破骨細胞の分化・増殖阻害剤

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【発明の名称】	破骨細胞の分化・増殖阻害剤
【発明者】	【氏名】河岸洋和【氏名】▲高▼橋守【氏名】山口宏二【氏名】矢澤一良
【要約】	【課題】破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬及び食品を提供する。【構成】破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬又は食品であって、下記の式(1)及び／又は式(2)（R¹及びR²は水素原子、アルキル基、又はアルカノイル基を示し、立体配置は絶対配置を示す）で表される化合物を有効成分として含む医薬又は食品。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬であって、下記の式(1)及び／又は式(2)：
【化１】

（式中、R¹及びR²は水素原子、アルキル基、又はアルカノイル基を示し、式中の立体配置は絶対配置を示す）で表される化合物を有効成分として含む医薬。
【請求項２】
破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、及び悪性腫瘍からなる群から選ばれる疾患である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いる請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
請求項１に記載の式(1)及び／又は(2)で表される化合物を含む破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害剤。
【請求項５】
破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、請求項１に記載の式(1)及び／又は(2)で表される化合物を有効成分として含む食品。
【請求項６】
飲食品の形態の請求項５に記載の食品。
【請求項７】
請求項１に記載の式(1)で表される化合物。

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞の分化及び／又は増殖を抑制する活性を有する化合物を有効成分として含む医薬及び該化合物を含む健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では2000年には高齢化率が17％を突破し、平均寿命も20年間世界一の高齢化社会を維持している。この急激な高齢化に伴い老化によるさまざまな慢性疾患が急増している。特に高齢者の生活の質を脅かす骨折とその原因となる骨粗鬆症の予防に関心が寄せられている。日本には1000万人の骨粗鬆症患者がおり、寝たきり高齢者の20％が骨折を原因とすると言われている。
【０００３】
骨粗鬆症は骨の骨量が減少し骨梁がなくなっていく病態を示す疾患である。骨量は、骨を作る骨芽細胞の活性（増殖）と骨を壊す破骨細胞の活性(増殖)とのバランスによってコントロールされている。骨形成と骨吸収とのサイクルは骨のリモデリングと呼ばれる。
【０００４】
破骨細胞は造血系の幹細胞に由来し、単球・マクロファージ系の前駆細胞から分化する巨細胞である。破骨細胞は正常な骨組織の発達及びリモデリングに関与しているが、骨粗鬆症における骨量減少、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、及び悪性腫瘍の骨転移などの病態に破骨細胞が重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１及び２）。
【０００５】
進行性の悪性腫瘍はしばしば骨転移をきたし、患者のQOLを損なう。骨転移の初期には、先ず破骨細胞が骨基質の破壊を促進し、そこに悪性腫瘍細胞が生着すると言われている。また、悪性腫瘍の成長に重要な血管新生促進因子と破骨細胞の骨吸収活性との間に強い因果関係があることが示唆されている（非特許文献３、４、５、及び６）。
【０００６】
これまで、骨粗鬆症治療薬としてはカルシウム製剤、エストロゲン製剤、イソフラボン製剤、カルシトニン製剤、ビスフォスフォネート製剤、活性型ビタミンＤ製剤、及びビタミンＫ製剤が使用されている。微生物由来の物質としてリベロマイシンA（特許文献１）、植物由来の物質として大豆やクローバーのイソフラボンやマチョエキス（特許文献２）が知られている。また、本発明者らにより、破骨細胞の分化及び増殖を抑制する医薬及び食品が提供されている（特許文献３）。
【特許文献１】特許第１９０５３３０号
【特許文献２】特開２００３－３１３１３７号公報
【特許文献３】国際公開WO2005/087248
【非特許文献１】Woodhouse, E. C., Cancer, 80(8Suppl), pp.1529-1537, 1997
【非特許文献２】Paleolog, E. M., J. Rheumatol., 35, pp.917-919, 1996
【非特許文献３】Leung, D.W., Science, 246, pp.1306-1309, 1989
【非特許文献４】Goad, D. L., Endocrinology, 137, pp.2262-2268, 1996
【非特許文献５】Gerber, H.P., Nat. Med., 5, pp.623-628, 1999
【非特許文献６】Niida, S., J. Exp. Med., 190, pp.293-298, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、骨粗鬆症における骨量減少の抑制や慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、あるいは悪性腫瘍の骨転移などの予防及び／又は治療のために有用な医薬又は食品を提供することにある。より具体的には、破骨細胞の分化又は増殖に対して抑制作用を有する物質を有効成分として含む医薬又は食品を提供することが本発明の課題である。さらに、破骨細胞の分化又は増殖に対して抑制作用を有する物質であって、安全性の高い物質を提供することも本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、安全性の高い物質を大量かつ安価に入手すべく、長い食習慣を有する食材としての茸に着目した。そして、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、茸粉砕物、茸抽出物などの茸の加工物が破骨細胞の分化又は増殖を抑制する作用を有することを見出した。そして、上記の茸の加工物が骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移などの破骨細胞の分化又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として優れた作用を有していること、及び上記の茸の加工物を含む食品が上記疾患の予防及び／又は治療のための健康食品として有用であることを見出した（上記特許文献３）。
【０００９】
本発明者らはさらに研究を続けた結果、下記の式で表される化合物が骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移などの破骨細胞の分化又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として優れた作用を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明により、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬であって、下記の式(1)及び／又は式(2)：
【化１】

で表される化合物（式中、R¹及びR²は水素原子、アルキル基、又はアルカノイル基を示し、式中の立体配置は絶対配置を示す）を有効成分として含む医薬が提供される。
【００１１】
上記発明の好ましい態様によれば、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、及び悪性腫瘍からなる群から選ばれる疾患である上記の医薬、及び骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いる上記の医薬が提供される。
【００１２】
別の観点からは、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬であって、上記式(1)及び／又は(2)で表される化合物を有効成分として含む医薬；及び、上記式(1)及び／又は(2)で表される化合物を有効成分として含む破骨細胞の分化及び／又は増殖の阻害剤が提供される。
また、上記の医薬の製造のための上記式(1)及び／又は(2)で表される化合物の使用、及びヒトを含む哺乳類動物の体内において破骨細胞の分化及び／又は増殖を阻害する方法であって、上記式(1)及び／又は(2)で表される化合物を該動物に投与する工程を含む方法、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療方法であって、上記式(1)及び／又は(2)で表される化合物をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【００１３】
さらに別の観点からは、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、上記式(1)及び／又は(2)で表される化合物を有効成分として含む食品が本発明により提供される。上記発明の好ましい態様によれば、飲食品の形態の上記食品も本発明により提供される。
また、本発明により、上記式(1)で表される新規化合物も提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有しており、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患（例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、又は悪性腫瘍など）の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。上記の医薬は、特に骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いることができる。
【００１５】
また、本発明の食品は、上破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有しており、例えば骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療などを目的とする健康食品として用いることができる。
さらに、本発明により提供される式(1)で表される新規化合物は、上記の医薬又は上記食品の有効成分として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明により提供される医薬及び食品の有効成分である上記式(1)は新規化合物であり、上記式(2)で表される化合物のうちR²が水素原子である化合物（4-ヒドロキシ-17-メチルインシステロール）は既知化合物である（Biochemical Pharmacology, 15, pp.583-590, 1998)。R¹及びR²が示すアルキル基としては、直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれでもよく、例えばC_1-6アルキル基が好ましく、より好ましくはC_1-4アルキル基である。アルキル基としてはメチル基が好ましい。R¹及びR²が示すアルカノイル基のアルキル部分としては上記のアルキル基を用いることができ、好ましいアルカノイル基としてアセチル基を挙げることができる。R¹及びR²としては、水素原子、メチル基、又はアセチル基が好ましく、水素原子であることが特に好ましい。
【００１７】
上記式(1)及び式(2)で表される化合物は、例えば本明細書の実施例に具体的に記載された方法に従って、茶樹茸から分離・精製することができ、あるいは化学合成手段により製造することも可能である。式(2)で表される化合物は上記文献に記載された方法により入手することもでき、式(2)で表される化合物の側鎖の二重結合を還元して式(1)で表される化合物を製造することもできる。
【００１８】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対して抑制作用を有している。この作用はインビトロで破骨細胞活性に対する直接作用を調べることにより当業者が容易に確認することができ、例えば国際公開WO2005/87248号及び本明細書の実施例に具体的に説明された方法に従って確認することができる。
【００１９】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬として用いることができる。上記疾患としては、例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、又は悪性腫瘍などを挙げることができるが、本発明の医薬の適用疾患はこれらの疾患に限定されることはない。より具体的には、本発明の医薬は、骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のための医薬として好ましく用いられる。
【００２０】
本発明の医薬としては、有効成分である上記式(1)又は式(2)で表される化合物、又はそれらの混合物を単独で投与してもよいが、骨組織と親和性の強い化合物、たんぱく質、又はペプチドなどの物質と組み合わせた医薬組成物、又はこれらの物質と上記式(1)及び／又は式(2)で表される化合物とを結合させた有効成分を含む医薬を調製して投与することもできる。医薬組成物として調製する場合には、医薬の製造に通常用いられる１種又は２種以上の製剤用添加物（例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、分散化剤、又は香料など）を用いることができ、常法により、液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、チュアブル剤等の経口投与用の医薬組成物を調製することができる。また、注射剤や坐剤などの非経口投与用の医薬組成物を調製してもよい。
【００２１】
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、患者の体重、性別、及び年齢等の条件、予防又は治療の目的、対象疾患の種類などの条件に応じて適宜選択できる。通常は、有効成分である上記式(1)及び／又は式(2)で表される化合物の重量として成人１日あたり1～1,000 mg程度である。
【００２２】
本発明により提供される食品は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、上記式(1)及び／又は式(2)で表される化合物を有効成分として含むことを特徴としている。本発明の食品の種類は特に限定されず、例えば、健康飲料、菓子類、加工食品などに適宜の量の上記式(1)及び／又は式(2)で表される化合物を配合することが可能である。本発明の食品は、骨量減少の抑制や骨関節破壊などの予防を目的とした健康食品として用いることができるが、本発明の食品の使用目的は上記に例示した目的に限定されることはない。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１（参考例）
骨髄由来の破骨前駆細胞からM-CSFとRANKLを用いて破骨細胞を誘導する系が確立されている（Journal of Bone and Mineral Research, 15, pp.1477-1488, 2000; Experimental Cell Research, 216, pp.335-342, 1995; Biochemical Biophysical Research Communications, 264, pp.590-595, 1999)。市販の破骨細胞培養キットを用いてもよい。本参考例では国際公開WO2005/87248の例５に記載された方法に従って、理研ジーンバンクのラット子宮エストロジェン受容体cDNA（pUC-ER6, RDB No. 1376）を遺伝子挿入して誘導したRAW264.7細胞をG418(600μg/mL）を入れた培地で増殖させた破骨細胞を用いた。
【００２４】
ERαをトランスフェクトさせたRAW264.7細胞を、100U/mLペニシリンと100μg/mLストレプトマイシン入りのフェノールレッドフリーの10％非動化処理CD-FBSのα-MEM培地に懸濁し、48ウェルの培養プレートに20000個／ウェルになるように接種し100ng/mL RANKLの存在下において37℃、5％炭酸ガス中において培養した。同時にDMSOに溶解させた茸抽出物(100mg/mL)をそれぞれ培養液に0.1％添加し培養した。ヤマブシタケ抽出物は1％添加し培養した。４日後に培地を交換し、さらに７日間培養後、培地を吸引除去し、PBSで2回洗浄後、細胞を固定し、シグマ社製の酒石酸抵抗性フォスファターゼ染色キットを用いて染色した。その結果、少なくとも、エリンギ、茶樹茸、松茸のクロロホルム抽出部に破骨細胞の分化・増殖に対する高い阻害活性を確認した。松茸には細胞死誘導が観察された。ヤマブシタケのクロロホルム抽出部にも弱いながら破骨細胞の分化及び増殖に対する抑制活性が認められた。
【００２５】
例２
茶樹茸乾燥子実体(1.5kg)をクロロホルム、酢酸エチル、エタノールで順次抽出し、抽出物を減圧濃縮した。得られたクロロホルム可溶部(32.4g)、酢酸エチル可溶部(2.8g)、エタノール可溶部(60.0g)の一部について骨髄細胞と骨芽細胞様間質細胞の共存培養法を用い、破骨細胞形成阻害試験を行った。骨髄細胞と骨芽細胞様間質細胞を活性ビタミンDの存在下で共存培養すると、酒石酸耐性酸性抵抗性フォスファターゼ(TRAP)を有する破骨様多核細胞（破骨細胞）に分化し、破骨様多核細胞（破骨細胞）はTRAP染色で陽性を示す。これを利用し、マウス由来の骨髄細胞と骨芽細胞様間質細胞の共存培養法により培養し、破骨細胞の形成数をカウントし、サンプルの阻害活性を評価したところ、クロロホルム可溶部のみに阻害活性が見られた。コントロールは活性ビタミンDのみを添加した。
【００２６】
クロロホルム可溶部をシリカゲルカラムに供し、順次極性を上げ溶出を行った。得られた各画分について再度破骨細胞形成阻害試験を行ったところ、NMRスペクトルでステロイド様骨格を示す画分AC-C-7, AC-C-8に阻害活性が見られた。AC-C-7を再結晶化によって結晶と濾液に分け、濾液画分(4.85g)を再度シリカゲルカラムに供し、順次極性を上げ溶出を行った。再結晶化で得られたエルゴステロールやエルゴステロール・パーオキサイドとは異なるステロイド様のNMRスペクトルを示したAC-C-7(O)-6(134.4mg)、 AC-C-7(O)-7(113.0mg)を分取TLCによって分画した。同様にAC-C-8(71.6mg)を分取TLCによって分画し、これら分取TLCで得られたAC-C-7(O)-6-6(44.4mg)、AC-C-7(O)-7-6(42.2mg)、AC-C-8-6(7.0mg)、AC-C-8-7(6.6mg)をC30カラムを用いて分離及び精製を行ったところAC-C-C30HPLC-3（化合物１、1.4mg）、AC-C-C30HPLC-2（化合物２、8.1mg）が単離された。
【００２７】
これらの化合物１及び化合物２について、¹H-NMR及び¹³C-NMRによる構造解析を行った結果、化合物２は既知化合物である4-ヒドロキシ-17-メチルインシステロールであることが確認され（Biochemical Pharmacology, 15, pp.583-590, 1998)、化合物１は新規化合物であると推定された。
【表１】

【００２８】
これらの化合物１及び化合物２について破骨細胞形成阻害試験を行った。また同時にＭＴＴ活性も測定し、細胞毒性の有無を確認した。結果を図１及び２に示す。化合物１及び化合物２はともに破骨細胞形成の阻害活性を有しており、MTT活性の減少も認められなかった。従って、これらの化合物は破骨細胞形成を特異的に阻害する作用を有すると結論された。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】式(1)で表される化合物の破骨細胞様細胞の形成数及びMTT活性との対コントロール比を表すグラフである。
【図２】式(2)で表される化合物の破骨細胞様細胞の形成数及びMTT活性との対コントロール比を表すグラフである。

【出願人】	【識別番号】３０４０２３３１８【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学【識別番号】５０４１４１７６８【氏名又は名称】ＺＭＣ－ＫＯＵＧＥＮ株式会社【識別番号】５０４１９６３００【氏名又は名称】国立大学法人東京海洋大学
【出願日】	平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【代理人】
【公開番号】	特開２００８－１９２２３（Ｐ２００８－１９２２３Ａ）
【公開日】	平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【出願番号】	特願２００６－１９３７７２（Ｐ２００６－１９３７７２）