| 【発明の名称】 |
内毒素または超抗原に誘導された毒性を治療するインターロイキン−１０類似体またはアンタゴニストの使用 |
| 【発明者】 |
【氏名】デ・ワル・マレフィット，レネ
【氏名】ハワード，モーリーン
【氏名】ス，ディ・ウェイ
【氏名】イシダ ヒロシ
【氏名】オガーラ，アン
【氏名】スピッツ，ハーゲン
【氏名】ズロトニック，アルバート
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| 【要約】 |
【課題】敗血症性又は毒素性ショックを治療する方法を提供する。
【構成】インターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを有効成分として含んでなる、宿主における炎症を調節するための医薬組成物；ならびに免疫機能を調節する、特に、微生物によって引起こされたショックまたは制御Ｂ細胞の分化若しくは発生の有害な作用を防止するおよび／または低減するためのＩＬ−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストの使用法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書等に記載されるような、内毒素または超抗原に誘導された毒性を治療するインターロイキン−１０
類似体またはアンタゴニストの使用。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症性または毒素性ショック様症状、例えば、内毒素または超抗原に誘導
された毒性および自己免疫状態の治療を含む、有効量のインターロイキン−１０（ＩＬ−
１０）またはその類似体若しくはアンタゴニストを投与することによって免疫応答を調節
する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
苛酷な感染は、大きな生理学的および代謝の変化を引起こすことがある。症状は様々で
あるが、発熱、低血圧症、代謝性アシドーシス、組織壊死、広範囲にわたる器官機能不全
および、正しく治療されない場合、最終的には致死を挙げることができる。例えば、それ
ぞれ本明細書中に参考として包含されているバーコウ（Ｂｅｒｋｏｗ）（監修）Ｔｈｅ
Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，ローウェー，ニュージャージー州；ウェザラル（Ｗｅａｔｈ
ｅｒａｌｌ）ら（監修）Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，オ
クスフォード・ユニバーシティー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒ
ｅｓｓ），ニューヨーク；ブラウンワルド（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ）ら（監修）Ｈａｒｒｉ
ｓｏｎ′ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，マグロー
・ヒル，ニューヨーク；またはワインガーデン（Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ）ら（監修）Ｃｅ
ｃｉｌ′ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，サンダース・カンパニー（Ｓ
ａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．），フィラデルフィアを参照されたい。敗血症性ショックおよび
毒素性ショック症状は種々の感染応答に特有であり、しばしば、若干のまたは全てのこれ
らの症状を示す。
【０００３】
敗血症性ショックは内毒素に誘導された応答の典型である。敗血症性ショックは、内毒
素、典型的には、グラム陰性細菌の細胞壁からのリポ多糖（ＬＰＳ）成分が免疫系に出現
することによって引起こされる。毒素性ショックは超抗原に誘導された応答の典型であり
、グラム陽性細菌の細胞膜からのタンパク質成分、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン
Ｂ（ＳＥＢ）の放出によって引起こされる。応答は両方とも微生物感染によって最初に引
起こされるが、免疫系は微生物産物に対して異なったように応答してそれらのそれぞれの
応答を引起こす。
【０００４】
内毒素、例えば、ＬＰＳによって引起こされたショック応答において、宿主由来タンパ
ク質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はグラム陰性敗血症の多数の有害な作用を引起こすこ
とが最近実証された。ＴＮＦに対する抗血清による受動免疫は、グラム陰性菌血症または
内毒素血症の多数の致命的作用を防止することができる。例えば、トレイシー（Ｔｒａｃ
ｅｙ）ら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：４７０〜４７４；ビュートラー（Ｂｅｕ
ｔｌｅｒ）ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５８４〜５８８；およびトレイシーら
（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６６２〜６６４を参照されたい。ＴＮＦの高血清濃
度は、髄膜炎菌性髄膜炎、マラリアおよびリーシュマニア症を含むいくつかの他の感染症
においても観察された。ＴＮＦの循環濃度が高い多数の患者の器官機能不全は更に高い死
亡率とともに増大した。例えば、ワージ（Ｗａａｇｅ）ら（１９８７）Ｌａｎｃｅｔ ３
５５〜３５７；ジラーディン（Ｇｉｒａｒｄｉｎ）ら（１９８８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ
．Ｍｅｄ．，３１９：３９７〜４００；スキュデリー（Ｓｃｕｄｅｒｉ）ら（１９８８）
Ｌａｎｃｅｔ １３６４〜１３６５；およびカーン（Ｋｅｒｎ）ら（１９８９）Ａｍ．Ｊ
．Ｍｅｄ．，８７；１３９〜 を参照されたい。
【０００５】
動物かまたはヒト被験者に対するＴＮＦの投与により、２〜６時間後に検出可能なイン
ターロイキン−６（ＩＬ−６）血清濃度を生じたことが報告された。マッキントッシュ（
ＭｃＩｎｔｏｓｈ）ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１６２〜１６７；ジャ
ブロンズ（Ｊａｂｌｏｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２巻，１５４２頁（１９８
９）；およびブロッカート（Ｂｒｏｕｃｋａｅｒｔ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９
巻，２２５７頁（１９８９）。Ｂ細胞刺激因子２、インターフェロン−β２または肝細胞
刺激因子としても知られているＩＬ−６は、Ｂ細胞成熟を引起こすＴ細胞由来の糖タンパ
ク質として同定された。例えば、キシモト（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ）、Ｂｌｏｏｄ ７４：
１〜１０を参照されたい。更に最近、ＩＬ−６は、肝細胞中の鋭敏タンパク質の誘導並び
に造血系前駆細胞およびＴ細胞に対する作用を含む多面的生物活性を有することが実証さ
れた。例えば、ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８巻，
７１７頁（１９８８）；マリンジョビク（Ｍａｒｉｎｊｏｖｉｃ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１．４２巻，８０８頁（１９８９）；モロン（Ｍｏｒｒｏｎｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２６３巻，１２５５４頁（１９８８）；およびパールムッター（Ｐｅｒｌ
ｍｕｔｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｒｓｔ．，８４巻，１３８頁（１９８９）を
参照されたい。スターンズ（Ｓｔａｒｎｅｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５巻，４
１８５〜４１９１頁（１９９０）には、敗血症性ショックのマウスモデルにおいてＩＬ−
６に対する抗体アンタゴニストが生存を延長することが示された。
【０００６】
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は超抗原であり、毒素性ショック反応を引起
こすことがある。これらの反応はＴ細胞の実質的なサブセットの活性化の結果として生じ
、苛酷なＴ細胞媒介全身性免疫反応を導く。この応答は、ＩＬ−１０またはその類似体若
しくはアンタゴニストが治療的処置に有用である点に関して、Ｔ細胞媒介応答に特有であ
る。機械的には、超抗原はＴ細胞受容体のＶβ要素と直接的に相互作用し且つ比較的低い
クラスＩＩ ＭＨＣ特異性でＴ細胞を活性化すると考えられる。ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ
）ら（１９９１）、Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７４５〜７７２を参照されたい
。
【０００７】
現在、敗血症、菌血症等のような敗血症症状は抗微生物性化合物によって治療されるの
が典型的である。敗血症は、細菌感染がカテーテル挿入または外科的処置によってしばし
ば引起こされる病院環境において一般的である。しかしながら、このような症状がショッ
クを伴う場合、感染に応答して誘導されたサイトカインによって部分的に引起こされるシ
ョック症候群を好転させる療法には有効な付加的手段が存在しない。例えば、ヤング（Ｙ
ｏｕｎｇ）（１９８５）「 」、マンデル（Ｍａｎｄｅｌｌ）ら（監修）Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａ
ｓｅｓ（第２版）ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ），ニューヨーク，４６８〜４７０頁を参照されたい。特に、抗生物質による治療は
微生物の致死をもたらし、そしてショック応答を引起こす細菌生産物の放出をもたらす。
【０００８】
細菌性敗血症および関連の敗血症性ショックは、ある種の手術、腹部外傷および癌若し
くは移植療法による免疫抑制または他の医学的症状の結果として生じた感染によって引起
こされた致命的な症状であることが多い。米国において、毎年７００，０００人を越える
患者が、敗血症性ショックを引起こす細菌感染に罹患している。これらの内約１６０，０
００人は敗血症性ショック症状を示し、そして約５０，０００人はこのような結果として
死に至っている。毒素性ショックに苦しむ患者は毎年少数であるが、典型的に、その応答
の重大さはより一層生命を脅かすものである。
【０００９】
感染に対するこれらの苛酷な免疫学的応答の重大な結果のために、微生物によって引起
こされたショックを予防的にまたは治療的に処置する有効な技術が急を用して必要とされ
ている。本発明は、これらのおよび他の苛酷な免疫反応を処置する組成物および方法を提
供する。
【００１０】
【非特許文献１】バーコウ（Ｂｅｒｋｏｗ）（監修）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，ローウェー，ニュージャージー州
【非特許文献２】ウェザラル（Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ）ら（監修）Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，オクスフォード・ユニバーシティー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク
【非特許文献３】ブラウンワルド（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ）ら（監修）Ｈａｒｒｉｓｏｎ′ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，マグロー・ヒル，ニューヨーク
【非特許文献４】ワインガーデン（Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ）ら（監修）Ｃｅｃｉｌ′ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，サンダース・カンパニー（Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．），フィラデルフィア
【非特許文献５】トレイシー（Ｔｒａｃｅｙ）ら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：４７０〜４７４
【非特許文献６】ビュートラー（Ｂｅｕｔｌｅｒ）ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５８４〜５８８
【非特許文献７】トレイシーら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６６２〜６６４
【非特許文献８】ワージ（Ｗａａｇｅ）ら（１９８７）Ｌａｎｃｅｔ ３５５〜３５７
【非特許文献９】ジラーディン（Ｇｉｒａｒｄｉｎ）ら（１９８８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９：３９７〜４００
【非特許文献１０】スキュデリー（Ｓｃｕｄｅｒｉ）ら（１９８８）Ｌａｎｃｅｔ １３６４〜１３６５
【非特許文献１１】カーン（Ｋｅｒｎ）ら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８７；１３９〜
【非特許文献１２】マッキントッシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１６２〜１６７
【非特許文献１３】ジャブロンズ（Ｊａｂｌｏｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２巻，１５４２頁（１９８９）
【非特許文献１４】ブロッカート（Ｂｒｏｕｃｋａｅｒｔ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９巻，２２５７頁（１９８９）
【非特許文献１５】キシモト（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ）、Ｂｌｏｏｄ ７４：１〜１０
【非特許文献１６】ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８巻，７１７頁（１９８８）
【非特許文献１７】マリンジョビク（Ｍａｒｉｎｊｏｖｉｃ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１．４２巻，８０８頁（１９８９）
【非特許文献１８】モロン（Ｍｏｒｒｏｎｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３巻，１２５５４頁（１９８８）
【非特許文献１９】パールムッター（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｒｓｔ．，８４巻，１３８頁（１９８９）
【非特許文献２０】スターンズ（Ｓｔａｒｎｅｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５巻，４１８５〜４１９１頁（１９９０）
【非特許文献２１】ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）ら（１９９１）、Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７４５〜７７２
【非特許文献２２】マンデル（Ｍａｎｄｅｌｌ）ら（監修）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（第２版）ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ），ニューヨーク，４６８〜４７０頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によって以下が提供される：
（１） インターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを有効
成分として含んでなる、宿主における炎症を調節するための医薬組成物。
（２） 炎症が腫瘍壊死因子アルファの異常濃度を伴う、項目１に記載の組成物。
（３） 有効成分がインターロイキン−１０である、項目２に記載の組成物。
（４） インターロイキン−１またはインターロイキン−６の濃度を更に調節する、項目２に
記載の組成物。
（５） 異常濃度を上昇させる、項目２に記載の組成物。
（６） 異常濃度が微生物感染を伴う、項目２に記載の組成物。
（７） 異常濃度が、発熱、低血圧症、組織壊死、代謝性アシドーシスまたは器官機能不全を伴
う、項目２に記載の組成物。
（８） 微生物感染が、敗血症性ショック、毒素性ショック、髄膜炎菌性髄膜炎またはマラリア
の症状を引起こす、項目６に記載の組成物。
（９） 宿主が細菌に感染している、項目２に記載の組成物。
（１０） 細菌感染がグラム陰性細菌による、項目９に記載の組成物。
（１１） 細菌感染が敗血症性ショックの症状を示す、項目１０に記載の組成物。
（１２） 細菌感染がグラム陽性細菌による、項目９に記載の組成物。
（１３） 細菌感染が敗血症性ショックの症状を示す、項目１２に記載の組成物。
（１４） インターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを有効
成分として含んでなる、宿主におけるＴ細胞媒介免疫機能を調節するための医薬組成物。
（１５） Ｔ細胞媒介免疫が腫瘍壊死因子アルファの異常濃度を伴う、項目１４に記載の組成物
。
（１６） 有効成分がインターロイキン−１０である、項目１５に記載の組成物。
（１７） インターロイキン−１０を有効成分として含んでなる、宿主における敗血症性ショック
を治療するための医薬組成物。
（１８） インターロイキン−１０を有効成分として含んでなる、宿主における毒素性ショックを
治療するための医薬組成物。
（１９） インターロイキン−１０アンタゴニストを有効成分として含んでなる、宿主における自
己免疫疾患を治療するための医薬組成物。
（２０） 自己免疫疾患がＢ細胞に媒介される、項目１９に記載の組成物。
（２１） 自己免疫疾患が腫瘍壊死因子アルファに媒介される、項目１９に記載の組成物。
（２２） インターロイキン−１０アンタゴニストが抗体分子である、項目１９に記載の組成物
。
（２３） 抗体分子がインターロイキン−１０に対して結合しうる、項目２２に記載の組成物。
（２４） 腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−６またはインターロイキン−１の少なくと
も１種類を調節する、項目１９に記載の組成物。
（２５） ヒトを除く宿主における炎症を調節する方法であって、前記宿主に対して有効量のイン
ターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを投与する工
程を含む方法。
（２６） ヒトを除く宿主におけるＴ細胞媒介免疫機能を調節する方法であって、前記宿主に対し
て有効量のインターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニス
トを投与する工程を含む方法。
（２７） ヒトを除く宿主における敗血症性ショックを治療する方法であって、前記宿主に対して
有効量のインターロイキン−１０を投与することを含む方法。
（２８） ヒトを除く宿主における毒素性ショックを治療する方法であって、前記宿主に対して有
効量のインターロイキン−１０を投与することを含む方法。
（２９） ヒトを除く宿主における自己免疫疾患を治療する方法であって、前記宿主に対して有効
量のインターロイキン−１０アンタゴニストを投与することを含む方法。
本発明は、有効量のインターロイキン−１０またはその類似体若しくはアンタゴニスト
を投与することにより、種々の微生物によって引起こされたショック症状を処置する方法
を提供する。本発明は、更に、これらのインターロイキン−１０に関連の化合物を含む薬
剤組成物を包含する。好ましくは、本発明のインターロイキン−１０は、以下のアミノ酸
配列
【００１２】
【化１】
【００１３】
および
【００１４】
【化２】
【００１５】
（但し、標準的な三文字略語を用いてＬアミノ酸を示し、Ｎ末端から開始している）
によって定義された読取り枠の成熟ポリペプチドから成る群より選択される。これらの２
種類の型のＩＬ−１０を、時にはそれぞれ、ヒトＩＬ−１０（またはヒトサイトカイン合
成阻害因子）およびウイルスＩＬ−１０（またはＢＣＲＦ１）と称する。ムーア（Ｍｏｏ
ｒｅ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１２３０〜１２３４；ヴイエイラ（Ｖｉ
ｅｉｒａ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１７２〜１
１７６；フィオレンチノ（Ｆｉｏｒｅｔｉｎｏ）ら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
７０：２０８１〜２０９５；およびシュー（Ｈｓｕ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
５０：８３０〜８３２を参照されたい。天然のタンパク質配列の突然変異体、例えば、欠
失および挿入変異型を含む対立遺伝子変異型および突然変異タンパク質は、本明細書中で
用いられる代替組成物である。
【００１６】
更に好ましくは、本発明の方法で用いられる成熟ＩＬ−１０は、
【００１７】
【化３】
【００１８】
および
【００１９】
【化４】
【００２０】
から成る群より選択される。
本発明は、部分的に、望ましくない炎症性反応（例えば、敗血症性ショック）を媒介す
るいくつかのサイトカインの合成と、毒素性ショック様症候群をもたらす場合である超抗
原によるＴ細胞の活性化の双方をＩＬ−１０が阻害するという発見に基づいている。逆に
、ＩＬ−１０アンタゴニストはこれらの同一免疫応答を増大させるものであり、そしてこ
のような増大は他の臨床的環境、例えば、ある種の腫瘍および自己免疫モデルにおいて実
際に望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、免疫機能を調節する、特に、微生物によって引起こされたショックまたは制
御Ｂ細胞の分化若しくは発生の有害な作用を防止するおよび／または低減するためのＩＬ
−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストの使用法に関する。本発明は、更に、こ
れらの方法を実施するためのＩＬ−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストを含む
薬剤組成物を含む。本発明において用いるためのＩＬ−１０は、好ましくは、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーランド州にそれぞれ受託番号
６８１９１、６８１９２および６８１９３として寄託されているｐＨ５Ｃ、ｐＨ１５Ｃお
よびｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）のｃＤＮＡインサートによって定義される読取り枠によって
コードされた成熟ポリペプチドの群より選択される。
【００２２】
ＩＬ−１０は、単球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を加えた単球によるＴＮＦα
およびＩＦＮγ合成を阻害するが、ＮＫ細胞単独では阻害されない。ＩＬ−４は、ＩＬ−
２で活性化されたＮＫ細胞からのサイトカイン分泌を直接的に阻害する。これは、ＩＬ−
４およびＩＬ−１０がＮＫ細胞に対して独特な経路によって作用することを示唆し、例え
ば、ＩＬ−１０作用は単球の関与を必要とする。ＩＬ−１０はＩＬ−２で活性化されたＮ
Ｋ細胞からのサイトカイン分泌を直接的に阻害するが、ＬＡＫ活性を阻害しないし、ＩＬ
−２に誘導されたサイトカイン合成およびリンパ球に活性化されたキラー（ＬＡＫ）活性
が異なる機序によって調節されていることが示唆される。
【００２３】
ＩＬ−１０は、単球および／または活性マクロファージまたはＮＫ細胞による前炎症性
サイトカインの産生を阻害するその能力の機序によって明らかに抗炎症活性を有すること
が実証されている。このサイトカイン生産の阻害は転写段階で生じる。
【００２４】
ＩＬ−１０は、更に、動物において超抗原に誘導された応答、例えば、Ｔ細胞に媒介さ
れた応答を調節することが本明細書中において実証された。ブドウ球菌性エンテロトキシ
ンＢ（ＳＥＢ）は苛酷な毒素性ショック応答を引起こすことがあり、マウスでの実験はイ
ンビボでの効力を実証する。超抗原と同時のまたは超抗原に対する暴露後でも、ＩＬ−１
０の投与は高ＳＥＢ暴露による致死を防止するのに有効である。
【００２５】
グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）は動物において敗血症性ショック応答を引起こす
。この内毒素に誘導されたショック応答は、前記のように、刺激されたマクロファージ／
単球からのＴＮＦα、ＩＬ−１および／またはＩＬ−６の放出の結果として生じる。しか
しながら、ＩＬ−１０の投与は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧ
Ｍ−ＣＳＦの誘導された発現を抑制する。データは、ＩＬ−１０がＬＰＳ出現後に投与さ
れたとしても内毒素に誘導されたショックからマウスを防護することができると決定され
ることを示す。逆に、抗ＩＬ−１０抗体はその防御作用を阻止することができる。実験は
、更に、抗ＩＬ−１０で処置されたマウスが実質的に高濃度の循環性腫瘍壊死因子アルフ
ァ（ＴＮＦα）および循環性ＩＬ−６並びに内毒素に誘導されたショック（例えば、ＬＰ
Ｓに誘導された）に対する深い感受性も示すことを示している。
【００２６】
抗ＩＬ−１０抗体は他の免疫学的症状の処置においても有用である。データは、若いマ
ウスに対する長期間の抗ＩＬ−１０抗体の投与がＢ細胞のＬｙ−１サブクラスを枯渇させ
ることがあるということを示す。これは、ＩＬ−１０をＬｙ−１Ｂ細胞発生の調節剤とし
て包含し、そしてＬｙ−１ Ｂ細胞を枯渇させる手段を提供する。この観察報告は自己免
疫症状の処置の見通しをもたらす。
【００２７】
自己免疫応答の発生には複雑なＴ細胞相互作用が必要である。マウスのＮＺＢ／Ｗ種は
狼瘡（全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ）傾向があり且つ自己免疫症状の処置用の治療薬
を検査するモデルを提供する。更に、これらのマウスは、他のＢ細胞種と比較して異常な
割合のＬｙ−１ Ｂ細胞を示す。インビボでのマウスの実験を、ＮＺＢ／Ｗ種を用いて記
載する。
【００２８】
これらのマウスの抗ＩＬ−１０処置は、全体の生存によってまたはタンパク尿症、腎炎
若しくは自己抗体力価の発生によって監視される自己免疫応答の開始を実質的に遅らせた
。この結果は、抗ＩＬ−１０処置が他の哺乳動物、例えば、ヒトを処置するのに当然有用
であることを示している。
【００２９】
広範囲の単細胞および多細胞発現システム（すなわち、宿主−発現ベクター組合わせ）
を用いて、本発明の方法で用いるためのポリペプチドを生産することができる。宿主細胞
種としては、制限されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物等がある。特異的発現システ
ムの選択および／または修飾を行なうための指針を提供する多数の論評が入手可能である
。例えば、いくつかの大腸菌発現システムを論評しているデ・ボーア（ｄｅ Ｂｏｅｒ）
およびシェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ）「大腸菌において異種遺伝子発現を最適にする方法
（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、２０５〜２４７
頁、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）（監修）Ｇｅｎｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９８３）；哺乳
動物細胞をトランスフェクトし且つ形質転換する方法を論評しているクチャラパティ（Ｋ
ｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，１６巻，４号，３４９〜３７９頁（１９８４）およびバネルジ（Ｂａｎｅ
ｒｊｉ）ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５巻，１９〜３１頁（１９８３
）；大腸菌、酵母および哺乳動物細胞における遺伝子発現の抜粋記事を論評しているレツ
ニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）およびゴールド（Ｇｏｌｄ）監修、Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（バターワース（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）、ボス
トン、１９８６）：並びに哺乳動物発現システムを論評しているスィリー（Ｔｈｉｌｌｙ
）、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（バターワース、ボストン、
１９８６）を参照されたい。これらはそれぞれ参考として本明細書中に包含される。同様
に、特異的ｃＤＮＡおよび発現制御配列を結合しおよび／または操作して本発明によって
用いるのに適当な発現ベクターを考案しおよび／または修飾する技術並びに条件を記載し
ている多数の論評が入手可能であり、例えば、それぞれ参考として本明細書中に包含され
る、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・
プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング
・ハーバー、ニューヨーク；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版；１〜３巻），コ
ールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９８７年および定期補遺）、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ウィリー・ア
ンド・サンズ、ニューヨークがある。
【００３０】
大腸菌発現システムは、リッグス（Ｒｉｇｇｓ）により、本明細書中に参考として包含
されている米国特許第４，４３１，７３９号明細書に開示されている。大腸菌における高
発現に特に有用な原核性プロモーターは、デ・ボーアにより、本明細書中に参考として包
含されている米国特許第４，５５１，４３３号明細書に開示されたｔａｃプロモーターで
ある。分泌発現ベクターは、更に、大腸菌宿主に利用可能である。特に有用なのは、グレ
イブ（Ｇｈｒａｙｅｂ）らによってＥＭＢＯ Ｊ．，３巻，２４３７〜２４４２頁（１９
８４）に開示されたｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡベクターであり、そこにおいて転写される
ｃＤＮＡは、ｏｍｐＡタンパク質のシグナルペプチドをコードしている大腸菌ＯｍｐＡ遺
伝子の一部分に融合され、順に、成熟タンパク質を細菌の周辺腔中に分泌させる。米国特
許第４，３３６，３３６号明細書および同第４，３３８，３９７号明細書は、更に、原核
生物のための分泌発現ベクターを開示している。したがって、これらの参考文献は参考と
して本明細書中に包含される。
【００３１】
多数の細菌株が原核性発現ベクターに適当な宿主であり、大腸菌、例えば、Ｗ３１１０
（ＡＴＣＣ番号２７３２５）、ＪＡ２２１、Ｃ６００、ＥＤ７６７、ＤＨ１、ＬＥ３９２
、ＨＢ１０１、Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１２４４）、Ｘ２２８２、ＲＲ１（ＡＴＣＣ
番号３１３４３） ＭＲＣＩ；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）株；並び
に他の腸内細菌科、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ）または霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および各種シュードモ
ナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）がある。真核性タンパク質の発現に有用な細菌株、例
えば、大腸菌Ｋ１２ Ｘ１７７６を誘導する一般的な方法は、カーチス三世（Ｃｕｒｔｉ
ｓ ＩＩＩ）によって米国特許第４，１９０，４９５号明細書に開示されている。
【００３２】
原核性および真核性微生物の他に、多細胞生物由来の細胞を含む発現システムを用いて
本発明のタンパク質を生産してもよい。特に興味深いのは、その翻訳後プロセッシグ機構
が生物学的に活性の哺乳動物タンパク質を生産するのに一層適当であるので、哺乳動物発
現システムである。数種類のＤＮＡ腫瘍ウイルスは哺乳動物宿主のためのベクターとして
用いられてきた。特に重要なのは、細菌の複製制御配列に結合したＳＶ４０複製、転写お
よび／または翻訳制御配列を含む多数のベクターであり、例えば、オカヤマ（Ｏｋａｙａ
ｍａ）およびベルグ（Ｂｅｒｇ）によって開発され、Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
２巻，１６１〜１７０頁（１９８２）およびＭｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３巻，２
８０〜２８９頁（１９８３）で開示され、そしてタケベ（Ｔａｋｅｂｅ）ら、Ｍｏｌｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８巻，４６６〜４７２頁（１９８８）によって改良されたｐｃＤ
ベクターがある。したがって、これらの参考文献は本明細書中に参考として包含される。
他のＳＶ４０基剤哺乳動物発現ベクターとしては、カオフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）および
シャープ（Ｓｈａｒｐ）によってＭｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２巻，１３０４〜１
３１９頁（１９８２）に、およびクラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、米国特許第４，６７５，２
８５号明細書に開示されたもののがあり、双方の文献とも本明細書中に参考として包含さ
れる。通常、サル細胞は上記ベクターに対して好ましい宿主である。ＳＶ４０ ｏｒｉ配
列および完全なＡ遺伝子を含むこのようなベクターはサル細胞中で自律複製することがで
きる（非自律複製プラスミドよりも高コピー数および／または安定コピー数を与える）。
更に、ＳＶ４０ ｏｒｉ配列を含み完全なＡ遺伝子を含まないベクターは、グルツマン（
Ｇｌｕｚｍａｎ）によってＣｅｌｌ，２３巻，１７５〜１８２頁（１９８１）に記載され
且つＡＴＣＣ（受託番号ＣＲＬ１６５１）から入手可能なＣＯＳ７サル細胞中で高コピー
数（安定ではない）に自律複製することができる。上記ＳＶ４０基剤ベクターは、更に、
宿主細胞ＤＮＡ中への組込みによって他の哺乳動物細胞、例えば、マウスＬ細胞を形質転
換しうる。
【００３３】
多細胞生物は、更に、本発明のポリペプチドの生産用宿主として役立つことができ、例
えば、昆虫幼生、マエダ（Ｍａｅｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２〜５９４頁
（１９８５）およびＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．，３５１〜３７２頁（１９８９）
；並びに形質転換した動物、ジェニッシュ
（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０巻，１４６８〜１４７４頁（１９８８）
である。これらの参考文献、類似の他のものも参考として本明細書中に包含される。
【００３４】
Ｉ． インターロイキン−１０および類似体の検定
ＩＬ−１０と集合的に称するＩＬ−１０関連タンパク質およびペプチドは、検定および
単位の基準を形成することができるいくつかの生物活性を示す。特に、ＩＬ−１０は、Ｉ
ＦＮγ、リンホトキシン、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦから成る群において、
同系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）および抗原に対する暴露によって１種類またはそれ以上の
これらのサイトカインを合成するように誘導されたＴヘルパー細胞集団の少なくとも１種
類のサイトカインの合成を阻害する性質を有する。この活性において、ＡＰＣは、それら
が複製することはできないが、それらの抗原プロセッシング機構は機能する状態であるよ
うに処理される。これは、便宜上、ＡＰＣに、例えば、約１５００〜３０００Ｒ（ガンマ
またはＸ線）をＴ細胞と混合する前に照射することによって達成される。マウスＩＬ−１
０の検定に関して、表２も参照されたい。
【００３５】
【表１】
【００３６】
或いは、サイトカイン阻害は、一次または、好ましくは、二次混合リンパ球反応（ＭＬ
Ｒ）において検定することができ、その場合、同系ＡＰＣを用いる必要はない。ＭＬＲは
当該技術分野において周知であり、例えば、本明細書中に参考として包含される、ブラド
リー（Ｂｒａｄｌｅｙ）、ミシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）ら監修のＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（フリーマン（Ｆｒｅｅｍ
ａｎ）、サン・フランシスコ、１９８０）の１６２〜１６６頁；およびバチスト（Ｂａｔ
ｔｉｓｔｏ）ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５０巻，８３〜９１頁（１９８
７）を参照されたい。簡単には、同種リンパ系細胞の２集団を混合し、その一方の集団は
、例えば、照射によって増殖を防止するように混合前に処理された。好ましくは、細胞集
団は、補足培地、例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０中において細胞
約２ｘ１０６個／ｍｌの濃度で調製される。対照および試験培養物双方に対して検定用に
各集団０．５ｍｌを混合する。二次ＭＬＲ用に、一次ＭＬＲにおいて７日後に残っている
細胞を、新たに調製され、照射された刺激剤細胞によって再刺激する。ＩＬ−１０を有す
ると疑われる試料は試験培養物に対して混合時に加えることができ、そして対照および試
験培養物双方のサイトカイン生産は、混合して１〜３日後に検定することができる。
【００３７】
ＩＬ−１０検定用にＴ細胞集団および／またはＡＰＣ集団を得るには、例えば、本明細
書中に参考として包含されている、ディサバト（ＤｉＳａｂａｔｏ）ら監修、Ｍｅｔｈ．
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻（１９８４）に充分に記載されている当該技術分野に
おいて周知の技術を用いる。好ましいＩＬ−１０検定用のＡＰＣは末梢血液単球または組
織マクロファージである。これらは、例えば、本明細書中に参考文献として包含されてい
る、ボイム（Ｂｏｙｕｍ）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻，８８〜１０
２頁（１９８４）；メイジ（Ｍａｇｅ）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻
，１１８〜１３２頁（１９８４）；リトヴィン（Ｌｉｔｖｉｎ）ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻，２９８〜３０２頁（１９８４）；スティーブンソン（Ｓｔｅ
ｖｅｎｓｏｎ）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻，２４２〜２４９頁（１
９８９）；およびロメイン（Ｒｏｍａｉｎ）ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１
０８巻，１４８〜１５３頁（１９８４）に記載の標準的な技法を用いて得られる。好まし
くは、ヘルパーＴ細胞をＩＬ−１０検定において用い、それは末梢血液、脾臓またはリン
パ節からリンパ球を最初に分離した後、商業的に入手可能な抗ＣＤ４抗体、例えば、米国
特許第４，３８１，２９５号明細書に記載され且つオルト・ファーマソイティカル・コー
ポレーション（Ｏｒｔｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）から入手可能
なＯＫＴ４を用いて、例えば、パニングまたは流動細胞計測法によってヘルパー細胞を選
択することにより得られる。マウス抗ＣＤ４は、ベクトン・ディクソン（Ｂｅｃｔｏｎ−
Ｄｉｃｋｓｏｎ）またはファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）から入手可能である。
必要な技術は、それぞれ参考として本明細書中に包含される、ボイム、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２１巻（補遺９７），７７頁（１９６８）；Ｍｅｔ
ｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻（上記に引用）およびブラム（Ｂｒａｍ）ら、Ｍ
ｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１巻，７３７〜７４８頁（１９８６）に十分に開
示されている。概して、ＰＢＬは、新鮮な血液からフィコール・ハイパク（Ｆｉｃｏｌｌ
−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離によって得られる。
【００３８】
種々の抗原を検定において用いることができ、例えば、スカシガイのヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）、トリのγ−グロブリンまたは類似のものを用いることができる。更に好ましくは
、抗原の代わりに、ヘルパーＴ細胞を検定において抗ＣＤ３単クローン性抗体、例えば、
米国特許第４，３６１，５４９号明細書に開示されたＯＫＴ３で刺激する。
【００３９】
対照および試験試料中のサイトカイン濃度は、標準的な生物検定および／または免疫化
学検定によって測定される。特異的サイトカインに関する免疫化学検定の構成は、精製サ
イトカインが入手可能である場合、当該技術分野において周知である。例えば、それぞれ
本明細書中に参考として包含され、論題に対する典型的な広範囲の参考文献のである、カ
ンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ（エルセビア、アムステルダム、１９８４）；テュッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）
、Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙｓ（エルセビア、アムステルダム、１９８５）；および米国特許第４，４８６，５３
０号明細書を参照されたい。ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−３およびヒトＧＭ−ＣＳＦ用のエ
リザキットは、ジェンザイム・コーポレーション（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）（ボス
トン、ＭＡ）から商業的に入手可能であり；そしてＩＦＮγ用のエリザキットはエンドジ
ェン・インコーポレーテッド（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）（ボストン、ＭＡ）から商業
的に入手可能である。ヒトリンホトキシンに特異的な多クローン性抗体はジェンザイム・
コーポレーションから入手可能であり、それを、ヒトリンホトキシンのためのラジオイム
ノアッセイ、例えば、チャード（Ｃｈａｒｄ）、Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ
Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
（エルセビア、アムステルダム、１９８２）で用いることができる。
【００４０】
上記に記載したサイトカインの生物検定を用いてＩＬ−１０活性を決定することができ
る。ヒトリンホトキシンの生物検定は、それぞれ本明細書中に参考として包含されている
、アガワール（Ａｇｇａｒｗａｌｌ）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１６巻，
４４１〜４４７頁（１９８５）およびマシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら、クレメンス（
Ｃｌｅｍｅｎｓ）ら監修のＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン
、Ｄ．Ｃ．、１９８７）の２２１〜２２５頁に開示されている。ヒトＩＬ−２およびＧＭ
−ＣＳＦは、ＡＴＣＣからそれぞれ受託番号ＴＩＢ２１４およびＣＣＬ２４６として入手
可能な因子依存細胞系ＣＴＬＬ−２およびＫＧ−１を用いて検定することができる。ヒト
ＩＬ−３は、例えば、メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、Ｔｈｅ Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ
Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ（エルセビア、アムステルダ
ム、１９８４）に記載されたように、軟質寒天培地において広範囲の造血細胞コロニーの
形成を刺激するその能力によって検定することができる。ＩＦＮγは抗ウイルス検定、例
えば、ミージャー（Ｍｅａｇｅｒ）、クレメンスら監修（上記に引用）の１２９〜１４７
頁を用いて定量することができる。マウス同等物は、適当な細胞系を用いて同様に検定す
ることができる。
【００４１】
サイトカイン生産は、更に、ｍＲＮＡ分析によって決定することができる。サイトカイ
ンｍＲＮＡは、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７巻，８５
６９〜８５７２頁（１９８２）およびジレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）ら、米国特許第
４，４８３，９２０号明細書に記載の細胞質ドットハイブリダイセーションによって測定
することができる。したがって、これらの参考文献は本明細書中に参考として包含される
。他の方法としては、精製ＲＮＡを用いるドットブロッティング、例えば、ヘイムズ（Ｈ
ａｍｅｓ）ら監修のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬプレス、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１９８５）
の第６章がある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いることもでき、本明細書中
に参考として包含されているイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら（監修）（１９９０）のＰＣＲ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ，アカデミック・プレス・インコーポレーテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨークを参照されたい。
【００４２】
いくつかの場合において、ＩＬ−１０活性の検査をするための試料を前処理して、検定
の妨げとなるかもしれない予め決定されたサイトカインを除去する。例えば、ＩＬ−２は
、若干の細胞においてＩＦＮγの生産を増大させる。したがって、検定で用いられるヘル
パーＴ細胞に応じて、ＩＬ−２を試験される試料から除去すべきことがある。このような
除去は、便宜上、試料を標準的な抗サイトカイン親和性カラムに通過させることによって
達成される。
【００４３】
便宜上、ＩＬ−１０活性の単位は、米国特許第４，５５９，３１０号明細書に記載され
且つＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ８３０６として入手可能なＭＣ／９細胞のＩＬ−４に誘
導された増殖を増大させるＩＬ−１０の能力に関して定義される。１単位／ｍｌは、以下
の検定においてＩＬ−４の水準を上記ＭＣ／９増殖の最大刺激の５０％にするＩＬ−１０
の濃度として定義される。ＩＬ−４およびＩＬ−１０の二重反復試験または三重反復試験
用希釈液を標準的な微量滴定プレートにおいて培地５０ｕｌ／ウェルに調製する。培地は
ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、５０ｕＭ２メルカプトエタノール、２ｍＭグル
タミン、ペニシリン（１００Ｕ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）から
成る。培地で希釈した１６００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４、２５μｌ／ウェル（最終４００Ｕ／
ｍｌ）を加え、そして一晩中、例えば、２０〜２４時間インキュベートする。
【００４４】
3Ｈ−チミジン（例えば、培地中５０ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５〜１．０ｍＣｉ／ウェル
で加え、そして細胞を再度一晩中インキュベートした後、細胞を採集し且つ取込まれた放
射能を測定する。
【００４５】
サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０の製法の一般的な説明に関しては、それぞれ本
明細書中に参考として包含されている米国特許第５，０１７，６９１号明細書およびＵ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／４５３，９５１号明細書を参照されたい。
【００４６】
ＩＩ． アゴニストおよびアンタゴニスト ＩＬ−１０アゴニストは、ＩＬ−１０とその
受容体との相互作用を模擬する分子であってよい。このようなものは、ＩＬ−１０の類似
体若しくはフラグメントまたはＩＬ−１０受容体のリガンド結合性部位エピトープに対す
る抗体、或いはＩＬ−１０の受容体相互作用性部分に対して結合する特定の抗体に対する
抗イディオタイプ抗体であってよい。
【００４７】
アンタゴニストは、受容体結合に関して競合するタンパク質の形をとることができ、例
えば、それは受容体を活性化する能力を欠き、同時にＩＬ−１０結合またはＩＬ−１０結
合性分子、例えば、抗体を阻止する。
【００４８】
抗体は、天然に存在する形でもそれらの組換体でも、ＩＬ−１０サイトカイン、フラグ
メントおよび類似体に対して生じることがある。更に、抗体はＩＬ−１０に対してその活
性型かまたは不活性型でも生じることができ、その相違は、活性サイトカインに対する抗
体が、活性コンホメーションでしか存在しないエピトープを認識すると考えられることで
ある。抗イディオタイプ抗体もこれらの方法で考えられ、潜在的なＩＬ−１０アゴニスト
でありうる。
【００４９】
望ましい抗原、例えば、サイトカインの予め決定されたフラグメントに対する結合性フ
ラグメントおよび一本鎖変型を含む抗体は、フラグメントと免疫原性タンパク質との結合
体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）で動物を免疫感作することによって生じることができる。単
クローン性抗体は望ましい抗体を分泌する細胞から製造される。これらの抗体は、正常若
しくは不活性類似体に対する結合性に関してスクリーンすることができるしまたはアゴニ
スト若しくはアンタゴニスト活性に関してスクリーンすることができる。通常、これらの
単クローン性抗体は、少なくとも約１ｍＭ、更に一般的には、少なくとも約３００μＭ，
典型的には少なくとも約１０μＭ、更に典型的には、少なくとも約３０μＭ、好ましくは
、少なくとも約１０μＭ、そして更に好ましくは、少なくとも約３μＭまたはそれ以上の
ＫＤと結合する。前記はＩＬ−１０に関するが、同様の抗体が他の類似体、その受容体お
よびアンタゴニストに対して生じる。
【００５０】
本発明の、抗原結合性フラグメントを含む抗体は、有意に、診断または治療的に有効で
ありうる。それらは、ＩＬ−１０受容体に対して結合し且つ該受容体に対するリガンド結
合を阻害しまたは生物学的応答を引き出すＩＬ−１０の能力を阻害する強力なアンタゴニ
ストでありうる。
【００５１】
ＩＬ−１０またはフラグメントは、他の物質、特に、免疫原として用いられる融合した
または共有結合したポリペプチドのようなポリペプチドに対して結合しうる。サイトカイ
ンおよびそのフラグメントは、種々の免疫原、例えば、スカシガイのヘモシアニン、ウシ
血清アルブミン、破傷風トキソイド等に対して融合または共有結合しうる。多クローン性
抗血清を製造する方法の説明に関しては、それぞれ本明細書中に参考として包含されてい
る、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ホーバー・メディカル・ディビジョン（Ｈｏｅｂｅｒ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）およびロウ（Ｒｏｗ）
、１９６９年；ランドスタイナー（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ）（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ドーバー・パブリケ
ーションズ（Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ），ニューヨーク、およびウィリア
ムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら（１９６７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１巻，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークを参照されたい。典型的な方法は、抗原による動物
の超免疫感作を行なう。次に、被験動物の血液を反復免疫感作直後に集め、そしてガンマ
グロブリンを単離する。
【００５２】
いくつかの場合、種々の哺乳動物宿主、例えば、マウス、齧歯類動物、霊長類、ヒト等
から単クローン性抗体を製造するのが望ましい。このような単クローン性抗体を製造する
技術の説明は、例えば、スタイツ（Ｓｔｉｔｅｓ）ら（監修）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、ランジ・メディカル・パブリケーショ
ンズ（Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロス・アルトス、Ｃ
Ａおよびそこにおいて引用された参考文献；ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌ
ａｎｅ）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
，ＣＳＨプレス；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク；コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら（監修；１９９１年
および定期補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
ウィリー・アンド・サンズ・ニューヨーク；そして特に、単クローン性抗体を生成する一
つの方法を論及しているコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ）（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７において見出すことができる。
これらの参考文献はそれぞれ本明細書中において参考として包含される。簡単に要約する
と、この方法は、動物に免疫原を注射することを含む。次に、被験動物を屠殺し、そして
その脾臓から細胞を取りだした後、それを骨髄腫細胞と融合させる。その結果は、骨髄腫
親細胞とは異なる、インビトロの選択的条件下において再現することができるハイブリッ
ド細胞すなわち「ハイブリドーマ」である。次に、ハイブリドーマ集団をスクリーンして
個々のクローンを単離し、そのそれぞれが単一抗体種を免疫原に対して分泌する。この方
法において、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質上で認識された特定部位に応答して
生じた免疫動物からの不死化およびクローン化された単一Ｂ細胞の生産物である。
【００５３】
他の適当な技術は、抗原性ポリペプチドに対するリンパ球のインビトロでの暴露或いは
ファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を伴う。それぞれ本明
細書中に参考として包含されている、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）「ファージラ
ムダにおける免疫グロブリンレパートリーの大型組合わせライブリーの生成（Ｇｅｎｅｒ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ
Ｌａｍｂｄａ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；およびワード（Ｗ
ａｒｄ）ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６を参照されたい。本発明
のポリペプチドおよび抗体は修飾を伴ってまたは伴うことなく用いることができ、キメラ
抗体またはヒト様抗体がある。更に、組換え免疫グロブリンを製造することができ、カビ
リー（Ｃａｂｉｌｌｙ）、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい。これ
らの特許は本明細書中に参考として包含される。
【００５４】
サイトカインまたはその受容体に対して生じた抗体は、更に、アゴニストまたはアンタ
ゴニストの性質を示すことができる抗イディオタイプ抗体を生じるのに有用である。これ
らは本明細書中で論及したような種々の免疫学的応答を調節するのに有用である。
【００５５】
ＩＩＩ． 精製および薬剤組成物
本発明のポリペプチドが、例えば、形質転換した酵母または哺乳動物細胞の分泌生成物
のような可溶性型で発現する場合、それらは、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーおよび／または
類似のものを含む当該技術分野の標準法にしたがって精製することができ、例えば、本明
細書中に参考として包含され、このような精製の指針を提供する「酵素精製および関連技
術（Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２：２３３〜５７７（１
９７７）およびスコープス（Ｓｃｏｒｐｅｓ），Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（スプリンガー・フェア
ラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、１９８２）を参照されたい
。同様に、本発明のポリペプチドが、例えば、凝集体、封入体または類似のもののような
不溶性型で発現する場合、それらは、遠心分離によって破裂した宿主細胞から封入体を分
離し、封入体をカオトロピズム剤および還元剤で可溶化させ、可溶化した混合物を希釈し
、そしてポリペプチドが生物学的に活性のコンホメーションをとるようにカオトロピズム
剤および還元剤の濃度を低下させることを含む、当該技術分野における標準法によって精
製することができる。後者の手順は、本明細書中にそれぞれ参考として包含されている以
下の参考文献、すなわち、ウィンクラー（Ｗｉｎｋｌｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２５：４０４１〜４０４５（１９８６）；ウィンクラー、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ
，３：９９２〜９９８（１９８５）；コス（Ｋｏｔｈｓ）ら、米国特許第４，５６９，７
９０号明細書；並びに欧州特許出願第８６３０６９１７．５号明細書および同第８６３０
６３５３．３号明細書に開示されている。
【００５６】
本明細書中で用いられる「有効量」とは、例えば、悪寒、血管収縮、精神的錯乱、灌流
低下、超高熱等のような認識された症状によって決定されるショック症状を改善しまたは
防止するのに十分な量を意味する。特定の患者に対する有効量は、治療される敗血症の状
態および種類、患者の全身の健康状態、投与方法、副作用の苛酷さ等のような因子に応じ
て変更することができる。概して、ＩＬ−１０試薬は、有効量の試薬および薬剤担体を含
む薬剤組成物として投与される。例えば、本明細書中に参考として包含される、カプラン
（Ｋａｐｌａｎ）およびパセ（Ｐａｓｃｅ）（１９８４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ、モスビ
ー・アンド・カンパニー（Ｍｏｓｂｙ ａｎｄ Ｃｏ．）、セント・ルイス、ＭＯ；およ
びギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）ら（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎｓ：
Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｓ（第８版）、ペルガモン・プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
ある種の用途において、ＩＬ−１０治療薬は、抗生物質組成物を含む別の薬学的活性成分
と組合わせることができる。
【００５７】
薬剤担体は、患者に対して本発明の組成物を供給するのに適当な何等かの適合した無毒
性物質でありうる。このような薬剤の非経口投与に有用な多数の組成物が知られている。
例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第
１５版（マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）、イーストン、ＰＡ １９８０）。或いは、本発明の組成物を植込み可能な
または注射可能な薬剤供給システムによって患者の体内に導入することができる。例えば
、本明細書中に参考として包含される、アーカート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２４巻，１９９〜２３６頁（
１９８４）；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）監修、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ
Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（プレナム・プレス
（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８１）；米国特許第３，７７３，９
１９号明細書；同第３，２７０，９６０号明細書等を参照されたい。
【００５８】
非経口によって投与される場合、ＩＬ−１０を薬剤担体と一緒に注射可能な状態の（溶
液、懸濁液、エマルジョン）単位剤形中に配合する。このような担体の例は、正常食塩水
、リンガー液、デキスロース溶液およびハンクス液である。非水性担体、例えば、固定油
およびオレイン酸エチルを用いてもよい。好ましい担体は５％デキストロース／食塩水で
ある。担体は、少量の添加剤、例えば、等張性および化学的安定性を増大させる物質、例
えば、緩衝剤および保存剤を含むことができる。ＩＬ−１０試薬は、凝集体および他のタ
ンパク質を実質的に含まない精製された状態において約５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度
で配合されるのが好ましい。好ましくは、ＩＬ−１０は、約５０〜８００ｍｇ／日の範囲
の量を供給するように（すなわち、約１〜１６ｍｇ／ｋｇ／日）、連続注入によって投与
される。毎日の注入速度は副作用および血液細胞計数の監視に基づいて変更することがで
きる。
【００５９】
有効量のＩＬ−１０アゴニストまたはアンタゴニストを決定する場合も同様に考えられ
るが、ある種のアンタゴニストは更に高い範囲などの一層広範囲の用量範囲が必要である
と考えられる。
【００６０】
ＩＶ．生物学的観察および機序
以下に提唱した機序によって制限されないが、以下の論及により、ＩＬ−１０類似体、
アゴニストおよびアンタゴニストの使用法および用途が洞察される。免疫システム機能、
発生および分化に対する有用な背景を提供する。例えば、本明細書中に参考として包含さ
れる、ポール（Ｐａｕｌ）（監修）（１９８９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ（第２版）ラヴェン・プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク。特に
、炎症に関する第２６章、遅延型過敏症に関する第２８章および自己免疫に関する第３１
章は、本明細書中に記載した使用法に関連する。
【００６１】
ヒトＰＢＭＣおよび精製ＮＫ細胞においてＩＬ−２によって引起こされたサイトカイン
合成およびＬＡＫ活性に対するＩＬ−４およびＩＬ−１０の作用は、例えば、実験Ａにお
いて研究された。ＩＬ−４およびＩＬ−１０双方がＰＢＭＣにおいてＩＬ−２に誘導され
たＩＦＮγおよびＴＮＦα合成を阻害し、ＩＬ−４だけが精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２に
誘導されたＩＦＮγ合成を阻害する。したがって、ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、異なる
機序によってＮＫ細胞サイトカイン合成を阻害している。
【００６２】
ＴＮＦα生産を研究する実験結果により同様の結論が示唆された。しかしながら、この
場合、単球もこのサイトカインを生産する。ＩＬ−１０はＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導Ｔ
ＮＦα合成に対して直接作用しなかったが、単球によるＴＮＦα生産を阻止することがで
きた。ＮＫ細胞およびＣＤ１４＋細胞双方を含む培養物のＩＬ−２による刺激は、生産を
大きく増大させ、そしてＩＬ−１０はこの増大を完全に阻止した。ＩＬ−２は、ＴＮＦα
を更に生産するようにＣＤ１４＋細胞を活性化しなかったので、相乗作用の増大はおそら
くＮＫ細胞ＴＮＦα合成の増加を示している。したがって、ＩＬ−１０は単球による双方
のＴＮＦα生産を阻害し、更に、それらの同時刺激がＮＫ細胞ＴＮＦα合成に対して作用
すると考えられる。
【００６３】
ＩＬ−４およびｈＩＬ−１０／ｖＩＬ−１０双方は、ＩＬ−２に刺激されたＰＢＭＣに
よるＩＦＮγおよびＴＮＦα合成を抑制するが、ＩＬ−４だけはＩＬ−２に誘導されたＬ
ＡＫ活性を阻害する。これらの観察は、ＰＢＭＣにおけるＩＬ−２に誘導されたサイトカ
イン生産および細胞毒性が異なる経路によって調節されていることを示す。これらの観察
報告は、ＩＬ−２およびＬＡＫ細胞の臨床的使用において重要である。ＩＬ−２療法に関
係した問題としては、心臓血管作用および毛細管漏出症候群があった。これらの副作用の
原因は不明であるが、癌患者においては、ＩＬ−２によって生じたＴＮＦαなどのサイト
カインの放出が関与していることがある。ＩＬ−１０が、ＩＬ−２に誘導されたサイトカ
イン合成を阻害するがＬＡＫ活性を阻害しないということは、このサイトカインが、この
ような患者を治療するのにＩＬ−２と組合わせて有用でありうるということを示唆する。
更に、ＴＮＦαが、感染したＴ細胞においてヒト免疫欠乏ウイルスの発現を引起こすこと
ができるということを示唆するデータを考慮すると、ＴＮＦαの合成を阻害するＩＬ−１
０の能力はこれに関連してかなり興味深いものである。
【００６４】
これらの研究は、更に、ヒトＩＬ−１０が、活性化後の単球によって比較的多量に生産
されることを実証する。速度論研究により、低濃度のＩＬ−１０は単球を活性化して７時
間後に検出され、そして最大のＩＬ−１０生産は活性化の２４〜４８時間後に生じうるこ
とが分かった。これは、活性化後４〜８時間に高濃度で分泌されたＩＬ−１α、ＩＬ−１
β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαの生産と比較して相対的に遅いものであった。更
に、ヒトＩＬ−１０は、ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＩＦＮγおよびＬＰＳの組合わせによる
活性化後の単球によるサイトカイン生産に対して強力な阻害作用を有することが分かった
。これらの阻害作用は、ＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０活性双方を阻害するｍＡｂ １
９Ｆ１によってそれらを完全に中和することができるので、ＩＬ−１０に特異的である。
濃度１００Ｕ／ｍｌで加えられたＩＬ−１０は、ＩＬ−１α、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦお
よびＧ−ＣＳＦ合成を、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）およびＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の組
合わせによる単球の最適の活性化後に９０％より大まで減少させた。ＩＬ−１β、ＩＬ−
６およびＩＬ−８生産に対する阻害作用は、特に、単球がＩＦＮγおよびＬＰＳの組合わ
せによって活性化された場合、あまり明白ではなかった。単球によるサイトカイン生産を
ＩＬ−１０が阻害する機序、例えば、ＩＬ−１０のこれらの副作用が他の因子によって直
接的に媒介されるのが間接的に媒介されるのかということは不明である。ＩＬ−１は繊維
芽細胞、胸腺細胞および単球においてＩＬ−６生産を引起こすことができるので、例えば
、ＩＬ−６生産の不完全な阻害は、減少したＩＬ−１生産の結果であるという可能性があ
る。 ヒト細胞に対して生物活性を有することが分かっているウイルス−ＩＬ−１０を、
あまり広範囲にではなく検査した。しかしながら、ｖ−ＩＬ−１０は、ＬＰＳで活性化さ
れた単球によるＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ生産を、ヒトＩＬ−１０が阻害したのと同程
度まで阻害した。ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ生産に対するｖ−ＩＬ−１０のこれらの阻
害作用はｍＡｂ １９Ｆ１によって中和され、ｖ−ＩＬ−１０作用の特異性を例証した。
【００６５】
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−Ｃ
ＳＦ分泌の阻害は転写段階で生じた。ＩＬ−１０は、ノーザン分析およびＰＣＲ分析によ
って確認されるように、ＬＰＳによって引起こされたサイトカイン特異的ｍＲＮＡ合成を
強く阻害した。ＰＣＲ分析は、個々の試料の反応生成物を半定量的方法で比較可能な条件
下において実施した。これは、試料と定量的に比較しうる結果との間に等量の反応生成物
を生じたβ−アクチンに特異的なプライマーによるｃＤＮＡの増幅が、ＩＬ−１０ ｍＲ
ＮＡ発現を同一試料においてノーザン分析およびＰＣＲ分析双方によって確認した場合に
得られたという事実によって確認された。更に、サイトカインｍＲＮＡ発現濃度はこれら
の培養物の上澄み中のタンパク質量と相関した。ＩＬ−１０は、活性化された単球におい
てＴＧＦβ ｍＲＮＡ発現に影響を与えることができなかった。しかしながら、ＴＧＦβ
が非活性単球において構成要素として発現され且つＬＰＳによる単球の活性化がＴＧＦβ
ｍＲＮＡ濃度に影響を与えなかったということは留意されるべきである。アソイアン（
Ａｓｓｏｉａｎ）ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
４：６０２０〜６０２４は、単球がＴＧＦβ ｍＲＮＡを構成要素として発現し且つＴＧ
Ｆβ分泌が単球活性化を必要とするということを実証した。しかしながら、ＩＬ−１０が
ＴＧＦβの潜伏型から活性型への変換に対する作用を有するかどうかは不明である。
【００６６】
ＩＬ−１０の生産はＩＬ−４によって転写段階で阻害されることが分かった。ＩＬ−１
０生産に対するＩＬ−４の阻害作用は顕著であったが、ＩＬ−４はＩＬ−１０の生産を完
全に阻止することはできなかった。ＩＬ−４は、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαの生
産を完全に阻害するのに十分であった高ＩＬ−４濃度（４００Ｕ／ｍｌ）を用いた場合で
さえも、ＩＬ−１０の生産を最大７０％までしか阻害しなかった。ＩＬ−４が、ヒト単球
によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαの生産を阻害するこ
とができることは既に実証されている。これらの知見は、ＩＬ−４が、更に、ＬＰＳで活
性化されたヒト単球によるＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を阻害するこ
とを実証することにより確証され且つ拡大された。この阻害は転写段階で生じた。更に、
データは、ＩＬ−４およびＩＬ−１０がヒト単球によるサイトカイン発現に対して同様の
作用を有するということを例証し、免疫系におけるサイトカインの多面的作用および重複
性が強調される。
【００６７】
興味深いことに、ＩＬ−１０は、２４時間活性化された単球においてＩＬ−１０ ＭＲ
ＮＡ合成を強く阻害したので、それは自己調節サイトカインである。更に、中和性抗ＩＬ
−１０ ｍＡｂの存在下におけるＬＰＲによる単球の活性化は、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの
発現を２４時間で増大させ、内因的に生じたＩＬ−１０もＩＬ−１０ ｍＲＮＡ合成を阻
害することが示された。ＩＬ−１０が、ヒト単球によるそれ自体の生産をダウンレギュレ
ートすることができるということにより、これは負のフィードバック機序によって調節さ
れる最初のサイトカインとなる。内因的に生じたＩＬ−１０の自己調節作用は、更に、Ｌ
ＰＳで活性化された単球によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα
、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産に関して、抗ＩＬ−１０抗体の存在下でＬＰＳを
用いて観察された。しかしながら、これらのサイトカインの生産に対する内因性ＩＬ−１
０の阻害作用は、培養開始時に加えられた内因性ＩＬ−１０の場合よりも顕著ではなかっ
た。これは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳ
Ｆが活性化の４〜８時間後に高濃度で既に生じているが、最大の内因性ＩＬ−１０生産は
活性化後２４〜４８時間ではるかに遅く生じるという事実に関係している。この見解は、
内因的に生じたＩＬ−１０の最も強い阻害作用が、単球の活性化後に遅れて生じることが
分かったＧＭ−ＣＳＦ分泌において見られたという観察報告によって支持される。ＩＬ−
１０ ｍＲＮＡ合成はＩＬ−１０タンパク質分泌に反映され且つそれに先行する、および
ＩＬ−１０は細胞表面上のその受容体と単に相互作用することができるだけであると仮定
すると、これらの結果により、内因的に生じたＩＬ−１０の阻害作用は比較的遅く起こり
、したがって、免疫応答の後期において特に重要でありうるということが示唆される。
【００６８】
最初に、ＩＬ−１０をマウスにおいて、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン生産（主として
ＩＦＮγ）を阻害したＴｈ２細胞によって生じたサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）
として記載した。Ｔｈ１細胞によるサイトカイン生産に対するｍ−ＩＬ−１０のこの阻害
作用はマクロファージの存在を必要とし、例えば、それぞれ本明細書中に参考として包含
される、フィオレンチノ（Ｆｉｏｒｅｎｉｎｏ）ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
４６：３４４４〜３４５１；トローブリッジ（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ）ら（１９８１）Ｊ
．Ｅｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．１５４：１５１７〜１５２４；ランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ）ら
（１９８９）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：４０１〜４１８；およびヒルシュ（Ｈ
ｉｒｓｃｈ）ら（１９８１）Ｊ．Ｅｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．１５４：７１３〜７２５を参照さ
れたい。ここにおいて、ＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０は、単球をＡＰＣとして用いる
場合、抗原特異的Ｔ細胞増殖を強く阻害する。更に、抗原特異的増殖性Ｔ細胞応答の減少
は、主として、これらの細胞でのクラスＩＩ ＭＨＣ抗原発現に対するＩＬ−１０の強力
なダウンレギュレートリー作用によって引起こされた単球の減少した抗原提示能力に依る
。これらのデータは、ＩＬ−１０が単球によって遅れて生産され且つこれらの細胞による
ＩＬ−１０分泌に対する自己調節作用を有するという本知見と共に、ＩＬ−１０が抗原特
異的Ｔ細胞応答の進行に対して強力なダウンレギュレートリー作用を有することを示す。
したがって、ＩＬ−１０は、抗原に駆動された増殖性Ｔ細胞応答を抑制するのに主要な役
割を果たすことができる。単球によって生産されたＩＬ−１０が、Ｔ細胞活性化に対する
強力な自己調節フィードバック活性を有することもできるという見解は、ＬＰＳ刺激が中
和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下で実施された場合にクラスＩＩ ＭＨＣ発現を低下さ
せなかったし、そして強くさえ増大させたので、ＬＰＳによる活性化後の単球によって生
産されたＩＬ−１０が、これらの細胞でのクラスＩＩ ＭＨＣ抗原のダウンレギュレーシ
ョンに対して応答性であるという観察によって支持される。
【００６９】
前炎症性サイトカインであるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮ
Ｆαは、急性および慢性の炎症性過程、並びに慢性関節リウマチを含む多数の自己免疫疾
患に関与する。これらのサイトカインは、免疫システムの細胞の活性化および機能を調節
するが、内皮細胞、ケラチノサイトおよび肝細胞のそれらも調節する。ＩＬ−１０がこれ
らのサイトカインの分泌に対して強いダウンレギュレートリー作用を有するという知見は
、ＩＬ−１０が炎症の強力な阻害剤であることを示唆する。これらの細胞でのクラスＩＩ
ＭＨＣ抗原のダウンレギュレーションによって単球のＡＰＣ能力を低下させることによ
る抗原特異的Ｔ細胞増殖の阻害および単球による前炎症性サイトカイン分泌に対する阻害
作用を含む、これまでに記載されたその性質に基づいて、ＩＬ−１０は免疫および炎症性
応答のサプレッサーとして主要な役割を果たすと考えられる。この役割は、更に別のイン
ビトロの研究において並びに内毒素およびエンテロトキシン双方の超抗原応答のインビボ
模型において確証される。
【００７０】
本研究は、ＩＬ−１０が、マクロファージ細胞系および腹膜マクロファージによるＬＰ
Ｓに誘導されたサイトカイン生産に対して阻害作用することを実証する。例えば、ＩＬ−
１０はＴ細胞応答の調節において重要な役割を有するのみならず、感染または損傷の際に
引出された炎症性応答に対しても重要な役割を有する。
【００７１】
マクロファージ細胞系に対するＩＬ−１０の作用は、ネズミおよびヒト双方のマクロフ
ァージおよび単球によるサイトカイン生産を阻害することが予め分かっている同様の量の
ＩＬ−４によって引出される作用よりも顕著である。これらの結果は、ＬＰＳに誘導され
たＴＮＦαタンパク質生産のＩＬ−４による有意の阻害を示すが、これらの細胞系におい
てＩＬ−６合成の阻害はあまり顕著ではない。しかしながら、ＩＬ−４によるＴＮＦαの
阻害は、ヒト単球に関して従来報告されたほど大きくはない。この相違は、種の相違、単
球よりもむしろ分化したマクロファージ細胞系を用いることにより、またはこれらの研究
が、ヒト単球システムの一つにおいて用いられた１００ｎｇ／ｍｌ用量に対立するものと
してＬＰＳ１０μｇ／ｍｌを用いたことから説明することができる。ＩＬ−４とは対照的
に、ＩＬ−１０は、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１タンパク質生産をこの高濃度のＬ
ＰＳで有意に阻害した。マクロファージ細胞系のＬＰＳおよびＩＦＮγによる刺激は、は
るかに高濃度のＴＮＦαおよびＩＬ−６を誘導し、ある場合において、これはＩＬ−４作
用に対して不応性であって、ＩＬ−４およびＩＦＮγがマクロファージ活性化のある種の
態様に対して反対のおよび相殺作用を有することができることを示唆した。更に、これは
、一層低量のＬＰＳを用いて実施されたヒト単球での研究とは対照的である。更に、ＬＰ
Ｓを加えたＩＦＮγに誘導されたＩＬ−６およびＴＮＦαタンパク質の生産のＩＬ−１０
に媒介された阻害は、ＩＬ−４を用いて見られる阻害よりも有意であった。ＩＬ−６およ
びＴＮＦαをコードしているＲＮＡの、ＬＰＳまたはＬＰＳを加えたＩＦＮγに誘導され
た発現の阻害は、更に、逆転写ＲＮＡに関する半定量的ＰＣＲ増幅法を用いて観察された
。若干の場合、ＩＬ−４はＩＬ−１０と同程度に発現を阻害し、ＩＬ−１０が、翻訳され
たタンパク質の分泌または安定性に対する作用を有することが示唆された。しかしながら
、ＩＬ−１０はその作用を達成し、マクロファージによるサイトカイン生産に対するその
最終の阻害作用は、ＩＬ−４によって見られる作用よりも強力であると考えられる。モノ
カイン生産に対するＩＬ−１０の作用は、この強力な阻害剤がおそらく広範囲の臨床的発
現において抗炎症薬としての可能性を有することができるということを示唆する。
【００７２】
腹膜マクロファージは、刺激性Ｔ細胞からのＩＬ−１０によって阻害されたことが更に
分かったので、ＩＬ−１０がこの精製細胞集団によってサイトカイン分泌を阻害したかど
うかを検査した。ＬＰＳによって刺激されたＢＡＬＢ／ｃまたはＣＢＡ／Ｊマウスから得
られたＦＡＣＳ精製腹膜マクロファージは、ＩＬ−１０の存在下において僅かだけ減少し
た有意の量のＩＬ−６タンパク質を生産した。予備的ＰＣＲデータは、精製されたマクロ
ファージがＩＬ−１０を生産したことを示唆したので、ある種のＬＰＳ刺激には、ＩＬ−
１０に対して向けられた抗体が含まれていた。双方の系統のマウスにおけるＬＰＳ刺激に
対してこの抗体を加えることにより、ＩＬ−６タンパク質の生産ははるかに高濃度まで増
大した（２０時間以内に３０〜３５ｎｇ／ｍｌ／細胞７ｘ１０５個／ｍｌ）。これは、タ
イトオートクリン制御下にあるマクロファージによるサイトカイン生産と一致し、すなわ
ち２集団以上のマクロファージが腹膜マクロファージＭａｃ−１+,鮮明 中に含まれ、そ
の一つがＩＬ−１０のその生産によって他にまさる制御を有することと一致する。更に、
ヒト単球システムにおいて平行して得られたデータは、ＩＬ−１０が、水簸によって精製
されたヒト単球によるＩＬ−１０それ自体の生産を含むＬＰＳに誘導されたサイトカイン
生産を阻害することを示す。ＩＬ−４およびＩＬ−１０などのＴヘルパー細胞由来のサイ
トカインの作用をＩＦＮγなどのＴｈ１ Ｔヘルパー細胞サイトカインと対比した従来の
報告により、これらのサイトカインが互いに相殺作用を有することがあるという確証が得
られる。ＩＦＮγは、同一マクロファージによるＩＬ−１０の生産を表面上阻害すること
により、ＬＰＳに応答して生じたＩＬ−６濃度を、抗ＩＬ−１０によって達成されたのと
ほぼ同程度の高濃度まで増大させた。これらのデータは、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどの
サイトカイン生産が、ＩＬ−１０によって調節され、引続き、活性Ｔ細胞およびＮＫ細胞
によって生産されたＩＦＮγの制御下にあることを示唆する。ＩＦＮγのこの作用は、腹
膜マクロファージとＩＦＮγとの２４時間のインキュベーションが、Ｔｈ１細胞を刺激す
るそれらの能力を改良したことを示す従来の観察報告を説明することができる。
【００７３】
ＩＬ−１０が、刺激性細胞からのマクロファージのサイトカイン合成をどのように阻害
するかという機序はまだ解明されていない。マクロフアージがＩＬ−１０の存在下で刺激
された場合に観察されるサイトカイン合成における有意の減少を考慮すると、ＩＬ−１０
は、マクロファージおよび抗原に応答した最適サイトカイン分泌に必要とされる同時刺激
活性をダウンレギュレートすることができる。刺激された１Ｇ１８．ＬＡマクロファージ
細胞から得られた上澄みを用いて、Ｔｈ１細胞のマクロファージおよび抗原依存刺激に対
するＩＬ−１０の阻害作用を克服することは不可能であった。これは、ＩＬ−１０が、可
溶性同時刺激剤のダウンレギュレーションによってサイトカイン合成に対するその作用を
媒介しない場合の機序と一致する。疑わしいが、ＩＬ−１０はこの種の因子の生産よりも
むしろその作用を妨害すること、またはこのような同時刺激剤が極めて不安定であり若し
くは吸収され、したがって、これらの上澄み調製試料中に存在しないことが考えられる。
或いは、ＩＬ−１０は膜に結合した同時刺激剤の発現を阻害することができ、更に、これ
は、可溶性同時刺激剤で置き換えることができないＡＰＣ／補助細胞を細胞の刺激に必要
とすることを示唆する従来の報告を説明するであろう。サイトカイン合成のＩＬ−１０阻
害機序に対する別の説明は、ＩＬ−１０が、マクロファージによる１種類または複数の阻
害因子の生産を誘導した後、Ｔ細胞に対して作用してサイトカイン分泌を阻害するという
ことがありうる。Ｔ細胞の刺激に関する抗原特異的システムにおけるマクロファージおよ
びＢ細胞ＡＰＣの混合は、それぞれの個々のＡＰＣによる刺激に匹敵するＴ細胞の追加の
刺激をもたらす。ＩＬ−１０の存在は、細胞によるサイトカイン合成を、Ｂ細胞ＡＰＣが
それ自体で達成する程度まで阻害する。これは、マクロファージが、Ｔ細胞に直接的に作
用する阻害剤またはＢ細胞ＡＰＣの生産を引起こさないことを示唆する。疑わしいが、こ
のような阻害剤がマクロファージ−Ｔ細胞相互作用に特異的でありうるかまたはＢ細胞Ａ
ＰＣがこのような活性作用を何とか克服し若しくは回避することが考えられる。ヒトシス
テムにおいて得られたデータにより、ＩＬ−１０は、単球によって生産された可溶性阻害
因子または同時刺激因子によるＴヘルパー細胞増殖のその阻害を達成しないことが示唆さ
れる。しかしながら、それらの作用は、ヒト単球でのＩＬ−１０によるＭＨＣ−クラスＩ
Ｉ抗原のダウンレギュレーションによって説明することができ、これはマウスシステムに
おいてはまだ観察されていない。
【００７４】
エフェクター機能の調節に加えて、ＩＬ−１０は、更に、種々のパターンのサイトカイ
ンを生産するＣＤ４ Ｔヘルパー細胞の種々のサブセットの活性化により、抗体生産に対
する免疫応答または遅延型過敏症（ＤＴＨ）の開始においてある役割を果たすことがある
。Ｂ細胞およびマクロファージ双方がＩＬ−１０を生産し且つＡＰＣとしても機能し、同
時に、種々のサイトカインモジュレーターに対して感受性である（ＩＦＮγは多数のＢ細
胞機能を阻害し；ＩＬ−１０はマクロファージを阻害するがＢ細胞ＡＰＣ機能を阻害しな
い）ということは、この理論に対する支持を与える。更に、これらの研究は、ＩＬ−１０
がマクロファージによるサイトカイン合成に対して有意の阻害作用を有し、更には、腹膜
マクロファージの顕著な形態学的変化を引起こすことを示唆する。総合すると、これらの
観察報告は、Ｔ細胞応答の調節においてのみならず、感染または損傷によって引出された
急性炎症応答の重要なモジュレーターとしても、ＩＬ−１０の重要な役割を示唆する。
【００７５】
実験Ｄにおいて、インビボでの超抗原に媒介された毒性を阻害するＩＬ−１０の能力を
検査した。ＩＬ−１０は、部分的にはＴ細胞を活性化するマクロファージの能力を阻害す
ることによって、Ｔ細胞によるサイトカイン生産を阻害することができる。超抗原は、Ｔ
ＣＲのＶβ鎖およびＡＰＣ上に存在するクラスＩＩ ＭＨＣ分子間に「橋」を形成するこ
とによってＴ細胞を活性化する分子として定義された。これらの結果は、ＩＬ−１０が、
マクロファージによって与えられた超抗原によって活性化されたＴ細胞によるサイトカイ
ン生産を阻害しうることを示唆した。この作用はインビトロで観察された。超抗原は、例
えば、ウイルスによってコードされた内因性でありうるしまたは外因性、例えば、微生物
エンテロトキシンでありうる。後者の群の最も研究された超抗原としてはブドウ球菌性エ
ンテロトキシンがある。現在、これらの毒素によって示された毒性は、インビボでＴ細胞
を活性化するそれらの能力に依ることが知られている。これらの観察報告は、Ｔ細胞活性
化を阻害する物質が、超抗原によって示された毒性を妨げることを示唆する。これは、シ
クロスポリンが、ＳＥＢに媒介された毒性を妨げるという観察報告と一致する。この模型
により、ＴＮＦαは毒性の主要な媒介物質である。ここで示された結果は、ＩＬ−１０が
、おそらくはＴ細胞によるＴＮＦ生産を阻害するその能力によってＳＥＢの毒性を防止す
ることができることを示す。
【００７６】
これらの観察報告は、インビボでのＩＬ−１０の作用機序に興味深く関係している。Ｉ
Ｌ−１０はマクロファージ機能、例えば、サイトカイン生産、Ｔ細胞を活性化する能力を
阻害することが分かっているし、そしてＢ細胞においてＩａ抗原発現を引起こす。しかし
ながら、ＳＥＢの毒性はＡＰＣによるＩａ抗原の発現に依存するので、これらのインビボ
での実験の成果は不明確であった。ＩＬ−１０がＳＥＢに誘導された毒性を防止するとい
うことは、インビボでの主ＡＰＣはマクロファージであってＢ細胞ではないということを
示唆する。
【００７７】
これらの結果は、ＩＬ−１０の治療的使用に関して重要な意味を持つ。ブドウ球菌性エ
ンテロトキシンによって引起こされる食中毒の他に、近年、多数の疾患が超抗原によって
引起こされることが報告されており、例えば、毒素性ショック症候群、川崎病、ブドウ球
菌性毒素によって引起こされた疾患および自己免疫疾患様慢性関節リウマチである。
【００７８】
ＩＬ−１０は、致命的な内毒素血症からマウスを防護するのに極めて有効であり、その
知見は、ＩＬ−１０が細菌性敗血症の治療に有用でありうることを示唆する。多数の他の
試薬、例えば、ＴＮＦαまたは内毒素に対する抗体およびＩＬ−１Ｒａは、細菌性敗血症
の治療のための臨床試験において一般的であるが、これらの大部分は、最適の防御のため
には、動物モデル実験において敗血症誘導前に与えられることが要求された。これに対す
る一つの例外であるＩＬ−１Ｒａは、動物モデル実験において敗血症誘導時に投与された
場合に有効であるが、内因性ＩＬ−１受容体全部を阻止するのに十分に多量に投与する必
要がある。更に、薬理学的用量のＩＬ−１０は、おそらくは受容体飽和量よりも少量で、
致命的な内毒素血症からの防護に寄与すべきであるマクロファージ／単球機能に対する一
連の作用を生じる。
【００７９】
前述の論及は、免疫系の種々の態様の調節および分化におけるＩＬ−１０投与の効果に
関するが、抗ＩＬ−１０抗体を用いてＩＬ−１０サイトカインの作用を遮断することによ
って更に別の見通しが達成される。
【００８０】
ここで示されたデータは、マウスの誕生から成体までの抗ＩＬ−１０抗体による連続処
置が、これらの同一被験動物の脾臓に位置した通常のＢ細胞の数、表現型または免疫担当
を変更することなく全Ｌｙ−１ Ｂ細胞の数および機能を激しく低減させることを示す。
いくつかの観察報告は、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１ Ｂ細胞の提案された
枯渇を支持する。すなわち、（ａ）抗ＩＬ−１０処置マウスは、正常マウスにおいてはＬ
ｙ−１ Ｂ細胞に富む部位であるそれらの腹膜腔中にＢ細胞をほとんどまたは全く含まな
い（ＤＮＡＸ実験動物施設の８週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜洗浄細胞は、表現型分析
により、５％未満の通常のＢ細胞を含む）；（ｂ）抗ＩＬ−１０処置マウスは、Ｌｙ−１
Ｂ細胞を循環性ＩｇＭの主要源として識別する従来の再構成実験と一致する、正常血清
ＩｇＭ濃度の０〜１０％を含み；そして（ｃ）抗ＩＬ−１０処置マウスは、特異的Ｂ細胞
がＬｙ−１ Ｂ細胞サブセットにあるための抗原であるホスホリルコリンおよびα１，３
−デキストランの注射に応答してほとんどまたは全く抗体を生じない。抗ＩＬ−１０処置
マウスにおいて通常のＢ細胞区分が変更されていないことを示唆するデータは同様に強制
的であり、変化していない脾臓Ｂ細胞数は正常細胞表面の遺伝標識表現型を示し、そして
胸腺依存抗原およびＢ細胞マイトジェンに対して正常に応答することを示唆する。抗ＩＬ
−１０処置マウスにおけるＬｙ−１Ｂ細胞の選択的枯渇は、これらの被験動物の腹膜腔に
おいて抗ＩＬ−１０処置の数週間後に再現されるＬｙ−１ Ｂ細胞が中断したように、一
時的であることが分かった。
【００８１】
抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１ Ｂ細胞の選択的枯渇に対する説明として、
いくつかの可能な機序が考えられた。示されたデータは、中和性抗ＩＬ−１０および抗Ｉ
ＦＮγ抗体の同時投与が、これらの実験において腹膜Ｂ細胞の枯渇を実質的に防止したの
で、少なくとも部分的には、これが抗ＩＬ−１０処置後のＩＦＮγ上昇の結果であること
を示す。ＩＦＮγが直接的にかまたは間接的にＬｙ−１ Ｂ細胞発生を阻害するという関
係は、Ｌｙ−１＋ Ｂリンパ腫ＢＣＬ１のＩＬ−５に誘導されたインビトロ増殖をＩＦＮ
γが僅かに抑制させるという従来の観察報告を暗示させる。これらの実験を続けて、正常
ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞以外の、腹膜細胞のＬＰＳに誘導された増殖のＩＦＮ
γに媒介された抑制が観察された。抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＩＦＮγの上昇がＬ
ｙ−１ Ｂ細胞枯渇を完全に説明するかどうか、およびこれがＬｙ−１ Ｂ細胞のＩＦＮ
γの直接作用または若干のＩＦＮγに媒介された間接作用に反映されるかどうかは十分に
理解されていない。おそらく、抗ＩＬ−１０処置マウスにおける他の変化が、Ｌｙ−１
Ｂ細胞の枯渇に対して更に寄与している。おそらく、抗ＩＬ−１０処置が内因性モノカイ
ン濃度の上昇をもたらしている。抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショッ
クによる致死に対して５０倍を越えて感受性であり、その結果はモノカインによって媒介
されることが知られており、そして個々の抗ＩＬ−１０処置マウス３２匹の内の５匹は実
質的な濃度の血清ＩＬ−６を含み、モノカインは正常な動物の循環において見出されない
のが一般的であり、これらの実験による１０匹の対照マウスのいずれの血清中でも検出さ
れなかった。しかしながら、ＬＰＳのインビボ投与によって血清モノカイン濃度が大きく
上昇したＩＬ−６形質転換マウスまたは動物は正常血清ＩｇＭ濃度を有すると考えられ、
Ｌｙ−１ Ｂ細胞数が変化していないことが示唆される。通常のＢ細胞以外のＬｙ−１
Ｂ細胞は構成的および誘導性ＩＬ−１０を生じるという初期の知見は、ＩＬ−１０がオー
トクリン成長因子として作用するという示唆をもたらす。現在のところ、これは、抗ＩＬ
−１０および抗ＩＦＮγ抗体で処置したマウスから回収された腹膜Ｌｙ−１ Ｂ細胞の実
質的な数を考慮すると、疑わしいと考えられる。
【００８２】
連続の抗ＩＬ−１０処置によってつくられたＬｙ−１ Ｂ細胞枯渇マウスは、Ｌｙ−１
Ｂ細胞を欠失し且つ胸腺非依存抗原のサブセットに対して非応答性であるＣＢＡ／Ｃａ
Ｈマウス由来の自然突然変異系統である免疫欠乏ｘｉｄマウスに対してかなりの類似点を
有する。これらの類似点にもかかわらず、本発明者の予備研究は、ｘｉｄマウスがＩＬ−
１０を正常に生産し、そして機能的ＩＬ−１０受容体を有し、したがって、ｘｉｄマウス
および抗ＩＬ−１０処置マウスが機械的に区別されることを示した。更に、抗ＩＬ−１０
処置マウスをｘｉｄマウスと区別した一つの性質は、前者によって示されるが後者の動物
では示されない抗ＩｇＭ刺激に対する脾臓細胞のインビトロの応答性である。
【００８３】
ＩＬ−１０の生理学的役割は、マウスに誕生から成体まで、ＩＬ−１０を特異的に中和
する単クローン性抗体を注射することによって研究された。このような処置は、これらの
被験動物の免疫状態に多数の独特な変化をもたらす。被験動物は、循環性ＴＮＦα、ＩＦ
Ｎ−γ、そして多くの場合、ＩＬ−６の増加を特徴とする。これらの作用は、従来報告さ
れたＩＬ−１０のインビトロの性質である、細胞培養実験におけるＩＦＮγおよびモノカ
イン生産の強力な抑制と一致する。内因性ＩＦＮγの増加は、抗ＩＬ−１０処置によって
得られた他の結果のいくつかの原因であると考えられる。例えば、それは、Ｌｙ−１ Ｂ
細胞の枯渇をもたらし、続いて、これは、循環性ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体の減少、並びに
ホスホリルコリンおよびα１，３デキストランに対する特異的抗体応答の要因となる。上
昇したＩＦＮ−γ濃度は、ＩＦＮ−γによってこのイソタイプが明確に調節される循環性
ＩｇＧ2aの増加の原因でもあると考えられる。腹膜Ｔ細胞、顆粒球および循環性ＩｇＧ2a
の増加の残りの変化は機械的に理解されないが、これらは、二次サイトカイン摂動の結果
でありうる。概して健康であるが、抗ＩＬ−１０処置マウスは、内毒素に誘導されたショ
ックの結果としての致死に対して極めて感受性であることが分かった。この致命的な炎症
反応は、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６かまたは内毒素に特異的な抗体の受身伝達によっ
て防止することができるモノカインに媒介された結果である。したがって、内因性モノカ
インのアップレギュレーションを示し、そして抗内毒素抗体を生じると考えられるＢ細胞
集団（すなわち、Ｌｙ−１ Ｂ細胞）を欠いている抗ＩＬ−１０処置マウスが、この炎症
性反応に対して一層感受性であるということは驚くべきことではない。これらのデータは
、抗炎症薬としてのＩＬ−１０の臨床的役割を示唆する。この概念と一致して、実験は、
薬理学的用量のＩＬ−１０が、内毒素に誘導されたショックによる致死からマウスを防護
することを示す。
【００８４】
抗ＩＬ−１０処置マウスの概説された表現型は、ＩＬ−１０の既知のインビトロの性質
と明らかに一致するが、それにもかかわらず、それは、遺伝子を標的とすることによって
ＩＬ−１０欠乏にされたマウスについての予備報告のそれとは対照的である。これらの突
然変異体は、検出不能な濃度の循環性ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６、腹膜腔中
の正常な数のＬｙ１ Ｂ細胞、並びに一次近似において正常の血清Ｉｇ濃度を有する。こ
の相違の解釈は明らかではないが、同様の相違する状態は、ＩＬ−２ノックアウトマウス
と、誕生から成体まで抗ＩＬ−２受容体抗体で処置されたマウスの少なくとも若干の報告
との間に存在する。一つの解釈は、サイトカイン系中に存在する十分に認識された重複性
に関係する。発育するマウス胚は、密接に関係した機能を有するサイトカインをコードし
ている遺伝子の発現を増幅することによって臨界的サイトカイン遺伝子の損失を補うこと
が可能である。例えば、ＩＬ−４はＩＬ−１０と多数の性質を分担しているので、このサ
イトカインは、ＩＬ−１０の全損失を補うのに優れた候補であり、したがって、その発現
はＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいてアップレギュレートされるようになりうる。こ
れに対して、マウスの誕生からの抗体治療による内因性ＩＬ−１０の中和は、サイトカイ
ンの「漏出」脱離を最もよく表わし、そして残留する痕跡の内因性ＩＬ−１０は、深刻な
免疫不全および補償サイトカイン経路の調節活性化を避けるのに十分でありうる。抗体で
処置された動物は、投与された異種抗体および／または結果として得られた免疫複合体に
対する人為的免疫応答を増大させるという別の解釈を全く排除することはできない。それ
にもかかわらず、この解釈は、イソタイプ対照抗体および、インビボで免疫複合体を更に
生じると考えられる他のサイトカインに対する抗体が、抗ＩＬ−１０処置マウスに起因す
る免疫調節を生じないので疑わしいと考えられる。
【００８５】
抗ＩＬ−１０処置マウスにおいて観察された免疫調節のパターンは、既知のヒト免疫不
全症のいずれとも全く相関しないので、ヴィスコット・オールドリッチ患者およびＩｇＡ
欠乏症候群患者双方にある種の類似点が存在する。これらのヒト免疫欠乏は、それぞれ循
環性ＩｇＭまたはＩｇＡの欠失、抗細菌性抗体応答を生じる低下した能力、および循環性
ＩｇＧ１の頻繁な増加、おそらくはネズミＩｇＧ２ａと相関する主な補体結合性ヒト抗体
イソタイプを特徴とする。このような患者が減少したＩＬ−１０生産または応答性を示す
かどうか、そうである場合に、続いてこれがそれらの免疫欠乏の一因となるかどうかは確
証を待っている。ＩｇＡ欠乏症候群におけるＩＬ−１０の可能な役割は、無経験（ｎａｉ
ｖｅ）ヒトＢ細胞を、架橋した抗ＣＤ４０抗体およびＴＧＦβによる活性化後にＩｇＡ分
泌細胞に分化させるのに必要とされる重要な補助因子としてＩＬ−１０が明らかに関係し
ている最近の研究を考慮すると、特に興味をそそる。抗ＩＬ−１０処置マウスが、２種類
の細菌性抗原に対する特異的抗体応答を生じることができないことは、ＩＬ−１０が、上
記に記載したように、抗細菌性免疫において有効なアジュバントであるという主張を更に
支持する。
【００８６】
ＩＬ−１０の生理学的役割および臨床的可能性についての情報の提供に加えて、抗ＩＬ
−１０処置マウスは、免疫系に対するＬｙ−１ Ｂ細胞の寄与を評価する新たな機会を提
供する。前記のように、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１ Ｂ細胞枯渇によって
生じた二次的結果は、この少数のＢ細胞亜集団に予め起因する多数の性質を確証する。し
かしながら、これらのデータにより、更に、免疫系に対するＬｙ−１ Ｂ細胞の寄与を考
える新しい見通しが得られる。特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３また
はＩｇＥの応答の発生に関して、これらのイソタイプの血清濃度はＬｙ−１ Ｂ細胞が枯
渇した抗ＩＬ−１０処置マウスにおいて減少しないので、Ｌｙ−１ Ｂ細胞は必要とされ
ないと結論することは適当である。同様に、Ｌｙ−１ Ｂ細胞は若干の胸腺非依存性ＩＩ
型抗原、例えば、ホスホリルコリンおよびα１，３デキストランに対する応答性に本質的
であるので、明らかに、それらは他の、例えば、ＴＮＰ−フィコールおよび抗ＩｇＭに必
要とされない。実際に、多糖抗原に対するＢ細胞応答性に独自に関係したイソタイプであ
る循環性ＩｇＧ３の不変のまたは僅かに上昇した濃度は、Ｌｙ−１ Ｂ細胞欠乏マウスが
、大部分の胸腺非依存性ＩＩ型抗原に対しておそらく応答することができるということを
示唆する。抗ＩＬ−１０処置マウスのこの態様は、Ｌｙ−１ Ｂ細胞を欠失しているが、
胸腺非依存性ＩＩ型抗原全部に対して応答しない自然発生免疫欠乏マウス系統であるｘｉ
ｄマウスとそれらとを容易に区別する。
【００８７】
免疫系に対するＬｙ−１ Ｂ細胞の寄与についての情報の提供に加えて、抗ＩＬ−１０
処置マウスは、本発明者がインビボでのＴＮＦα上昇の結果を評価することを可能にする
。本発明者のデータは、ＩＬ−１０のインビボでの拮抗作用が血清ＴＮＦα濃度の実質的
な上昇をもたらすことを明らかに例証する。ＴＮＦα上昇の好ましくない結果は上記（例
えば、敗血症性ショック、大脳マラリア等）で詳細に考察されたが、ＴＮＦα上昇の多数
の好ましい結果も考慮すべきである。これらには、直接的抗腫瘍作用、顆粒球−単球造血
系の拡大、若干の自己免疫疾患および感染症に対する放射線防御および防御の動物モデル
における実証がある。したがって、これらの考察は、ＩＬ−１０アンタゴニストをこれら
の種類の疾患の処置において治療的に介入するための候補として暗示する。実際に、本発
明者は、抗ＩＬ−１０抗体が、狼瘡傾向のあるＮＺＢ／Ｗマウスにおいて自己免疫の発生
を実質的に遅らせることができるということを実証する程度までこの提案を確証した。
【００８８】
要約すると、本発明は、多数の疾患状態の主要な媒介物質であるモノカインの生産を調
節するためのＩＬ−１０またはＩＬ−１０アンタゴニストの使用に関する。ＩＬ−１０お
よびそのアゴニストは、ＴＮＦαなどのモノカインの顕著な抑制を引起こし、この方法に
おいて、望ましくない炎症性反応、例えば、細菌性敗血症、毒素性ショック、慢性関節リ
ウマチおよびプソナシス（ｐｓｏｎａｓｉｓ）に対する防御を提供する。同様に、ＩＬ−
１０アンタゴニストは、ＴＮＦαなどのモノカインの濃度を増大させ、引続き、抗腫瘍薬
として、並びにある種の自己免疫疾患および感染症に対する放射線防御および防御の提供
において作用することができる。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。ベクターおよび宿主の選択並びに試薬
の濃度、温度および他の可変パラメーターの値は、本発明の適用を例示するためのもので
あり、それを制限するものと考えるべきではない。
【００９０】
実例１
細菌宿主におけるヒトＩＬ−１０の発現
合成ヒトＩＬ−１０遺伝子を多数の化学的に合成された二本鎖ＤＮＡフラグメントから
組立てて、ＴＡＣ−ＲＢＳ−ｈＩＬ−１０と称する発現ベクターを生成した。クローニン
グおよび発現は、標準的な細菌の系、例えば、ビエラ（Ｖｉｅｒａ）およびメシング（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ）によってＧｅｎｅ，１９巻，２５９〜２６８頁（１９８２）に記載された
大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１、ＪＭ１０３または類似のものにおいて実施した。制限エン
ドヌクレアーゼ消化およびリパーゼ反応は、典型的に、標準的なプロトコル、例えば、本
明細書中に参考として包含される、マニアティスら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨ
ーク、１９８２）；サムブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニュ
ーヨーク）；およびオースベルら（１９８７年および定期補遺）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ウィリー・アンド・サン
ズ、ニューヨークを用いて実施した。
【００９１】
アルカリ法を小規模なプラスミド調製試料に用いた。大規模な調製試料に対しては、等
量のイソプロパノールを用いて核酸を透明な溶菌液から沈殿させるアルカリ法の変法を用
いた。冷２．５Ｍ酢酸アンモニウムによる沈殿を用いてＲＮＡを除去した後に、塩化セシ
ウム平衡密度遠心分離および臭化エチジウムによる検出を行なった。
【００９２】
フィルターハイブリダイセーションに関して、ワットマン５４０円形フィルターを用い
てコロニーを取り上げた後、それを、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ；１Ｍト
リスＨＣｌ ｐＨ８．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ（それぞれ２分間）による連続処理によっ
て溶解させ且つ固定し；そして８０℃で（３０分間）加熱した。ハイブリダイセーション
は、６ｘＳＳＰＥ、２０％ホルムアミド、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
大腸菌ｔＲＮＡ１００μｇ／ｍｌおよびクマシーブリリアントブルーＧ−２５０（バイオ
・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））１００μｇ／ｍｌ中において３２Ｐ標識（キナーゼ処理）合
成ＤＮＡを用いて４２℃で６時間であった。（２０ｘＳＳＰＥは、ＮａＣｌを１７４ｇ、
ＮａＨ2ＰＯ4９Ｈ2Ｏを２７．６ｇおよびＥＤＴＡ７．４ｇをＨ2Ｏ８００ｍｌ中に溶解す
ることによって製造された。ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。容量を１リットルに調
整し、そしてオートクレーブによって滅菌した）。フィルターを１ｘＳＳＰＥ、０．１％
ＳＤＳで２回洗浄した（室温、１５分間）。オートラジオグラフィー（フジ（Ｆｕｊｉ）
ＲＸフィルム）後、陽性コロニーは、フィルター上において再増殖コロニーを青色に染色
されたコロニーと一緒に整列させることによって位置が示された。ＤＮＡは、ジデオキシ
法、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４巻，
５４６３頁（１９７７）によって配列決定された。ジデオキシ反応用の鋳型は、Ｍ１３ｍ
ｐベクターで再クローン化された適当な領域の一本鎖ＤＮＡ、例えば、メシングら、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９巻，３０９頁（１９８１）かまたはミニアルカリ
法によって製造し且つ０．２Ｍ ＮａＯＨで変性し（室温、５分間）、そして２容量のエ
タノールを加えることによって０．２Ｍ ＮａＯＨ、１．４３Ｍ酢酸アンモニウムから沈
殿させた二本鎖ＤＮＡであった。ＤＮＡは、ホスホルアミダイト化学によりアプライド・
バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ合成機を用いて合
成された。合成、脱保護、開裂および精製（７Ｍ尿素ＰＡＧＥ、溶離、ＤＥＡＥ−セルロ
ースクロマトグラフィー）は、３８０Ａ合成機マニュアルに記載されたように実施した。
【００９３】
クローン化される合成ＤＮＡの相補鎖（それぞれ４００ｎｇ）を混合し、そして反応容
量５０ｍｌ中においてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。このＤＮＡをベクター
ＤＮＡ１ｍｇと連結し、適当な制限酵素で消化し、そして連結反応は容量５０ｕｌ中にお
いて室温で４〜１２時間行なった。リン酸化、制限酵素消化、ポリメラーゼ反応および連
結反応の条件は記載されている（マニアティスら、上記に引用）。コロニーは、アンピシ
リン、イソプロリル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（０．４ｍＭ）およ
び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ
）（４０μｇ／ｍｌ）を補足したＬ寒天上に平板培養することによって（望ましい場合）
ｌａｃＺ＋の評点をした。
【００９４】
ＴＡＣ−ＲＢＳベクターは、ｔａｃＰ含有プラスミドｐＤＲ５４０（ファーマシア（Ｐ
ｈａｒｍｃｉａ））の単一ＢａｍＨＩ部位を、ＤＮＡポリメラーゼを用いる充填によって
構築された。次に、これを、共通リボソーム結合性部位（ＲＢＳ、ＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴ
ＴＴＡＡＣ）をコードしている二本鎖フラグメントを形成する非リン酸化合成オリゴヌク
レオチド（ファーマシア）に対して連結した。連結反応後、混合物をリン酸化し、そして
ＳｓｔＩリンカーＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴと再連結した。次に、この複合体をＳｓｔＩおよ
びＥｃｏＲＩで開裂させ、そして１７３ｂｐのフラグメントをポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＰＡＧＥ）によって単離し、そしてＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ制限ｐＵＣ１９（ファ
ーマシア）（下記に記載の）でクローン化した。最終構築物（ＴＡＣ−ＲＢＳと称する）
のＲＢＳ−ＡＴＧ−ポリリンカー領域の配列は、本明細書中に参考として包含される米国
特許第５，０１７，６９１号明細書に開示されている。
【００９５】
合成ＩＬ−１０遺伝子を８工程においてｐＵＣ１９プラスミドで組立てた。各工程で、
欠失および／またはインサートを含まないインサートは、工程１で挿入されたＡＴＧ開始
コドンを含む枠においてｐＵＣ１９のｌａｃＺ（ａ）遺伝子を維持することによってクロ
ーニング後に検出することができた。欠失および／または挿入変化を含むクローンは、Ｘ
−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含むＬ−アンピシリンプレート上の青色コロニーの評点によっ
て濾去することができた。或いは、各工程で、小規模のプラスミドＤＮＡ調製試料に普遍
的配列決定プライマーを用いてインサートの配列を容易に確証することができる。
【００９６】
工程１において、ＴＡＣ−ＲＢＳベクターをＳｓｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（その３′エキソヌクレアーゼ活性はＳｓｔＩカットの３′突出鎖を消化してブラン
ト末端フラグメントを生成する）で処理し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの失活後に
ＥｃｏＲＩで処理して１７３塩基対（ｂｐ）フラグメントを生成する。このフラグメント
はＴＡＣ−ＲＢＳ領域を含み且つＡＴＧ開始コドンのところにブラント末端および反対側
の末端にＥｃｏＲＩカットを有する。最後に、１７３ｂｐのＴＡＣ−ＲＢＳフラグメント
を単離した。
【００９７】
工程２において、工程１の単離されたＴＡＣ−ＲＢＳフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／Ｋ
ｐｎＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９と、下記に示したように、上流末端にブラント末
端および下流末端にＫｐｎＩカットに対応するスタッガー末端を有する合成フラグメント
１Ａ／Ｂと一緒に混合した。このＫｐｎＩ末端はＢｓｔＥＩＩ部位に対しておよびその下
流に隣接している。フラグメントを連結して工程２のｐＵＣ１９を生成する。
【００９８】
工程３において、合成フラグメント２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂ（下記に示した）を、Ｂｓ
ｔＥＩＩ／ＳｍａＩで消化した工程２のｐＵＣ１９と混合し（増幅および精製後）且つ連
結して工程３のｐＵＣ１９を生成した。フラグメント３Ａ／Ｂの下流末端が、ＳｍａＩブ
ラント末端を生成する余分の塩基を含むことに留意されたい。これらの余分の塩基は工程
４において開裂した。更に、フラグメント２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂは、混合によってアニ
ールする相補的９残基一本鎖末端を有し、２Ａ／Ｂの上流ＢｓｔＥＩＩカットと、ｐＵＣ
１９に対して連結する３Ａ／Ｂの下流ブラント末端を残している。
【００９９】
工程４において、ＡｆｌＩＩ／ＸｂａＩで消化した工程３のｐＵＣ１９（増幅および精
製後）を再精製し、合成フラグメント４Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し、そして連結し
て工程４のｐＵＣ１９を生成する。
【０１００】
工程５において、ＸｂａＩ／ＳａｌＩで消化した工程４のｐＵＣ１９（増幅および精製
後）を合成フラグメント５Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し且つ連結して工程５のｐＵＣ
１９を生成する。フラグメント５Ａ／ＢのＳａｌＩスタッガー末端が工程６においてＨｐ
ａＩによる消化によって除去されることに留意されたい。
【０１０１】
工程６において、ＨｐａＩ／ＰｓｔＩで消化した工程５のｐＵＣ１９（増幅および精製
後）を合成フラグメント６Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し且つ連結して工程６のｐＵＣ
１９を生成する。
【０１０２】
工程７において、ＣｌａＩ／ＳｐｈＩで消化した工程６のｐＵＣ１９（増幅および精製
後）を合成フラグメント７Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し且つ連結して工程７のｐＵＣ
１９を生成する。
【０１０３】
工程８において、ＭｌｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した工程７のｐＵＣ１９（増幅およ
び精製後）を合成フラグメント８Ａ／Ｂおよび９Ａ／Ｂと混合し且つ連結して最終構築物
を生成する。最終構築物を標準的な技法によって、例えば、ＡＴＣＣから受託番号３３８
７６として入手可能な大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１に挿入した。培養後、タンパク質をＪ
Ｍ１０１細胞から抽出し、そしてその抽出物の希釈液の生物活性を検査した。フラグメン
トと称する配列を表１に示す。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
実施例２
ＣＯＳ７サル細胞におけるｖＩＬ−１０の発現
ｖＩＬ−１０の読取り枠をコードしている遺伝子を、タケベ（Ｔａｋｅｂｅ）ら（１９
８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６〜４７２に記載された、増幅フラグメン
トをＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤ（ＳＲａ）ベクター中に後で挿入することが可能なプライマー
を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。挿入されたフラグメントのコーディ
ング鎖を以下に示す（読取り枠を大文字で与える）。
【０１０７】
【化５】
【０１０８】
適当な配向のインサートを有するクローンを、ｖＩＬ−１０の発現および／または制限
消化の電気泳動パターンによって識別した。ｖＩＬ−１０遺伝子を有する一つのこのよう
なベクターはｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）と称され且つＡＴＣＣに受託番号６８１９３として
寄託された。ｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）を大腸菌ＭＣ１０６１において増幅させ、標準的な
技法によって単離し、そしてＣＯＳ７サル細胞を以下のようにトランスフェクトするのに
用いた。すなわち、トランスフェクションの前日に、ＣＯＳ７サル細胞約１．５ｘ１０6
個を、１００ｍｍプレートそれぞれの５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２ｍＭグルタミ
ンを含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）中に播種した。トランスフェクションを
実施するために、ＣＯＳ７細胞をトリプシンとのインキュベーションによる皿から取出し
、血清不含ＤＭＥ中で２回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥ中において細胞１０7個／ｍｌ
に懸濁させた。アリコート０．７５ｍｌをＤＮＡ２０μｇと混合し、そして滅菌０．４ｃ
ｍエレクトロポレーションキュベットに移した。１０分後、細胞にバイオラド・ジーン・
パルサー（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）装置において２００ボルト、９６０
ｍＦでパルスした。更に１０分後、細胞をキュベットから取出し、そして５％ＦＣＳ、２
ｍＭグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを含むＤＭＥ２
０ｍｌを加えた。混合物を１００ｍｍ組織培養皿４個に分別した。３７℃、５％ＣＯ2で
１２〜２４時間後、培地を同様の１％ＦＣＳのみを含む培地と取り換え、そしてインキュ
ベーションを３７℃、５％ＣＯ2で更に７２時間続けた後、培地を集め、そしてＩＦＮγ
合成を阻害するその能力を検定した。
【０１０９】
新たに単離した末梢血液白血球（ＰＢＬ）のアリコート１０ｍｌ（細胞約２ｘ１０6個
／ｍｌ）を、（ｉ）５％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを補足した９０％ＤＭＥと、（ｉ
ｉ）ｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）で予めトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞からの１０％上
澄みとから成る培地中においてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（１００ｎｇ／ｍｌ）と
一緒に３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞および上澄みを採集して、ＩＦＮ
γ ｍＲＮＡかまたはＩＦＮγタンパク質の存在をそれぞれ検定した。対照は、１０％上
澄みが、無関係のｃＤＮＡインサートを有するプラスミドで予めトランスフェクトされた
ＣＯＳ７培養物からであることを除き、同様に処理された。ｖＩＬ−１０処置試料は、対
照に相対して約５０％のＩＦＮγ合成阻害を示した。
【０１１０】
実施例３
大腸菌におけるｖＩＬ−１０の発現
下記のｖＩＬ−１０をコードしている遺伝子は大腸菌において発現することができる。
【０１１１】
【化６】
【０１１２】
ｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）のｃＤＮＡインサートをＭ１３プラスミドで再クローン化し、
そこにおいて、それは特定部位の突然変異誘発によって２回変更された。すなわち、最初
に、成熟ｖＩＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の５′末端にＣｌａＩ部位を形成
し、そして第二に、成熟ｖＩＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の３′末端にＢａ
ｍＨＩ部位を形成した。次に、突然変異配列を、以下に記載したＴＲＰＣ１１発現ベクタ
ー中に容易に挿入した。
【０１１３】
ＴＲＰＣ１１ベクターを、合成した共通ＲＢＳフラグメントをＣｌａＩリンカー（ＡＴ
ＧＣＡＴ）に対して連結することによっておよびその結果得られたフラグメントをＣｌａ
Ｉ制限ｐＭＴ１１ｈｃ（ＣｌａＩ部位を含むように予め修飾された）でクローニングする
ことによって構築した。ｐＭＴ１１ｈｃは、ｐＶＸプラスミドＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉポリリンカー領域を有するｐＢＲ３２２のＴＥＴＳ誘導体である小型の（２．３キロベ
ース）高コピーＡＭＰRである。ｐＶＸは、マニアティスら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリン
グ・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバーに記載されている。これを、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでｐＭＴ１１ｈｃを制限することによってＣｌａＩ部位を含む
ように修飾し、得られた５′付着端をフィルインし、そしてＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣ
ＧＡＴＧ）と連結し、それによってＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を復元し且つＳｍａ
Ｉ部位をＣｌａＩ部位で置き換えた。ＴＲＰＣ１１構築による一つの形質転換体は、Ｃｌ
ａＩ部位に隣接してタンデムにＲＢＳ配列を有した。ＣｌａＩ部位の一つおよびＲＢＳ配
列の第二コピーの一部分を、このプラスミドをＰｓｔＩで消化し、Ｂａｌ３１ヌクレアー
ゼで処理し、ＥｃｏＲＩで制限し、そして４種類全部のデオキシヌクレオチド三リン酸の
存在下においてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって除去した。得られた３
０〜４０ｂｐのフラグメントをＰＡＧＥによって回収し且つＳｍａＩ制限ｐＵＣ１２中に
クローン化した。次に、ｐＫＣ１０１由来の２４８ｂｐの大腸菌ｔｒｐｐ含有ＥｃｏＲＩ
フラグメント（ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）ら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５〜１６４，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ），ニューヨークに記載された）をＥｃｏＲＩ部位でクローン化してＴＲＰ
Ｃ１１構築を完成した。これを図１に図示する。ＴＲＰＣ１１は、最初にそれをＣｌａＩ
およびＢａｍＨＩで消化し、それを精製した後、それを標準的な連結反応溶液中において
、成熟ＢＣＲＦ１をコードするヌクレオチド配列を有するＭ１３のＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ
フラグメントと混合することによってｖＩＬ−１０のためのベクターとして用いられた。
ＴＲＰＣ１１−ＢＣＲＦ１と称するインサート含有ＴＲＰＣ１１を、例えば、ＡＴＣＣか
ら受託番号３３８７６として入手可能な大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０１において増殖させた。
【０１１４】
実験Ａ
インターロイキン−２に誘導されたインターフェロン−γ合成およびリンホカインに活性
化されたキラー活性に対するインターロイキン−４およびインターロイキン−１０の示差
効果
この項で示したデータは、本明細書中にその全部が参考として包含されているシューら
（１９９２）Ｉｎｔ′ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４：５６３〜５６９、においてその優
先日後に公開された。
【０１１５】
概要
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）とインターロイキン−２（ＩＬ−２）との培養は、
サイトカインの合成およびリンホカインに活性化されたキラー（ＬＡＫ）活性の発生を刺
激する。インターロイキン−４およびインターロイキン−１０（ＩＬ−１０；サイトカイ
ン合成阻害因子、ＣＳＩＦ）双方は、ＩＬ−２に誘導されたヒトＰＢＭＣによるＩＦＮγ
およびＴＮＦαの合成を阻害する。しかしながら、ＩＬ−４とは異なり、ＩＬ−１０は、
ＰＢＭＣおよび活発なナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩＬ−２に誘導された増殖も、Ｉ
Ｌ−２に誘導されたＬＡＫ活性も阻害しない。更に、ＩＬ−４は、精製された活発なＮＫ
細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成を阻害するが、対照的に、ＩＬ−１０の阻
害作用はＣＤ１４＋細胞（単球／マクロファージ）によって媒介される。ＩＬ−１０は単
球またはＮＫ細胞を加えた単球によるＴＮＦα合成を阻害するが、ＮＫ細胞単独による場
合は阻害しない。これらの結果は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０が異なる経路によってＮＫ
細胞に作用することおよびＩＬ−２に誘導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性は異
なる機序によって調節されることを示す。
【０１１６】
インターロイキン−１０（サイトカイン合成阻害因子、ＣＳＩＦ）は、マウスおよびヒ
トＴリンパ球および単球／マクロファージによるＩＦＮγなどのサイトカインの合成を阻
害する。Ｔ細胞サイトカイン合成に対する阻害作用は間接的であり、単球／マクロファー
ジによってそれらの抗原提示細胞としての能力において媒介される。マウスおよびヒト双
方のＩＬ−１０（ｍＩＬ−１０；ｈＩＬ−１０）は、マウスおよびヒト細胞に対してＩＬ
−１０活性を示すエプスタイン・バールウイルス読取り枠ＢＣＲＦ１（ウイルスＩＬ−１
０；ｖＩＬ−１０）に対して相同である。ｖＩＬ−１０が、ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２
に誘導されたＩＦＮγ合成を阻害することは初期に観察された。ＮＫ細胞はＩＬ−２に刺
激されたＰＢＭＣ中の主要なＩＦＮγ源であることが報告されているので、ＩＬ−２に誘
導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性に対するｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０の
作用は、これらのサイトカインとＬＡＫ活性の既知の阻害剤であるＩＬ−４とを比較する
ことと一緒に研究された。データは、ＩＬ−４、ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０が、Ｉ
Ｌ−２に刺激されたＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成を阻害するが、ＩＬ−
４だけが精製ＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成を阻害するということを示す。更に、ＩＬ−４
とは異なり、ＩＬ−１０はＩＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性を阻害しない。これらの結果
は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０が異なる機序によってＮＫ細胞に作用し且つＩＬ−２に誘
導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性が異なる経路によって調節されるという模型
を支持する。
【０１１７】
実施例Ａ１
ＩＬ−２に誘導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性に対するＩＬ−４およびＩＬ−
１０の作用
サイトカイン
ヒト組換体ＩＬ−２（ｒＩＬ−２）は、Ｓ．ズラウスキー（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）による
標準的な方法（ＤＮＡＸ）を用いて好ましく製造するかまたは購入した（シータス（Ｃｅ
ｔｕｓ）、エメリービル、ＣＡ）。ヒトｒＩＬ−４はシェリング・プラウ・リサーチ（Ｓ
ｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）からであった。ヒトｒＩＬ−１βは
バイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
）（カマリロ、ＣＡ）から購入した。組換体ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０をＣＯＳ７
トランスフェクション上澄みとして用い、不適当なｃＤＮＡを含むかまたはｃＤＮＡ不含
のトランスフェクションからの上澄みを対照として用いた。本明細書中に参考として包含
され且つ上記のビエラら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ ８８：１１７２〜１１７６およびシューら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：８
３０〜８３２を参照されたい。ＩＦＮγおよびＴＮＦα（エンドジェン（Ｅｎｄｏｇｅｎ
）、ボストン、ＭＡ）をエリザによって測定した。ＩＬ−２不存在下のサイトカイン生産
は、ＩＦＮγおよびＴＮＦαエリザ検定の感度限界未満であり、それぞれ０．３ｎｇ／ｍ
ｌおよび１２ｐｇ／ｍｌであった。
【０１１８】
細胞系
ダウディ（バーキットリンパ腫）細胞はシェリング・プラウ（リヨン、フランス）によ
って提供された。ルイス・ラニア博士（Ｄｒ．Ｌｅｗｉｓ Ｌａｎｉｅｒ）によって提供
されたＣＯＬＯ（結腸癌）細胞を、５％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０中におい
て培養した。
【０１１９】
抗体
白血球細胞表面抗原に対する単クローン性抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１４、
ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６）をベクトン・ディキンソン（サン・ホセ、ＣＡ）から購
入した。マグネチックビーズ枯渇実験用の抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１４、Ｃ
Ｄ１９）は、適当な細胞系を注射したＳＣＩＤマウスの腹水から製造した。抗ＩＬ−４お
よび抗ＩＬ−１０中和抗体は、例えば、本明細書中に参考として包含される、クレティア
ン（Ｃｈｒｅｔｉｅｎ）ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１７：
６７〜８１；およびイセル（Ｙｓｓｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．７２
：２１９〜２２７に記載されている。
【０１２０】
ＰＢＭＣの調製および培養
ヒトＰＢＭＣを、健康なドナーからのバフィーコートからフィコール・ハイパクでの遠
心分離によって単離し、そして１％ヒトＡｂ＋血清を有するイセル（Ｙｓｓｅｌ′ｓ）培
地中において他のサイトカインを含むかまたは含まない１０６／ｍｌ ｕｂ ｒＩＬ−２
（２００単位／ｍｌ）で培養した。培養は２４（または９６）ウェルプレート中において
５日間実施し、そして上澄みを採集した。異なるドナーからのＰＢＭＣは、ＩＬ−２によ
って刺激された場合、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを生産するそれらの能力が異なった。
【０１２１】
細胞精製
ＰＢＭＣを洗浄し且つ組織培養皿中において３７℃で４０分間インキュベートした。付
着細胞をラバーポリスマンで掻取ることによって集めた。非付着細胞を除去し、ペレット
にし、そしてナイロンウールカラムに入れ且つ３７℃で４０分間インキュベートした。カ
ラムから溶離後、細胞をペレットにし、１０％ＦＣＳ／ＰＢＳを含む３０％パーコール（
Ｐｅｒｃｏｌｌ）中に再懸濁させ、そして４０％パーコール上に重層した。室温で３０分
間遠心分離後、界面の大型顆粒リンパ球を回収し且つ２回洗浄した。これらの細胞を抗Ｃ
Ｄ５６抗体（ベクトン・ディキンソン、サン・ホセ、ＣＡ）と一緒に４℃で３０分間イン
キュベートし、洗浄した後、ＦＡＣＳ選別の前に、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ（ジャクソン・
イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、エーボンデール、
ＰＡ）で染色した。ＣＤ５６＋細胞は、選別を行なった細胞の約３５〜５０％であった。
選別された細胞は、再分析により、９９．５％より大のＣＤ５６＋であった。精製ＮＫ細
胞９ｘ１０４個を、最終容量１００ｍｌ中において付着細胞またはＴ細胞３ｘ１０４個と
混合し、そして他のサイトカインを含むかまたは含まないＩＬ−２と一緒に培養した。
【０１２２】
同一ドナーからの精製ＮＫ細胞および単球を以下のように得た。すなわち、ＰＢＭＣを
ヒツジ赤血球と一緒に一晩中インキュベートし；ロゼット形成「Ｅ＋」（ＣＤ２＋）およ
び非ロゼット形成「Ｅ−」細胞をフィコール・ハイパク勾配での遠心分離によって分離し
た。Ｅ＋細胞に、ＰＢＭＣに関して記載したのと同様の精製操作（前記を参照されたい）
を施して精製ＮＫ細胞を得た。引続き、Ｅ−細胞を抗ＣＤ１４ ｍＡｂ（ＬｅｕＭ３）お
よびＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートし、そしてＣＤ１４＋
細胞をファクスタープラス（ＦＡＣＳｔａｒ ｐｌｕｓ）で選別した。これらの細胞純度
は９８％より大であった。精製ＮＫ細胞１０５個を１００ｍｌ中において純粋な単球１０
4個と一緒にインキュベートし且つ単独でかまたはＩＬ−２および前記に記載の他の添加
物と一緒に培養した。
【０１２３】
或いは、ＮＫ細胞および単球をマグネチックビーズ選択によって豊富にした後、以下の
ように選別した。すなわち、ＰＢＭＣを最初に単クローン性抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ
５および抗ＣＤ１９抗体と一緒にインキュベートしてＴ細胞およびＢ細胞を染色した。Ｐ
ＢＳで２回洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧ被覆マグネチックビーズ（ダイナビーズ（Ｄｙｎ
ａｂｅａｄｓ）Ｍ−４５０、ダイナル・インコーポレーテッド（Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．）
、グレート・ネック、ＮＹ）を加えて、抗体被覆Ｔ細胞およびＢ細胞をマグネチック選択
によって除去した。得られた豊富なＮＫ細胞および単球を抗ＣＤ５６−ＰＥおよび抗ＣＤ
１４−ＦＩＴＣで染色し、そしてＣＤ５６＋およびＣＤ１４＋細胞を細胞ソーターで単離
した。２種類の選別された細胞集団の純度は９８．５％より大であった。
【０１２４】
細胞毒性検定
ＰＢＭＣを、１％ヒトＡＢ＋血清を含むイセル培地中においてＩＬ−２を２００Ｕ／ｍ
ｌと一緒に細胞１０６個／ｍｌで３日間インキュベートした。培養は、リンブロ（Ｌｉｎ
ｂｒｏ）２４ウェルプレート（フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）、マクリーン、ＶＡ）の１−ｍｌウェル中で実施した。培養期間後に細胞を採集
し、２回洗浄し、そして５１Ｃｒ放出検定においてエフェクター細胞として用いた。本明
細書中に参考として包含される、スピッツ（Ｓｐｉｔｓ）ら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１４１：２９〜 を参照されたい。５１Ｃｒで標識された標的細胞（ＣＯＬＯま
たはダウディ）１０００個を、Ｕ字型の９６ウェルプレート中の０．２５％ＢＳＡ含有イ
スコヴ（Ｉｓｃｏｖ′ｓ）培地（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．）、セント・ルイス、ＭＯ）中において種々の数のエフェクター細胞と
混合した。プレートを５０ｘｇで５分間遠心分離した後に、給湿した５％ＣＯ２雰囲気中
において３７℃で４時間インキュベーションした。試料を採集し且つガンマカウンター（
ＬＡＢ、ブロンマ、スウェーデン）で計数した。
【０１２５】
組換体ｈＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０およびｈＩＬ−４を、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ
）中においてＩＬ−２によって引起こされたＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成並びにＬＡＫ
活性に対するそれらの作用に関して検査した。ＰＢＭＣをｒＩＬ−２の２００Ｕ／ｍｌ中
においてｒＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）と一緒にかまたはｈＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０含
有若しくはサイトカイン不含（模擬）のＣＯＳ７上澄みと一緒に５日間培養した後、サイ
トカイン合成を測定した。ｈＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０またはＩＬ−４を含む培養物中に
おいてＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成は実質的に阻害された（図２
Ａ、２Ｂ）。
【０１２６】
ＩＬ−４によって得られた結果は、ＩＬ−４が、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ ｍＲ
ＮＡおよびタンパク質の発現を阻害するという観察報告を確証する。ＩＬ−４およびＩＬ
−１０双方によるサイトカイン合成の阻害は用量依存性であり、抗ｈＩＬ−４および抗ｈ
ＩＬ−１０単クローン性抗体をそれぞれ阻止することによって逆行するが、イソタイプ対
照免疫グロブリンでは逆行しない（図２Ｃ、２Ｄ）。
【０１２７】
ＬＡＫ活性を、更に、ＬＡＫ細胞によって効率よく死滅するが活発なＮＫ細胞によって
は死滅しないバーキットリンパ腫細胞系ダウディおよび結腸癌系ＣＯＬＯに対して評価し
た。ダウディおよびＣＯＬＯ細胞に対するＩＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性は、ＩＬ−４
を含む培養物においてのみ阻害され、ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０培養物中において
は変化しないかまたは僅かに増大さえした（図３Ａ）。ＩＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性
は、主としてＣＤ５６（Ｌｅｕ１９）＋ＮＫ細胞によって媒介される。ＣＯＬＯ細胞に対
するＬＡＫ活性がＩＬ−１０によって阻害されなかったということは、活性ＮＫ細胞によ
って媒介された細胞毒性がこのサイトカインによって影響されないことを示した。しかし
ながら、活性ＣＤ３＋ ｇｄ＋ Ｔ細胞はダウディ細胞を死滅させることができるので、
ダウディに対するＩＬ−２に誘導されたｇｄ＋ Ｔ細胞の細胞毒性をＩＬ−１０が刺激し
、同時に、この標的細胞に対するＩＬ−２に誘導されたＮＫ活性を阻止することは可能で
あった。
【０１２８】
ＩＬ−２およびｈＩＬ−１０で培養されたＰＢＭＣ中において誘導された抗ダウディＬ
ＡＫ細胞の表現型を決定するために、ＣＤ５６＋およびＣＤ５６−集団をＦＡＣＳによっ
て選別し且つそのダウディ細胞に対する細胞毒性を検査した。図３Ｂは、ＩＬ−２単独の
場合と同様に、有意のＬＡＫ活性がＣＤ５６＋集団においてのみ観察されたことを示す。
したがって、ＩＬ−４およびＩＬ−１０双方がＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγおよびＴＮ
Ｆαの合成を阻害し、ＩＬ−４だけが、ＰＢＭＣ中に存在する活性ＮＫ細胞によるＩＬ−
２に誘導された細胞毒性を阻害する。
【０１２９】
実施例Ａ２
ＩＬ−１０は、ＩＬ−２に刺激された精製ＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成またはその増殖を
阻害しない。
増殖検定
細胞を９６ウェル丸底プレート中において細胞１０５個／ウェルで分配し、そして最終
容量２００μｌ／ｍｌ中においてサイトカイン存在下または不存在下で４日間インキュベ
ートした。次に、１０μｌ中の３Ｈ−チミジン１ｍＣｉを各ウェルに加えた。６時間後に
培養物を採集し、そして取込まれた放射能をシンチレーション計数によって評価した。
【０１３０】
ＰＢＭＣにおけるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成の大部分は、Ｔ細胞よりもむしろ
ＮＫ細胞由来であるらしい。したがって、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成に対するｈ
ＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０およびＩＬ−４の作用は、ＦＡＣＳで精製されたＮＫ細胞（純
度＞９９．５％）によって検査された。ＩＬ−４は、これらの細胞によるＩＬ−２に誘導
されたＩＦＮγ分泌を阻害したが；対照的に、ｈＩＬ−１０もｖＩＬ−１０も、精製され
た活発なＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成を抑制しなかった（図４Ａ）。更に、ＩＬ−４は、
ＰＢＭＣまたは精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導された増殖を有意に阻害したが、ＩＬ
−１０は、ＩＬ−２に媒介された増殖に対して作用しなかった（図４Ｂ）。
【０１３１】
ＩＬ−４とは対照的に、ＩＬ−１０はＮＫ細胞に直接的に作用しないが、同時刺激シグ
ナルを与える単球の能力を阻害する。この結論は、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産に
対するＩＬ−１０の作用によって最も明確に支持される。前記のように、補助細胞調製試
料はＩＦＮγを生産しなかった。ＩＬ−２に刺激されたＮＫ細胞は、補助細胞を用いるこ
となく有意の濃度のＩＦＮγを生産したが（図４Ａ、５Ａおよび５Ｂ）、プラスチック付
着細胞および精製ＣＤ１４＋細胞双方を精製ＮＫ細胞に加えることにより、ＩＦＮγ合成
は大きく増大した。ＮＫ細胞に対するＩＬ−１０の直接作用の不存在（図４Ａおよび４Ｂ
）は、ＩＬ−１０が、単球に対して作用することによってＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ
生産を阻害していることを示唆する。同様に、ＩＬ−１０によるＴ細胞サイトカイン合成
阻害は、単球／マクロファージ補助細胞によって媒介される。
【０１３２】
実施例Ａ３
単球は、ＮＫ細胞によるＩＬ−２に刺激されたＩＦＮγおよびＴＮＦα合成のＩＬ−１０
による阻害を媒介する。
ＩＦＮγ合成が、ＰＭＢＣの培養物中においてＩＬ−１０によって阻害されたが純粋な
ＮＫ細胞では阻害されなかったということは、ＩＬ−１０のこの作用が補助細胞によって
媒介されたことを示唆した。これらの補助細胞の性質を研究するために、パーコール勾配
遠心分離によって得られた低密度細胞画分から、またはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を枯渇
したＰＢＭＣからＣＤ５６＋細胞を選別することによってＮＫ細胞を精製し、そしてプラ
スチック付着細胞とまたはパーコール勾配からの高密度細胞集団（Ｔ細胞９８％）と混合
した。付着細胞をＮＫ細胞に加えることにより、ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩ
ＦＮγ生産は激しく増大し；付着細胞のこの刺激作用はＩＬ−１０によって阻止された（
図５Ａ）。付着細胞集団自体は、ＩＬ−２に応答して検出可能な濃度のＩＦＮγを生産し
なかった。対照的に、Ｔ細胞含有画分は、ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ
生産に対して作用しなかったし、ＩＬ−１０によるＩＦＮγ生産の阻害を媒介しなかった
（図５Ａ）。
【０１３３】
プラスチック付着細胞は単球に富むが、他の細胞集団を含むことができる。単球が、Ｉ
Ｌ−２に誘導されたＩＦＮγ生産を増大させたし、ＩＬ−１０によるその阻害も媒介した
ことを確証するために、ＮＫ細胞およびＣＤ１４＋単球を選別によって精製し且つＩＬ−
２およびＩＬ−１０存在下で培養した。図５Ｂは、ＮＫ細胞に対して精製された単球を加
えることにより、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産が増大したことおよびＩＬ−１０が
この増大を阻害したことを示す。
【０１３４】
ＴＮＦα合成に関して、定性的に同様の結果が観察された。図５Ｃは、予想されるよう
に、ＮＫ細胞がＩＬ−２に応答して検出可能なＴＮＦαを生産したことを示す。ＣＤ１４
＋細胞は、ＩＬ−２とは無関係にＴＮＦαを生産する。ＩＬ−１０は、ＩＬ−２の存在下
（図５Ｃ）および不存在下双方において単球によるＴＮＦα生産を阻害する。対照的に、
ＮＫ細胞によるＴＮＦα合成はＩＬ−１０によって阻害されなかった。ＮＫおよびＣＤ１
４＋細胞の同時の刺激により、どちらかの細胞だけで観察されるよりも実質的に高いＴＮ
Ｆα生産濃度が得られ、この増加はＩＬ−１０によって阻止された。
【０１３５】
単球およびそれらの生産物は、ＮＫ細胞を休止させることにより、ＩＬ−２に誘導され
たＩＦＮγ生産を実質的に増加させることが分かった（図５Ｂ）。いくつかのモノカイン
、例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦαは、種々の条件下においてヒトおよびマウスＮＫ細胞
によるＩＦＮγ合成の同時刺激剤として包含された。ＬＰＳまたはＩＦＮγに刺激された
単球／マクロファージによるＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどのモノカインの合成
をＩＬ−１０が阻害するということは、ここで報告されたＩＬ−１０の作用が、補助細胞
による同時刺激分子の生産をＩＬ−１０が阻害することに基づいていたことを示唆する。
付着細胞の上澄み（主として単球を含む）は、ＩＬ−２に刺激された精製ＮＫ細胞による
ＩＦＮγ生産を増大させることが観察されたが、ＩＬ−１０存在下で培養された付着細胞
の上澄みは、ＩＬ−１０を枯渇した場合でさえもこの能力を欠いている。この上澄みの活
性が補助細胞の完全な同時刺激作用の要因であるかどうかは不明である。ＩＬ−１αおよ
びＩＬ−１βはＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産を同時刺激するが、Ｉ
Ｌ−６またはＴＮＦαは刺激しないということが観察されたが；しかしながら、ＩＬ−１
を最大１０００Ｕ／ｍｌまで加えることは、未分別のＰＢＭＣによるＩＬ−２に誘導され
たＩＦＮγ合成に対するＩＬ−１０の阻害作用を逆行させない。したがって、１種類若し
くはそれ以上の追加の活性がこの系において機能し、またはＩＬ−１０が、ＮＫ細胞によ
るサイトカイン合成を阻害する第二の因子の合成をもたらすという可能性が存在する。
【０１３６】
実験Ｂ
ＩＬ−１０はヒト単球によるサイトカイン合成を阻害する：単球によって生産されたＩＬ
−１０の自己調節の役割。
この項において示したテータは、本明細書中に参考として完全に包含されている、デ・
ワール・マレフィト（ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ）ら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐｔｌ
．Ｍｅｄ．１７４：１２０９〜１２２０に、その優先日後に公開された。
【０１３７】
概要
この項は、ＬＰＳによって活性化されたヒト単球が、従来、サイトカイン合成阻害因子
（ＣＳＩＦ）と称されるインターロイキン（ＩＬ−１０）を用量依存形式において高濃度
で生産することができるということを実証する。ＩＬ−１０は、単球の活性化の７時間後
に検出可能であり、ＩＬ−１０生産の最大濃度は２４〜４８時間後に観察された。これら
の速度論は、ヒト単球によるＩＬ−１０の生産が、活性化の４〜８時間後にいずれも高濃
度で分泌されたＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦαおよびＧ−ＣＳ
Ｆの生産と比較して相対的に遅いことを示した。ＬＰＳで活性化した単球によるＩＬ−１
０の生産は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦお
よびＧ−ＣＳＦの場合と同様に、ＩＬ−４によって阻害された。更に、培養の開始時に、
ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγの組合わせによって活性化された単球に対
して加えられたＩＬ−１０は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα
、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を転写段階で強く阻害した。ウイルスＩＬ−１０
はヒト細胞に対する同様の生物活性を有するが、更に、ＬＰＳ活性化後の単球によるＴＮ
ＦαおよびＧＭ−ＣＳＦの生産を阻害した。中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下におけ
るＬＰＳによる単球の活性化は、ＬＰＳ処理のみの場合と比較して多量のサイトカイン生
産を引起こし、内因的に生じたＩＬ−１０はＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−
８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を阻害することが示唆された。更に
、ＩＬ−１０は、ＬＰＳに活性化された単球においてＩＬ−１０ ｍＲＮＡ合成を強く阻
害したので、その作用は自己調節的であった。更に、内因的に生じたＩＬ−１０は、ＬＰ
Ｓによる単球の活性化後のクラスＩＩ ＭＨＣ発現の減少の原因であることが分かった。
総合すると、これらの結果により、ＩＬ−１０は、クラスＩＩ ＭＨＣ発現をダウンレギ
ュレートし且つ単球による前炎症性サイトカインの生産を阻害するその能力ゆえに、免疫
学的応答および炎症性応答に対して重要な調節作用を有するということが示される。
【０１３８】
最近、ネズミ−インターロイキン１０（ＩＬ−１０）が同定され、その遺伝子はそのサ
イトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）活性に基づいてクローン化された。ネズミの系にお
いて、ＩＬ−１０はＣＤ４＋ Ｔｈ２サブセットによって生産されており、しかも、Ｔｈ
１クローンによるサイトカイン生産、特に、ＩＦＮγを阻害する。ＩＬ−１０によるサイ
トカイン生産の阻害は、Ｂ細胞ではなくマクロファージを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として
用いた場合にのみ観察された。そのＣＳＩＦ活性に加えて、ＩＬ−１０は多面的であり且
つ胸腺細胞、細胞毒性Ｔ細胞、マスト細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含む種々の細
胞種に対して作用することが分かった。
【０１３９】
更に、ヒトＩＬ−１０はＣＳＩＦ活性を示す。ＰＨＡまたは抗ＣＤ３ ｍＡｂによって
活性化したＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの生産はＩＬ−１０によって強く
阻害され、そしてこの阻害は転写段階で生じた。ヒトおよびネズミ双方のＩＬ−１０は、
エプスタイン・バールウイルスゲノムの従来特性決定されていない読取り枠ＢＣＲＦ−１
に対して広範囲の配列相同関係を有する。この読取り枠の発現は、マウスおよびヒトＴ細
胞でのＣＳＩＦ活性を含む大部分の性質をヒトおよびネズミＩＬ−１０と共有するウイル
スＩＬ−１０（ｖ−ＩＬ−１０）と称する活性タンパク質を生成させた。
【０１４０】
ヒトＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子のダウンレギュレー
ションによってヒト単球の抗原提示能力を減少させることにより、抗原特異的増殖性Ｔ細
胞応答を阻害することができる。ここで示された結果は、ヒト単球が、ＬＰＳによる活性
化後に高濃度のＩＬ−１０を生産することができること、およびこの生産が他のモノカイ
ンの場合と比較して相対的に遅いということを示す。更に、ＩＬ−１０は、ＬＰＳ、ＩＦ
ＮγまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによって活性化された単球による前炎症性サイトカイン
、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦα並びに造血系成
長因子であるＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を強く阻害することをここで報告する
。内因的に生じたＩＬ−１０は、単球によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−
８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産に対して自己調節的作用を有するの
みならず、それ自体の生産および単球でのクラスＩＩ ＭＨＣ発現を自己調節的にダウン
レギュレートする。これらの結果は、ＩＬ−１０が免疫学的応答および炎症性応答に対し
て重要な調節作用を有することを示す。
【０１４１】
実施例Ｂ１
ＩＬ−１０はヒト単球によって生産される。
ヒト単球の単離および培養
ヒト末梢血液単球を正常ドナーの血液５００ｍｌから単離した。単核細胞を血液成分分
離器での密度遠心分離によって単離した後、遠心水簸によってリンパ球および単球に分別
した。単球調製試料は、非特異的エステラーゼ染色によって判定したところ＞９５％純度
であり、生存しうる細胞を９８％を越えて含んでいた。単球は、１％のプールされた熱失
活ヒトＡＢ＋血清を補足したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有イセル培地中で培養され
た。この培地は、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞溶解検定によって確認した
ところ、内毒素を含んでいなかった（内毒素＜０．２ｎｇ／ｍｌ）。単球は、これらの細
胞の付着を防止するテフロン（登録商標）バッグ（ヤンセン（Ｊａｎｓｅｎ）ＭＮＬ、セント・ニクラ
ース、ベルギー）中において細胞濃度４ｘ１０6個／ｍｌで培養された。指定した時間培
養後に単球を集め、そして間接免疫蛍光法によってその細胞表面発現を分析するかまたは
ノーザン分析およびＰＣＲ分析によってそのリンホカイン遺伝子発現を分析した。更に、
単球培養上澄みを、これらの細胞の活性化後のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ
−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を決定するために集
めた。培養後の細胞の生存率は、トリパンブルー排除によって決定したところ９５％を越
えていた。
【０１４２】
試薬
組換体ヒトＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０を大腸菌においてグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ融合タンパク質として発現させ、精製し、そしてトロンビンで消化してＮ
末端融合部分を除去し、活性ヒトおよびウイルスＩＬ−１０を得た。精製ヒトｒ−ＩＬ−
４およびｒ−ＩＦＮγは、シェリング・プラウ・リサーチ（ブルームフイールド、ＮＪ）
によって提供された。ＬＰＳ（大腸菌０１２７：Ｂ８）は、ディフコ・ラボラトリーズ（
Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（デトロイト、ＭＩ）から得られた。中和性抗
ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１は、ｖ−ＩＬ−１０に対して生じたものであり、ヒトおよび
ウイルスＩＬ−１０双方を効率よく中和した。
【０１４３】
リンホカイン決定
単球によるＩＬ−１αおよびＴＮＦαの生産は、エンドジェン（ボストン、ＭＡ）から
入手したリンホカイン特異的エリザによって測定された。これらのエリザの下方検出限界
は、それぞれ５０ｐｇ／ｍｌおよび１０ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−１βの生産は、シス
トロン（Ｃｉｓｔｒｏｎ）（パイン・ブルック、ＮＪ）から入手したリンホカイン特異的
エリザによって決定された。このエリザの感度は２０ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−６濃度
は、ジェンザイム（ボストン、ＭＡ）から購入したリンホカイン特異的エリザによって決
定された。この検定の感度は０．３１３ｎｇ／ｍｌであった。ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦ
特異的エリザをＲ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネアポリス、ＭＮ）から入手し
、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの生産を定量するのに用いた。これらのエリザの感度は、そ
れぞれ４．７ｐｇ／ｍｌおよび７．２ｐｇ／ｍｌであった。ＧＭ−ＣＳＦ生産は、リンホ
カイン特異的エリザによって決定された。このエリザの感度は５０ｐｇ／ｍｌであった。
ＩＬ−１０生産は、抗ＩＬ−１０ ｍＡｂ（ＪＥＳ ９Ｄ７）を被覆抗体として、および
別の抗ＩＬ−１０ ｍＡｂ（ＪＥＳ３−１２Ｇ８）をトレーサー抗体として用いる特異的
エリザによって決定された。このエリザの感度は５０ｐｇ／ｍｌであった。
【０１４４】
ＩＬ−１０は、活性ヒトＴ細胞クローン、活性末梢血液ＴおよびＢ細胞、ＥＢＶ形質転
換Ｂ細胞系および単球によって生産される。遠心水簸によって単離された、高度に精製さ
れたヒト単球は、ＬＰＳによる活性化後にＩＬ−１０を生産した。更に、これらのヒト単
球は、高濃度のＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦを生産しうることが分かった（図
６）。ＬＰＳで活性化された単球によるサイトカイン生産の速度論は、ＬＰＳで活性化さ
れた単球によるＩＬ−１０生産が比較的遅いことを示した。それは７．５時間で採集され
た上澄み中において最初に検出されたが、最大生産は活性化の２０〜４８時間後に観察さ
れた。対照的に、ＴＮＦαおよびＩＬ−６は、活性化によって速やかに生産され、そして
それぞれ活性化後３．５時間および７．５時間で最大生産濃度に達した（図６）。しかし
ながら、ＧＭ−ＣＳＦ生産は、更に、ＬＰＳによる活性化の７．５時間後に最初に検出さ
れたが、この場合、最大生産濃度は２０時間で達せられた。用量応答実験により、１０ｎ
ｇ／ｍｌのＬＰＳによる単球の活性化は既に有意の濃度のＩＬ−１０生産を引起こすこと
が示されたが、最大ＩＬ−１０合成はＬＰＳ濃度１μｇ／ｍｌで観察された（図７）。
【０１４５】
実施例Ｂ２
ＩＬ−１０はヒト単球によるサイトカイン生産を阻害する。
ＩＬ−１０は、活性ＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦ生産を阻害することが
分かった。単球によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の作用を決定するために、
高度に精製された単球を、ＩＬ−１０の不存在下または存在下でＬＰＳにより２４時間活
性化した。更に、単球を、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）または、ｖ−ＩＬ−１０に対して
生じたものであるがヒトＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０双方を効率よく中和する中和性
抗ＩＬ−１０ ｍＡｂ １９Ｆ１の存在下においてＬＰＳを用いて２４時間活性化した。
サイトカイン生産は、活性化して２４時間後に採集されたこれらの培養物の上澄みにおい
て、サイトカイン特異的エリザによって決定された。表Ｂ１に示したように、培地のみに
おいて３７℃でインキュベートされた単球は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ
−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦを生産しなかった。これら
の条件下では、有意の濃度のＩＬ−８のみが合成された。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）による
単球の活性化は、高濃度のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、
ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦを生産した。興味深いことに、ＩＬ−１０は、
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳ
Ｆの生産を様々な程度まで阻害した（表Ｂ１）。ＩＬ−１０の最も強い阻害作用は、８０
〜１００％まで阻止されたＩＬ−１α、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産
に対して観察された。ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の生産阻害はあまり顕著ではなかったし
、ＩＬ−８の合成はＩＬ−１０によって僅かしか影響されなかった。
【０１４６】
【表４】
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