| 【発明の名称】 |
免疫賦活食品，免疫賦活補助食品，抗腫瘍食品および抗酸化食品 |
| 【発明者】 |
【氏名】具 然和
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| 【要約】 |
【課題】生体の免疫機能を高め、癌・感染症等の各種疾患にならない為に日常的に摂取することのできる抗腫瘍作用・免疫賦活作用・免疫賦活補助作用・抗酸化作用・フリーラジカルスカベンジング作用を有する機能性食品を提供する。
【構成】エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物，抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される１種以上を含有する機能性食品（免疫賦活食品・免疫賦活補助食品・抗腫瘍食品・抗酸化食品）とする。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有する免疫賦活食品。
【請求項２】
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有する免疫賦活補助食品。
【請求項３】
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有する抗腫瘍食品。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有する抗酸化食品。
【請求項５】
前記エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株（ＩＦＯ１６８０３）である請求項１乃至４いずれか記載の食品。
【請求項６】
前記抗酸化酵素が、ヴォークルシアン（Ｖａｕｃｌｕｓｉｅｎ）から抽出した抗酸化酵素を、小麦抽出物グリアディンでコーティングしたものである請求項１乃至５いずれか記載の食品。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される１種以上を含有する免疫賦活食品，免疫賦活補助食品，抗腫瘍食品および抗酸化食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌（悪性新生物）は、放射線・化学物質等の発癌物質の作用により正常細胞が突然変異を起こし、その結果、細胞の無制限な増殖が起こり、最終的に宿主を死に至らしめる慢性の進行性疾患であるが、近年の我国における癌による死亡者数は、全死亡者数の約３０％を占めるに至っており、癌は我国の死因第一位として揺ぎ無いものとなっている。
癌に対する治療法としては、外科療法・放射線療法・化学療法（抗癌剤治療）の三大療法が主流であるが、何れも人体に多大な負担とかけることとなり、免疫機能を弱らせる結果となる。又、癌治療で重要となってくるのは、患者の癌を克服しようとする意欲であるが、抗癌剤や放射線治療の過程で体全体に副作用が現れ、嘔吐や食欲の減退なども避けられなくなると克服しようとする意欲がなくなってしまう。
そこで、次なる第四の癌療法として医学界が注目するのが「免疫療法」である。
「免疫」とは、外界から侵入してきた微生物・有害化学物質のみならず、身体の中で作られた癌細胞等の多くのものから身体を守り、健康な状態を維持するための生体防御機構であるが、体内の免疫機能が、ストレス（身体的，精神的）・環境因子（汚染，放射線，薬剤等）・加齢等の要因により低下した時、（疾病に対する抵抗力が低下するので）各種の疾病や、癌、感染症が引き起こされると考えられている。
その為、生体の防御機能である免疫力を強化することは、病気や癌に対する抵抗力を高めることとなるので、生体の恒常性を維持し、健康な身体を保つのに重要である。
【０００３】
癌に対しては、抗癌剤等の抗生物質を使った対症療法が以前より広く行われているが、患者の持つ免疫機能を向上させれば、（患者自身の自然治癒力により）その治療効果がさらに高まると期待されるので、（免疫療法として）免疫賦活活性を有する薬剤の併用が試みられている。又、外科治療、放射線治療、抗癌剤治療は、何れも癌の治療が主目的であり、予防或いは再発に積極的に働きかけるものではないが、免疫療法剤は癌の治療目的に用いられるだけでなく、予防目的にも用いることができる。
癌の治療又は予防剤として免疫機能に働きかけるものとして、免疫増強・賦活効果を持つ新規多糖体物質（特許文献１）、有機ゲルマニウム化合物を有効成分とする免疫療法剤（特許文献２）、フィブロネクチンレセプター産生異常細胞が原因である癌に対するフィブロネクチンレセプター産生異常細胞抑制剤（特許文献３）、腫瘍反応性細胞の豊富なリンパ節を用いた養子細胞療法における治療薬（特許文献４）、癌予防剤として有用なモラノリン誘導体（特許文献５）、抗原提示細胞によるＴ細胞活性化において抗原提示細胞上及び／またはＴ細胞上の補助刺激シグナルの伝達に関与する分子に相互作用することにより補助刺激シグナルの伝達を制御する免疫制御分子（特許文献６）などが知られている。
しかしながら、従来報告されてきたこれら癌の予防治療剤は（何れも医薬品として開発されたものであるので）予防といっても一度癌になった人が再発防止の為に服用するもので、遺伝的及び環境的に癌にかかる可能性があるが、現在は全く健康であるような人が癌にならない為に摂取できる効果の高い癌の予防治療剤ではなかった。
そこで、全く健康な人が通常の食品と同様に摂取することのできる安全で効果の高い癌の予防治療剤が望まれている。
【０００４】
さらに最近の健康ブームは、食生活の改善や、特定の食品成分の力を借りることで、「病気になりにくい体を作る」，「病気になっても治りやすい体を作る」といった意識を一般大衆に徐々に浸透させており、免疫機能を強化する医薬品だけでなく、このような機能性を有する飲食品の需要を高めてきた。
その為、免疫賦活剤等を飲食品として摂ることで病気に対する抵抗力を強め、健康状態と生活状態を改善することが近年重要視されている。
実際、これまでに数多くの天然物について免疫賦活作用が研究され、効果が認められた幾つかの素材や抽出成分が機能性食品の原料として実用化されているが、これらは免疫賦活活性が不十分であったり、安全性が十分に確認されていないものも存在し、より高活性で安全性の高い天然素材の登場が望まれている。
【０００５】
その一方で、癌・糖尿病等、多くの生活習慣病の原因の一つが、放射線・化学物質・ストレス等の様々な要因により体内で発生する「活性酸素」であることが知られており、生活習慣病の９０％以上は体内における活性酸素やそれに由来するフリーラジカル・過酸化脂質等による酸化ストレスが発症の主要因となっていることが報告されている。
その為「活性酸素」を除去し、体の「免疫力」を高めることが重要となる。
活性酸素とは、酸素呼吸する生体内のあらゆる部位で必ず産生されるものであるが、紫外線，重金属等の外来刺激や、（活性酸素の一種である過酸化脂質を含む）食用油、強力な塩素消毒を施された水道水等の飲食物の形で、生体外から生体内に取り込まれる。
活性酸素は、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）、過酸化水素、ヒドロキシラジカル（ＯＨ・）、一重項励起種（１Ｏ２）など種々の形態をとるが、生体内において、酸素を基に最初に生成されるラジカルはスーパーオキサイドであり、ヒドロキシラジカル（最も組織傷害性の高いとされる）等、他のラジカルはスーパーオキサイドを経て生成される。
細胞内のスーパーオキサイドは、細胞内で産生されたスーパーオキサイドジスムターゼ（以下「ＳＯＤ」と略）によって過酸化水素に変換されるが、ＳＯＤ量は加齢に伴って減少し、ＳＯＤ量の減少によってスーパーオキサイドの細胞内濃度が上昇し、スーパーオキサイドが生体に対して障害（関節リウマチやベーチェット病などの組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩こり、冷え性等の障害）を及ぼすようになる。
即ち、活性酸素は生体内でＳＯＤ等の酵素の働きで除去或いは解毒されるが、老化と共に体内のＳＯＤ活性が低下し、活性酸素が原因となる種々の疾患の可能性が高くなる。
その為、活性酸素の消去能の評価は、一般的に、ＳＯＤ活性の測定により行われ、活性の強いものが抗酸化、或いは抗老化の素材として提案されている。
このような障害を予防又は治療するＳＯＤ様作用剤として、ＳＯＤ量の減少を補うために、オウゴンからの抽出物（特許文献７）、バラ科植物である棘梨の果汁等に含まれているＳＯＤ様物質（特許文献８）や、デンプン加水分解物，ポリデキストロース等，グルコースを構成糖とする水溶性多糖類を柿渋に混合したのち噴霧乾燥等の方法により加熱乾燥して得られる無臭の柿渋組成物からなるＳＯＤ様物質（特許文献９）、マンネンタケ属に属するキノコの抽出物を含有するＳＯＤの活性促進効果を有する食品（特許文献１０）等の他、ＳＯＤを含有する食品（特許文献１１）等も報告されている。
しかしながら、従来の健康食品では、活性酸素に起因する種々の病態や老化等を緩和するには不十分であった。
その為、活性酸素を除去し、活性酸素に起因する各種疾患や老化を緩和するのに十分な効果を発揮し、免疫力を高め、身体を健やかに保つことのできる新たな機能性食品の開発が、前記免疫賦活活性等を有する健康食品とともに、要望されていた。
【０００６】
【特許文献１】特開平０８−２５９６０２号公報
【特許文献２】特開昭５６−１０８７０８号公報
【特許文献３】特開平０６−１７２２０３号公報
【特許文献４】特開平０７−１７９３５２号公報
【特許文献５】特開平０７−８２６９７０号公報
【特許文献６】特開平１１− １４９４号公報
【特許文献７】特開昭６４−５０８７７号公報
【特許文献８】特開平０３−８３５４８号公報
【特許文献９】特開２０００−２９０１９０号公報
【特許文献１０】特開２００２−１７３４４１号公報
【特許文献１１】特開平１０−２８５５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上記した従来技術の問題点に鑑み、優れた免疫賦活効果、免疫賦活補助効果および抗腫瘍効果を有し、生体の免疫機能を高め、癌や感染症等の予防に（治療にも）有効な機能性食品を提供することを目的とする。
併せて、顕著な抗酸化作用及びフリーラジカルスカベンジング作用を発揮し、活性酸素に起因する各種疾患や老化を緩和させ、生体の免疫機能を高めるのに有効な機能性食品を提供することを目的とする。
即ち、癌・感染症等の各種疾患にならない為に、日常的に摂取することのできる抗腫瘍作用・免疫賦活作用・免疫賦活補助作用・抗酸化作用・フリーラジカルスカベンジング作用を有し、身体を健やかに保つことのできる機能性食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、「エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物，抗酸化酵素およびチャーガの抽出物」からなる群より選択される１種以上を含有する機能性食品が、抗腫瘍作用、免疫賦活作用、免疫賦活補助作用、抗酸化作用およびフリーラジカルスカベンジング作用を発揮することを見出した為、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、請求項１に係る発明は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有する免疫賦活食品に関する。
請求項２に係る発明は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有する免疫賦活補助食品に関する。
請求項３に係る発明は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有する抗腫瘍食品に関する。
請求項４に係る発明は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有する抗酸化食品に関する。
請求項５に係る発明は、前記エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物が、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株（ＩＦＯ１６８０３）である請求項１乃至４いずれか記載の食品に関する。
請求項６に係る発明は、前記抗酸化酵素が、ヴォークルシアン（Ｖａｕｃｌｕｓｉｅｎ）から抽出した抗酸化酵素を、小麦抽出物グリアディンでコーティングしたものである請求項１乃至５いずれか記載の食品に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る機能性食品（免疫賦活食品・免疫賦活補助食品・抗腫瘍食品・抗酸化食品）は、「エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物」からなる群より選択されるいずれか一種以上を含有するので、優れた免疫賦活効果、免疫賦活補助効果および抗腫瘍効果を発揮すると同時に、優れた抗酸化作用およびフリーラジカルスカベンジング作用を発揮することができる。
その為、全く健康な人が、通常の食品と同様に、本発明に係る機能性食品を日常的に摂取することにより、生体の免疫機能を高めることができ、癌や感染症の予防に（治療にも）有効で、且つ活性酸素に起因する各種疾患や老化を緩和することができるので、結果として、身体を健やかに保つことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択されるいずれか一種以上、若しくはこれらを組み合わせることにより、非常に高い腫瘍成長抑制、免疫賦活作用および免疫賦活補助作用、並びに抗酸化能及びフリーラジカルスカベンジング作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、これらの効果を発揮することができる本発明の実施形態について、本発明にかかる機能性食品（免疫賦活食品・免疫賦活補助食品・抗腫瘍食品・抗酸化食品）を構成する有効成分ごとに説明する。
【００１２】
〔エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物〕
エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物は、乳酸球菌の一種であるが、本発明においては、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株「ＥＣ−１２（ＩＦＯ１６８０３）」を使用するのが好ましい。
「ＥＣ１２（ＩＦＯ１６８０３）」は、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株として、国立遺伝子研究所に遺伝子登録されており（ＩＦＯ１６８０３）、その１６ＳｒＤＮＡについても国立遺伝研究所に「ＡＢ１５４８２」として登録されている。
エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株の菌学的性質を「表１」に示すが、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株の培養方法としては、従来公知の乳酸菌の培養方法も含め、特に制限されるものではなく、乳酸菌生育用培地を用い、３７℃で培養ｐＨを中性付近に維持しながら５〜１２０時間、好ましくは、１６〜２８時間培養し、生菌数約１０７〜１０１０／ｍｌ、好ましくは約１０８〜１０１０／ｍｌの培養液を得る方法を例示することができる。
【００１３】
ＥＣ−１２株死菌体の調製方法として、エンテロコッカス・フェカリスＥＣ−１２株を、ロゴサ培地で３７℃、２４時間培養した前培養液を、酵母エキス４％、ポリペプトン３％、乳糖１０％を含む液体培地に０．１（ｖ／ｖ）％接種し、ｐＨスタットを用いてｐＨ６．８〜７．０に苛性ソーダ水溶液で調整しながら、３７℃で２２〜２４時間中和培養を行う。
【００１４】
ＥＣ１２株の加熱死菌体の水溶性抽出物は、特に制限されるものではないが、例えば、以下の１）または２）ようにして得ることができる。
１）任意の方法で調製した加熱死菌体を約２０〜２６℃の水に懸濁させ、可溶性成分を溶出させる。その後、遠心分離して菌体を除き、上澄みを、必要ならば濃縮した後、乾燥して粉末状の水溶性抽出物を得る。
２）生菌体または加熱死菌体を超音波処理等の方法で破砕した後、約２０〜２６℃の水中に懸濁させ、可溶性成分を溶出させる。その後、遠心分離して菌体破砕物を除き、上澄みを、必要ならば濃縮した後、乾燥して粉末状の水溶性抽出物を得る。
尚、２）の方法は、有効成分の抽出効率に優れているので、特に有効である。
又、本発明の有効成分である「ＥＣ１２株の加熱死菌体の水溶性抽出物」の市販製品としては、「Ｂｉｏ Ａｍｂ」（Ｂｉｏ Ｑｗｅｅｎ株式会社）等を例示することができる。
【００１５】
【表１】
【００１６】
〔抗酸化酵素〕
本発明における抗酸化酵素としては、南フランス、アヴィニョン地方で栽培されているメロン、ヴォークルシアン（Ｖａｕｃｌｕｓｉｅｎ）から抽出した抗酸化酵素を、小麦抽出物グリアディンでコーティングしたものが好ましく、オキシカイン（素材品名）（登録商標）を例示することができる。特に、グリアディンでコーティングされた抗酸化酵素は、直接体内の活性酸素を消去するのではなく、人がすでに自分で持っている抗酸化酵素類を増殖させる働きがあるので、効果が長持ちする。
オキシカイン（登録商標）の原料となるのは、完熟後２週間保存がきくよう育種されたヴォークルシアン種のメロンの改良株、南仏のモンペリエ近郊で栽培されているもの等を例示することができ、メロン・グリアディン複合エキスともいわれている。
又、本発明における抗酸化酵素の市販製品としては「オキシカイン」（株式会社ブロマ研究所）等を例示することができる。
【００１７】
〔チャーガの抽出物〕
「チャーガ（Ｉｎｏｎｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）」は、白樺の木に寄生する日本名「カバノアナタケ」という耐寒性に優れたキノコの菌核で、これを水で抽出すると２５〜４４％の可溶成分が抽出される。又、その生物的活性物質は色原体ポリフェノール複合体の活性フェノール性アルデヒドポリフェノール酸化フェノールとキノンの化学的複合体から形成された染色体である。又、その色原体の複合体からグルコース、ガラクタトーでキシロースなどのフミンに似た物質が析出する。この全ての化合物は白樺木質部のリグニンから生合成された酸化芳香族先駆物質と発泡的結びつきがあり、チャーガのコブには（Ｃ２２Ｈ４０Ｏ７）や蓚酸、蟻酸、酢酸、酪酸などの酸やバニリン酸、疑似酸化ベンゾイン、ライラック酸、ピロカテキン酸、ピロガロールどの芳香族酸やトリテルペノイメタロ、トリテルペン酸、ホビリツロビン酸のほか脂肪酸Ｃ１０，Ｃ１１２，Ｃ１４が存在する。
チャーガは、煎じてお茶として、又はアルコールで抽出して飲用すると、癌予防効果を奏することが知られている。又、チャーガは、これまでのキノコ類と比較して、免疫賦活作用を有するβ−グルカンや活性酸素除去能をもつＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）が豊富に含まれていることが確認されている。特にＳＯＤに関しては、アガリクスや山伏茸の約３０倍といわれている。又、その他多種多様な生理活性物質が含まれていることが分かり、抗腫瘍作用、慢性胃炎や胃潰瘍に対する効果、血統効果作用があることが分かっている。
尚、チャーガのエキスの抽出方法としては、植物（チャーガ）の各部位を常温、又は加温下にて抽出するか、若しくはソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を意味する。
【００１８】
上記した「エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物」からなる群より選択されるいずれか一種以上を含有し、腫瘍成長抑制、免疫賦活作用および免疫賦活補助作用、並びに抗酸化能及びフリーラジカルスカベンジング作用を発揮するのに十分な効果を発揮することができ、抗腫瘍食品，免疫賦活食品，免疫賦活補助食品及び抗酸化食品として利用されるものであれば、本発明に含まれる。
【００１９】
本発明の各機能性食品（免疫賦活食品・免疫賦活補助食品・抗腫瘍食品・抗酸化食品）は、エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物からなる群より選択される何れか一種以上を含有するが、
１）免疫賦活食品としては、所望の効果を発揮するに際し、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物（特に、ＥＣ１２株）とチャーガを含有するのが好ましく、加えて抗酸化酵素をさらに含有するのがより好ましい。
２）免疫賦活補助食品としては、所望の効果を発揮するに際し、エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物（特に、ＥＣ１２株）とチャーガの抽出物を含有するのが好ましく、加えて抗酸化酵素をさらに含有するのがより好ましい。
３）抗腫瘍食品としては、所望の効果を発揮するに際し、エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物（特に、ＥＣ１２株）とチャーガの抽出物を含有するのが好ましく、加えて抗酸化酵素をさらに含有するのがより好ましい。
４）抗酸化食品としては、所望の効果を発揮するに際し、チャーガの抽出物を含有するのが好ましく、加えて抗酸化酵素をさらに含有するのがより好ましい。
【００２０】
〔含有量〕
本発明にかかる各機能性食品に含有されている「エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物」からなる群より選択される何れか一種以上の有効成分は、各機能性食品中に於いて、夫々単独若しくは２種以上の混合であるか否かに拘らず、「チャーガの抽出物」では、５５〜６５質量％配合するのが好ましく、さらに「加熱死菌体の水溶性抽出物」及び「抗酸化酵素」では、１０〜２０質量％配合するのが好ましい。
その理由は、チャーガの抽出物の配合量が５５質量％未満では、本発明の効果（免疫賦活作用，免疫賦活補助作用，抗腫瘍作用および抗酸化作用）を十分に発揮することができず、また６５質量％を超えて配合しても好ましい範囲の効果に比較して期待されるほどの効果は得られない為、何れの場合も好ましくないからである。
同様に「エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物」および「抗酸化酵素」の配合量が１０％未満では、本発明の効果を十分に発揮することができず、また２０質量％を超えて配合しても好ましい範囲の効果に比較して期待されるほどの効果は得られない為、何れの場合も好ましくない。
【００２１】
これら各機能性食品の製造方法は、〔エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物〕からなる群より選択される何れか一種以上を有効成分として、得られるものであれば特に限定されず、各用途で当業者によって使用されている方法に従えばよい。
即ち、使用剤型などを考慮して臨機応変に調製することができ、水単独、アルコールやグリコールなどの水溶性溶媒単独、あるいは水と水溶性溶媒の混合物で抽出することが出来る。抽出されたエキスのｐＨは用いた溶媒のｐＨ、植物材料、酸・アルカリの使用にも左右される。
【００２２】
本発明の各機能性食品（免疫賦活食品・免疫賦活補助食品・抗腫瘍食品・抗酸化食品）は、上記の有効成分〔エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物〕と共に薬学的に許容される製剤担体を用いて、機能性食品として従来から公知の形態とすることができる。
本発明の機能性食品として、例えば、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメント等）、栄養機能食品、特定保健用食品、病者用食品等があげられる。又、本発明の上記有効成分は、通常の手段を用いてジュース、飴、ガム、アイスクリーム等の通常の食品に含有させれば良く、食品の味覚等を損なわない範囲で含有させることができる。
【００２３】
以上のようにして得られた本発明にかかる各機能性食品は「エンテロコッカス・フェカリス属に属する微生物の加熱死菌体の水溶性抽出物、抗酸化酵素およびチャーガの抽出物」を含有するので、癌予防効果、免疫賦活効果、免疫賦活補助効果、抗酸化作用効果を発揮することができ、該食品を日常的に摂取することにより、腫瘍成長抑制、免疫増強作用、並びに抗酸化能及びフリーラジカルスカベンジング作用を発揮するのに十分な効果を発揮することができ、結果として、身体を健やかに保つことができる。
【００２４】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
（１）腫瘍成長抑制への影響
〔実験動物〕
日本ＳＬＣ株式会社より雄６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（体重：２５〜２７ｇ）を購入し、室温２２±３℃，湿度６０％の条件下で、午前７時から１２時間の明暗サイクルとし、一定の飼料（マウス・ラット・ハムスター飼育繁殖型ＣＥ−２（日本クレア））および上水道を自由摂取させた。実験飼育環境に適応させるために１週間予備飼育後に実験に使用した。実験群の分類は、蒸留水を経口投与し、ＳＣＣ７を接種したｃｏｎｔｒｏｌ群（以下「Ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群」）、オキシカイン（登録商標）を経口投与し、ＳＣＣ７を接種したオキシカインＴ群、チャーガを経口投与し、ＳＣＣ７を接種したチャーガ群、（オキシカイン（登録商標）、チャーガ、ＥＣ１２の全てを含有する）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを経口投与し、ＳＣＣ７を接種したＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ群 ＥＣ１２を経口投与し、ＳＣＣ７を接種したＥＣ１２（乳酸球菌）群の計１０群とした。
また、実験に使用したマウスは各群１０匹とした。
【００２６】
〔腫瘍体積および腫瘍抑制率算出〕
オキシカイン（登録商標）、チャーガ、ＥＣ１２及びＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを１週間投与後ＳＣＣ７（２×１０５個）をＣ３Ｈマウスの右大腿部に皮下接種し、オキシカイン（登録商標）、チャーガ、ＥＣ１２を連続４４日まで経口投与し、腫瘍接種後９日後より２９日目まで２日おきにノギスにてマウス右大腿部の腫瘍の短経および長径を測定し、下記の（１）式より腫瘍体積を求めた。
腫瘍体積［ｍｍ３］＝１／２×（長径）×（短経）２ （１）
【００２７】
３０日後に腫瘍摘出を行い自動はかりにて腫瘍重量を測定し、（２）式より腫瘍抑制率を求めた。
腫瘍抑制率［％］＝（（Ｃｗ−Ｔｗ）／ＣＷ）×１００ （２）
Ｃｗ：対照群の平均腫瘍重量
Ｔｗ：検体群の平均腫瘍重量
【００２８】
〔結果〕
腫瘍接種から３０日目までの腫瘍の体積（ｍｍ３）を示した。横軸に腫瘍体積を、縦軸に経過日数をとり図１に示した。図１からわかるように、腫瘍成長の抑制に有意な差はみとめられなかったが、ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に対しオキシカイン（登録商標）、チャーガおよびＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群において、腫瘍接種から２３日目より腫瘍成長の抑制が示唆でき、腫瘍接種から２９日目では２／３の大きさに抑えられた。サンプルを投与したものの腫瘍体積が小さく、腫瘍成長抑制傾向が見られた。
腫瘍接種から３０日目に摘出し重量（ｇ）を求め、図２に示した。
チャーガ投与群、オキシカイン投与群およびＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群に有意な差はみとめられなかったが、腫瘍重量の減少傾向が見られた。
腫瘍抑制率を（２）式より求めて示した。腫瘍抑制率はｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、チャーガ群が最も高く３６．０％であり、次にオキシカイン群の３２．７％、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ群の２６．７％であり、ＥＣ１２（乳酸球菌）群は０．３％であった。
【実施例２】
【００２９】
（２）マウス末梢血液中における血球数への影響
〔実験動物〕
使用したマウスは「（１）マウス腫瘍成長抑制への影響」と同じである。
実験群の分類は、蒸留水を経口投与したｃｏｎｔｒｏｌ群、蒸留水を経口投与し、ＳＣＣ７を接種したｃｏｎｔｒｏｌ群（以下「Ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群」）、オキシカインを経口投与し、ＳＣＣ７を接種したオキシカイン（登録商標）群、チャーガを経口投与し、ＳＣＣ７を接種したチャーガ群、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを経口投与し、ＳＣＣ７を接種したＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ群、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ含まないＥＣ１２を経口投与し、ＳＣＣ７を接種したＥＣ１２（乳酸球菌）群の計６群とした。
又、実験に使用したマウスは各群８匹とした。
【００３０】
〔血球数の測定〕
マウスの尾静脈から末梢血液をキャピラリーチューブにて１０μｌ採血し、日本光電株式会社製の自動血球測定器（Ｃｅｌｌｔａｃ−α ＭＥＫ−６３１８）にて血球数を経時的に測定した。
測定項目は免疫システムの主な細胞ともなり、免疫賦活に影響あると思われる白血球数・リンパ球数・顆粒球数・単球数とした。測定はＳＣＣ７接種前日、ＳＣＣ７接種７、２１、３５日目に測定した。
統計学的処理については、マウスの血球数が正規分布を示す為、多群間におけるパラメトリックな検定法であるＡＮＯＶＡ検定およびＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いて各群における血球数の有意差検定を行った。
【００３１】
〔結果〕
横軸に投与からの経過日数、縦軸には各血球数をとり、測定により得られた各血球数の経時的変化を図３〜６に示した。
図３に、白血球数の変化を示した。ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、オキシカイン（登録商標）投与群、チャーガ投与群、ＥＣ１２投与群に白血球数の有意な増加が見られた（ｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１）。
図４に、リンパ球数の変化を示した。ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、チャーガ投与群、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群、ＥＣ１２投与群にリンパ球数の有意な増加が見られた（ｐ＜０．０５）。
図５に、単球数の変化を示した。ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、オキシカイン（登録商標）投与群、チャーガ投与群、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群、ＥＣ１２投与群に単球数の有意な増加が見られた（ｐ＜０．０５）。
図６に、顆粒球数の変化を示した。ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、オキシカイン（登録商標）投与群、チャーガ投与群、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群、ＥＣ１２投与群に単球数の有意な増加は見られなかった（ｐ＜０．０５）。
図３〜６より血球数の増加が認められ、免疫増強作用が認められた。
【実施例３】
【００３２】
（３）マウス末梢血液中の抗酸化能及びフリーラジカルスカベンジング作用の測定
〔実験動物〕
使用したマウスは「（２）マウス末梢血液中における血球数への影響」と同じである。
【００３３】
〔ケミルミネッセンス法による抗酸化測定〕
２，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）の加温発生ラジカルとアルカリ条件下のルミノール発光を組み合わせた系を用い測定した。
・実験試薬は以下のものを用いた。
ＭＷ（分子量）
２，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ） ２７１．１９
Ｎａ２ＨＰＯ４ １４１．９６
ＮａＨ２ＰＯ４ １１９．９８
Ｂｏｒｉｃ Ａｃｉｄ（ホウ酸） ６１．８３
Ｌｕｍｉｎｏｌ （ルミノール） ２〜１０℃で遮光保存 １７７．１６
ＡＡＰＨおよびルミノールは、各５００ｍＬ
【００３４】
試薬の調製方法は以下の手順で行った。
１）０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液
Ｎａ２ＨＰＯ４ ７．０９８ｇを、蒸留水に溶かし、５００ｍｌにメスアップした。
２）０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４溶液
ＮａＨ２ＰＯ４ ５．９９９ｇを、蒸留水に溶かし、５００ｍｌにメスアップした。
３）０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液３０５ｍｌ ＋ ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４溶液１９５ｍｌとした。
４）ＡＡＰＨ試薬
２，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）（和光純薬社製）５．４２３８ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解させ、５００ｍｌにメスアップした。
５）０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）
ホウ酸１．５４５７５ｇを４００ｍｌの蒸留水に溶かし、１ＭのＮａＯＨでｐＨ９．３に合わせた後、５００ｍｌまでメスアップした。
６）１Ｍ ＮａＯＨ
２０ｇのＮａＯＨを、蒸留水に溶かし、５００ｍｌにメスアップした。
７）ルミノール試薬
５０．４３８ｍｇのチトクロームＣ（和光純薬）と、９．７４４ｍｇのルミノール（和光純薬）を０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）：メタノール＝１：３の割合の溶液に溶かして５００ｍｌにメスアップした。
【００３５】
測定試料は心臓採血に得られた血液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ（２〜４℃））し、上澄み（血清）を用いた。
血清をラウンドチューブに１００μｌ採り９００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液を添加混合し、１０倍希釈した。この溶液をラウンドチューブに１００μｌ採り９００μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液を添加混合し、さらに１０倍希釈し１００倍希釈した。
１００倍希釈した血清をラウンドチューブに２００μｌ採り同量のＡＡＰＨ試薬を添加混合した。
測定試料は一匹につき２本作り、その平均を用いた。
ブランク液は０．１Ｍリン酸緩衝液２００μｌ＋ＡＡＰＨ２００μｌとした。
測定は測定試料をアロカ社製ＢＬＲ−２０１ルミネッセンスリーダーに入れ、２分間３７℃で加温し、ルミノール試液を入れ、２０秒反応させた後、発光量を測定し、ｂｌａｎｋ（全発光量）よりそれぞれの試料の発行量を引き抗酸化活性度を求めた。
【００３６】
〔血清ＳＯＤ活性〕
ＳＯＤ活性度の測定については、和光純薬工業株式会社製ＳＯＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ＮＢＴ還元法による血清中のＳＯＤ活性度の測定を行った。
ここでＮＢＴ還元法とは、Ｏ−２の検出剤として、ＮＯ２−ＴＢ（ニトロブルーテトラゾリウム）を用い、Ｏ−２の生成反応（キサンチン・キサンチンオキシターゼ）とＳＯＤによる不均化反応とを共役させ、Ｏ−２による還元呈色が低下する程度を阻害率としてＳＯＤ活性度を求める方法であり、抗酸化活性を定量的に測定することができる。
具体的な測定手順としては、第一に麻酔下のマウス心臓より、テルモ社製シリンジ（針：２３Ｇ）を用いて、全血の採血を行ない血液凝固防止ためヘパリン処理（５単位／ｍｌ）した後、遠心分離（１５分、１．５×１０００ｒｐｍ）にかけ全血より血清のみを分離した。
次にサンプルとして、検体（Ｓ）、盲検（Ｂｌ）、検体盲検（Ｓ−Ｂｌ）、試薬盲検（Ｂｌ−Ｂｌ）をたて、９６穴マイクロプレートに各サンプルを１０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。
その際の分注は、検体（Ｓ）と検体盲検（Ｓ−Ｂｌ）には血清、盲検（Ｂｌ）と試薬盲検（Ｂｌ−Ｂｌ）には蒸留水とした。各サンプルの分注後、発色試薬を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、１分間の攪拌を行った。
攪拌後、検体（Ｓ）と盲検（Ｂｌ）には酵素溶液、検体盲検（Ｓ−Ｂｌ）と試薬盲検（Ｂｌ−Ｂｌ）にはブランク液を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、再び１分間の攪拌後、３７℃で２８分間インキュベートした。インキュベート後、各サンプルに反応停止液を２０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、５分間の攪拌後、東洋曹達株式社製マイクロプレートリーダーＭＰＲ Ａ４（波長：５６０ｎｍ）を用いて、各サンプルの吸光度を測定した。
測定により得られた吸光度から（３）式によりＳＯＤ活性度を求めた。
【００３７】
【００３８】
統計学的分析については、２群間におけるノンパラメトリックなＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を統計処理に用いて、各群におけるＳＯＤ活性度の有意差検定を行った。
その他、ＡＡＰＨ法、ＤＰＰＨ法、ＥＳＲ法でも抗酸化作用を検討した。
【００３９】
〔結果〕
・ ケミルミネッセンス法による抗酸化測定
各群におけるケミルミネッセンス法による抗酸化測定の発光量平均値を示した。
ケミルミネッセンス法による抗酸化測定の結果を図７に示した。
横軸に各群を、縦軸に発光量をとった。
図７から分かるようにオキシカイン投与群、チャーガ投与群およびＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群においてｐ＜０．００１でラジカル除去による有意な低下が見られた。
【実施例４】
【００４０】
（４）Ｔリンパ球への影響
〔実験動物〕
使用したマウスは「（２）マウス末梢血液中における血球数への影響」と同じである。
【００４１】
〔実験試薬〕
ウシ胎児血清：ＦＢＳ（非働化処理済み（５６℃、３０分間処理））
洗浄緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（０．１％アジカナトリウムを含むＰＢＳ（−））
染色緩衝液：０．１％アジカナトリウムと２％ＦＢＳを含むＰＢＳ（−）
リンパ球サブセット用フローサイトメトリー試薬：抗体ＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ５．５／抗体ＣＤ４−ＦＩＴＣ／抗体ＣＤ８−ＰＥ／陰性コントロール ＣＤ３−ＦＩＴＣ／ＣＤ１６−ＰＥ
【００４２】
〔Ｔリンパ球の解析〕
Ｔリンパ球サブセットの解析については、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社製のマルチカラーフローサイトメトリー（ＦＣＳ）システムを用いて、３カラーによるフローサイトメトリー解析による末梢血液中のＴリンパ球ＣＤマーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８の測定およびＮＫ−ｃｅｌｌ ＣＤマーカーＣＤ３、ＣＤ１６の測定を行った。
ここでフローサイト解析とは、細胞に蛍光標識したモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を反応させ細胞を蛍光染色した後、細胞にレーザー光を照射し、前方散乱光と９０°散乱光からコンピュータのディスプレイ上に細胞の分布（以下サイトグラムという）を表示させ、目的とする細胞の領域を指定して、その領域の細胞について解析を行う方法である。フローサイトメトリーは、細胞表面に発現されている分子に結合した抗体から発される蛍光強度を電気信号に変換することで、定量的に解析することが可能である。
具体的な測定手順としては、マウスの心臓より採血した血液をヘパリンにて抗凝固処理後、リンパ球分離、洗浄、細胞の数をカウント後、染色、し解析した。
処理はリンパ球分離法にて行った。リンパ球分離法の過程は以下の通りとした。
【００４３】
〔リンパ球分離過程〕
１）採取した血液１ｍｌをＰＢＳにて３倍に希釈し、リンパ球分離液の入った１５ｍｌのファルコン遠心チューブに１：４の割合でリンパ球分離液と混合しないようパスツールピペットを用いて静かに流し込んだ。
２）４００Ｇ（１６００ｒｐｍ）、２５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、リンパ球層を注意深くパスツールピペットにて吸引し別のファルコン遠心チューブに移した。
３）５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ（−）を５ｍｌ加え、よく混合した。
４）２００Ｇ（１３００ｒｐｍ）、１０分間遠心分離し、上清を除去した後再度ウシ胎児血清を含むＰＢＳ（−）に細胞を浮遊させ１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を２度行った。
５）上澄みを取り除き、１ｍｌの染色緩衝液を加え、再懸濁した。
６）生細胞数をカウントし、検体には９０％以上の生細胞が含まれるように、また、抗体の量の関係上染色されない細胞の出現を防ぐために１検体当たりに細胞数は１×１０６ｃｅｌｌｓ以下とした。
【００４４】
〔染色課程〕
１）ファルコンチューブに調製した細胞５０μｌを取り抗体を加え、冷暗所で３０分間反応させた。
２）洗浄緩衝液を２ｍｌ加え、緩やかに混合した。
３）２００Ｇ（９５０ｒｐｍ）、５ｍｉｎ、室温で遠心分離し上澄みを取り除いた。
４）０．５ｍｌのＰＢＳを加えよく混合し、解析するまで２〜８℃で保存した。
尚、この方法はＢＤ社のプロトコールである。
解析のスケジュールは、投与開始から７、２１、３５、４２日目に解析した。
【実施例５】
【００４５】
（５）ＮＫ細胞活性
本研究に用いたＥＣ１２とオキシカイン（登録商標）は、Ｂｉｏ Ｑｕｅｅｎ株式会社と株式会社ブロマ研究所から提供されたものである。
実験群の分類は、蒸留水を経口投与し、ＳＣＣ７を接種したｃｏｎｔｒｏｌ群（以下Ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群）、オキシカイン（登録商標）を経口投与し、ＳＣＣ７を接種したオキシカイン（登録商標）群、チャーガを経口投与し、ＳＣＣ７を接種したチャーガ群、ＥＣ１２を経口投与し、ＳＣＣ７を接種したＥＣ１２群、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを経口投与し、ＳＣＣ７を接種したＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ群の計５群とした。また、実験に使用したマウスは各群１０匹とした。
【００４６】
Ｃ３Ｈマウスを頚椎脱臼でマウスを殺し、体表面をアルコールで滅菌した。
滅菌したハサミとピンセットで表皮を切開し、脾臓を取り出し、クリーンベンチ内で滅菌した器具を用いて、滅菌した銅金属メッシュ上でヘラを用いてすり潰した。
すり潰した脾臓細胞にＰＢＳ液１０ｍｌを加えて、顕微鏡にて細胞数を測定する。次にこれを遠心分離にかけた（３分、１．５×１０００ｒｐｍ）。
細胞が下に溜まっているので、上液のＰＢＳ液を捨てて、ＲＰＭＩ１６４０の培養液を加えて、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにした。
次に、ＹＡＣ−１ １０７Ｃｅｌｌｓ／ｍｌに１００μＣｉの５１Ｃｒを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＲＰＭＩ１６４０培養液で３回洗浄後、標的細胞として使用した。ＲＰＭＩ１６４０の培養液を加えて、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌにした細胞と、ＹＡＣ−１ １０７Ｃｅｌｌｓ／ｍｌに１００μＣｉの５１Ｃｒを加えた標識細胞とを混合し、遠心分離し（３分、１．５×１０００ｒｐｍ）、インキュベータ内で４時間培養した。
培養後、９６穴平底マイクロプレートに各種細胞数（Ａ．２×１０６、Ｂ．１×１０６、Ｃ．５×１０５、Ｄ．２．５×１０５、Ｅ．１．２５×１０５）に分けて、２４時間放置した。その後、放出された５１Ｃｒをガンマーカウンターで測定した。
尚、データの統計処理については、ＡＮＯＶＡ検定及びＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。
【００４７】
〔結果〕
サイトグラム上において、リンパ球領域を決定したのち解析を行い、Ｔリンパ球中のＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞数、即ちヘルパーＴ細胞数およびＣＤ３陽性ＣＤ８陽性細胞数すなわちサプレッサーＴ細胞およびキラーＴ細胞数を求めた。そのときのサイトグラムを図８に示し、ＣＤ４およびＣＤ８の解析図（ドットプロット）をそれぞれ図９および図１０に示した。さらにＮＫ−ｃｅｌｌの活性度をＣＤ３陽性ＣＤ１６陽性細胞数にて解析した。横軸に各群を、縦軸にＣＤ４陽性細胞数の割合をとり、各群におけるＣＤ４陽性細胞の活性の比較を図１１に、各群におけるＣＤ８陽性細胞の活性の比較を図１２に、各群におけるＣＤ１６陽性細胞の活性の比較を図１３に示した。
【００４８】
フローサイトメーターにより、各群におけるＴリンパ球中のヘルパーＴ細胞数を測定したところ、図１１からもわかるように、投与２１日後にｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、ＥＣ１２、オキシカインおよびＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群のＣＤ４陽性数すなわちヘルパーＴ細胞が増加を示した。
しかし、チャーガ投与群ではヘルパーＴ細胞の減少がみられた。
フローサイトメーターにより、各群におけるＴリンパ球中のサプレッサーＴ細胞数およびキラーＴ細胞数を測定したところ、図１２からもわかるように、ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、ＥＣ１２、オキシカイン（登録商標）およびＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群のＣＤ８陽性数つまりサプレッサーＴ細胞数およびキラーＴ細胞数の増加を示した。
フローサイトメーターにより、各群におけるＴリンパ球中のＮＫ−ｃｅｌｌ数を測定したところ、図１３からもわかるように、投与４２日後においてｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、ＥＣ１２、オキシカイン（登録商標）およびＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ投与群のＣＤ１６陽性数つまりＮＫ−ｃｅｌｌ数の増加が示された。
【実施例６】
【００４９】
（６）血清中におけるＴＮＦ−α，ＩＮＦ−γ，ＩＬ−２およびＩＬ−１２の測定
１）ＴＮＦ−α測定
実験方法はＣ３Ｈ／ＨｅＪ４週令雄のマウス１群１０匹を用い、ＥＣ１２、チャーガ、オキシカイン（登録商標）、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを投与した。
投与方法は、以上の実験と同様である。
投与後４週目マウスに採血し、血清を採取した。
その血清とＰＩＥＲＣＥ ＥＮＤＯＧＥＮ社のＭｏｕｓｅ ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ＥＭＴＥＮＦＡ（ｃｏｄｅ ＲＰＮ２７１８）を用いて測定を行った。
キットを室温に平衡し，ＴＮＦ−α ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅに、希釈したＴＮＦ−α ｓｔａｎｄａｒｄおよびＳａｍｐｌｅを各ウェルに５０μｌずつ加え、その後、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅａｇｅｎｔを５０μｌ加えた。その後、室温にて２時間インキュベート後、Ａｕｔｏ ｍｉｎｉ ｗａｓｈｅｒ（バイオテック株式会社）を用いて５回洗浄した。
洗浄後、作成したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｎ−ＨＲＰ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに１００μｌづつ加え、室温にて３０分インキュベート後、５回洗浄した。
ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ加え室温暗所にて３０分インキュベートし、発色確認後、反応停止液を１００μｌ加え、ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲＭＰＲ−Ａ４（ＴＯＹＯＳＯＤＡ）を用い、４５０ｎｍの波長にて測定した。
【００５０】
２）ＩＮＦ−γの測定
ＩＮＦ−γの測定についても、ＴＮＦ−αと同様、ＥＬＩＳＡ法を用い、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社）で測定した。実験方法はＣ３Ｈ／ＨｅＪ４週令雄のマウス１群１０匹を用い、ＥＣ１２、チャーガ、オキシカイン（登録商標）、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを投与した。投与後４週目マウスに採血し、血清を採取した。その血清を−２０℃で３時間凍結し、融解させた後遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）し、上澄液を透析膜に入れポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）を用いて濃縮させ、ｓａｍｐｌｅとし、ｓａｍｐｌｅ及びｓｔａｎｄａｒｄを各ウェルに５０μｌずつ分注した後、室温（２０−２５℃）で、１２０分インキュベートした。次にＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅａｇｅｎｔを５０μｌ各ウェルへ加え、室温（２０−２５℃）で、６０分インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒにて３回洗浄したものに、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎを１００μｌずつ加え、室温で３０分インキュベートした後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒにて、３回洗浄し、ＴＭＢ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌずつ加えた。
その後室温で３０分以上（青色の発色の程度に応じて時間を決定）インキュベートした。インキュベート後、Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ加え、Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ添加後３０分以内にＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＳ−ＵＶ（大日本製薬（株））にて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した後、Ｓｔａｎｄａｒｄから得られた検量線を用いて、吸光度からＩＦＮ−γの蛋白濃度を算定した。
【００５１】
３）血清ＩＬ２、ＩＬ１２の測定
実験方法はＣ３Ｈ／ＨｅＪ４週令雄のマウス１群１０匹を用い、ＥＣ１２、チャーガ、オキシカイン（登録商標）、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを投与した。投与方法は、以上の実験と同様である。投与後４週目マウスに採血し、血清を採取した。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＩＬ−２，ＩＬ−１２， Ｍｏｕｓｅ，Ｂｉｏｔｒａｋ ＥＬＩＳＡ Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定を行った。
キットを室温に平衡し、ＩＬ−２，１２ ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅにそれぞれ、Ｐｌａｔｅ ｒｅｇｅｎｔを５０μｌ加え、希釈したＩＬ−２、ＩＬ−１２ ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｉｌｕｅｎｔおよびＳａｍｐｌｅを、各ウェルに５０μｌずつ加えた。その後、３７℃±２℃で２時間インキュベート後、Ｗａｓｈｅ ｂｕｆｆｅｒにて５回洗浄し、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを１００μｌ加え、３７℃±２℃で１時間インキュベートした。Ｗａｓｈｅ ｂｕｆｆｅｒにて５回洗浄し、Ｐｒｅ−ｍｉｘｅｄ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ加え室温暗所にて３０分インキュベーションしＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ加え、ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲを用い、波長４５０ｎｍにて測定した。
【００５２】
〔結果〕
１）ＳＣＣ７担癌マウスによるＴＮＦ−α産生能
ＴＮＦ−αはＥＬＩＳＡ法により測定した。Ｓｔａｎｄａｒｄから得られた検量線を用いて、吸光度から求めたＴＮＦ−αを示した。横軸に各群を、縦軸にＴＮＦ−αをとり図１４に示した。ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、Ｓｈａｍｃｏｎｔｒｏｌ群、オキシカイン投与群にＴＮＦ−αの有意な増加が見られた。
２）ＳＣＣ７担癌マウスによるＩＦＮ−γ産生能
ＩＦＮ−γの測定にはＥＬＩＳＡ法により求めたＩＦＮ−γを示した。また、横軸に各群を、縦軸にＩＦＮ−γをとり図１５に示した。ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、すべての投与群にＴＮＦ−γの有意な増加が見られた。
３）ＩＬ−２
横軸に各群を、縦軸にＩＬ−２をとり図１６に示した。ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、すべての投与群にＩＬ−２の有意な増加が見られた。特にＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎに活性が認められた。
４）ＩＬ−１２
横軸に各群を、縦軸にＩＬ−１２をとり図１７に示した。ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して、すべての投与群にＩＬ−１２の有意な増加が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】腫瘍接種（ＳＣＣ７）から３０日目までの腫瘍体積（ｍｍ３）の推移を示したグラフである。
【図２】腫瘍接種（ＳＣＣ７）から３０日目までの腫瘍重量（ｇ）の推移を示したグラフである。
【図３】マウスの尾静脈から採取した末梢血液中に含まれる白血球数（１０２／ｕｌ）の変化を示したグラフである。
【図４】放射線処理したマウスの尾静脈から採取した末梢血液中に含まれる白血球数（１０２／ｕｌ）の変化を示したグラフである。
【図５】マウスの尾静脈から採取した血液中の単核細胞数（１０２／ｕｌ）の推移を示したグラフである。
【図６】マウスの尾静脈から採取した血液中の顆粒球数（１０２／ｕｌ）の推移を示したグラフである。
【図７】ケミルミネッセンス法による抗酸化測定の発光量（Ｋ ｃｏｕｎｔ）の平均値を示したグラフである。
【図８】Ｔリンパ球中のヘルパーＴ細胞数、サプレッサーＴ細胞数およびキラーＴ細胞数を、サイトグラム上で示した図である。
【図９】ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）をフローサイトメトリー解析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）した図である。
【図１０】ＣＤ８陽性（ＣＤ８＋）をフローサイトメトリー解析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）した図である。
【図１１】ＣＤ４陽性細胞（ＣＤ４＋）の活性の比較を示した図である。
【図１２】ＣＤ８陽性細胞（ＣＤ８＋）の活性の比較を示した図である。
【図１３】ＣＤ１６陽性細胞（ＣＤ１６＋）の活性の比較を示した図である。
【図１４】ＥＬＩＳＡ法によってＴＮＦ−α蛋白濃度を測定した図である。
【図１５】ＥＬＩＳＡ法によってＩＦＮ−γ蛋白濃度を測定した図である。
【図１６】ＥＬＩＳＡ法によってＩＬ−２蛋白濃度を測定した図である。
【図１７】ＥＬＩＳＡ法によってＩＬ−１２蛋白濃度を測定した図である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５００５７０９３３
【氏名又は名称】馬面 賢一
【識別番号】５００５７０８５２
【氏名又は名称】具 然和
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| 【出願日】 |
平成１８年６月２０日（２００６．６．２０） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００８２０７２
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
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| 【公開番号】 |
特開２００８−１２１（Ｐ２００８−１２１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成２０年１月１０日（２００８．１．１０） |
| 【出願番号】 |
特願２００６−１９７４４６（Ｐ２００６−１９７４４６） |
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