：ヘラー・アーマン・ホワイト・アンド・マックォリフ
（Ｂ）通り：ユニバーシティー・アベニュー５２５番
（Ｃ）市：パロ・アルト
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺIＰ：９４３０１
（v） コンピューター解読書式：
（Ａ） 媒体型：フロッピー・ディスク
（Ｂ） コンピューター：IＢＭ ＰＣコンパティブル
（Ｃ） オペレーティング・システム： ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ） ソフトウエア：PatentIn Release #１.０、Version #１.２５
（vi） 本出願のデータ：
（Ａ） 出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９６／０８４９０
（Ｂ） 出願日：１９９６年６月３日
（Ｃ） 分類：
（viii） 代理人情報：
（Ａ） 氏名：チョウ，ワイ・ピン
（Ｂ） 登録番号：３０,７４０
（Ｃ） 参照／整理番号：２７６１０−０３
（ix） 電話連絡先情報：
（Ａ） 電話番号：４１５−３２４−７０７８
（Ｂ） ファックス番号：４１５−３２４−０６３８
（２） 配列番号１の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号１：
（２） 配列番号２の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号２：
（２） 配列番号３の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号３：
（２） 配列番号４の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号４：
（２） 配列番号５の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号５：
（２） 配列番号６の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号６：
（２） 配列番号７の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号７：
（２） 配列番号８の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：３４
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa３４＝ホモセリン”
（xi） 配列：配列番号８：
（２） 配列番号９の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：３４
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa３４＝ホモセリンラクトン”
（xi） 配列：配列番号９：
（２） 配列番号１０の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３７アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（xi） 配列：配列番号１０：
（２） 配列番号１１の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号１１：
（２） 配列番号１２の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号１２：
（２） 配列番号１３の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号１３：
（２） 配列番号１４の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号１４：
（２） 配列番号１５の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号１５：
（２） 配列番号１６の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号１６：
（２） 配列番号１７の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号１７：
（２） 配列番号１８の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：２９
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa２９＝リジン−(OCCH２(OCH２CH２)２OCH３)”
（xi） 配列：配列番号１８：
（２） 配列番号１９の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：２９
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa２９＝リジン−(OCCH２(OCH２CH２)１１０OCH３)”
（xi） 配列：配列番号１９：
（２） 配列番号２０の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号２０：
（２） 配列番号２１の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号２１：
（２） 配列番号２２の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号２２：
（２） 配列番号２３の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa８＝ノルロイシン”
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：１８
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa１８＝ノルロイシン”
（xi） 配列：配列番号２３
（２） 配列番号２４の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa８＝ノルロイシン”
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：１８
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa１８＝ノルロイシン”
（xi） 配列：配列番号２４：
（２） 配列番号２５の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３５アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号２５：
（２） 配列番号２６の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：らせん状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：中間部
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa８＝グルタミン酸またはアルギニン”
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Region
（Ｂ）存在位置：１..１０
（Ｄ）他の情報：／注＝“配列２６は配列５、６、７、８、９、１０、１１、 １２、１３および１４の２２ないし３１位にはめ 込まれる”
（xi） 配列：配列番号２６：
（２） 配列番号２７の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：らせん状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：中間部
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：８
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaa８＝グルタミン酸、リジン、
またはリジン−(OCCH２PEGX)”
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Region
（Ｂ）存在位置：１..１０
（Ｄ）他の情報：／注＝“配列２７は配列１５、１６、１７、１８および１ ９の２２ないし３１位にはめ込まれる”
（xi） 配列：配列番号２７：
（２） 配列番号２８の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：らせん状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：中間部
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Peptide
（Ｂ）存在位置：１..１０
（Ｄ）他の情報：／注＝“配列２８は配列２０の２２ないし３１位にはめ込 まれる”
（xi） 配列：配列番号２８：
（２） 配列番号２９の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：らせん状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：中間部
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Peptide
（Ｂ）存在位置：１..１０
（Ｄ）他の情報：／注＝“配列２９は配列２１の２２ないし３１位にはめ込 まれる”
（xi） 配列：配列番号２９：
（２） 配列番号３０の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１０アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：らせん状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：中間部
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Peptide
（Ｂ）存在位置：１..１０
（Ｄ）他の情報：／注＝“配列３０は配列２２の２２ないし３１位にはめ込 まれる”
（xi） 配列：配列番号３０：
（２） 配列番号３１の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：８８塩基対
（Ｂ） 配列の型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：cＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
（xi） 配列：配列番号３１：
（２） 配列番号３２の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：９０塩基対
（Ｂ） 配列の型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：cＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＹＥＳ
（xi） 配列：配列番号３２：
（２） 配列番号３３の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２３塩基対
（Ｂ） 配列の型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：cＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＮＯ
（xi） 配列：配列番号３３：
（２） 配列番号３４の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ） 配列の型：核酸
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：cＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（iv） アンチセンス：ＹＥＳ
（xi） 配列：配列番号３４：
（２） 配列番号３５の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号３５：
（２） 配列番号３６の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：３４
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaaはホモセリンである”
（xi） 配列：配列番号３６：
（２） 配列番号３７の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：３４
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaaはホモセリンである”
（xi） 配列：配列番号３７：
（２） 配列番号３８の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号３８：
（２） 配列番号３９の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号３９：
（２） 配列番号４０の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３５アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号４０：
（２） 配列番号４１の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３７アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号４１：
（２） 配列番号４２の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３８アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：３８
（Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘaaはホモセリンである”
（xi） 配列：配列番号４２：
（２） 配列番号４３の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号４３：
（２） 配列番号４４の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号４４：
（２） 配列番号４５の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（xi） 配列：配列番号４５：
（２） 配列番号４６の情報：
（i） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：３４アミノ酸
（Ｂ） 配列の型：アミノ酸
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii） ハイポセティカル：ＮＯ
（v） フラグメント型：Ｎ−末端
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：Modified-site
（Ｂ）存在位置：１３
（Ｄ）他の情報：／注＝“ＸaaはＣys(CH-2CONH(CH-2)-2NH(ビオチニル))で ある”
（xi） 配列：配列番号４６：
（２） 配列番号４� | |