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【発明の名称】 血管形成促進剤
【発明者】 【氏名】▲高▼倉 伸幸
【要約】 【課題】本発明は、本発明は、血管形成を促進させる手段を提供することを目的とする。

【構成】本発明は、アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩を有効成分として含有する血管形成促進剤、及び、虚血性疾患の予防又は治療剤に関する。本発明はまたアペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩を用いた、人工血管の製造方法、疾患の診断方法、有用物質のスクリーニング方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩を有効成分として含有する血管形成促進剤。
【請求項２】
アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩を有効成分として含有する虚血性疾患の予防又は治療剤。
【請求項３】
アペリンをコードする遺伝子を含む血管形成促進剤。
【請求項４】
アペリンをコードする遺伝子を含む虚血性疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
血管新生を促進する作用を有する、請求項１又は３に記載の血管形成促進剤。
【請求項６】
血管腔の拡張を促進する作用を有する、請求項１又は３に記載の血管形成促進剤。
【請求項７】
アペリンが配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１〜６の何れか１項に記載の剤。
【請求項８】
アペリンが配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の部分配列を含有するペプチドである請求項１〜６の何れか１項に記載の剤。
【請求項９】
アペリンが（ａ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４０番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｃ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｄ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｅ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｆ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド又はそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したアミノ酸配列を有するペプチド、（ｇ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｈ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｉ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｊ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｋ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｌ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｍ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｎ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｏ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６４番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｐ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｑ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７６番目のアミノ酸配列を有するペプチド又は（ｒ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７５番目のアミノ酸配列を有するペプチドである請求項１〜６の何れか１項に記載の剤。
【請求項１０】
アペリンが配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１〜６の何れか１項に記載の剤。
【請求項１１】
アペリンがｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１〜６の何れか１項に記載の剤。
【請求項１２】
アペリンが配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１〜６の何れか１項に記載の剤。
【請求項１３】
アペリンの修飾体が式：
Ｘ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ４−Ｘ５ （Ｉ）
［式中、Ｘ１は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、Ｘ２は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示し、Ｘ３は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、側鎖が置換されていてもよい芳香性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、Ｘ４は結合手又は側鎖が置換されていてもよい中性又は芳香性アミノ酸残基を示し、Ｘ５は（イ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（ロ）水酸基又は（ハ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたペプチド誘導体を示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−、−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−又は−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。但し、Ｘ２がＬｅｕを、Ｘ３がＬｙｓを、Ｘ４がＭｅｔを示し、かつＸ５が（イ）Ｐｒｏ又は（ロ）Ｐｒｏ−Ｐｈｅを示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−が無置換の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−を、−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−が無置換の−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−を、且つ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−が無置換の−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−を示す場合を除く。］
で表される化合物である請求項１、２、５及び６の何れか１項に記載の剤。
【請求項１４】
アペリンの修飾体が式：
Ｐ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐ２−Ｐ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐ４−Ｐ５ （ＩＩ）
［式中、Ｐ１は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、Ｐ２は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、Ｐ３は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、側鎖が置換されていてもよい芳香性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、Ｐ４は結合手又は側鎖が置換されていてもよい中性又は芳香性アミノ酸残基を示し、Ｐ５は（イ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（ロ）水酸基又は（ハ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたペプチド誘導体を示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−又は−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。］
で表される化合物である請求項１、２、５及び６の何れか１項に記載の剤。
【請求項１５】
アペリンの修飾体が式：
Ｑ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｑ２−Ｇｌｙ−Ｑ５−Ｑ３−Ｑ４ （ＩＩＩ）
［式中、Ｑ１は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、Ｑ２は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、側鎖が置換されていてもよい芳香性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、Ｑ３は結合手又は側鎖が置換されていてもよい中性又は芳香性アミノ酸残基を示し、Ｑ４は（イ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（ロ）水酸基又は（ハ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたペプチド誘導体を示し、Ｑ５は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。］
で表される化合物である請求項１、２、５及び６の何れか１項に記載の剤。
【請求項１６】
アペリンの修飾体が式：
Ｒ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｒ２−Ｐｒｏ−Ｒ３ （ＩＶ）
［式中、Ｒ１は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、Ｒ２は置換されていてもよいＣｈａ、置換されていてもよいＭｅｔ又は置換されていてもよいＮｌｅを示し、Ｒ３は置換されていてもよいＰｈｅ（Ｃｌ）、置換されていてもよいＰｈｅ、置換されていてもよいＮａｌ（２）、置換されていてもよいＣｈａ又は置換されていてもよいＴｙｒを示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ又は−Ｐｒｏ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。］
で表される化合物である請求項１、２、５及び６の何れか１項に記載の剤。
【請求項１７】
請求項１、３及び５〜１６の何れか１項に記載の血管形成促進剤を用いて、血管系に分化可能な細胞からin vitroにおいて人工血管を製造する方法。
【請求項１８】
被験体から採取された検体中のアペリン濃度を測定し、測定値を健常者及び虚血性疾患患者の測定値と対比することにより虚血性疾患を診断する方法。
【請求項１９】
被験体から採取された検体中のアペリン濃度を測定し、測定値を健常者及び血管が過剰増殖する疾患の患者の測定値と対比することにより血管が過剰増殖する疾患を診断する方法。
【請求項２０】
被験体から採取された検体中のアペリン濃度を測定し、測定値を健常者及び血管怒張又は毛細血管拡張を呈する疾患の患者の測定値と対比することにより血管怒張又は毛細血管拡張を呈する疾患を診断する方法。
【請求項２１】
（ａ）アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩、及び／又は、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン受容体、その部分ペプチド若しくはその塩を用いることを特徴とする、血管形成促進剤又は虚血性疾患の治療若しくは予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
（ａ）アペリンをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、及び／又は、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン受容体若しくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを用いることを特徴とする、血管形成促進剤又は虚血性疾患の治療若しくは予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２３】
（ａ）アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩、及び／又は、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン受容体、その部分ペプチド若しくはその塩を用いることを特徴とする、血管形成抑制剤又は血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２４】
（ａ）アペリンをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、及び／又は、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン受容体若しくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを用いることを特徴とする、血管形成抑制剤又は血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成促進剤およびそれを用いた人工血管の製造方法、並びに、虚血性疾患の予防又治療剤及びそれを用いた虚血性疾患、血管が過剰増殖する疾患、又は、血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の診断方法に関する。本発明はまた、血管形成促進剤、虚血性疾患の治療若しくは予防剤、血管形成抑制剤、又は血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は酸素をはじめとして養分やその他の分子及び免疫細胞を組織の局所に運搬する重要な役目を持つことは周知である。糖尿病や高脂血症、高血圧などの生活習慣病などによる血管の破綻は、血流異常や血管内外の組織環境因子のホメオスタシスの異常を来し最終的に局所的および臓器全体の不全に陥ることは周知である。血管異常が急性に生じ、致死にいたる危険性の高い脳梗塞や心筋梗塞が血管異常の代表となる疾患である。このような血管病を改善するには、血管異常の早期診断技術およびその抑制法、あるいは破綻を生じた血管を修復する効率良い血管再生医療が必要であり、成熟した血管がいかなる分子機序で形成されるのかを解明することにより、血管異常に応じた血管治療が可能になると考えられる。近年、血管形成における分子機序の解明が進み、血管形成の促進因子を用いた遺伝子治療やサイトカイン治療あるいは血管形成を促進する細胞を用いた細胞治療が臨床の現場で行われている。しかし、現在未解決であるのが、現行の治療法では数μという極細の毛細血管の構築は誘導が可能でも、ミリメートル単位の太い血管形成を誘導できない点である。その問題点を鑑み、発明者は従来より、血管形成に関わるTie2受容体型チロシンキナーゼの機能解析を詳細に実施してきた。
【０００３】
一方、ホルモンなどの生理活性因子は、細胞膜に存在するＧタンパク質共役型受容体と総称される受容体に結合することにより、様々な生理活性を示すことが知られている。ＡＰＪはこのようなＧタンパク共役型受容体の一種であるが、作用する因子（リガンド）が未知のいわゆるオーファン受容体として以前から知られていた。最近になり、ＡＰＪ受容体はエイズウイルスの感染の際に重要な役割を果たしている受容体の一つであることが明らかにされた。またAPJは血管内皮細胞や血管壁細胞に発現することから、血管形成に対する機能があることが示唆されてきた。しかし、ＡＰＪ受容体のリガンドが不明なため、ＡＰＪ受容体が本来どのような生理機能の調節に関与しているのかは不明であった。近年ＡＰＪ受容体の内因性リガンドの探索が進められた結果、ウシの胃よりリガンドとして働くペプチドが精製単離し、さらにこのペプチドをコードするウシおよびヒト遺伝子が同定された。そしてＡＰＪ受容体のリガンドは新規生理活性ペプチドであることが明らかにされ、またこのペプチドはＡＰＪ受容体の内因性リガンド(ＡＰＪendogenous ligand)として機能することからアペリン(Apelin)と命名された。アペリンはＡＰＪ受容体に結合することにより様々な作用を発揮するものと推定されてきているが、まだその詳細は明らかとなっていない。
【０００４】
なおアペリンの用途に関しては例えば特許文献１に記載されているが、同文献には、血管形成に及ぼす作用については全く言及されていない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−３９３４５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血管形成を促進させる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従来の検討結果から、血管内皮細胞に発現するTie2受容体に対する結合因子Angiopoietin-1（以下Ang1）は、内皮細胞の細胞死を抑制し、内皮細胞と血管壁細胞の細胞接着を誘導して血管腔の拡張の誘導や血管の安定化に寄与することが示唆されてきた。そこで、本発明者はTie2の活性化により、いかなる分子が血管内皮細胞で分泌が誘導され、血管径の拡張に関与するのかを解明すべく、Tie2が恒常的に活性化する遺伝子を作成して、この遺伝子導入された細胞において発現が上昇する分子を単離してきた。そこでこれらの遺伝子により、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いた試験管内血管形成解析法および発明者らが以前発明したP-Sp領域を用いた試験管内血管形成解析法で血管形成を促進する分子をスクリーニングしてきた。そのなかで、アペリン分子が血管径を拡張させる可能性が示唆された。
【０００８】
そして、本発明者は、アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩が血管形成（典型的には血管新生（例えば、血管網の構築）又は血管腔の拡張）を促進する作用を有することを見出し本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩を有効成分として含有する血管形成促進剤。
（２）アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩を有効成分として含有する虚血性疾患の予防又は治療剤。
【００１０】
（３）アペリンをコードする遺伝子を含む血管形成促進剤。
（４）アペリンをコードする遺伝子を含む虚血性疾患の予防又は治療剤。
（５）血管新生を促進する作用を有する、（１）又は（３）に記載の血管形成促進剤。
（６）血管腔の拡張を促進する作用を有する、（１）又は（３）に記載の血管形成促進剤。
【００１１】
（７）アペリンが配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである（１）〜（６）の何れかに記載の剤。
（８）アペリンが配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の部分配列を含有するペプチドである（１）〜（６）の何れかに記載の剤。
【００１２】
（９）アペリンが（ａ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４０番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｃ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｄ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｅ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｆ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド又はそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したアミノ酸配列を有するペプチド、（ｇ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｈ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｉ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｊ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｋ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｌ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｍ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｎ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｏ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６４番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｐ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｑ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７６番目のアミノ酸配列を有するペプチド又は（ｒ）配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７５番目のアミノ酸配列を有するペプチドである（１）〜（６）の何れかに記載の剤。
【００１３】
（１０）アペリンが配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチドである（１）〜（６）の何れかに記載の剤。
【００１４】
（１１）アペリンがｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を含有するペプチドである（１）〜（６）の何れかに記載の剤。
【００１５】
（１２）アペリンが配列番号５、７、９又は１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を含有するペプチドである（１）〜（６）の何れかに記載の剤。
【００１６】
（１３）アペリンの修飾体が式：
Ｘ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ４−Ｘ５ （Ｉ）
［式中、Ｘ１は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、Ｘ２は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示し、Ｘ３は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、側鎖が置換されていてもよい芳香性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、Ｘ４は結合手又は側鎖が置換されていてもよい中性又は芳香性アミノ酸残基を示し、Ｘ５は（イ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（ロ）水酸基又は（ハ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたペプチド誘導体を示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−、−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−又は−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。但し、Ｘ２がＬｅｕを、Ｘ３がＬｙｓを、Ｘ４がＭｅｔを示し、かつＸ５が（イ）Ｐｒｏ又は（ロ）Ｐｒｏ−Ｐｈｅを示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−が無置換の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−を、−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−が無置換の−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−を、且つ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−が無置換の−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−を示す場合を除く。］
で表される化合物である（１）、（２）、（５）及び（６）の何れかに記載の剤。
【００１７】
（１４）アペリンの修飾体が式：
Ｐ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐ２−Ｐ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐ４−Ｐ５ （ＩＩ）
［式中、Ｐ１は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、Ｐ２は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、Ｐ３は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、側鎖が置換されていてもよい芳香性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、Ｐ４は結合手又は側鎖が置換されていてもよい中性又は芳香性アミノ酸残基を示し、Ｐ５は（イ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（ロ）水酸基又は（ハ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたペプチド誘導体を示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−又は−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。］
で表される化合物である（１）、（２）、（５）及び（６）の何れかに記載の剤。
【００１８】
（１５）アペリンの修飾体が式：
Ｑ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｑ２−Ｇｌｙ−Ｑ５−Ｑ３−Ｑ４ （ＩＩＩ）
［式中、Ｑ１は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、Ｑ２は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、側鎖が置換されていてもよい芳香性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、Ｑ３は結合手又は側鎖が置換されていてもよい中性又は芳香性アミノ酸残基を示し、Ｑ４は（イ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（ロ）水酸基又は（ハ）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖又はそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたペプチド誘導体を示し、Ｑ５は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。］
で表される化合物である（１）、（２）、（５）及び（６）の何れかに記載の剤。
【００１９】
（１６）アペリンの修飾体が式：
Ｒ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｒ２−Ｐｒｏ−Ｒ３ （ＩＶ）
［式中、Ｒ１は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、Ｒ２は置換されていてもよいＣｈａ、置換されていてもよいＭｅｔ又は置換されていてもよいＮｌｅを示し、Ｒ３は置換されていてもよいＰｈｅ（Ｃｌ）、置換されていてもよいＰｈｅ、置換されていてもよいＮａｌ（２）、置換されていてもよいＣｈａ又は置換されていてもよいＴｙｒを示し、式中の−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ又は−Ｐｒｏ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。］
で表される化合物である（１）、（２）、（５）及び（６）の何れかに記載の剤。
【００２０】
（１７）（１）、（３）及び（５）〜（１６）の何れかに記載の血管形成促進剤を用いて、血管系に分化可能な細胞からin vitroにおいて人工血管を製造する方法。
（１８）被験体から採取された検体中のアペリン濃度を測定し、測定値を健常者及び虚血性疾患患者の測定値と対比することにより虚血性疾患を診断する方法。
【００２１】
（１９）被験体から採取された検体中のアペリン濃度を測定し、測定値を健常者及び血管が過剰増殖する疾患の患者の測定値と対比することにより血管が過剰増殖する疾患を診断する方法。
（２０）被験体から採取された検体中のアペリン濃度を測定し、測定値を健常者及び血管怒張又は毛細血管拡張を呈する疾患の患者の測定値と対比することにより血管怒張又は毛細血管拡張を呈する疾患を診断する方法。
【００２２】
（２１）（ａ）アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩、及び／又は、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン受容体、その部分ペプチド若しくはその塩を用いることを特徴とする、血管形成促進剤又は虚血性疾患の治療若しくは予防剤のスクリーニング方法。
【００２３】
（２２）（ａ）アペリンをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、及び／又は、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン受容体若しくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを用いることを特徴とする、血管形成促進剤又は虚血性疾患の治療若しくは予防剤のスクリーニング方法。
【００２４】
（２３）（ａ）アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩、及び／又は、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン受容体、その部分ペプチド若しくはその塩を用いることを特徴とする、血管形成抑制剤又は血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤のスクリーニング方法。
【００２５】
（２４）（ａ）アペリンをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、及び／又は、（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン受容体若しくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを用いることを特徴とする、血管形成抑制剤又は血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤のスクリーニング方法。
【００２６】
なお本明細書において、「アペリン、その修飾体、それらのアミド、それらのエステル又はそれらの塩」とは、「アペリン、アペリンの修飾体、アペリンのアミド、アペリンのエステル、アペリンのアミドのエステル、アペリンの塩、アペリンのアミドの塩、アペリンのエステルの塩、アペリンのアミドのエステルの塩、アペリン修飾体のアミド、アペリン修飾体のエステル、アペリン修飾体のアミドのエステル、アペリン修飾体の塩、アペリン修飾体のアミドの塩、アペリン修飾体のエステルの塩、又はアペリン修飾体のアミドのエステルの塩」を意味する。
【００２７】
本明細書において、「実質的に同一」とはタンパク質の活性、例えば、リガンドと受容体の結合活性、生理的な特性（例、血管形成促進作用）などが、実質的に同じことを意味する。アミノ酸（特に１又は数個のアミノ酸）の置換、欠失、付加あるいは挿入はしばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をもたらさないが、こうした場合その置換、欠失、付加あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、付加あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされる場合が多い。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の血管形成促進剤は、特に血管新生（例えば、血管網の構築）及び血管腔の拡張を促進する作用を有する。本発明の血管形成促進剤を用いて人工血管を製造することにより、従来実現できなかった径の太い血管の形成が可能となる。
【００２９】
本発明によればまた、血管の破綻により組織の虚血症状を呈する、脳梗塞、心筋梗塞、慢性動脈硬化による腎硬化症、下肢の慢性閉塞性動脈硬化症、バージャー病などの虚血性疾患の予防又は治療剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアペリン（以下、単にペプチドと略称する場合がある）、その製造法および用途を以下にさらに詳細に説明する。本発明で用いられるアペリンは、ＡＰＪ（O'Dowd. B.F., et al., Gene, 436, 355-359, 1993）に対し、リガンド活性を有するペプチドであれば、如何なるものであってもよく、具体的には、例えば配列番号３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体タンパク質に結合能を有するポリペプチドなどがあげられる。起源は特に限定されず、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（たとえば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または細胞などに由来するものであってよい。
【００３１】
本発明で用いられるアペリンは、具体的には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドもしくはその部分ペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン前駆体の部分ペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン前駆体の部分ペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン前駆体の部分ペプチド、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン前駆体の部分ペプチドなどを含有するものであればよい。例えば、本発明のアペリンとしては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドなどの他に、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と約５０〜９９．９％（好ましくは７０〜９９．９％、より好ましくは８０〜９９．９％、さらに好ましくは９０〜９９．９％）の相同性を有するアミノ酸配列或いは配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含有し、且つ、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチド、配列番号５で表されるアペリン前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチド、配列番号７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドまたは配列番号１１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリン前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチド、などが挙げられる。実質的に同質の活性としては、例えばレセプター結合活性、シグナル伝達活性などが挙げられる。実質的に同質とは、レセプター結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、レセプター結合活性の強さなどの強弱、ペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００３２】
アペリンとしては、具体的には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列、などで表わされるアミノ酸配列を含有するマウス脳、ラット脳、ブタ脳、ブタ小腸、ウシ視床下部、ウシ胃、ヒト視床下部またはヒト肺由来のペプチドなどが挙げられる。さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列などと同一のアミノ酸配列を含有するペプチドもしくはその部分ペプチドに対して１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加あるいは挿入されているアミノ酸配列を含有するペプチドであって、同一の活性（例えば血管形成促進作用、レセプター結合活性、シグナル伝達活性など）を有するペプチドは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとして挙げられる。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列中の１個以上７個以下、好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、或いは、配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列に１個以上２０個以下、好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加した（または挿入された）アミノ酸配列、或いは、配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列中の１個以上７個以下、好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するペプチドであって、同一の活性（例えば血管形成促進作用、レセプター結合活性、シグナル伝達活性など）を有するペプチドなどである。さらに、アペリンまたはその部分ペプチドには、ＧｌｎのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇｌｎがピログルタミン酸化したものなども含まれる。アペリンの前駆体とは、アペリンをその部分配列として含有するタンパク質であればいかなるものであってもよく、具体的には、配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる（以下、前記のアペリンとアペリン前駆体を含めてアペリンと称することがある）。また、アペリンの分子量は約１０００〜１００００ダルトン、好ましくは約１０００〜約５０００ダルトン、より好ましくは、約１０００〜約３０００ダルトンである。
【００３３】
本明細書におけるペプチドはペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列などを含有するペプチドは、Ｃ末端が通常カルボキシル基（-COOH）またはカルボキシレート(-COO−)であるが、Ｃ末端がアミド（-CONH２）またはエステル(-COOR)であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキルなどのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが挙げられる。配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列などを含有するペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この時のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。アペリンの塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。アペリンは、ヒトや温血動物の組織または細胞からペプチドを精製する方法によって製造することもできるし、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。また、後述するアペリンをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。ヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００３４】
上記したようにアペリンは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはアペリンを含有する前駆体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、アペリンを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の文献に記載された方法が挙げられる。M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)、SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)、泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）、矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)、矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるアペリンが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３５】
アペリンのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いて製造することができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のペプチドを取得する。上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HOOBtなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＲとして上記したＣ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ７−１４アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl２-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが挙げられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが挙げられる。原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
【００３６】
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。アペリンのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。アペリンのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のアペリンのエステル体を得ることができる。
【００３７】
アペリンとしては、上記した配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列などと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドと同様の作用（例、血管形成促進作用など）を有しているものであれば、どのようなペプチドであってもよい。このようなペプチドとしてはたとえば、上記した配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列などを有するペプチドから、１個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するペプチドであって、同様の活性（例、血管形成促進作用など）を有しているものを挙げることができる。具体的には、(1)配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１２番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(2)配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１３番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(3)配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(4)配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(5)配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第１６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(6) 配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドなどが好ましい。なかでも、配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドなどが好ましい。
【００３８】
また、配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドとして具体的には、（ａ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第４０番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｃ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｄ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第４７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｅ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｆ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したもの、（ｇ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第１番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｈ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６番目から第２５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｉ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｊ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６１番目から第６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｋ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第４３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｌ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第４１番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｍ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６６番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｎ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６７番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｏ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６４番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｐ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６３番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｑ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｒ）配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、などがあげられ、なかでも配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したものまたは配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第４２番目から第７７番目のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく用いられる。特に、配列番号５、７、９または１１で表されるアミノ酸配列の第６５番目から第７７番目のアミノ酸配列で表わされるペプチドまたはそのＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したもの（pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe）が好ましい。さらにpGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Pheで表されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列を有するペプチドもアペリンとして好ましく用いられる。
【００３９】
アペリンをコードするＤＮＡとしては、具体的には、前記した配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアペリンをコードするＤＮＡを含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは特に限定されず、例えばバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する)によって増幅することもできる。より具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列を含有するマウス全脳、ラット全脳、ウシ視床下部、ウシ胃由来、ヒト視床下部またはヒト肺由来のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、(1)配列番号２で表される塩基配列もしくはその部分配列、配列番号６で表わされる塩基配列の部分配列、配列番号８で表される塩基配列の部分配列、配列番号１０で表される塩基配列の部分配列、または配列番号１２で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、(2) (1)で規定された配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡであって、同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするＤＮＡ、(3)遺伝コードの縮重のため(1)および(2)に定められている配列とハイブリッド形成しないが、同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば４２℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＰＥ(１×ＳＳＰＥ＝150mM NaCl, 10mM NaH２PO４・H２O, 1mM EDTA pH7.4)、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳである。上記配列番号２で表される塩基配列において、ＹはＴまたはＣを、ＮはＴ，Ｃ，ＡまたはＧを、ＲはＡまたはＧを、ＭはＣまたはＡを、ＷはＴまたはＡを、ＳはＣまたはＧを示す。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号７で表されるアミノ酸配列の部分配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列の部分配列、または配列番号１１で表されるアミノ酸配列の部分配列などを含有するポリペプチドをコードするＤＮＡの中で例えば６個以上５１個以下（好ましくは９個以上３０個以下、さらに好ましくは１２個以上３０個以下）の部分塩基配列を含有するＤＮＡ断片はＤＮＡ検出プローブとしても好ましく用いられる。
【００４０】
アペリンをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。アペリンを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、アペリンの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを例えば本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molecular Cloning（２nd ed.；J. Sambrook et al., Cold SpringHarbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。クローン化されたアペリンをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。アペリンの発現ベクターは、例えば、（イ）アペリンをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
【００４１】
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、phoA・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα(ＭＦα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築されたポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００４２】
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
【００４３】
酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveＴＭ細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖero細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行われる。酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれる。
【００４４】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,６巻, ４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et al. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of the NatinalAcademy of Sciences of the United States of America），８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A.J.ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等が挙げられる。このようにして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。なお、動物細胞を用いて、本発明のポリペプチド等を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のポリペプチド等の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチド等をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。上記の形質転換体を本発明のポリペプチド等をコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のポリペプチド等を生成、蓄積せしめることによって、本発明のポリペプチド等を製造することができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００４５】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４６】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Jounal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。特にＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
【００４７】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。かくして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生する本発明のポリペプチドを、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられ得る。かくして生成する本発明のポリペプチドの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００４８】
次に、アペリンの修飾体について説明する。本願明細書においてアミノ酸残基とは、アミノ酸が水分子を失ってペプチド結合を形成し、タンパク質やペプチド中に取り込まれた時のＮ末端もしくはＣ末端以外の部分の構造をいう。例えば、α−アミノ酸残基とはα−アミノ酸（H２NC(R0)(R1)COOH：R０およびR1はそれぞれ同一または異なって、任意の置換基を示す）が水分子を失ってペプチド結合を形成し、タンパク質やペプチド中に取り込まれた時のＮ末端もしくはＣ末端以外の部分の-NHC(R0)(R1)CO-の構造をいう。一方、Ｎ末端のアミノ酸残基はH２NC(R0)(R1)CO-、Ｃ末端のアミノ酸残基は-NHC(R0)(R1)COOHで示される。また、β−アミノ酸（H２NC(R0)(R1)C(R2)(R3)COOH： R0、R1、R2およびR3はそれぞれ同一または異なって、任意の置換基を示す）が水分子を失ってペプチド結合を形成しタンパク質やペプチド中に取り込まれた時のＮ末端もしくはＣ末端以外の部分の-NHC(R0)(R1)C(R2)(R3)CO-の構造をいう。一方、Ｎ末端のアミノ酸残基はH２NC(R0)(R1)C(R2)(R3)CO-、Ｃ末端のアミノ酸残基は-NHC(R0)(R1)C(R2)(R3)COOHで示される。また、γ−アミノ酸（H２NC(R0)(R1)C(R2)(R3)C(R4)(R5)COOH ： R0、R1、R2、R3、R4およびR５はそれぞれ同一または異なって、任意の置換基を示す）が水分子を失ってペプチド結合を形成しタンパク質やペプチド中に取り込まれた時のＮ末端もしくはＣ末端以外の部分の-NHC(R0)(R1)C(R2)(R3)C(R4)(R5)CO-の構造をいう。一方、Ｎ末端のアミノ酸残基はH２NC(R0)(R1)C(R2)(R3)C(R4)(R5)CO-、Ｃ末端のアミノ酸残基は-NHC(R0)(R1)C(R2)(R3)C(R4)(R5)COOHで示される。さらに、ε−アミノ酸（H２NC(R0)(R1)C(R2)(R3)C(R4)(R5)C(R6)(R7)C(R8)(R9)COOH： R0、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびR９はそれぞれ同一または異なって、任意の置換基を示す）が水分子を失ってペプチド結合を形成しタンパク質やペプチド中に取り込まれた時のＮ末端もしくはＣ末端以外の部分の-NHC(R0)(R1)C(R2)(R3)C(R4)(R5)C(R6)(R7)C(R8)(R9)CO-の構造をいう。一方、Ｎ末端のアミノ酸残基はH２NC(R0)(R1)C(R2)(R3)C(R4)(R5)C(R6)(R7)C(R8)(R9)CO-、Ｃ末端のアミノ酸残基は-NHC(R0)(R1)C(R2)(R3)C(R4)(R5)C(R6)(R7)C(R8)(R9)COOHで示される。
【００４９】
本明細書において、アミノ酸としては、天然または非天然のアミノ酸であって、Ｄ−体またはＬ−体のいずれでもよく、α−、β−、γ−、ε−型のいずれのものでもよい。α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、ε−アミノ酸の側鎖を形成する基としては、例えば(1)Ｃ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなど、好ましくはＣ１−３アルキルなど）、(2)シアノ基、(3)ハロゲン（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、(4)ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル基（例、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチルなど）、(5)Ｃ１−６アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなど、好ましくはＣ１−３アルコキシなど）、(6) Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルなど、好ましくはＣ１−３アルコキシ−カルボニルなど）、(7)Ｃ１−４アシル基（例、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのホルミルおよびＣ2−4アルカノイルなど）、(8)ヒドロキシ基、(9)式：−Ｓ(Ｏ)ａ−Ｒ２１（式中、ａは０〜２の整数を、Ｒ２１はＣ１−６アルキル（具体例は、上記と同様のものが挙げられる）を示す）で表わされる基（例、メチルチオ、メタンスルフィニル、メタンスルホニル、エチルチオ、エタンスルフィニル、エタンスルホニルなど）、(10)ベンジルオキシカルボニル、(11)トシル基、(12)カルバモイル基、(13)メルカプト基、(14)アミノ基、(15)スルホ基、(16)ホスホノ基、(17)ホスホ基、（18）カルボキシル基、（19）テトラゾリル基、(20)アミノ−Ｃ１−６アルキル基（例、アミノメチル、アミノエチルなど）、(21)アミノアリル基、(22)チアゾリル基、(23)チエニル基、(24)オキサゾリル基、(25)フリル基、(26)ピラニル基、(27)ピリジル基、(28)ピラジル基、(29)ピラジニル基、(30)ピリミジニル基、(31)ピリダジニル基、(32)インドリル基、(33)インドジニル基、(34)イソインドリル基、(35)ピロリル基、（36）イミダゾリル基、(37)イソチアゾリル基、(38)ピラゾリル基、(39)クロメニル基、(40)プリニル基、(41)キノリジニル基、(42)キノリル基、(43)イソキノリル基、(44)キナゾリニル基、(45)キノキサリニル基、(46)シンノリニル基、(47)モルホリニル基、(48)ベンゾチエニル基、(49)ベンゾフラニル基、（50）ベンズイミダソリル、(51)ベンズイミダゾリル基、(52) Ｃ３−８シクロアルキル基、 (53)上記(2)、(3)、(5)から（17)、(20)から(52)に記載の置換基で置換されたＣ１−４アルキル基、(54) 上記(2)、(3)、(5)から（17)、(20)から(52)に記載の置換基で置換されたホルミル、Ｃ２−４アルカノイルなどのＣ１−４アシル基、(55)上記(1)から(52)の記載の置換基で置換されたフェニルなどのＣ６−１０アリール基（メシチル、トリル、キシリル、スチレニルなど）、(56) 上記(1)から(52)の記載の置換基で置換されたベンジルなどのＣ7-15アラルキル基（メチルベンジル、メトキシベンジルなど）、(57) Ｃ7-15アラルキル基(ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチルなど)、(58) Ｃ６−１０アリール基（フェニル、ナフチル、インデニルなど）、および(59)水素原子などがあげられる。
【００５０】
また、アミノ酸残基を形成する側鎖と窒素原子が結合し、環を形成してもよく（例、プロリンなど）、２つの側鎖が結合し環を形成してもよい（例、３−アミノノルボルナンカルボン酸など）。α−アミノ酸の例としては、例えば、グリシン，アラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，セリン，スレオニン，システイン，メチオニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，リジン，アルギニン，フェニルアラニン，チロシン，ヒスチジン，トリプトファン，アスパラギン、グルタミン、プロリン，ピペコリン酸、ノルロイシン，γ−メチルロイシン，tert-ロイシン，ノルバリン，ホモアルギニン，ホモセリン，α−アミノイソ酪酸，α−アミノ酪酸，オルニチン、α−アミノアジピン酸、フェニルグリシン、チエニルグリシン、シクロヘキシルグリシン、シクロヘキシルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、ビフェニルアラニン、ｐ−ホスホノメチルフェニルアラニン、オクタハイドロインドール−２−カルボン酸、Ｏ−ホスホチロシン、アダマンチルアラニン、ベンゾチエニルアラニン、ピリジルアラニン、ピペリジルアラニン、ピラジルアラニン、キノリルアラニン、チアゾリルアラニン、ホモシステイン、ホモフェニルアラニン、シトルリン、ホモシトルリン、オキシプロリン（ヒドロキシプロリン）、α、β−ジアミノプロピオン酸、α、γ−ジアミノ酪酸、アミノマロン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、ペニシラミン、シクロロイシン、2-アミノ-4-ペンテン酸などがあげられる。β−アミノ酸の例としては、例えば、β−アラニン、β−アミノ酪酸、イソアスパラギン、3-アミノアジピン酸、3-アミノフェニルプロピオン酸、3-アミノ-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸、3-アミノノルボルナンカルボン酸、3-アミノビシクロヘプタンカルボン酸などがあげられる。γ−アミノ酸の例としては、例えば、γ-アミノ酪酸、イソグルタミン、スタチン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-シクロヘキシルペンタン酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノペニシラン酸、3-アミノアダマンタン-1-カルボン酸などがあげられる。ε−アミノ酸の例としては、例えば、ε-アミノカプロン酸、4-アミノメチル-シクロヘキサンカルボン酸などがあげられる。
【００５１】
該天然のアミノ酸としては、グリシン，アラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，セリン，スレオニン，システイン，シスチン，メチオニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，リジン，アルギニン，フェニルアラニン，チロシン，ヒスチジン，トリプトファン，アスパラギン，グルタミン，プロリン，オルニチン，シトルリンなどが挙げられる。非天然のアミノ酸としては、ノルロイシン，γ−メチルロイシン，tert-ロイシン，ノルバリン，ホモアルギニン，ホモセリン，アミノイソ酪酸， アミノアジピン酸（例、α−アミノアジピン酸）、フェニルグリシン、チエニルグリシン、シクロヘキシルグリシン、アミノ酪酸、β−アラニン、シクロヘキシルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、アダマンチルアラニン、ベンゾチエニルアラニン、ピリジルアラニン、ピペリジルアラニン、ピラジルアラニン、キノリルアラニン、チアゾリルアラニン、イソアスパラギン、イソグルタミン、ホモシステイン、ホモフェニルアラニン、ホモシトルリン、オキシプロリン（ヒドロキシプロリン）、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、アミノ安息香酸、前記天然アミノ酸、非天然アミノ酸のＮ-メチル化体などが挙げられる。これらのアミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基の例としては、(1) Ｃ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなど、好ましくはＣ１−３アルキルなど）、(2)シアノ基、(3)ハロゲン（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、(4)ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル基（例、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチルなど）、(5) Ｃ１−６アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなど、好ましくはＣ１−３アルコキシなど）、(6) Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルなど、好ましくはＣ１−３アルコキシ−カルボニルなど）、(7) Ｃ１−４アシル基（例、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのホルミルおよびＣ２−４アルカノイルなど）、(8)ヒドロキシ基、(9)式：−Ｓ(Ｏ)ａ−Ｒ２１（式中、ａは０〜２の整数を、Ｒ２１はＣ１−６アルキル（具体例は、上記と同様のものが挙げられる）を示す）で表わされる基（例、メチルチオ、メタンスルフィニル、メタンスルホニル、エチルチオ、エタンスルフィニル、エタンスルホニルなど）、(10)ベンジルオキシカルボニル、(11)トシル基、(12)カルバモイル基、(13)メルカプト基、(14)アミノ基、(15)スルホ基、(16)ホスホノ基、(17)ホスホ基、（18）カルボキシル基、（19）テトラゾリル基、(20)アミノ−Ｃ１−６アルキル基（例、アミノメチル、アミノエチルなど）、(21)アミノアリル基、(22)チアゾリル基、(23)チエニル基、(24)オキサゾリル基、(25)フリル基、(26)ピラニル基、(27)ピリジル基、(28)ピラジル基、(29)ピラジニル基、(30)ピリミジニル基、(31)ピリダジニル基、(32)インドリル基、(33)インドジニル基、(34)イソインドリル基、(35)ピロリル基、（36）イミダゾリル基、(37)イソチアゾリル基、(38)ピラゾリル基、(39)クロメニル基、(40)プリニル基、(41)キノリジニル基、(42)キノリル基、(43)イソキノリル基、(44)キナゾリニル基、(45)キノキサリニル基、(46)シンノリニル基、(47)モルホリニル基、(48)ベンゾチエニル基、(49)ベンゾフラニル基、（50）ベンズイミダソリル、(51)ベンズイミダゾリル基、(52) Ｃ３−８シクロアルキル基、(53)オキソ基、(54)上記(2)、(3)、(5)から（19)、(22)から(52)に記載の置換基で置換されたＣ１−４アルキル基、(55) 上記(2)、(3)、(5)から（19)、(22)から(52)に記載の置換基で置換されたホルミル、Ｃ２−４アルカノイルなどのＣ１−４アシル基、(56)上記(1)から(52)の記載の置換基で置換されたフェニルなどのＣ６−１０アリール基（メシチル、トリル、キシリル、スチレニルなど）、(57)上記(1)から(52)の記載の置換基で置換されたベンジルなどのＣ7-15アラルキル基（メチルベンジル、メトキシベンジルなど）、(58) Ｃ7-15アラルキル基(ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチルなど)、(59) Ｃ６−１０アリール基（フェニル、ナフチル、インデニルなど）などがあげられる。
【００５２】
本明細書において、中性の置換基としては、(1) Ｃ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなど、好ましくはＣ１−３アルキルなど）、(2)シアノ基、(3)ハロゲン（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、(4)ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル基（例、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチルなど）、(5)ヒドロキシ基、(6)カルバモイル基、(7)メルカプト基、(8)式: −Ｓ(Ｏ)ａ−Ｒ２１(式中の各記号は前記と同意義)で表される基、（9）Ｃ６−１０アリール基（例フェニル、ナフチル、インデニル、クロメニルなど）、(10)チエニル基、(11)オキサゾリル基、(12)フリル基、(13)インドリル基、(14)インドリジニル基、(15)イソインドリル基、(16) Ｃ３−８シクロアルキル基、(17)オキソ基、(18)上記(2),(3),(5)から(16)に記載の置換基で置換されたＣ１−６アルキル、(19) 上記(1)から(16)に記載の置換基で置換されたフェニル、ナフチルなどのＣ６−１０アリール基（メシチル、トリル、キシリル、スチレニルなど）、(20) 上記(1)から(16)に記載の置換基で置換されたベンジルなどのＣ7-15アラルキル基（メチルベンジル、メトシキベンジルなど）などがあげられる。酸性の置換基としては、それぞれカルボキシル基、スルホ基、テトラゾリル基等で置換されたＣ１−４アルキル基、フェニル、ナフチルなどのＣ６−１０アリール基もしくはベンジルなどのＣ7-15アラルキル基、カルボキシル基などがあげられる。塩基性の置換基としては、(1)アミノ−Ｃ１−６アルキル基（アミノメチル、アミノエチルなど）、(2)アミノアリル基、(3)ピリジル基、(4)ピラジル基、(5)ピラジニル基、 (6)ピリダジニル基、（7）イミダゾリル基、(8)ピラゾリル基、(9)ピラゾリル基、(10)モルホリニル基、(11)アミノ基、(12)上記(3)から(10)に記載の置換基で置換されたＣ１−４アルキル基、(13)上記(1)から(11)に記載の置換基で置換されたベンジルなどのＣ7-15アラルキル基、(14)上記(1)から(11)に記載の置換基で置換されたフェニル、ナフチルなどのＣ６−１０アリール基などがあげられる。本明細書において、酸性アミノ酸としては、具体的には、たとえば、側鎖にカルボキシル基、スルホ基、テトラゾリル基のような酸性基を有するアミノ酸があげられる。その具体例としては、グルタミン酸、ピログルタミン酸、アスパラギン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、３−（５−テトラゾリル）アラニン、２−アミノ−４−（５−テトラゾリル）酪酸などがあげられる。本明細書において、塩基性アミノ酸としては、たとえば、ヒスチジン、アルギニン、 オルチニン、リジン、 ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ホモアルギニンなどがあげられる。側鎖が置換された塩基性アミノ酸としては、具体的には、たとえば、Ｎα−アセチルアルギニン、 Ｎε−トシルアルギニン、 Ｎε−アセチルリジン、Ｎε−メチルリジン、Ｎε−トシルリジンなどがあげられる。本明細書において、中性アミノ酸としては、具体的には、たとえば、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、ノルロイシン、ターシャリーロイシン、ガンマメチルロイシン、プロリン、フェニルグリシン、フェニルアラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、グリシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、オキシプロリン（ヒドロキシプロリン）、シクロヘキシルアラニン、などのアミノ酸があげられる。側鎖が置換された中性アミノ酸としては、具体的には、たとえば、ビフェニルアラニンなどがあげられる。
【００５３】
本明細書において、芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基としては、具体的には、たとえば、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−チエニルアラニン、ヒスチジン、ピリジルアラニン（２−ピリジルアラニン）、Ｏ−メチルチロシンなどがあげれらる。側鎖が置換された芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基としては、具体的には、たとえば、３−ヨードチロシン、p-ホスホノメチルフェニルアラニン、Ｏ−ホスホチロシンなどがあげられる。本明細書において、ヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基としては、例えば、セリン、スレオニン、チロシン、オキシプロリン（ヒドロキシプロリン）などがあげられる。本明細書におけるペプチドおよびペプチド鎖はペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のペプチドおよびペプチド鎖はＣ末端が通常カルボキシル基（-COOH）またはカルボキシレート(-COO−)であるが、Ｃ末端がアミド（-CONH２）またはエステル(-COOR)であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキルなどのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この時のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。また、本発明のペプチドまたはペプチド鎖には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が置換基（例えば、（１）ホルミル、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基、グアニジノアセチル、チエニルアクリリル、ピリジルアセチルなどのＣ１−８アシル基、（２）メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどのＣ１−６アルキル基、（３）フェニル、ナフチルなどＣ６−１０アリール基またはベンジル、フェネチルなどのＣ７−１６アラルキル基、（４）トシル基、（５）ベンジルオキシカルボニル基、（６）式：−Ｓ(Ｏ)ａ−Ｒ２２（式中、ａは０〜２の整数を、Ｒ２２はＣ１−６アルキル（具体例は、上記と同様のものがあげられる）を示す）で表される基（例、メチルチオ、メタンスルフィニル、メタンスルホニル、エチルチオ、エタンスルフィニル、エタンスルホニルなど）、（７）ｔ−ブトキシカルボニル基、（８）Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基など）で置換されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾリル基、インドリル基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００５４】
アペリンの修飾体（Ｉ）は、式Ｘ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ４−Ｘ５で表され、−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−、−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−および−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されていてもよく、置換基としては、上記の置換基などがあげられる。本明細書において、Ｘ１は「水素原子またはそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖」を示す。該「側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸」における置換基としては、例えば、上記の「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基」と同様のものなどがあげられる。Ｘ１が「側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基」を示すときの好ましい例としては、例えば、置換されていてもよいピログルタミン酸または側鎖が置換されていてもよいグルタミンなどがあげられ、より好ましくは、ピログルタミン酸またはグルタミンなどがあげられる。該「側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基」、「置換されていてもよいピログルタミン酸」、「側鎖が置換されていてもよいグルタミン」におけるアミノ酸残基の置換基としては、例えば、上記の「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基」と同様のものなどがあげられる。また、「置換されていてもよいピログルタミン酸」の好ましい置換基としては、ベンジルオキシカルボニル基などがあげられる。Ｘ１が「それぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい２〜２５個のアミノ酸からなるペプチド鎖」を示すときの具体例としては、例えば、式Ｙ１−Ｙ２（式中、Ｙ１はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい１〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、Ｙ２はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい１〜８個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す）で表されるペプチドなどがあげられる。
【００５５】
上記Ｙ１およびＹ２で表されるアミノ酸残基またはペプチド鎖中のアミノ酸残基の側鎖の置換基としては、例えば、上記の「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基」と同様のものなどがあげられる。上記Ｙ１としての具体例としては、例えば、(a) 式 Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、Ａ１〜Ａ１７はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示す）、(b) 式 Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(c) 式 Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(d) 式 Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(e) 式 Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(f) 式 Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(g) 式 Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(h) 式 Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(i) 式 Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(j) 式 Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(k) 式 Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(l) 式 Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(m) 式 Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(n) 式 Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(0) 式 Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(p) 式 Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）または(q) Ａ１７（Ａ１７は前記と同意義を示す）で表されるアミノ酸残基またはペプチド鎖などがあげられる。
【００５６】
上記Ａ１は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、芳香性の側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、芳香性の側鎖を有するＬ−アミノ酸残基、さらに好ましくはＬ−チロシンなどを示す。上記Ａ２およびＡ３はそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、より好ましくは、側鎖が置換されていてもよいＬ−中性アミノ酸残基、さらに好ましくはＡ２としてはＬ−ロイシンなど、Ａ３としてはＬ−バリンなどがあげられる。上記Ａ４は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい中性または塩基性アミノ酸残基、より好ましくは、側鎖が置換されていてもよいＬ−中性またはＬ−塩基性アミノ酸残基、さらに好ましくはＬ-リジンまたはＮε−アセチルリジンなどを示す。上記Ａ５は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、より好ましくは、置換されていてもよいＬ-プロリン、さらに好ましくは、Ｌ-プロリンなどを示す。上記Ａ６およびＡ９はそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基、より好ましくは、側鎖が置換されていてもよいＬ−塩基性アミノ酸残基、さらに好ましくはＬ−アルギニンなどを示す。上記Ａ７およびＡ１０は、それぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、ヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基などを示す。Ａ７としては、置換されていてもよいグリシン、特にグリシンなどが好ましく用いられる。上記Ａ８は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、Ｌ-プロリンやヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基、より好ましくは、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリンまたはオキシプロリン（ヒドロキシプロリン）などを示す。上記Ａ１０として好ましくは、ヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、より好ましくはセリン、スレオニン、アスパラギンなどを示す。上記Ａ１１〜Ａ１４はそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、より好ましくは、Ａ１１としてはグリシン、Ａ１２としてはＬ-プロリン、Ａ１３としてはグリシン、Ａ１４としてはＬ-アラニン、Ｌ-プロリンなどがあげられる。上記Ａ１５は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、芳香族性の側鎖を有するＬ−アミノ酸残基、さらに好ましくはＬ−トリプトファンなどを示す。上記Ａ１６は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、より好ましくは、カルバモイル基を持つ中性Ｌ−アミノ酸残基、さらに好ましくはＬ-グルタミンを示す。カルバモイル基を持つ中性Ｌ−アミノ酸残基としては、例えばＬ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンなどがあげられる。Ａ１７は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、より好ましくは、グリシンなどを示す。
【００５７】
上記Ｙ２としての具体例としては、例えば、（１）式 Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８（式中、Ｂ１〜Ｂ８はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示す）、（２）式 Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８（式中、各記号は上記と同意義を示す）、（３）式 Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８（式中、各記号は上記と同意義を示す）、（４）式 Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８（式中、各記号は上記と同意義を示す）、（５）式 Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８（式中、各記号は上記と同意義を示す）、（６）式 Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８（式中、各記号は上記と同意義を示す）、（７）式 Ｂ７−Ｂ８（式中、各記号は上記と同意義を示す）または（８）式 Ｂ８（Ｂ８は上記と同意義を示す）で表されるアミノ酸残基またはペプチド鎖などがあげられる。
上記Ｂ１は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、より好ましくは、側鎖が置換されていてもよい中性Ｌ−アミノ酸残基、さらに好ましくは、置換されていてもよいグリシン、最も好ましくは、グリシンなどを示す。上記Ｂ２〜Ｂ４はそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基、より好ましくは、側鎖が置換されていてもよい塩基性Ｌ−アミノ酸残基、さらに好ましくは、Ｂ２としてはＬ−アルギニン、Ｂ３としてはＬ−アルギニン、Ｂ４としては、Ｌ−リジンなどを示す。上記Ｂ５は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基、より好ましくは、芳香族性の側鎖を有するＬ−アミノ酸残基、さらに好ましくは、Ｌ−フェニルアラニンなどを示す。上記Ｂ６およびＢ７はそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基、より好ましくは、側鎖が置換されていてもよい塩基性Ｌ−アミノ酸残基、さらに好ましくは、Ｌ-アルギニンなどを示す。上記Ｂ８は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、側鎖が置換されていてもよいグルタミン、より好ましくは、Ｌ-グルタミンなどを示す。
【００５８】
Ｙ１とＹ２の組み合わせとしては、上記(a)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合（即ちＸ１が、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８で表される場合：以下の組み合わせの説明においては省略する）、上記(a)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(a)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(a)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(a)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(a)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(a)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(a)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合、上記(q)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(q)で表される式＋上記（２）で表される式で表される場合、上記(q)で表される式＋上記（３）で表される式で表される場合、上記(q)で表される式＋上記（４）で表される式で表される場合、上記(q)で表される式＋上記（５）で表される式で表される場合、上記(q)で表される式＋上記（６）で表される式で表される場合、上記(q)で表される式＋上記（７）で表される式で表される場合、および上記(q)で表される式＋上記（８）で表される式で表される場合があげられるが、なかでも、上記(a)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(b)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(c)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(d)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(e)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(f)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(g)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(h)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(i)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(j)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(k)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(l)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(m)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(n)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(o)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、上記(p)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合、および上記(q)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合が好ましい。
【００５９】
なかでも、上記(a)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合および上記(b)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合がより好ましい例としてあげられる。上記(a)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合および上記(b)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合の更に好ましい具体例を以下に示す。上記(b)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合とは、Ｘ１が式 Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８（式中、Ａ2〜Ａ１７およびＢ１〜Ｂ８は上記と同意義を示す）で表される場合のことをいうが、この場合の好ましい具体例としては、Ａ２およびＡ３がそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいＬ−中性アミノ酸残基、好ましくはＡ２としてはＬ−ロイシンなど、Ａ３としてはＬ−バリンなどであり、Ａ４が側鎖が置換されていてもよいＬ−中性またはＬ−塩基性アミノ酸残基、好ましくはＬ−グルタミン、 Ｌ-リジンまたはＮε−アセチルリジンなどであり、Ａ５が側鎖が置換されていてもよいＬ-プロリン、好ましくは、Ｌ-プロリンなどであり、Ａ６およびＡ９がそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいＬ−塩基性アミノ酸残基、好ましくはＬ−アルギニンなどであり、Ａ７が置換されていてもよいグリシン、好ましくはグリシンなどであり、Ａ８がＬ-プロリンまたはヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基、好ましくは、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリンまたはオキシプロリン（ヒドロキシプロリン）などであり、Ａ１０が、ヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、好ましくはＬ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギンなどであり、Ａ１１がグリシン、Ａ１２がＬ-プロリン、Ａ１３がグリシン、Ａ１４がＬ-アラニンまたはＬ-プロリンなどであり、Ａ１５が芳香族性の側鎖を有するＬ−アミノ酸残基、好ましくはＬ−トリプトファンなどであり、Ａ１６がカルバモイル基を持つ中性Ｌ−アミノ酸残基、好ましくはＬ-グルタミンであり、Ａ１７が中性アミノ酸残基、好ましくは、グリシンなどであり、Ｂ１が側鎖が置換されていてもよい中性Ｌ−アミノ酸残基、好ましくは、置換されていてもよいグリシン、より好ましくは、グリシンなどであり、Ｂ２〜Ｂ４がそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよい塩基性Ｌ−アミノ酸残基、好ましくは、Ｂ２としてはＬ−アルギニン、Ｂ３としてはＬ−アルギニン、Ｂ４としては、Ｌ−リジンなどであり、Ｂ５が芳香族性の側鎖を有するＬ−アミノ酸残基、好ましくは、Ｌ−フェニルアラニンなどであり、Ｂ６およびＢ７がそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよい塩基性Ｌ−アミノ酸残基、好ましくは、Ｌ-アルギニンなどであり、Ｂ８が側鎖が置換されていてもよいグルタミン、好ましくは、Ｌ-グルタミンなどである場合などがあげられる。
【００６０】
上記(a)で表される式＋上記（１）で表される式で表される場合とは、Ｘ１が式 Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６−Ｂ７−Ｂ８（式中、Ａ１〜Ａ１７およびＢ１〜Ｂ８は上記と同意義を示す）で表される場合のことをいうが、この場合の好ましい具体例としては、Ａ１が芳香性の側鎖を有するＬ−アミノ酸残基、より好ましくはＬ−チロシンなどであり、Ａ２およびＡ３がそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいＬ−中性アミノ酸残基、好ましくはＡ２としてはＬ−ロイシンなど、Ａ３としてはＬ−バリンなどであり、Ａ４が側鎖が置換されていてもよいＬ−中性またはＬ−塩基性アミノ酸残基、好ましくはＬ−グルタミン、Ｌ-αアミノアジピン酸、Ｌ-リジンまたはＮε−アセチルリジンなどであり、Ａ５が置換されていてもよいＬ-プロリン、好ましくは、Ｌ-プロリンなどであり、Ａ６およびＡ９がそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよいＬ−塩基性アミノ酸残基、好ましくはＬ−アルギニンなどであり、Ａ７が置換されていてもよいグリシン、好ましくはグリシンなどであり、Ａ８がＬ-プロリンまたはヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基、好ましくは、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリンまたはオキシプロリン（ヒドロキシプロリン）などであり、Ａ１０がヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、好ましくはＬ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギンなどであり、Ａ１１がグリシン、Ａ１２がＬ-プロリン、Ａ１３がグリシン、Ａ１４がＬ-アラニンまたはＬ-プロリンなどであり、Ａ１５が芳香族性の側鎖を有するＬ−アミノ酸残基、好ましくはＬ−トリプトファンなどであり、Ａ１６がカルバモイル基を持つ中性Ｌ−アミノ酸残基、好ましくはＬ-グルタミンであり、Ａ１７が中性アミノ酸残基、好ましくは、グリシンなどであり、
Ｂ１が側鎖が置換されていてもよい中性Ｌ−アミノ酸残基、好ましくは、置換されていてもよいグリシン、より好ましくは、グリシンなどであり、Ｂ２〜Ｂ４がそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよい塩基性Ｌ−アミノ酸残基、好ましくは、Ｂ２としてはＬ−アルギニン、Ｂ３としてはＬ−アルギニン、Ｂ４としては、Ｌ−リジンなどであり、Ｂ５が芳香族性の側鎖を有するＬ−アミノ酸残基、好ましくは、Ｌ−フェニルアラニンなどであり、Ｂ６およびＢ７がそれぞれ同一または異なって、側鎖が置換されていてもよい塩基性Ｌ−アミノ酸残基、好ましくは、Ｌ-アルギニンなどであり、Ｂ８が側鎖が置換されていてもよいグルタミン、好ましくは、Ｌ-グルタミンＬ-ピログルタミン酸などである場合などがあげられる。
【００６１】
Ｘ１として、より具体的な好ましい例として、(1) 水素原子、(2) Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln、(3) pGlu、(4) Leu-Val-Adi(NH２)-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln 、(5) Leu-Val-Lys(Ac)-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln 、(6) Tyr-Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln 、および(7) Z-pGluなどがあげられる。
【００６２】
本明細書において、Ｘ２は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示すが、好ましくは側鎖が置換されていてもよいＬ−ロイシン、側鎖が置換されていてもよいＬ−ノルロイシン、より好ましくは、Ｌ−ロイシンまたはＬ−ノルロイシンなどがあげられる。
【００６３】
本明細書において、Ｘ３は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示す。塩基性アミノ酸残基の側鎖への置換基としては、例えばＣ１−４アシル基、トシル基、Ｃ１−６アルキル基などがあげられる。Ｃ１−４アシル基としては、例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのホルミルおよびＣ２−４アルカノイルなどがあげられる。Ｃ１−６アルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどがあげられる。Ｘ３として好ましくは、側鎖が置換されていてもよいＬ−リジン、側鎖が置換されていてもよいＬ−ノルロイシン、または側鎖が置換されていてもよいＬ−アルギニンなどがあげられ、より好ましくは、側鎖がＣ１−４アシル基（例、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのホルミルおよびＣ２−４アルカノイルなど）、Ｃ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）またはトシル基で置換されていてもよいＬ−リジン、Ｌ−ノルロイシンまたはＬ−アルギニンなどがあげられ、さらに好ましくは、Ｌ−リジン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｎε−アセチルリジン、Ｎε−メチルリジン、 Ｎε−トシルリジン、 Ｎε−トシルアルギニンなどがあげられる。
【００６４】
本明細書において、Ｘ４は結合手または側鎖が置換されていてもよい中性または芳香性アミノ酸残基を示す。Ｘ４として好ましくは、結合手、側鎖が置換されていてもよいＬ−ノルロイシン、側鎖が置換されていてもよいＬ−メチオニン、側鎖が置換されていてもよいＬ−メチオニンスルフォキシドまたは側鎖が置換されていてもよいＬ−アラニンなどがあげられ、より好ましくは結合手、Ｌ−ノルロイシンまたはＬ−メチオニン、Ｌ−メチオニンスルフォキシド、Ｌ−シクロヘキシルアラニンなどがあげられる。
【００６５】
本明細書において、Ｘ５は（１）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（２）水酸基または（３）側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体を示す。Ｘ５として好ましくは、（１）側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（２）水酸基または（３）側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよい芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体などがあげられる。Ｘ５としてさらに好ましくは、（１）側鎖が置換されていてもよいＬ−プロリンまたはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（２）側鎖が置換されていてもよい４−クロロフェニルアラニンまたはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（３）側鎖が置換されていてもよい２−ナフチルアラニンまたはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（４）側鎖が置換されていてもよいシクロヘキシルアラニンまたはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、（５）水酸基または（６）置換されていてもよいＬ−プロリンと(a)側鎖が置換されていてもよいＬ−フェニルアラニン、(b)側鎖が置換されていてもよいＬ−チロシン、(c)側鎖が置換されていてもよいＬ−２−チエニルアラニン、（d）側鎖が置換されていてもよいＬ−フェニルグリシンもしくは（e）側鎖が置換されていてもよいＬ−２−ピリジルアラニンが結合してなるジペプチド鎖、またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体などがあげられる。Ｘ５としてさらに好ましくは、(1)Ｌ−プロリンまたはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、(2)４−クロロフェニルアラニンまたはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、(3)２−ナフチルアラニンまたはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、(4)シクロヘキシルアラニンまたはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、(5)水酸基、(6)Ｌ−プロリンとＬ−フェニルアラニンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(7)Ｌ−プロリンとＬ−チロシンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(8)Ｌ−プロリンとＬ−２−チエニルアラニンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(9)Ｌ−プロリンとＬ−フェニルグリシンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(10)Ｌ−プロリンと４−クロロフェニルアラニンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(11)Ｌ−プロリンと２−ナフチルアラニンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(12)Ｌ−プロリンと３−ヨードチロシンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(13)Ｌ−プロリンとＯ−メチルチロシンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、または(14)Ｌ−プロリンとＬ−２−ピリジルアラニンが結合してなるジペプチド鎖またはそのＣ末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体などがあげられる。
【００６６】
「−Ｘ４−Ｘ５」として、特に好ましくは、(1) -Nle-Pro-Phe、(2) -Nle-Pro-Tyr、(3) -Nle-Pro、(4) -Nle、(5) -Met-Pro-Phe、(6) -Nle-Pro-Thi、(7) -Nle-Pro-Phg、(8) -Nle-Pro-Pya(2)、(9) -Met(O)、(10) -Met-Phe(Cl)、(11) -Met-Pro-Phe(Cl)、(12) -Met-Pro-Nal(2)、(13) -Met-Nal(2)、(14) -Met-Cha、(15) -Cha-Pro-Phe、(16) -Cha、(17) -Met-Pro-Tyr(I)、および(18) -Met-Pro-Tyr(Me)などがあげられる。
【００６７】
アペリンの修飾体（Ｉ）の具体例としては、例えば、(1) Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号１３）、(2) Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Tyr （配列番号１４）、(3) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号１５）、(4) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Tyr （配列番号１６）、(5) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro （配列番号１７）、(6) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle （配列番号１８）、(7) Ac-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Tyr （配列番号１９）、(8) Ac-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro （配列番号２０）、(9) Ac-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle （配列番号２１）、(10) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys(Ac)-Gly-Pro-Met-Pro-Phe （配列番号２２）、(11) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys(Me)-Gly-Pro-Met-Pro-Phe （配列番号２３）、(12) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys(Ac)-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号２４）、(13) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys(Me)-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号２５）、(14) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys(Tos)-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号２６）、(15) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Arg(Tos)-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号２７）、(16) pGlu-Arg-Pro-Arg-Nle-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号２８）、(17) pGlu-Arg-Pro-Arg-Nle-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Tyr （配列番号２９）、(18) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Thi （配列番号３０）、(19) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phg （配列番号３１）、(20) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Pya(2) （配列番号３２）、(21) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Tyr （配列番号３３）、(22) Leu-Val-Adi(NH２)-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号３４）、(23) Leu-Val-Lys(Ac)-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Tyr （配列番号３５）、(24) Tyr-Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号３６）、(25) Z-pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys(Ac)-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe （配列番号３７）、(26) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met(O) （配列番号３８）、(27) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Tyr （配列番号３９）、(28) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Phe(Cl) （配列番号４０）、(29) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe(Cl) （配列番号４１）、(30) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Nal(2) （配列番号４２）、(31) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Nal(2) （配列番号４３）、(32) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe(Cl) （配列番号４４）、(33) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Phe(Cl) （配列番号４５）、(34) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Cha （配列番号４６）、(35) ｐGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe （配列番号４７）、(36) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Cha （配列番号４８）、(37) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe(Cl) （配列番号４９）、(38) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Nle-Gly-Pro-Met-Pro-Phe(Cl) （配列番号５０）、(39) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Nle-Gly-Pro-Met-Pro-Tyr(I) （配列番号５１）、および(40) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Nle-Gly-Pro-Met-Pro-Tyr(Me) （配列番号５２）などがあげられる。
【００６８】
アペリンの修飾体（II）は、式Ｐ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐ２−Ｐ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐ４−Ｐ５で、アペリンの修飾体（III）は、式Ｑ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｑ２−Ｇｌｙ−Ｑ５−Ｑ３−Ｑ４で、アペリンの修飾体（IV）は、式Ｒ１−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｒ２−Ｐｒｏ−Ｒ３で表され、式中の各アミノ酸残基（の側鎖）は置換されていてもよく、置換基としては、上記の置換基などがあげられる。本願明細書において、Ｐ１、Ｑ１およびＲ１は「水素原子またはそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖」を示す。該「側鎖が置換されていてもよい１〜２５個のアミノ酸」における置換基としては、例えば、上記の「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基」と同様のものなどがあげられる。Ｐ１、Ｑ１およびＲ１が「側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基」を示すときの好ましい例としては、例えば、置換されていてもよいピログルタミン酸または側鎖が置換されていてもよいグルタミンなどがあげられ、より好ましくは、ピログルタミン酸またはグルタミンなどがあげられる。該「側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基」、「置換されていてもよいピログルタミン酸」、「側鎖が置換されていてもよいグルタミン」におけるアミノ酸残基の置換基としては、例えば、上記の「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基」と同様のものなどがあげられる。また、「置換されていてもよいピログルタミン酸」の好ましい置換基としては、ベンジルオキシカルボニル基などがあげられる。Ｐ１、Ｑ１およびＲ１が「それぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい２〜２５個のアミノ酸からなるペプチド鎖」を示すときの具体例としては、例えば、式Ｙ１−Ｙ２（式中、Ｙ１はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい１〜１７個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、Ｙ２はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい１〜８個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す）で表されるペプチドなどがあげられる。上記Ｙ１およびＹ２で表されるアミノ酸残基またはペプチド鎖中のアミノ酸残基の側鎖の置換基としては、例えば、上記の「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基」と同様のものなどがあげられる。
【００６９】
上記Ｙ１としての具体例としては、例えば、(a) 式 Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、Ａ１〜Ａ１７はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示す）、(b) 式 Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(c) 式 Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(d) 式 Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(e) 式 Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(f) 式 Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(g) 式 Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(h) 式 Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(i) 式 Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(j) 式 Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(k) 式 Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(l) 式 Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(m) 式 Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(n) 式 Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(0) 式 Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）、(p) 式 Ａ１６−Ａ１７（式中、各記号は前記と同意義を示す）または(q) Ａ１７（Ａ１７は前記と同意義を示す）で表されるアミノ酸残基またはペプチド鎖などがあげられる。
【００７０】
上記Ａ１は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、好ましくは、芳香�