| 【発明の名称】 |
プロトカドヘリンαを用いた精神神経疾患モデル動物およびその利用 |
| 【発明者】 |
【氏名】八木 健
【氏名】福田 絵美
【氏名】濱田 俊
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| 【要約】 |
【課題】精神神経疾患と脳神経系で発現する多様化膜蛋白、詳細にはプロトカドヘリンαとの関連性を明らかにし、精神神経疾患の治療薬や予防薬の新規スクリーニング方法を開発する。
【構成】プロトカドヘリンα遺伝子の機能が破壊された、ヒトを除く哺乳動物；ならびにそれを用いる精神神経疾患の治療物質のスクリーニング方法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトカドヘリンα遺伝子の機能が破壊された、ヒトを除く哺乳動物。
【請求項２】
マウスである請求項１記載の動物。
【請求項３】
プロトカドヘリンα遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされた請求項１または２記載の動物。
【請求項４】
精神神経疾患の治療物質をスクリーニングする方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項記載の動物に候補物質を与え、
候補物質を与えられた動物の行動と、候補物質を与えていない動物の行動とを比較する
ことを特徴とし、候補薬剤を与えられた動物における行動異常が軽減または消失した場合に該候補薬剤を精神神経疾患の治療物質と認定する、方法、
【請求項５】
該精神神経疾患が統合失調症である請求項４記載の方法。
【請求項６】
該動物がマウスである請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
該動物がプロトカドヘリンα遺伝子をノックダウンまたはノックアウトされたものである請求項４〜６記載の方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項記載の方法により得ることのできる精神神経疾患の治療物質。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な精神神経疾患モデル動物およびその使用に関する。詳細には、プロトカドヘリンα遺伝子の機能が破壊されたヒトを除く哺乳動物およびそれを用いた精神神経疾患の治療物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
統合失調症などの精神神経疾患は、脳神経系で発現する多様化膜蛋白と深く関わっていることが知られている。そして、いずれの蛋白の発現がどのような精神神経疾患に関連しているのかについて研究が進められている。しかしながら、明確なデータを得ることは困難であり、これらの蛋白と精神神経疾患との関連性は、特定の事例に限って示唆されているにすぎない。
【０００３】
脳神経系で発現する多様化膜蛋白のうち、ヒトのプロトカドヘリンαにつていては、多くのアミノ酸配列置換を伴う１塩基多型（非特許文献１参照）、ならびにハプロタイプや欠失が認められており、ヒトの精神神経疾患への関与も示唆されている。しかしながら、プロトカドヘリンαと精神神経疾患との関連性に関して、プロトカドヘリンα遺伝子の機能を破壊した動物、特にノックダウンマウスやノックアウトマウスを用いた確実な研究結果は得られていなかった。
【非特許文献１】Miki R, et al: Gene (2005) 349: 1-14
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
精神神経疾患と脳神経系で発現する多様化膜蛋白、詳細にはプロトカドヘドリンαとの関連性を明らかにし、精神神経疾患の治療薬や予防薬の新規スクリーニング方法を開発することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記事情に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、プロトカドヘドリンα遺伝子機能を破壊した動物を作製し、その行動について解析したところ、情動性、学習性、統合脳機能に関わる異常を認め、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、精神神経疾患のモデル動物が提供され、それを用いた精神神経疾患の治療物質のスクリーニングを行うことができ、それにより統合失調症などの精神神経疾患の治療物質を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
上述のごとく、本発明者らは、プロトカドヘドリンα遺伝子の機能を破壊した動物が情動性、学習性、統合脳機能に関わる異常を有することを認め、かかる動物を用いた統合失調症などの精神神経疾患の治療物質をスクリーニングする系を開発することができた。
【０００８】
したがって、本発明は下記のものを提供する：
（１）プロトカドヘリンα遺伝子の機能が破壊された、ヒトを除く哺乳動物、
（２）マウスである（１）記載の動物、
（３）プロトカドヘリンα遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされた（１）または（２）記載の動物、
（４）精神神経疾患の治療物質をスクリーニングする方法であって、
（１）〜（３）のいずれかに記載の動物に候補物質を与え、
候補物質を与えられた動物の行動と、候補物質を与えていない動物の行動とを比較する
ことを特徴とし、候補薬剤を与えられた動物における行動異常が軽減または消失した場合に該候補薬剤を精神神経疾患の治療物質と認定する、方法、
（５）該精神神経疾患が統合失調症である（４）記載の方法、
（６）該動物がマウスである（４）または（５）記載の方法、
（７）該動物がプロトカドヘリンα遺伝子をノックダウンまたはノックアウトされたものである（４）〜（６）記載の方法、ならびに
（８）（４）〜（７）のいずれかに記載の方法により得ることのできる精神神経疾患の治療物質
【０００９】
本発明は、第１の態様において、プロトカドヘリンα遺伝子の機能が破壊された、ヒトを除く哺乳動物を提供する。本発明のプロトカドヘリンα遺伝子機能が破壊された動物（以下、「本発明の動物」と称することがある）は哺乳動物であればいずれの動物であってもよく、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが例示される。好ましくは齧歯動物である。とりわけ実験データの豊富なマウスが本発明の動物として好ましい。ただし、ヒトは本発明の動物から除外される。
【００１０】
本発明の動物には、プロトカドヘリンα遺伝子ノックダウン動物、プロトカドヘリンα遺伝子ノックアウト動物、および発現産物たるプロトカドヘリンα蛋白の活性が低下または消失している動物が包含される。
【００１１】
本発明のプロトカドヘリンα遺伝子がノックダウンされた動物（以下、「本発明のノックダウン動物」と称することがある）は、プロトカドヘリンα遺伝子の機能が部分的に破壊されて、プロトカドヘリンα遺伝子の発現が正常個体と比較して減少している動物をいう。本発明の好ましいノックダウン動物は、プロトカドヘリンα遺伝子の発現が正常個体の５０％以下、さらに好ましくは２０％以下の動物である。
【００１２】
本発明のプロトカドヘリンα遺伝子がノックアウトされた動物（以下、「本発明のノックアウト動物」と称することがある）は、プロトカドヘリンα遺伝子の機能が破壊されて、プロトカドヘリンα遺伝子の発現が消失している動物をいう。
【００１３】
本発明の、発現産物たるプロトカドヘリンα蛋白の活性が正常個体と比較して低下している動物（以下、「本発明の活性低下動物」と称することがある）は、好ましくはプロトカドヘリンα蛋白の活性が正常個体の５０％以下に、さらに好ましくは２０％以下に低下している動物であり、特に好ましくは発現した蛋白からプロトカドヘリンα活性が消失している動物である。
【００１４】
本発明においてはノックアウト動物、ノックダウン動物、活性低下動物のいずれを用いても同様の結果が得られるので、いずれを用いてもよいが、好ましくはノックダウン動物またはノックアウト動物を用いる。ノックアウト動物はプロトカドヘリンα遺伝子の発現が消失しているので、より明確な実験結果を得ることができ、精神神経疾患のモデル動物として、あるいは精神神経疾患の治療薬や予防薬のスクリーニングにおいて非常に有用である。
【００１５】
本発明の動物を得るためには、プロトカドヘリンα遺伝子の機能を破壊すればよい。遺伝子機能を破壊するための様々な方法が公知である。これらの方法は、ゲノム自体を改変する方法であってもよく、転写を抑制する方法であってもよく、転写後に抑制する方法であってもよく、スプライシングを抑制する方法であってもよく、あるいは翻訳または翻訳後修飾を抑制する方法であってもよい。さらにプロトカドヘリンα蛋白のアミノ酸配列に変異をもたらして活性を低下または消失させる方法であってもよい。遺伝子機能の破壊様式（ノックアウト、ノックダウン、あるいは産物たる蛋白に変異を導入など）、動物の種類、実験目的、その他の要因に応じて、当業者は適宜、遺伝子機能破壊方法を選択して適用することができる。
【００１６】
本発明のノックアウト動物の作製方法としては相同組換え法が一般的である。一般的な相同組換え法の概略は以下のとおりである。先ず、相同組換えのためのターゲティングベクターを作製する。ターゲティングベクターは、市販プラスミドにプロトカドヘリンα遺伝子ゲノムＤＮＡフラグメント、ポジティブおよびネガティブセレクションマーカー遺伝子等を公知方法により組み込むことによって作製することができる。次に、ターゲティングベクターを全能性細胞（例えばＥＳ細胞）に導入する。ターゲティングベクターの細胞への導入は公知の方法を用いて行うことができ、エレクトロポレーション法がよく用いられる。ベクター導入後細胞を培養し、ポジティブ−ネガティブマーカー選択法、所望によりサザンブロッティング法などにより目的の相同組換えが起こっている細胞を選択する。選択された細胞を胚盤胞に導入する。次いで、胚盤胞を仮親に移植し、生まれた動物を野生型動物と交配させて第１世代（ヘテロ個体）を得て、これらをさらに交配させて第２世代（ホモ個体）を得ることができる。通常は、このようにして得られた第２世代の動物を本発明のノックアウト動物として使用する。上記操作は公知方法を用いて行うことができる。ノックアウト動物の作製効率を向上させるために、ノックアウトマウスを作製する際にテトラサイクリンやＣｒｅ−ＬｏｘＰを用いた条件つき遺伝子ターゲティングなどの手法を取り入れてもよい。本発明のノックアウト動物を作製するための他の方法としては、ＲＮＡインヒビターを用いた方法、タンパク質機能をドミナントネガティブに調節するタンパク質を発現させる方法などが挙げられる。
【００１７】
本発明のノックダウン動物もまた、公知の方法を用いて作製することができる。上記のような相同組換え法を適用してもよい。また、ＲＮＡｉ法をもちいてもよく、例えばＳｉＲＮＡをレトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで動物に導入することにより本発明のノックダウン動物を得てもよい。その他、プロトカドヘリンα遺伝子の発現を抑制するような変異（例えば定常領域を欠損した細胞外領域、定常領域のみ）を導入したトランスジェニック動物を作製することによっても本発明のノックダウン動物を得ることができる。
【００１８】
得られた本発明のノックアウト動物およびノックダウン動物は、その組織から得た試料についてサザンブロッティング等の方法を適用して、プロトカドヘリンα遺伝子の発現の抑制または消失を確認することができる。
【００１９】
本発明の活性低下動物の作製もまた、公知の方法により行うことができる。例えば、突然変異を誘発させた動物の選別などの方法により本発明の活性低下動物を得ることができる。
【００２０】
本発明の動物は、種々の精神神経疾患の症状あるいはそれに類似した挙動および症状を示す。本発明の動物は、特に、統合失調症において見られる症状またはそれらに類似した症状を示す。すなわち、情動性、学習性、統合脳機能に関わる異常などが見られる。それゆえ本発明の動物は種々の精神神経疾患、特に統合失調症のモデル動物として有用である。本発明の動物はヒトの病態モデルとして用いることができる。本発明の動物の行動は一定の試験条件下で正常個体と異なるものである。精神神経疾患、特に統合失調症および類似疾患を有する動物の行動を試験する方法は様々であるが、例えば、プレパルスインヒビション試験（Prepulse Inhibition (PPI)試験）、恐怖条件付け学習試験などの公知の試験において行動異常を確認することができる。
【００２１】
本発明の動物が種々の精神神経疾患の症状あるいはそれに類似した挙動および症状を示すことから、これらの疾患の治療物質のスクリーニングにも使用することができる。したがって、本発明は、第２の態様において、精神神経疾患の治療物質をスクリーニングする方法を提供する。典型的な本発明のスクリーニング方法は、本発明の動物に候補物質を与え、次いで、候補物質を与えられた動物の行動と、候補物質を与えていない動物の行動とを比較することを特徴とする。具体的には、情動性、学習性、統合脳機能に関わる異常などの改善または正常化が起こるか否かを調べる。そして、候補薬剤を与えられた動物における行動異常が軽減または消失した場合に該候補物質を精神神経疾患の治療物質と認定するものである。
【００２２】
上記スクリーニング方法に使用する動物は本発明の動物であればいずれのものであってもよく、ノックダウン動物またはノックアウト動物が好ましい。実験結果が明確であることから、本発明のノックアウト動物を用いることが好ましい。また、過去の実験データが十分に蓄積されていること等を考慮すると、マウスを用いることが好ましい。
【００２３】
上記スクリーニング方法における動物の行動の解析は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、プレパルスインヒビション試験（Prepulse Inhibition (PPI) Test）、恐怖条件付け学習試験などを用いて行うことができる。
【００２４】
本発明は、さらなる態様において、上記スクリーニングにより得ることのできる精神神経疾患の治療物質も提供する。本発明のスクリーニング方法により精神神経疾患の治療物質と認定された物質は、とりわけ統合失調症の治療に有効である。また、本発明のスクリーニング方法により精神神経疾患の治療物質と認定された物質は、精神神経疾患の治療効果のみならず予防効果も期待される。上記スクリーニングにより得ることのできる精神神経疾患の治療物質はヒトにおいても効果を示し得る。
【００２５】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２６】
本発明のノックダウン動物およびノックアウト動物の作製
マウスＥＳ細胞株（ＴＴ２株）を用いて、相同遺伝子組み換え法によりプロトカドヘリンα遺伝子クラスター中の共通領域エクソンに、ｌｏｘＰ配列をネオマイシン耐性遺伝子カセットとともに導入した（図１の上パネル参照）。導入に用いたベクターの構造を図１の上パネルのTargeting vectorとして示す。ネオマイシン耐性を選択マーカーとして相同組み換えＥＳ細胞株を選択し、これを正常マウス胚に移植し、キメラマウスを作製した。得られたキメラマウスを交配することにより遺伝子変換マウスを作製した。この遺伝子変換マウスにおいて、プロトカドヘリンα遺伝子の発現が正常個体の約２０％にまで減少しており、このマウス系統を遺伝子ノックダウンマウスとして系統化した。得られたノックダウンマウスのゲノム構造を図１の下パネル（ΔＢ）に示す。また、このノックダウンマウスと別の遺伝子変換マウス（Ｇ１マウス）（そのゲノム構造を図１の下パネル（Ｇ１）に示す）を用い、Ｃｒｅ組換え酵素を用いて、プロトカドヘリンα遺伝子クラスターの共通領域をすべて欠失させた遺伝子を欠失したマウスを作製し、遺伝子ノックアウトマウスとして系統化した。得られたノックアウトマウスのゲノム構造を図１の下パネル（ΔＣＰ／ΔＣＰ）に示す。これらのノックダウンマウスおよびノックアウトマウスを用いて、以下の実施例に示すような行動異常解析、組織化学的解析等を行ってヒト精神神経疾患に関連性のある異常を確認した。
なお、この実験に使用したＧ１マウスは以下のようにして作製した。マウスＥＳ細胞（ＴＴ２株）を用いて、相同遺伝子組み換え法によりプロトカドヘリンα遺伝子クラスターの共通領域エクソン前の共通第１イントロンに、ｌｏｘＰ配列をネオマイシン耐性遺伝子カセットとともに導入した。ネオマイシン耐性を選択マーカーとして相同組み換えＥＳ細胞株を選択し、正常マウス胚に移植してキメラマウスを得、交配により遺伝子変換マウス（Ｇ１マウス）を得た。
【実施例２】
【００２７】
本発明のノックダウン動物のプロトカドヘリンα蛋白の発現解析
実施例１で得られたノックダウンマウスのプロトカドヘリンα蛋白の発現を、ウエスタンブロット解析および免疫沈降法によって調べた。実験方法は下記のとおりであった。
【００２８】
ウエスタンブロット解析
タンパク質は各遺伝子型の１ヶ月令マウスの小脳または海馬から調整した。実体顕微鏡下で脳から小脳および海馬を分離後、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で血液を除去し、直ちに液体窒素に入れ、急速凍結した。凍結した小脳または海馬の入っているチューブに、試料重量の１０倍量のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用サンプルバッファーを加え均質化後、２０４００×ｇ、２０分間室温で遠心分離して上清を回収した。蛋白質濃度を定量（ＢＣＡプロテインアッセイ、ＰＩＥＲＣＥ社）後、２−メルカトルエタノール（最終濃度２％）とＢＰＢ（最終濃度０．１％）を加え、９８℃５分間の熱処理を行い、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料とした。３０μｇのタンパク質可溶化液を７．５％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに展開し、ニトルセルロース膜（Schleicher&Schuell）に電気的に転写した。その後、ブロッキング液（１０％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳに０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む））で２時間室温ないし一晩４℃でブロッキングした。ブロッキングしたニトロセルロース膜をＰＢＳ−Ｔで５分３回洗浄した後、ＣＮＲの定常領域を認識する抗体（ＣＮＲ１ＣＰ）を用いて１時間室温で抗体反応した。ＰＢＳ−Ｔで５分３回の洗浄後、二次抗体（各一次抗体に対するＨＲＰ標識抗体）を３０分間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔで５分３回の洗浄後、ＥＣＬ化学発光法（Amersham）を用いて免疫陽性バンドを検出した。
【００２９】
免疫沈降法
免疫沈降用のサンプルは各遺伝子型の１０日令マウスの脳から調整した。脳摘出後、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で血液を除去し、直ちに液体窒素により凍結した。脳重量の１０倍量のＲＩＰＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ Ｎａｃｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００，１％ ＤＯＣ，０．１％ ＳＤＳ）にタンパク分解阻害剤（０．０３％ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，０．１％ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，０．５％ ＰＭＳＦ）を加えた液で懸濁し、ローテーターで１０分間４℃で撹拌した。この懸濁液を９１００×ｇ、２０分間４℃で遠心分離し上清を回収した。非特異的な免疫沈降物を除くため、ＰＢＳで平衡化したプロテインＧセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を各チューブにつき２０μｌ加え、ローテーターで３０分間４℃で撹拌した後、８００×ｇ、１分間４℃で遠心分離し上清を回収した。この懸濁液にＣＮＲのすべてのスプライシングバリアントを認識する抗体ＣＮＲ−１Ｎを加え、ローテーターで１時間４℃で撹拌した後、プロテインＧを各チューブにつき２０μｌ加えさらに２時間４℃で撹拌した後８００×ｇ、１分間４℃で遠心分離し上清を除いた。氷冷ＲＩＰＡで５分間３回洗浄後、３０μｌのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用サンプルバッファーを加え９８℃５分間熱処理し、これを免疫沈降法サンプルとした。上記の方法と同様、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開後、ニトルセルロース膜に電気的に転写した。ＣＮＲ−Ｂ型タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体（１Ｆ４）を使用し、ＣＮＲ−Ｂ型タンパク質の有無を検討した。
【００３０】
図２（ａ）に示すように、ノックダウンマウスはプロトカドヘリン蛋白（１１６ｋＤ）が正常個体の約２０％にまで減少していることがわかった。さらに図２（ｂ）に示すように、ノックダウンマウスでは１１６ｋＤのスポットが確認されなかった。実施例１で得られたノックアウトマウスについてもノックダウンマウスの場合と同様にしてプロトカドヘリンα蛋白発現を調べたが、発現は検知されなかった。
【実施例３】
【００３１】
本発明のノックダウン動物およびノックアウト動物のＰＰＩ試験における挙動
マウスをプラスチックの円柱の実験箱に入れ、５分後に実験を開始した。驚愕刺激（startle stimulus）はすべてのテストにおいて、４０ミリ秒にした。バックグラウンドとして、各チャンバーには７０ｄＢのノイズを使用した。驚愕反応（startle response）の振幅は、プレパルス刺激が開始してから１６０ミリ秒間記録され、その間最も振幅の大きい値をピーク驚愕反応値とした。驚愕刺激音は１１０ｄＢまたは１２０ｄＢに設定した。プレパルス音は７４、７８、８２ｄＢで、驚愕刺激音の１００ミリ秒前に表示された。１試行中、驚愕刺激音とプレパルス音の６つの組み合わせ（７４−１１０、７８−１１０、８２−１１０、７４−１２０、７８−１２０、８２−１２０ｄＢ）は６回繰り返され、平均１５秒の間隔を空け、ランダムな順番に表示された。
【００３２】
プロトカドヘリンαノックダウンマウスの結果及びプロトカドヘリンαノックアウトマウスの結果を、それぞれ図３および図４に示す。プロトカドヘリンαノックダウンマウスでは７８−１１０、８２−１１０、７４−１２０ｄＢにおいて、またプロトカドヘリンαノックアウトマウスでは８２−１１０、７４−１２０、７８−１２０、８２−１２０ｄＢにおいて驚愕反応抑制率（prepulse inhibition）が野生型に比べ有意に減少していることが認められた。
【実施例４】
【００３３】
本発明のノックダウン動物およびノックアウト動物の恐怖条件付け学習課題における挙動
この実験では２つの実験箱を準備した。実験箱１は１辺が１０．５ｃｍの透明のアクリルでできた立方体で、底面には直径２ｍｍのステンレス製グリッドが５ｍｍ間隔で配置され、被検体に電気ショックを与えることができた。また実験箱２（altered context用）は半透明のアクリルでできた１辺が１０．５ｃｍの立方体で、底にはチップを敷き詰めた。
【００３４】
１日目、トレーニングを行った。被検体を実験箱１に入れ、２分間自由に探索させた。２分後７０ｄＢの音を３０秒間ならし、最後の２秒間で０．３５ｍＡのフットショックを与えた。この音と電気ショックの組み合わせを２分の間隔で２回被検体に与えた。トレーニングから２４時間後、contextualテストを行った。被検体をトレーニングと同じ実験箱１に入れ、体を硬直させる、フリージング（freezing）の割合を５分間測定した。またcontextualテストの１時間後、cuedテストを行った。cuedテストでは被検体を実験箱２に入れ、３分間後にトレーニングのときにならした７０ｄＢの音を聞かせたときのフリージングの割合を画像処理により測定した。
【００３５】
プロトカドヘリンαノックダウンマウスの結果及びプロトカドヘリンαノックアウトマウスの結果を、それぞれ図５および図６に示す。２４時間後のcontextualテストではプロトカドヘリンαノックダウンマウス及びプロトカドヘリンαノックアウトマウスでフリージングの割合が野生型に比べて有意に亢進していた（ノックダウンマウスのcontextualテストにてｐ＜０．０５）。トレーニングでは各遺伝子間で有意差は認められなかった。cuedテストでは音を聞かせる前後でプロトカドヘリンαノックダウンマウスでは各遺伝子間でフリージングに有意な差は見られなかった。一方、プロトカドヘリンαノックアウトマウスではcuedテストにおいて音を聞かせたときのフリージングが有意に亢進していた（ｐ＜０．０１）。これらの結果は実験箱１および２において同傾向であった。
【００３６】
異常の実施例で示したように、本発明の動物は、精神神経疾患の症状あるいはそれに類似した挙動および症状（情動性、学習性、統合脳機能に関わる異常など）を示し、
【実施例５】
【００３７】
本発明のノックダウン動物における抗精神薬（ハロペリドール）の効果
本発明の動物を用いた精神神経疾患の治療物質のスクリーニング系の有効性を確認するために、公知の抗精神薬を用いてモデル試験系を構築した。具体的には試験開始３０分前にハロペリドールを動物に腹腔内投与し、実施例２と同じ手順でＰＰＩ試験を行った。
【００３８】
図７に結果を示す。ハロペリドール投与により、本発明のノックダウンマウスの反応が野生型マウスの反応に近づくことがわかった。ハロペリドール０．０５ｍｇ／ｋｇ投与群よりも０．１ｍｇ／ｋｇ投与群において、野生型マウスの反応に近づく傾向が見られた。これらの結果から、精神神経疾患の治療物質のスクリーニングに本発明の動物を使用できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、精神神経疾患の研究分野、ならびに精神神経疾患の治療薬および予防薬の開発の分野等において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１の上パネルは、相同遺伝子組み換え法によりプロトカドヘリンα遺伝子クラスター中の共通領域エクソンに、ｌｏｘＰ配列をネオマイシン耐性遺伝子カセットとともに導入したことを模式的に示す。図１の下パネルは、野生型マウスのゲノム構造（wild-type）、およびＧ１マウスの遺伝子変換されたゲノム構造（Ｇ１）、本発明のノックダウンマウスの遺伝子変換されたゲノム構造（ΔＢ）、および本発明のノックアウトマウスの遺伝子変換されたゲノム構造（ΔＣＰ／ΔＣＰ）を示す。
【図２】図２は、本発明のノックダウンマウスのプロトカドヘリンα蛋白の発現を解析した結果である。（ａ）はウエスタンブロット解析法による解析結果、（ｂ）は免疫沈降法による解析結果を示す。ｗｔは野生型マウス、＋／−はヘテロ型マウス、−／−はホモ型マウスを示す。
【図３】図３は、本発明のノックダウンマウスのＰＰＩ試験における異常を示すグラフである。パネルＡはパルス音レベルに対する驚愕反応の振幅、パネルＢはプレパルス音レベルに対するプレパルスインヒビション（％）を示す。
【図４】図３は、本発明のノックアウトマウスのＰＰＩ試験における異常を示すグラフである。パネルＡはパルス音レベルに対する驚愕反応の振幅、パネルＢはパルス音レベルに対するプレパルスインヒビション（％）を示す。
【図５】本発明のノックダウンマウスの恐怖条件付け学習課題における挙動を示す図である。左パネルはcontextual testの結果、右パネルはcued testの結果である。
【図６】本発明のノックアウトマウスの恐怖条件付け学習課題における挙動を示す図である。左パネルはcontextual testの結果、右パネルはcued testの結果である。
【図７】本発明のノックダウンマウスに対するハロペリドールの効果をＰＰＩ試験にて調べた結果を示す図である。パネルＡは驚愕刺激音１１０ｄＢ、パネルＢは驚愕刺激音１２０ｄＢにおけるハロペリドール投与量と驚愕反応の振幅との関係を示す。パネルＣはハロペリドール投与量とプレパルス音レベルに対するプレパルスインヒビション（％）を示す。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５０４１７６９１１
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
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| 【出願日】 |
平成１８年７月１８日（２００６．７．１８） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００８１４２２
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 光雄
【識別番号】１００１１６３１１
【弁理士】
【氏名又は名称】元山 忠行
【識別番号】１００１２２３０１
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
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| 【公開番号】 |
特開２００８−２２７１４（Ｐ２００８−２２７１４Ａ） |
| 【公開日】 |
平成２０年２月７日（２００８．２．７） |
| 【出願番号】 |
特願２００６−１９５４０１（Ｐ２００６−１９５４０１） |
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