| 【発明の名称】 |
蛍光タンパク質の園芸植物への応用 |
| 【発明者】 |
【氏名】竹中 洋美
【氏名】武藤 周
【氏名】和賀 巌
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| 【要約】 |
【課題】非植物由来の蛍光タンパク質の遺伝子を導入し、植物体の葉や花弁において、かかる蛍光タンパク質を、活性型成熟タンパク質として、組み換え発現させ、蛍光は発する形質転換植物体を創製する方法、ならびに、該方法で作製される蛍光を発する形質転換園芸植物の提供。
【構成】Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ、そのＨ５２Ｆ改変体タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆの完全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを、Ｔ−ＤＮＡ型発現ベクター系に挿入し、植物体の染色体ＤＮＡに導入することで創製される形質転換植物として、これら蛍光タンパク質に起因する蛍光を示すとともに、それ以外の表現形質は、当該植物の野生型植物体と実質的な差異を示さないものを得ることが可能である。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光を発する形質転換植物を創製することを目的とする、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用であって、
前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、
下記のアミノ酸配列（配列番号：１）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SHCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の野生型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ、または、
下記のアミノ酸配列（配列番号：３）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SFCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆであり、
目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、野生型植物は、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能な植物であり、
目的とする蛍光を発する形質転換植物の創製は、
該Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターのクローニング・サイトに挿入する工程；
得られるＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを宿主アグロバクテリウム属細菌に導入し、該アグロバクテリウム属細菌を形質転換する工程；
得られるアグロバクテリウム属細菌の形質転換株を、前記野生型植物に感染させ、前記Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター中に含まれる、Ｔ−ＤＮＡ領域を、当該野生型植物の染色体ＤＮＡ中に組み換え導入し、形質転換植物を得る工程；
得られた形質転換植物の植物個体を自家交配させて、植物個体それぞれのＴ１種子を収穫する工程；
得られたＴ１種子を種蒔きし、生育した各植物体において、前記植物体の葉の表面において、当該蛍光タンパク質の組み換え発現に起因する蛍光を発する表現形質が付与された、表現形質の示す転換植物個体を選別する工程、
を含む
ことを特徴とする、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用。
【請求項２】
前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、
下記のアミノ酸配列（配列番号：１）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SHCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の野生型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰであり、
該Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片は、前記完全長アミノ酸配列をコードするＯｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅの塩基配列として、
下記の塩基配列（配列番号：２）：
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG 48
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC 96
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC 144
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC 192
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT 240
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG 288
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC 336
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC 384
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC 432
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC 480
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT 528
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA 576
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC 624
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG 660
を含むものである
ことを特徴とする、請求項１に記載のＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用。
【請求項３】
前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、
下記のアミノ酸配列（配列番号：３）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SFCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆであり、
該Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片は、前記完全長アミノ酸配列をコードするＯｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅの塩基配列として、
下記の塩基配列（配列番号：４）：
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG 48
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC 96
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC 144
CTG CTG TCC TTC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC 192
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT 240
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG 288
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC 336
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC 384
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC 432
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC 480
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT 528
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA 576
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC 624
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG 660
を含むものである
ことを特徴とする、請求項１に記載のＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用。
【請求項４】
目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科に属する植物のいずれかを選択する
ことを特徴とする、請求項１に記載のＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用。
【請求項５】
目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、
バラ、カーネーション、キク、ガーベラ、トルコキキョウ、ペチュニア、トレニア、ニーレンベルギア、バーベナ、カリブラコア、シクラメン、サボテン、ラン
のいずれかを選択する
ことを特徴とする、請求項１に記載のＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用。
【請求項６】
前記得られるＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを宿主アグロバクテリウム属細菌に導入し、該アグロバクテリウム属細菌を形質転換する工程において利用する、該宿主アグロバクテリウム属細菌として、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を選択する
ことを特徴とする、請求項１に記載のＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用。
【請求項７】
該宿主アグロバクテリウム属細菌として、Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｌｌ ＧＶ３１０１株を選択する
ことを特徴とする、請求項６に記載のＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用。
【請求項８】
前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターのクローニング・サイトに挿入する工程において使用する、該Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターとして、大腸菌・アグロバクテリウム系バイナリー・ベクターのｐＢｉｇ２１１３ＳＦを選択する
ことを特徴とする、請求項１に記載のＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用。
【請求項９】
遺伝子組み換えにより、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質を組み換え発現し、その細胞内で産生される当該蛍光タンパク質を利用して、蛍光を発する形質転換植物を創製する方法であって、
前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、
下記のアミノ酸配列（配列番号：１）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SHCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の野生型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ、または、
下記のアミノ酸配列（配列番号：３）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SFCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆであり、
目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、野生型植物は、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能な植物であり、
目的とする蛍光を発する形質転換植物の創製は、
該Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターのクローニング・サイトに挿入する工程；
得られるＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを宿主アグロバクテリウム属細菌に導入し、該アグロバクテリウム属細菌を形質転換する工程；
得られるアグロバクテリウム属細菌の形質転換株を、前記野生型植物に感染させ、前記Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター中に含まれる、Ｔ−ＤＮＡ領域を、当該野生型植物の染色体ＤＮＡ中に組み換え導入し、形質転換植物を得る工程；
得られた形質転換植物の植物個体を自家交配させて、植物個体それぞれのＴ１種子を収穫する工程；
得られたＴ１種子を種蒔きし、生育した各植物体において、前記植物体の葉の表面において、当該蛍光タンパク質の組み換え発現に起因する蛍光を発する表現形質が付与された、表現形質の示す転換植物個体を選別する工程、
を含む
ことを特徴とする、蛍光を発する形質転換植物を創製する方法。
【請求項１０】
目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能な園芸植物を選択する
ことを特徴とする、請求項９に記載の蛍光を発する形質転換植物を創製する方法。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋動物プランクトン由来の蛍光タンパク質を組み換え発現し、植物成体の各組織において、当該蛍光タンパク質に起因する蛍光を発する園芸植物の創製方法と、該方法で作製される園芸植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
外来遺伝子を導入し、形質転換した植物を創製する方法の一つとして、対象植物が病原菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ：癌腫菌）による感染を受ける場合、該アグロバクテリウム由来のプラスミドを利用して、外来遺伝子を導入する手法が広く知られている。この遺伝子組み換えに利用可能なアグロバクテリウム由来のプラスミドとしては、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＴｉ−プラスミド（Ｔｕｍｏｒｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ）、あるいはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）由来のＲｉ−プラスミドが広く研究されている。これらアグロバクテリウム由来のプラスミド；Ｔｉ−プラスミド、Ｒｉ−プラスミド中には、Ｔ−ＤＮＡと称される領域が存在しており、このＴ−ＤＮＡ領域が植物の染色体へ組み込まれる。また、該Ｔ−ＤＮＡ領域の植物染色体へ組込みに関与する遺伝子群が、Ｔ−ＤＮＡ領域に近接するＶｉｒ領域に存在している。Ｖｉｒ領域には、ＶｉｒＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇの遺伝子が存在しており、その産物がＴ−ＤＮＡ領域の植物染色体への導入を促進すると考えられている。
【０００３】
Ｔ−ＤＮＡ領域は、約２０ｋｂのサイズであり、その領域の構造は、種の間で相違はあるが、このＴ−ＤＮＡ領域の両端の２５塩基対の配列は類似しており、Ｔ−ＤＮＡの染色体ＤＮＡへの組込みに不可欠である。このＴ−ＤＮＡ領域両端の２５塩基対の配列（ボーダー塩基配列）に挟まれる領域に、目的の遺伝子を挿入した上で、この改変Ｔｉ−プラスミドをアグロバクテリウムに導入して、形質転換菌株を作製する。この形質転換菌株を対象の植物に感染させると、目的遺伝子が挿入されているＴ−ＤＮＡ領域が、高い確率で対象植物の染色体ＤＮＡへ導入される。
【０００４】
アグロバクテリウム形質転換菌株の感染を介する、Ｔｉ−プラスミド系を利用して、バチラス・チュウリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来の殺虫性タンパク質（ＢＴ−毒素）の遺伝子を、タバコ細胞の染色体ＤＮＡに導入し、ＢＴ−毒素を組み換え発現する形質転換植物が作製されている。さらには、Ｔｉ−プラスミド系を利用して、ホタル由来の発光タンパク質（ルシフェラーゼ）の遺伝子を、タバコ細胞の染色体ＤＮＡに導入し、活性なルシフェラーゼを発現する形質転換植物が作製されている。
【０００５】
アグロバクテリウム形質転換菌株の感染を介する、Ｔｉ−プラスミド系を利用した、対象植物の染色体ＤＮＡへのＴ−ＤＮＡの導入は、通常、一つの植物個体当たり、１〜２コピー程度の頻度であることが報告されている（非特許文献１を参照）。また、染色体ＤＮＡへのＴ−ＤＮＡの導入は、Ｔ−ＤＮＡ領域の両端の２５塩基対の配列を利用して、相同置換型のＤＮＡ挿入機構に因っている。従って、対象植物の染色体ＤＮＡ中に存在する、前記の相同置換型のＤＮＡ挿入が可能な塩基配列を有する多数の部位に対して、無作為的にＴ−ＤＮＡの断片が挿入可能である。その際、Ｔ−ＤＮＡの導入の頻度が、通常、一つの植物個体当たり、１〜２コピー程度の頻度であるという事実は、一つの植物個体当たり、多数の挿入可能部位中の、一部位、あるいは、多くても二部位にしか、Ｔ−ＤＮＡの挿入が起こらないことを意味している。
【０００６】
このＴ−ＤＮＡの導入の頻度が、通常、一つの植物個体当たり、１〜２コピー程度の頻度であるという特長を利用して、Ｆｏｘ−ｈｕｎｔｉｎｇシステム（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｈｕｎｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）が開発されている（特許文献１、非特許文献２を参照）。Ｆｏｘ−ｈｕｎｔｉｎｇシステムで利用する組み換え発現ベクター系では、
最終的に、植物の染色体ＤＮＡ中に導入される、Ｔ−ＤＮＡ領域には、
挿入される遺伝子の発現を調節する配列として、
対象植物中において、発現を誘起するプロモータ配列と、転写を終了させるターミネーター配列とを組み合わせた「カセット」、ならびに、
前記プロモータ配列の下流側、ターミネーター配列の上流側に、導入すべき遺伝子に由来する完全長ｃＤＮＡを挿入するための、クローニング・サイトを設けている。このようなＴ−ＤＮＡ領域と、Ｔｉ−プラスミド由来の複製開始点（ＯＲＩ）を具え、加えて、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子、さらには、大腸菌のプラスミド由来の複製開始点（ＯＲＩ）を組み込んだ、大腸菌・アグロバクテリウム系バイナリー・ベクター、例えば、ｐＴＡＳ，ｐＢｉｇ由来のベクターを利用している。前記のバイナリー・ベクター中のクローニング・サイトを利用して、導入すべき遺伝子に由来する完全長ｃＤＮＡを挿入して、形質転換用のベクターを構築し、Ｔｉ−プラスミドを保持するアグロバクテリウムに導入し、アグロバクテリウム形質転換菌株を作製する。このアグロバクテリウム形質転換菌株を、例えば、フローラル・ディッピング法を適用して、対象植物体に感染させ、該形質転換菌株が保持するバイナリー・ベクター中のＴ−ＤＮＡ領域を対象植物体の染色体ＤＮＡに導入する。このディッピング処理を施した、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫する。対象植物体の染色体ＤＮＡ中に、該Ｔ−ＤＮＡは１〜２コピー程度の頻度でしか挿入されていないため、減数分裂によって、２ｎの相同染色体（ａ*・ａ型）から、各ｎの染色体を有する花粉、胚珠細胞が生成した際、該Ｔ−ＤＮＡの導入がなされている花粉、胚珠細胞（ａ*型）と、該Ｔ−ＤＮＡの導入がなされていない花粉、胚珠細胞（ａ型）との比率は、略等しくなっている。従って、Ｔ１種子中には、メンデルの遺伝の法則によって、染色体ＤＮＡ中に導入されている該Ｔ−ＤＮＡを保持しているもの（ａ*・ａ型またはａ*・ａ*型）と、保持していないもの（ａ・ａ型）が混在している。実際に、Ｔ−ＤＮＡ領域が、染色体ＤＮＡに保持されているか、否かは、収穫されたＴ１種子を、例えば、薬剤を添加している選別用培地上などの上で発芽させ、該Ｔ−ＤＮＡ領域中に予め付与している、薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現の有無による、一次スクリーニングを行い、Ｔ−ＤＮＡ領域が導入されている形質転換植物を選別する。
【０００７】
さらに、一次スクリーニングで選別された発芽体を生長させ、該Ｔ−ＤＮＡ領域に挿入されている遺伝子の発現に伴って、野生型の植物体と比較して、表現型が相違する形質転換植物を選抜する表現型スクリーニングを行う。この表現型スクリーニングにおいて選別された形質転換植物について、実際に、その染色体ＤＮＡ中に、導入すべき遺伝子に由来する完全長ｃＤＮＡが挿入されたＴ−ＤＮＡ領域が存在していることを、ＰＣＲ法を利用して、該Ｔ−ＤＮＡ領域由来のＰＣＲ産物を作製することで検定する。また、検定がなされた、表現型スクリーニングにおいて選別された形質転換植物について、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ２種子を収穫する。
【０００８】
上記のＦｏｘ−ｈｕｎｔｉｎｇシステムで利用する、Ｔ−ＤＮＡ組換え発現ベクター系を用いた形質転換植物の作製手段は、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能な各種の植物に適用可能である。適用可能な植物として、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科に属する植物、その代表の一例として、下記の植物が挙げられている。
アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）
ナス科：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）
イネ科：トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）
マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）
【特許文献１】国際公開第０３／０１８８０８号パンフレット
【非特許文献１】Ａｚｐｉｒｏｚ−Ｌｅｅｈａｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １３（４）， ｐ．１５２−６ （１９９７）
【非特許文献２】Ｓｅｋｉ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２９６，Ｎｏ．５５６５， ｐ．１４１-１４５ （２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
遺伝子工学の組み換え技術を利用して、園芸植物ペチュニアの花弁の色を変えたことが報告されている。これは、色素の産生に関与する酵素タンパク質を欠損しているため、淡いピンクの花弁を持つペチュニア品種に対して、トウモロコシ由来の酵素タンパク質の遺伝子を導入して、組み換え発現させ、色素の産生能を付与することで、鮮やかな赤色の花弁を有する品種を作り出したものである。また、上述のホタル由来の発光タンパク質（ルシフェラーゼ）の遺伝子を、Ｔｉ−プラスミド系を利用して、タバコ細胞の染色体ＤＮＡに導入し、形質転換を行い、植物体を再生させることにより、活性なルシフェラーゼを発現する形質転換植物が作製されている。この形質転換タバコ植物体に、基質のルシフェリンを溶解した溶液を、その根から吸収させると、該植物体の根、茎、葉の各組織細胞に供給される基質ルシフェリンに、組換え発現されたルシフェラーゼが作用する結果、化学発光により、光を発する。その発光は、ホタルの発光と同様の色調を示すことから、ホタル草と称されている。
【００１０】
上述するように、園芸植物が本来産生していない色素を産生させる、あるいは、植物が本来具えていない発光能を付与する試みは、遺伝子工学の組み換え技術を利用した事例は報告されている。これ以外に観賞を目的とする園芸植物に、視覚的に新たな特長を付与するものとして、蛍光性を付与することが挙げられる。
【００１１】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、非植物由来の蛍光タンパク質の遺伝子を導入し、植物体の葉や花弁において、かかる蛍光タンパク質を、活性型成熟タンパク質として、組み換え発現させ、蛍光は発する形質転換植物体を創製する方法、ならびに、該方法で作製される蛍光を発する形質転換園芸植物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、園芸植物、特に、葉の色が緑色を示す植物を対象として、その葉の表皮細胞において、非植物由来の蛍光タンパク質を組み換え発現させ、該蛍光タンパク質が発する蛍光を利用して、蛍光を発する形質転換園芸植物を創製することを目標とした。その際、園芸植物において、その葉の表皮が緑色を示す要因は、表皮細胞中にクロロプラスト（葉緑体）が存在していることに起因することに着目した。すなわち、クロロプラスト（葉緑体）中に存在するチラコイド内には、黄色のカロチノイドに加えて、多量のクロロフィル（葉緑素）が存在しており、このクロロフィル（葉緑素）に起因して、緑色を呈していることに着目した。葉の色が緑色を示す園芸植物においては、クロロフィルａおよびクロロフィルｂが主成分となっている。このクロロフィルａ、クロロフィルｂは、赤色部と青紫色部に吸収極大を有しており、この二つの吸収帯に挟まれた、波長６００ｎｍ〜４９０ｎｍの範囲の光を吸収しない結果、その葉は、緑色に見える点に着目した。
【００１３】
少なくとも、緑色の葉の表皮細胞において、非植物由来の蛍光タンパク質を組み換え発現させ、該蛍光タンパク質が発する蛍光を利用する場合、かかる蛍光タンパク質が発する蛍光スペクトルのピーク波長λem.ならびに、その蛍光を引き起こす励起光の波長分布（励起スペクトル）のピーク波長λex.は、前記の波長領域６００ｎｍ〜４９０ｎｍの範囲に存在する必要があることを見出した。すなわち、対象の蛍光タンパク質の示す励起スペクトルのピーク波長λex.が、クロロフィルａ、クロロフィルｂの青紫色部領域の吸収帯と重なると、緑色の葉の表面から励起光を照射しても、多量に存在するクロロフィルａ、クロロフィルｂにより吸収される結果、対象の蛍光タンパク質に到達する比率は低くなる。
【００１４】
同様に、対象の蛍光タンパク質の示す蛍光スペクトルのピーク波長λem.が、クロロフィルａ、クロロフィルｂの赤色部領域の吸収帯中心と重なると、発した蛍光は、多量に存在するクロロフィルａ、クロロフィルｂにより吸収される結果、緑色の葉の表面から放出される蛍光強度は低減される。
【００１５】
特には、緑色の葉の表皮細胞において、非植物由来の蛍光タンパク質を組み換え発現させ、該蛍光タンパク質が発する蛍光を利用する場合、かかる蛍光タンパク質が発する蛍光スペクトルのピーク波長λem.は、５１０ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲に位置し、また、その蛍光を引き起こす励起光の波長分布（励起スペクトル）のピーク波長λex.は、４９０ｎｍより長波長側、特には、５００ｎｍより長波長側に位置することが望ましいことを見出した。本発明者らは、前記要件を満足する非植物由来の蛍光タンパク質として、既に特許文献（国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレット、または米国特許出願公開２００５／０２２１３３８号明細書）に開示している、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉに由来するＧＦＰ様の蛍光タンパク質（ＣｐＹＧＦＰ）が好適に利用できることを見出した。加えて、前記蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰは、植物の葉表皮細胞中で組み換え発現可能であり、ペプチド鎖へ翻訳された後、実際に、植物細胞内で、「適正なタンパク質フォールディング」と「蛍光団の構成」がなされることを確認した。具体的には、国際公開第０３／０１８８０８号パンフレットに開示される手法を応用して、前記蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを、Ｔ−ＤＮＡ型発現ベクター系に挿入し、植物体の染色体ＤＮＡに導入すると、その植物体の葉の表皮細胞において、成熟型のＣｐＹＧＦＰの産生に起因する蛍光が観測されることを確認した。その他に、該蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰのＨｉｓ52をＰｈｅで置き換えたＨ５２Ｆ改変体タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆも、その全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを、Ｔ−ＤＮＡ型発現ベクター系に挿入し、植物体の染色体ＤＮＡ中に導入すると、その植物体の葉の表皮細胞において、成熟型のＣｐＹＧＦＰの産生に起因する蛍光が観測されることを確認した。
【００１６】
本発明者らは、以上の知見に加えて、前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ、そのＨ５２Ｆ改変体タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆの完全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを、Ｔ−ＤＮＡ型発現ベクター系に挿入し、植物体の染色体ＤＮＡに導入することで創製される形質転換植物として、これら蛍光タンパク質に起因する蛍光を示す点を除くと、その表現形質は、当該植物の野生型植物体と実質的な差異を示さないものを得ることが可能であることを確認して、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明にかかるＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用は、
蛍光を発する形質転換植物を創製することを目的とする、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用であって、
前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、
下記のアミノ酸配列（配列番号：１）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SHCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の野生型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ、または、
下記のアミノ酸配列（配列番号：３）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SFCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆであり、
目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、野生型植物は、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能な植物であり、
目的とする蛍光を発する形質転換植物の創製は、
該Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターのクローニング・サイトに挿入する工程；
得られるＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを宿主アグロバクテリウム属細菌に導入し、該アグロバクテリウム属細菌を形質転換する工程；
得られるアグロバクテリウム属細菌の形質転換株を、前記野生型植物に感染させ、前記Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター中に含まれる、Ｔ−ＤＮＡ領域を、当該野生型植物の染色体ＤＮＡ中に組み換え導入し、形質転換植物を得る工程；
得られた形質転換植物の植物個体を自家交配させて、植物個体それぞれのＴ１種子を収穫する工程；
得られたＴ１種子を種蒔きし、生育した各植物体において、前記植物体の葉の表面において、当該蛍光タンパク質の組み換え発現に起因する蛍光を発する表現形質が付与された、表現形質の示す転換植物個体を選別する工程、
を含む
ことを特徴とする、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の使用である。
【００１８】
その際、前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、
下記のアミノ酸配列（配列番号：１）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SHCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の野生型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰである場合、
該Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片は、前記完全長アミノ酸配列をコードするＯｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅの塩基配列として、
下記の塩基配列（配列番号：２）：
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG 48
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC 96
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC 144
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC 192
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT 240
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG 288
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC 336
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC 384
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC 432
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC 480
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT 528
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA 576
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC 624
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG 660
を含むものであることが好ましい。あるいは、前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、
下記のアミノ酸配列（配列番号：３）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SFCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆである場合、
該Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片は、前記完全長アミノ酸配列をコードするＯｐｅｎ−ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅの塩基配列として、
下記の塩基配列（配列番号：４）：
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG 48
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC 96
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC 144
CTG CTG TCC TTC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC 192
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT 240
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG 288
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC 336
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC 384
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC 432
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC 480
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT 528
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA 576
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC 624
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG 660
を含むものであることが好ましい。
【００１９】
一方、目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科に属する植物のいずれかを選択することが望ましい。
【００２０】
例えば、目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、
アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）
ナス科：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）
イネ科：トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）
マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）
のいずれかを選択することが可能である。
【００２１】
さらには、種々の園芸植物のうち、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを宿主アグロバクテリウム属細菌に導入してなる形質転換細菌を感染させ、形質転換植物を創製することが可能な植物として、
・バラ：バラ科バラ属；
・カーネーション（Dianthus caryophyllus）：ナデシコ科ナデシコ属；
・キク、特に栽培ギク（Chrysantemum morifolium）：キク科キク属；
・ガーベラ（Gerbera cvs.）：キク科ガーベラ(オオセンボンヤリ)属；
・トルコキキョウ（Eustoma grandiflorum）：リンドウ科ユーストマ属；
・ペチュニア（Petunia×hybrida）：ナス科ペチュニア属；
・トレニア（Torenia fournieri）：ゴマノハグサ科トレニア属；
・ニーレンベルギア（Nierembergia hippoamanica）：ナス科アマモドキ属；
・バーベナ（garden verbena）：クマツヅラ科バーベナ属；
・カリブラコア（Calibrachoa hybrid Cultivar）： ナス科カリブラコア属；
・シクラメン（Cyclamen persicum）：サクラソウ科シクラメン属；
・サボテン（Cactaceae）、例えば、
サボテン科アウストロキリンドロプンティア属、アストロフィツム属、エキノカクツス属、エキノセレウス属、エキノプシス属、エピフィラム属、オプンティア属、カニバサボテン属、カマエセレウス属、 キリンドロプンティア属、ギムノカリキウム属、シャコバサボテン属、 セレニセレウス属、テフロカクツス属、ネオブクスバウミア属、ネオライモンディア属、ノパレア属、フェロカクツス属、マミラリア属、メロカクツス属、リプサリス属、 ロセオカクツス属、ロフォフォラ属；
・ラン、例えば、
ファレノプシス（Phalaenopsis cvs.）：ラン科ファレノプシス(コチョウラン)属；
シンビジウム（Cymbidium cvs.）：ラン科シンビジウム(シュンラン)属；
デンドロビウムのノビル系（Dendrobium nobile hybrids）、デンドロビウムのデンファレ系（D. phalaenopsis hybrids）：ラン科デンドロビウム(セッコク)属；
オンシジウム（Oncidium cvs.）：ラン科オンシジウム属；
カトレア（Cattleya cvs.）：ラン科カトレア属；
を例示でき、目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、これらのいずれかを選択することも可能である。
【００２２】
また、前記得られるＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを宿主アグロバクテリウム属細菌に導入し、該アグロバクテリウム属細菌を形質転換する工程において利用する、該宿主アグロバクテリウム属細菌として、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を選択することが好ましい。例えば、該宿主アグロバクテリウム属細菌として、Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｌｌ ＧＶ３１０１株を選択することが好ましい。
【００２３】
さらには、前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターのクローニング・サイトに挿入する工程において使用する、該Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターとして、大腸菌・アグロバクテリウム系バイナリー・ベクターのｐＢｉｇ２１１３ＳＦを選択することが望ましい。
【００２４】
また、本発明は、遺伝子組み換えにより、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質を組み換え発現し、その細胞内で産生される当該蛍光タンパク質を利用して、蛍光を発する形質転換植物を創製する方法の発明をも提供しており、
すなわち、本発明にかかる蛍光を発する形質転換植物を創製する方法は、
遺伝子組み換えにより、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質を組み換え発現し、その細胞内で産生される当該蛍光タンパク質を利用して、蛍光を発する形質転換植物を創製する方法であって、
前記Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、
下記のアミノ酸配列（配列番号：１）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SHCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の野生型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ、または、
下記のアミノ酸配列（配列番号：３）：
MTTFKIESRI HGNLNGEKFE LVGGGVGEEG RLEIEMKTKD KPLAFSPFLL SFCMGYGFYH 60
FASFPKGTKN IYLHAATNGG YTNTRKEIYE DGGILEVNFR YTYEFNKIIG DVECIGHGFP 120
SQSPIFKDTI VKSCPTVDLM LPMSGNIIAS SYARAFQLKD GSFYTAEVKN NIDFKNPIHE 180
SFSKSGPMFT HRRVEETHTK ENLAMVEYQQ VFNSAPRDM 219
を、完全長アミノ酸配列として有する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆであり、
目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、野生型植物は、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能な植物であり、
目的とする蛍光を発する形質転換植物の創製は、
該Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターのクローニング・サイトに挿入する工程；
得られるＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを宿主アグロバクテリウム属細菌に導入し、該アグロバクテリウム属細菌を形質転換する工程；
得られるアグロバクテリウム属細菌の形質転換株を、前記野生型植物に感染させ、前記Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター中に含まれる、Ｔ−ＤＮＡ領域を、当該野生型植物の染色体ＤＮＡ中に組み換え導入し、形質転換植物を得る工程；
得られた形質転換植物の植物個体を自家交配させて、植物個体それぞれのＴ１種子を収穫する工程；
得られたＴ１種子を種蒔きし、生育した各植物体において、前記植物体の葉の表面において、当該蛍光タンパク質の組み換え発現に起因する蛍光を発する表現形質が付与された、表現形質の示す転換植物個体を選別する工程、
を含む
ことを特徴とする、蛍光を発する形質転換植物を創製する方法である。
【００２５】
特に、目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能な園芸植物を選択することが望ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明では、蛍光を発する形質転換植物を創製する際、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡ型発現ベクター系に挿入し、植物体の染色体ＤＮＡに導入することで、該植物の細胞内でＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質を組み換え発現させ、産生される成熟型の蛍光タンパク質を、その蛍光源として、利用している。このＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、該蛍光タンパク質が発する蛍光スペクトルのピーク波長λem.ならびに、その蛍光を引き起こす励起光の波長分布（励起スペクトル）のピーク波長λex.は、波長領域６００ｎｍ〜４９０ｎｍの範囲に存在しているため、その葉の表皮細胞中に多量に存在するクロロフィルａおよびクロロフィルｂが示す赤色部と青紫色部の二つの吸収帯に挟まれた、波長６００ｎｍ〜４９０ｎｍの範囲の「窓」を利用して、該蛍光タンパク質の光励起と、蛍光の取り出しを行うことが可能となっている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に、本発明をより詳しく説明する。
【００２８】
本発明では、蛍光を発する形質転換植物を創製する際、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、Ｔ−ＤＮＡ型発現ベクター系に挿入し、植物体の染色体ＤＮＡに導入することで、該植物の細胞内でＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質を組み換え発現させ、産生される成熟型の蛍光タンパク質を、その蛍光源として、利用している。
【００２９】
その際、植物の染色体ＤＮＡ中に、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を導入する手段として利用する、Ｔ−ＤＮＡ型発現ベクター系は、国際公開第０３／０１８８０８号パンフレットに開示される、Ｆｏｘ−ｈｕｎｔｉｎｇシステム（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｈｕｎｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の開発に利用される組み換え発現系である。すなわち、大腸菌・アグロバクテリウム系バイナリー・ベクター中、上流側と下流側の二つのＴ−ＤＮＡ・ボーダー塩基配列に挟まれる領域に、外来のプロモータと、ポリ・アデニレーション・シグナル配列ならびにターミネーターを設け、前記プロモータと、ポリ・アデニレーション・シグナル配列との間に、目的とするＤＮＡ断片を挿入する。この目的とするＤＮＡ断片を挿入した大腸菌・アグロバクテリウム系バイナリー・ベクターを、Ｔｉ−プラスミドを有するアグロバクテリウム・チュメファシエンスに導入し、形質転換菌株を作製した後、この形成転換菌株を対象の植物に感染させ、形質転換植物を創製する。
【００３０】
この形質転換法を利用することで、前記バイナリー・ベクター中の二つのＴ−ＤＮＡ・ボーダー塩基配列に挟まれる領域が、アグロバクテリウム・チュメファシエンスのＴｉ−プラスミド中のＶｉｒ領域に存在する、遺伝子群ＶｉｒＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇの遺伝子に由来する産物によって、対象植物の染色体ＤＮＡへの導入が促進される。すなわち、アグロバクテリウム・チュメファシエンスの感染により、その本来のＴ−ＤＮＡが挿入される部位に、前記バイナリー・ベクター中の二つのＴ−ＤＮＡ・ボーダー塩基配列に挟まれる領域が導入される。
【００３１】
実際には、アグロバクテリウム・チュメファシエンス形質転換菌株は、その本来のＴ−ＤＮＡ領域も保持しているため、前記バイナリー・ベクター中の二つのＴ−ＤＮＡ・ボーダー塩基配列に挟まれる領域が導入される以外に、本来のＴ−ＤＮＡ領域が導入されるものの存在するが、植物体に腫瘍（クラウンゴール）を生じさせるか否かを確認することで、本来のＴ−ＤＮＡ領域が導入されたものを選別し、排除することが可能である。
【００３２】
特には、予め、目的とするＤＮＡ断片を、大腸菌・アグロバクテリウム系バイナリー・ベクターｐＢＩＧ２１１３ＳＦ中に設けられているクローニング・サイト、具体的には、二つのＳｆｉＩ制限酵素サイトを利用して、該ベクター中に挿入する。前記の二つのＳｆｉＩ制限酵素サイトで構成されるクローニング・サイトは、予め、対応するＳｆｉＩ制限酵素サイトを目的とするＤＮＡ断片の上流と下流に設けておくことにより、前記プロモータ配列の下流に、目的とするＤＮＡ断片をセンス方向となるように選択的に挿入することができる。
【００３３】
アグロバクテリウム・チュメファシエンス形質転換菌株による、植物の染色体ＤＮＡ中への前記バイナリー・ベクター中の二つのＴ−ＤＮＡ・ボーダー塩基配列に挟まれる領域の導入は、通常、一植物当たり、一つの部位への導入となっている。すなわち、２倍体の染色体ＤＮＡ中には、前記外来遺伝子の挿入がなされたＴ−ＤＮＡ領域が相同置換型の遺伝子組み換えがなされている染色体ａ*と、遺伝子組み換えがなされていない相同染色体ａとが含まれ、（ａ*・ａ）型の染色体構成を採っている。従って、得られた形質転換植物の植物個体（ａ*・ａ）を自家交配させて、植物個体それぞれのＴ１種子を収穫すると、得られるＴ１種子は、（ａ*・ａ*）、（ａ*・ａ）、（ａ・ａ*）、（ａ・ａ）の４種の染色体構成のいずれかを採る。前記外来遺伝子の挿入がなされたＴ−ＤＮＡ領域中に、予め、薬剤耐性遺伝子を組み込んでおくことで、得られるＴ１種子を、該薬剤耐性を有するか否かにより選択して、（ａ*・ａ*）、（ａ*・ａ）、（ａ・ａ*）型の染色体構成を有するものを選別することができる。
【００３４】
なお、アグロバクテリウム・チュメファシエンス形質転換菌株による、植物の染色体ＤＮＡ中への前記外来遺伝子の挿入がなされたＴ−ＤＮＡ領域の導入は、該植物が有する複数の染色体ＤＮＡ中、特定の染色体ＤＮＡに極めて高い頻度で生じている結果、一植物当たり、二以上の部位への導入が生じることは、殆ど皆無である。一方、本発明で利用する形質転換手法で創製される形質転換植物では、フローラル・ディッピング法による感染を行う際、利用するアグロバクテリウム・チュメファシエンス形質転換菌株の懸濁液中の菌体密度を適正に選択することで、一植物当たり、二以上の部位への導入を皆無としている。また、得られるＴ１種子を発芽させる際、その培地中に前記薬剤耐性遺伝子による選別を行うため、対象の薬剤を適正な濃度で添加することで、前記（ａ*・ａ*）、（ａ*・ａ）、（ａ・ａ*）型の染色体構成を有するものを選別することができる。
【００３５】
前記バイナリー・ベクター中の二つのＴ−ＤＮＡ・ボーダー塩基配列に挟まれる領域に予め組み込み、この薬剤耐性遺伝子による選別に利用する薬剤耐性遺伝子としては、対象とする植物細胞中で、適正な発現量で発現可能な薬剤耐性遺伝子であれば、どのようなものを用いてもよい。特に、Ｔ１種子の発芽に際して、適正な発現量で発現可能な薬剤耐性遺伝子であることが望ましく、例えば、ハイグロマイシンに対する耐性遺伝子が好適に利用可能である。
【００３６】
前記薬剤耐性遺伝子の発現の有無による一次選別後、前記（ａ*・ａ*）、（ａ*・ａ）、（ａ・ａ*）型の染色体構成を有する植物体に関して、さらに、栽培を継続して、生育した植物体の葉の表皮細胞中において、組み込まれたＤＮＡ断片から、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質が、実際に、成熟体タンパク質として、発現されているか、否かを確認する。
【００３７】
本発明においては、目的とするＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現は、その細胞内に多量のクロロフィル（葉緑素）が存在する葉の表皮細胞で行われる。その際、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質をコードする遺伝子からのｍＲＮＡの転写は、当該植物の葉の表皮細胞内において、適正な転写量を達成可能な外来のプロモータを利用して行う。本発明の目的では、対象植物をその野生種と同様の生育条件で栽培した際に、その葉の表皮細胞内において、適正な転写量を達成可能な外来のプロモータを利用する。この要件に適する外来のプロモータとしては、当該植物の葉の表皮細胞内において、機能可能な恒常発現型プロモータが適している。好適に利用可能な恒常発現型プロモータとしては、カリフラワー・モザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）の３５Ｓプロモータ配列が挙げられる。恒常発現型プロモータは、恒常的に発現を引き起こし、また、その発現頻度は、大きな変動を示さないため、生育する植物の葉の表皮細胞内において、略均一な発現量を達成することを可能とする。
【００３８】
後述するように、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、他の種の蛍光タンパク質と同様に、転写・翻訳後、所定の三次元構造を有するタンパク質へとフォールディングがなされ、さらに、その内部に蛍光団が形成されて、初めて、蛍光性タンパク質として機能する。すなわち、転写・翻訳後、所定の三次元構造を有するタンパク質へとフォールディングがなされるだけでなく、さらに、その内部に目的とする蛍光団が形成されて、初めて、その本来の蛍光特性、特には、蛍光のピーク波長、光吸収の極大波長が得られる。本発明の大きな特長は、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、植物体の葉の表皮細胞内において、実際に、後述するような、目的とする蛍光団の形成が、高い効率でなされる点にある。具体的には、植物体の葉の表皮細胞の内部は、微生物の細胞内、あるいは、動物細胞の細胞内とは、その環境は異なっているが、本発明で利用するＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質は、所定の三次元構造を有するタンパク質へとフォールディングがなされ、さらに、目的とする蛍光団の形成が、高い効率でなされる点にある。特に、本発明で利用するＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質では、「ＧＹＧ」部分の環化と、その後の酸化を経て、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団を形成し、その際、さらに、この蛍光団が有するπ電子共役系に対して、Ｈｉｓ残基側鎖のイミダゾール環、またはＰｈｅ残基のベンゼン環が“π−π ｓｔａｃｋｉｎｇ”が可能な配置を有していること必要である。この配向も含めて、目的とする蛍光団の形成が、植物体の葉の表皮細胞の内部においても、高い効率でなされる点にある。
【００３９】
植物体の葉の表皮細胞の内部においても、前記の“π−π ｓｔａｃｋｉｎｇ”を含めで、その本来の蛍光団の形成がなされることで、該蛍光タンパク質が発する蛍光スペクトルのピーク波長λem.ならびに、その蛍光を引き起こす励起光の波長分布（励起スペクトル）のピーク波長λex.は、波長領域６００ｎｍ〜４９０ｎｍの範囲に存在しているため、その葉の表皮細胞中に多量に存在するクロロフィルａおよびクロロフィルｂが示す赤色部と青紫色部の二つの吸収帯に挟まれた、波長６００ｎｍ〜４９０ｎｍの範囲の「窓」を利用して、該蛍光タンパク質の光励起と、蛍光の取り出しを行うことが可能となっている。
【００４０】
本発明で利用されるＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質：Ｃｐ ＹＧＦＰ（Chiridius poppei Yellowish Green Fluoresent Protein）の完全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ断片は、クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫのクローニング・サイト、Ｂｌｕｎｔ−Ｘｈｏ Ｉ 部位間に挿入され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ−ＮＦＰは、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６８１として、国際寄託（平成１６年３月３１日付け）がなされている。
【００４１】
該ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ−ＮＦＰ中に挿入されている、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ断片の塩基配列は、全長：７８２ｂｐ、ＯＲＦ（翻訳枠）：６６０ｂｐが特定された。その全塩基配列と、ＯＲＦから推定されるアミノ酸配列：２１９アミノ酸長を以下に示す。
AGAACACTCA GTGTATCCAG TTTTCCGTCC TACTACAAAC 40
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG 88
M T T F K I E S R I H G N L N G
1 5 10 15
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC 136
E K F E L V G G G V G E E G R L
20 25 30
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC 184
E I E M K T K D K P L A F S P F
35 40 45
CTG CTG TCC CAC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC 232
L L S H C M G Y G F Y H F A S F
50 55 60
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT 280
P K G T K N I Y L H A A T N G G
65 70 75 80
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG 328
Y T N T R K E I Y E D G G I L E
85 90 95
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC 386
V N F R Y T Y E F N K I I G D V
100 105 110
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC 424
E C I G H G F P S Q S P I F K D
115 120 125
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC 472
T I V K S C P T V D L M L P M S
130 135 140
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC 520
G N I I A S S Y A R A F Q L K D
145 150 155 160
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT 568
G S F Y T A E V K N N I D F K N
165 170 175
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA 616
P I H E S F S K S G P M F T H R
180 185 190
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC 664
R V E E T H T K E N L A M V E Y
195 200 205
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG 700
Q Q V F N S A P R D M *
210 215
AATGTGGAAC GAAACCTTTT TTTCTGATTA CTTTCTCTGT TGACTCCACA 750
TTCGGAACTT GTATAAATAA GTTCAGTTTA AA 782
かかるＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質：Ｃｐ ＹＧＦＰが示す蛍光特性と、それをコードするｃＤＮＡのクローニング方法に関しては、既に、特許文献中に公表されている（国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレット、または米国特許出願公開２００５／０２２１３３８号明細書を参照）。
【００４２】
加えて、このＣｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来の蛍光タンパク質：Ｃｐ ＹＧＦＰの示す蛍光特性における特徴：蛍光ピーク波長、５１７ｎｍ、励起スペクトルにおけるピーク波長、５０９ｎｍを示す蛍光団の構造上の特異性に関しても、本出願人の研究グループにより解明されている。具体的には、該組換え発現ＣｐＹＧＦＰのＸ線結晶構造解析を進めた結果、図３に示す結晶構造、特に、図４に示す蛍光団を中心とする部分構造を詳細に検討した結果、その蛍光団は、“ＧＹＧ”の環化、脱水過程を介して形成されるｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造であることが確認された。また、該蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造に含まれる、Ｔｙｒ56に由来するｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）に対して、Ｈｉｓ52の側鎖上のイミダゾール環が、“π−π ｓｔａｃｋｉｎｇ”が可能な配置を有していることが、前記の蛍光ピーク波長を決定する主な要因であることを解明した。
【００４３】
なお、組換え発現ＣｐＹＧＦＰの蛍光団、すなわち、図３に示す結晶構造の詳細な座標データは、Ｐｒｏｔａｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ中に、ＩＤ ｃｏｄｅ：２ＤＤ７として、登録されており、かかる座標データに基づき、三次元的グラフィック化することで、図３に示す全体像のみでなく、図４に示す部分構造も更に詳細に参照可能な状態とされている。
【００４４】
実際に、決定されたＣｐＹＧＦＰの三次元構造は、図３に示すように、１１個のβ鎖と、蛍光団の構成に関与するＧＹＧを内在するαヘリックス（α1−ヘリックス）と他の一本の短いαヘリックス（α2−ヘリックス）が、Ａ． ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａ由来のＤｓＲＦＰが共通に示す全体形状、すなわち、“βｃａｎ”と称されているバレル形状を構成している。図１０に、ＣｐＹＧＦＰのアミノ酸配列と、Ａ． ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰ、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｔｒｉａｔａ由来のＤｓＲＦＰのアミノ酸配列とを対比させ、前記の二次構造部分は、全体的に共通性を有することを示す。また、バレルの内部に位置するαヘリックス中に内在するＧＹＧは、環化と、その後の酸化を経て、実際に、下記のようなｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団を形成している。
【００４５】
ＣｐＹＧＦＰにおいて、翻訳後、成熟型蛍光たんぱく質へと変換されるメカニズム、すなわち、αヘリックス中に存在している、「ＧＹＧ」から、蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の形成は、下記の機構によると推定される。
【００４６】
・翻訳後、フォールディング；（歪んだ配置への移行）
【００４７】
【化１】
【００４８】
・環化、脱水過程
【００４９】
【化２】
【００５０】
・酸化過程：p-hydroxybenzylideneimidazolinone構造の完成
【００５１】
【化３】
【００５２】
最終的に、蛍光団：ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造は、下記の非イオン化型とイオン化型の間で平衡状態となっている。
【００５３】
・p-hydroxybenzylideneimidazolinone構造におけるイオン化型と、非イオン化型の平衡
【００５４】
【化４】
【００５５】
この蛍光団の近傍に存在するアミノ酸残基を含む、局所的な立体配置は、図４に示すものとなっていることが判明した。野生型のＣｐＹＧＦＰにおいても、蛍光に関与する形状は、上述するイオン化型形状であり、このイオン化型の安定化には、β鎖（β6）中に存在する、１３６番目のＴｈｒが何らかの寄与を有することが予測される。加えて、野生型のＣｐＹＧＦＰにおいては、ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団中、Ｔｙｒ由来のｐ−ヒドロキシフェニル基（フェノール環）部分に対して、５２番目のＨｉｓ側鎖のイミダゾール環が、重ね合わせた位置に存在し、両者のπ電子の重なりを介した、相互作用（π−π−スタッキング）により、蛍光波長をレッド・シフトさせる機能を有すると予測される。
【００５６】
また、本発明において、上記の野生型Ｃｐ ＹＧＦＰと同様に利用される改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆの示す蛍光特性は、蛍光ピーク波長、５２１．８ｎｍ、励起スペクトルにおけるピーク波長、５１３．６ｎｍである。
【００５７】
図４に示す、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰが有する蛍光団の構造上の特徴を利用し、Ｈｉｓ52に由来するイミダゾール環を、対応する配置を採ることが可能な芳香族アミノ酸；Ｐｈｅに由来するベンゼン環で置き換え、“π−π ｓｔａｃｋｉｎｇ”に起因する、π電子共役系の相互作用を増すことで、蛍光状態の励起エネルギーをより低下させることで、改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆの極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）は、野生型ＣｐＹＧＦＰの極大蛍光波長（蛍光ピーク波長）より、長波長側へシフト（レッド・シフト）されている。
【００５８】
一方、改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆの完全長アミノ酸配列をコードする遺伝子は、例えば、下記の手順に従って、部位特異的変異導入法を適用することで作製できる。
【００５９】
国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来のＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰ中に挿入されている、野生型ＣｐＹＧＦＰをコードする遺伝子を鋳型として、部位特異的変異導入により、Ｈ５２Ｆ改変体タンパク質をコードする遺伝子を調製する。
【００６０】
Ｈｉｓ52をコードするコドンＣＡＣを、ＰｈｅをコードするコドンＴＴＣにそれぞれ置換するため、下記のプライマーを利用して、ＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を作製する。すなわち、ＰＣＲ用フォワード・プライマーとして、その５'末端に上記のコドン変換を施した、下記のプライマーを使用する。一方、リバース・プライマーとして、Ｈｉｓ52をコードするコドンＣＡＣより上流側の部分的塩基配列（塩基番号１２５−１５３；下記部分配列）に対して、相補的な塩基配列を有するプライマーを利用する。
５'− A CTG GCA TTC TCT CCC TTC CTG CTG TCC −３’
３'− T GAC CGT AAG AGA GGG AAG GAC GAC AGG −５’
Leu Ala Phe Ser Pro Phe Leu Leu Ser
45 50
具体的には、ＰＣＲ用フォワード・プライマーは、
Ｈ５２Ｆのポイント・ミューテーション用には、
ＣｐＹＧＦＰ/Ｈ５２Ｆ ＵＰ（３０ｍｅｒ）
５’− TTC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC −３’
を用い、一方、共通のリバース・プライマーとして、
リバース・プライマー：ＣｐＹＧＦＰ/ＬＰ１５３（２８ｍｅｒ）
５’− GGA CAG CAG GAA GGG AGA GAA TGC CAG T −３’
を用いる。
【００６１】
ＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰを鋳型として、下記する条件で、該プラスミドの全長に相当する、約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物を調製する。表１に、用いるＰＣＲ反応の温度条件、表２に、反応液の組成を示す。なお、ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ時間は、伸長すべき塩基長が約６．４ｋｂｐと長い点を考慮して、十分に長い時間を選択している。
【００６２】
【表１−１】
【００６３】
【表１−２】
【００６４】
調製されたＰＣＲ増幅産物の精製は、以下の手順で行う。
【００６５】
各２５μＬの反応液量でＰＣＲ反応を実施した後、合計３回の反応液を合わせ、５μＬの反応液を採取し、０．７％アガロース・ゲル上で泳動し、目的分子量、約６．４ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物を確認する。
【００６６】
次いで、反応液から、産物ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で濃縮する。反応液１容（７０μＬ）当たり、ＰＢ ｂｕｆｆｅｒ ５容（３５０μＬ）を加え、ヴォルテックスにかけた後、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移す。３０秒間遠心し、析出するＤＮＡを沈積させ、上清を除去する。析出したＤＮＡを、ＰＥ ｂｕｆｆｅｒ ０．７ｍＬで洗浄し、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）する。さらに、ＥＢ ｂｕｆｆｅｒ ２０μＬを加えて、室温で、１分間静置する。その後、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、上清を回収する。
【００６７】
回収されるＤＮＡ溶液に、３μＬ １０×Ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ９．５，１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＤＴＴ）、３μＬ ５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、３μＬ ７５ｍＭ ＡＴＰを加え、ヴォルテックスにかけた後、１μＬ Ｔ４ ＰＮＫ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ）を加え、３７℃で約３０分インキュベートする。
【００６８】
１０×ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ 液 ３μＬを添加した後、０．７％ ＴＡＥ アガロース・ゲル上、各レーン ＤＮＡ溶液 ３３μＬを泳動する。目的の約６．４ｋｂｐのバンドをゲルから切り出す。切り出したゲル切片は、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を使用し、１０分間、遠心（７０００ｒｐｍ）し、ゲル切片から１．５ｍＬ容ｅｐｐｅｎチューブ中にＤＮＡ溶液を抽出する。その抽出液から、産物ＤＮＡを、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で濃縮する。反応液１容当たり、ＰＢ ｂｕｆｆｅｒ ５容を加え、ヴォルテックスにかけた後、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移す。３０秒間遠心し、析出するＤＮＡを沈積させ、上清を除去する。析出したＤＮＡを、ＰＥ ｂｕｆｆｅｒ ０．７ｍＬで洗浄し、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）した。さらに、ＥＢ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬを加えて、室温で、１分間静置する。その後、１分間、遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、上清を回収する。回収された上清を、精製済み二本鎖ＤＮＡの溶液として使用する。
【００６９】
精製済み二本鎖ＤＮＡの溶液１μＬを１μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ製）とミックスし、１６℃で一晩、ライゲーション反応を施す。このライゲーション反応により、二本鎖ＤＮＡは、両端で連結され、環状プラスミドが構築される。各プラスミドは、導入されたポイント・ミューテーションを除き、それ以外は、鋳型のＣｐＹＧＦＰの組換え発現ベクター：ｐＥＴ１０１−ＮＦＰと同じ構成となっており、該改変体タンパク質の組換え発現ベクターとなっている。
【００７０】
ライゲーション後、ＴＯＰ１０ ｃｅｌｌにライゲーション液全量（２μＬ）をトランスフォームし、Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢプレートに蒔種する。翌朝、プラスミド・ベクター中に存在する、前記薬剤に対する耐性遺伝子を保持するコロニーを数個採取する。採取したコロニーを、Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地に植菌し、形質転換大腸菌を増殖させ、プラスミド・ベクターの増殖を行う。集菌した形質転換大腸菌を破砕し、ＤＮＡを回収し、目的の分子量約約６．４ｋｂｐを有する環状ＤＮＡ分子（プラスミド・ベクター）を単離、精製する。
【００７１】
精製した各プラスミド・ベクター中に含まれる、該改変体タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を確認するため、該各プラスミド・ベクター中に含まれる改変体タンパク質をコードする領域を鋳型として、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、シークエンス解析用試料を作製する。
【００７２】
その際、用いるＰＣＲ用プライマーは、国際公開第２００５／０９５５９９号パンフレットに開示する、フォワード・プライマー：ｐＥＴ−ＵＰ１（２８ｍｅｒ）：
５’−CACCATGACAACCTTCAAAATCGAGTCC−３’
リバース・プライマー：ＳａｌＩ−ＬＰ１（３５ｍｅｒ）：
５’−CTCGTCGACCTACATGTCTCTTGGGGCGCTGTTGA−３’
を用いて、塩基長６７３ｂｐの増幅産物を調製する。
【００７３】
該６７３ｂｐのＤＡＮ断片から調製した、シークエンス解析用試料は、例えば、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、５’末端側からの配列解析、ならびに、３’末端側からの配列解析をそれぞれ行う。
【００７４】
５’末端側からの配列解析結果と、３’末端側からの配列解析結果とを総合し、改変体タンパク質をコードする領域の塩基配列が、目的の部位特異的変異が導入されていること、また、ＰＣＲ増幅時の誤りを含まないことを確認する。
【００７５】
上記の部位特異的変異法を適用すると、改変体型蛍光タンパク質：ＣｐＹＧＦＰ Ｈ５２Ｆの完全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ断片として、その塩基配列は、全長：７８２ｂｐ、内在している、ＯＲＦ（翻訳枠）：６６０ｂｐのＤＮＡ断片を調製することができる。この部位特異的変異導入が施された全塩基配列と、そのＯＲＦから推定されるアミノ酸配列：２１９アミノ酸長を以下に示す。
AGAACACTCA GTGTATCCAG TTTTCCGTCC TACTACAAAC 40
ATG ACA ACC TTC AAA ATC GAG TCC CGG ATC CAT GGC AAC CTC AAC GGG 88
M T T F K I E S R I H G N L N G
1 5 10 15
GAG AAG TTC GAG TTG GTT GGA GGT GGA GTA GGT GAG GAG GGT CGC CTC 136
E K F E L V G G G V G E E G R L
20 25 30
GAG ATT GAG ATG AAG ACT AAA GAT AAA CCA CTG GCA TTC TCT CCC TTC 184
E I E M K T K D K P L A F S P F
35 40 45
CTG CTG TCC TTC TGC ATG GGT TAC GGG TTC TAC CAC TTC GCC AGC TTC 232
L L S F C M G Y G F Y H F A S F
50 55 60
CCA AAG GGG ACT AAG AAC ATC TAT CTT CAT GCT GCA ACA AAC GGA GGT 280
P K G T K N I Y L H A A T N G G
65 70 75 80
TAC ACC AAC ACC AGG AAG GAG ATC TAT GAA GAC GGC GGC ATC TTG GAG 328
Y T N T R K E I Y E D G G I L E
85 90 95
GTC AAC TTC CGT TAC ACT TAC GAG TTC AAC AAG ATC ATC GGT GAC GTC 386
V N F R Y T Y E F N K I I G D V
100 105 110
GAG TGC ATT GGA CAT GGA TTC CCA AGT CAG AGT CCG ATC TTC AAG GAC 424
E C I G H G F P S Q S P I F K D
115 120 125
ACG ATC GTG AAG TCG TGT CCC ACG GTG GAC CTG ATG TTG CCG ATG TCC 472
T I V K S C P T V D L M L P M S
130 135 140
GGG AAC ATC ATC GCC AGC TCC TAC GCT AGA GCC TTC CAA CTG AAG GAC 520
G N I I A S S Y A R A F Q L K D
145 150 155 160
GGC TCT TTC TAC ACG GCA GAA GTC AAG AAC AAC ATA GAC TTC AAG AAT 568
G S F Y T A E V K N N I D F K N
165 170 175
CCA ATC CAC GAG TCC TTC TCG AAG TCG GGG CCC ATG TTC ACC CAC AGA 616
P I H E S F S K S G P M F T H R
180 185 190
CGT GTC GAG GAG ACT CAC ACC AAG GAG AAC CTT GCC ATG GTG GAG TAC 664
R V E E T H T K E N L A M V E Y
195 200 205
CAG CAG GTT TTC AAC AGC GCC CCA AGA GAC ATG TAG 700
Q Q V F N S A P R D M *
210 215
AATGTGGAAC GAAACCTTTT TTTCTGATTA CTTTCTCTGT TGACTCCACA 750
TTCGGAACTT GTATAAATAA GTTCAGTTTA AA 782
なお、本発明の手法を適用して、目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、野生型植物は、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能な植物であり、特には、その葉の表皮細胞は、その細胞内に多量のクロロフィル（葉緑素）が存在する際、特に顕著な効果を発揮する。該植物の形質転換は、アグロバクテリア菌が有する、感染性を利用しているため、アグロバクテリウムによる感染を受ける、双子葉植物、単子葉植物のいずれにも適用できる。目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科に属する植物のいずれかを選択することが望ましい。
【００７６】
例えば、目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、
アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）
ナス科：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）
イネ科：トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）
マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）
のいずれかを選択することが可能である。
【００７７】
さらには、種々の園芸植物のうち、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを宿主アグロバクテリウム属細菌に導入してなる形質転換細菌を感染させ、形質転換植物を創製することが可能な植物として、
・バラ：バラ科バラ属；
・カーネーション（Dianthus caryophyllus）：ナデシコ科ナデシコ属；
・キク、特に栽培ギク（Chrysantemum morifolium）：キク科キク属；
・ガーベラ（Gerbera cvs.）：キク科ガーベラ(オオセンボンヤリ)属；
・トルコキキョウ（Eustoma grandiflorum）：リンドウ科ユーストマ属；
・ペチュニア（Petunia×hybrida）：ナス科ペチュニア属；
・トレニア（Torenia fournieri）：ゴマノハグサ科トレニア属；
・ニーレンベルギア（Nierembergia hippoamanica）：ナス科アマモドキ属；
・バーベナ（garden verbena）：クマツヅラ科バーベナ属；
・カリブラコア（Calibrachoa hybrid Cultivar）： ナス科カリブラコア属；
・シクラメン（Cyclamen persicum）：サクラソウ科シクラメン属；
・サボテン（Cactaceae）、例えば、
サボテン科アウストロキリンドロプンティア属、アストロフィツム属、エキノカクツス属、エキノセレウス属、エキノプシス属、エピフィラム属、オプンティア属、カニバサボテン属、カマエセレウス属、 キリンドロプンティア属、ギムノカリキウム属、シャコバサボテン属、 セレニセレウス属、テフロカクツス属、ネオブクスバウミア属、ネオライモンディア属、ノパレア属、フェロカクツス属、マミラリア属、メロカクツス属、リプサリス属、ロセオカクツス属、ロフォフォラ属；
・ラン、例えば、
ファレノプシス（Phalaenopsis cvs.）：ラン科ファレノプシス(コチョウラン)属；
シンビジウム（Cymbidium cvs.）：ラン科シンビジウム(シュンラン)属；
デンドロビウムのノビル系（Dendrobium nobile hybrids）、デンドロビウムのデンファレ系（D. phalaenopsis hybrids）：ラン科デンドロビウム(セッコク)属；
オンシジウム（Oncidium cvs.）：ラン科オンシジウム属；
カトレア（Cattleya cvs.）：ラン科カトレア属；
を例示できる。本発明を園芸植物に応用する際、目的とする蛍光を発する形質転換植物を創製する際に利用される、前記野生型植物として、これらの園芸植物のいずれかを選択することも可能である。
【００７８】
本発明においては、形質転換植物において、その染色体ＤＮＡ中に目的の蛍光タンパク質の完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を組み込み、その形質転換植物をＴ１種子を発芽させることで選別する。従って、当該植物体において、その花へと分化する成長点の細胞に、形質転換アグロバクテリウム菌を感染させ、形質転換を行うことが好ましい。すなわち、少なくとも、当該植物体の地上部に対して、アグロバクテリウム菌を感染することが可能な植物を対象とすることが好ましい。
【００７９】
以下に、実施の態様を挙げて、本発明を詳しく説明する。この実施態様は、本発明にかかる最良の実施形態の一例であるが、本発明は、かかる実施態様で例示する形態に限定されるものではない。
【００８０】
（実施態様）
以下に、植物体の葉、茎の表皮細胞内において、非植物由来の蛍光タンパク質を組み換え発現させ、産生される成熟型蛍光タンパク質に起因した蛍光を発する形質転換植物を創製する手順を具体的に説明する。
【００８１】
（野生型植物）
本実施態様においては、該形質転換植物を創製する際、遺伝子組み換えの宿主植物として、双子葉植物の一つである、アブラナ科に属するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を利用している。特に、野生型シロイヌナズナのうち、標準株の一つであるＣｏｌ−Ｏ株を利用している。
【００８２】
野生型シロイヌナズナは、アグロバクテリウムによる感染を受け、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫することが可能であり、また、その染色体ＤＮＡ中にアグロバクテリウム属細菌に由来するＴｉ−プラスミド系を利用して、外来遺伝子ＤＮＡを組み換え、形質転換植物の創製に利用できる。
【００８３】
（形質転換アグロバクテリウムの作製用宿主アグロバクテリウム属細菌株）
本実施態様では、野生型シロイヌナズナの葉茎部に対して、形質転換アグロバクテリウムを感染する形態を利用するため、宿主アグロバクテリウム属細菌株として、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を選択している。具体的には、後述するＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターの導入に際して、エレクトロ・ポレーション法を適用するため、アグロバクテリウム・チュメファシエンス ＧＶ３１０１株、特に、Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｌｌ ＧＶ３１０１を利用して、形質転換菌株の作製を行っている。
【００８４】
（Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター）
本実施態様では、アグロバクテリウム・チュメファシエンス ＧＶ３１０１株の形質転換には、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３ＳＦを用いている。このＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３ＳＦは、恒常発現型プロモータを具えているＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３Ｎ（Ｔａｊｉ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２４（４）， ｐ．４１７−４２６ （２００２）を参照）中に、クローニング・サイトとして、２つのＳｆｉＩ制限酵素サイトを導入したものである。従って、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３Ｎ中に存在する、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２由来の大腸菌複製開始点ＯＲＩと、アグロバクテリウム・チュメファシエンスのＴｉ−プラスミド由来のアグロバクテリウム複製開始点ＯＲＩとを具えている。また、かかる大腸菌・アグロバクテリウム系バイナリー・ベクターの、大腸菌あるいはアグロバクテリウムへの導入を確認する際に利用するマーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子、すなわち、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍr）を具えている。
【００８５】
一方、Ｔｉ−プラスミド中のＴ−ＤＮＡ領域に由来する、上流側と下流側の二つのＴ−ＤＮＡ・ボーダー塩基配列に挟まれる領域には、恒常発現型プロモータと、ポリ・アデニレーション・シグナル配列ならびにターミネーターとが設けられている。この恒常発現型プロモータと、ポリ・アデニレーション・シグナル配列ならびにターミネーターとの間に、前記のクローニング・サイトが形成されている。ｐＢＩＧ２１１３ＳＦは、ｐＢＩＧ２１１３Ｎに由来しており、恒常発現型プロモータとして、カリフラワー・モザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）の３５Ｓプロモータ配列（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５（４）， ｐ．１５４３−５８ （１９８７）を参照）が採用されている。すなわち、かかるＴ−ＤＮＡ領域の両端のボーダー塩基配列を利用して、宿主植物の染色体遺伝子中に、相同置換型の遺伝子組み換えにより、導入される外来遺伝子は、前記恒常発現型プロモータによって、恒常的に転写がなされる。
【００８６】
加えて、かかるＴ−ＤＮＡ領域の両端のボーダー塩基配列で挟まれる領域には、宿主植物中に遺伝子組み換えがなされたことを確認する際に利用する、マーカー遺伝子として、第二の薬剤耐性遺伝子、すなわち、ハイグロマイシン耐性遺伝子が予め組み込まれている。
【００８７】
一方、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３ＳＦ中に設けられているクローニング・サイトは、制限酵素の認識部位が８塩基以上である、２つのＳｆｉＩ制限酵素サイトで構成されているため、このクローニング・サイトに挿入されるＤＮＡ断片の方向は一方向に限定されている。従って、挿入されるＤＮＡ断片中に存在する外来遺伝子のセンス鎖が、前記恒常発現型プロモータに因って、転写を受ける方向に、目的のＤＮＡ断片を選択的に挿入することが可能である。
【００８８】
なお、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３ＳＦ中には、そのＴ−ＤＮＡ領域の両端のボーダー塩基配列で挟まれる領域を、宿主植物の染色体ＤＮＡ中に相同置換型組み換え導入を行う過程に関与する遺伝子群が存在するＶｉｒ領域は存在していない。従って、目的とする外来遺伝子を、該Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３ＳＦ中のクローニング・サイトに挿入して、アグロバクテリウムの形質転換用プラスミド・ベクターを構築した後、この形質転換用プラスミド・ベクターを、Ｔｉ−プラスミドを有する宿主ＧＶ３１０１株に導入する。得られる形質転換アグロバクテリウム菌株では、Ｔｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と、導入された形質転換用プラスミド・ベクター中のＴ−ＤＮＡ領域との間に、相同置換型組み換えが起こると推定されている。すなわち、宿主アグロバクテリウムのＴｉ−プラスミド由来するＶｉｒ領域と、外来遺伝子が挿入されているＴ−ＤＮＡ領域とを含む、組み換え型Ｔｉ−プラスミドが、形質転換されたアグロバクテリウムの細胞内で形成されると推定される。
【００８９】
その結果、この形質転換アグロバクテリウム菌株を宿主植物に感染させると、前記組み換え型Ｔｉ−プラスミド中のＶｉｒ領域に存在する、遺伝子群ＶｉｒＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇの遺伝子に由来する産物によって、外来遺伝子が挿入されているＴ−ＤＮＡ領域の植物の染色体ＤＮＡへの導入が促進されると推定される。
【００９０】
（野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターの構築）
先ず、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡの上流側、ならびに、下流側にそれぞれＳｆｉＩ制限酵素サイトが付加されているＤＮＡ断片を下記の手順に従って調製する。
【００９１】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ−ＮＦＰ中にクローニングされている、配列番号：２の塩基配列を有する、Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ断片を鋳型として、下記の塩基配列を有するプライマー対；
フォワード側プライマー；プライマーＧＳ１７：
（配列番号：１０） ５’−GTACGTATTTTTACAACAATTACCAAC−３’
リバース側プライマー；プライマーＧＳ１８：
（配列番号：１１） ５’−GGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGC−３’
を用いて、ＰＣＲ反応を行い、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡの上流側、ならびに、下流側にそれぞれＳｆｉＩ制限酵素サイトが導入されたＰＣＲ増幅産物を調製する。なお、このＰＣＲ反応は、前記ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ−ＮＦＰを鋳型として、市販のＰＣＲキットを利用し、下記の条件で行う。
【００９２】
【表２−１】
【００９３】
【表２−２】
【００９４】
調製されるＰＣＲ増幅産物は、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ中のＯＲＦに相当する６６０ｂｐ部分と、その５’末端側に、ＳｆｉＩ制限酵素サイトを有する約４０ｂｐの非翻訳領域、また、３’末端側に、ＳｆｉＩ制限酵素サイトを有する約８０ｂｐの非翻訳領域を有する、合計７８２ｂｐのＤＮＡ断片となる。
【００９５】
一方、市販のベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）のマルチ・クローニングサイトに存在する、ＸｂａＩサイト中に、二つのＳｆｉＩ制限酵素サイトを内在する短いＤＮＡ断片を組み込み、改変型ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ型クローニング・ベクターを調製する。
【００９６】
次いで、改変型ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ型クローニング・ベクターの二つのＳｆｉＩ制限酵素サイトの間に、前記５’末端側と３’末端側に、ＳｆｉＩ制限酵素サイトを導入した、前記野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を挿入する。得られたプラスミド・ベクターは、一旦、大腸菌に導入し、形質転換菌株を作製する。この形質転換菌株を培養し、増殖されたプラスミドを回収する。回収されたプラスミド・ベクターは、ＤＮＡ濃度２５０ｎｇ／μＬのプラスミド溶液に調製する。このプラスミド・ベクターを、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片が、改変型ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ型クローニング・ベクターの二つのＳｆｉＩ制限酵素サイトの間に挿入されている、サブ・クローニング・ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＣｐＹＧＦＰと称する。
【００９７】
該ベクター：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＣｐＹＧＦＰから、両端が制限酵素ＳｆｉＩによる消化端を有する、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、下記の手順で採取する。なお、下記の制限酵素を用いる消化反応の反応液に用いる、制限酵素ＳｆｉＩ、緩衝液成分１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒは、市販元（タカラバイオ株式会社）から入手したものである。
【００９８】
【表３−１】
【００９９】
前記初期反応液を、５０℃、３時間保持し、酵素反応を行わせる。次いで、反応液に、ＳｆｉＩ 酵素液を０．５μＬ添加した後、さらに、５０℃、２時間保持し、酵素反応を継続させる。その後、反応液から、酵素消化されたＤＮＡを、イソプロパノール沈澱させ、回収する。回収されたＤＮＡを、蒸留水５μＬに再溶解させる。
【０１００】
前記の初回の消化反応において、制限酵素ＳｆｉＩによる切断が完了していない部分が残留する可能性がある。その残留部分の切断を完了させる目的で、下記の手順で、二回目の消化反応を行う。
【０１０１】
【表３−２】
【０１０２】
前記初期反応液を、５０℃、２時間保持し、酵素反応を行わせる。その後、反応液から、酵素消化されたＤＮＡを、イソプロパノール沈澱させ、回収する。回収されたＤＮＡを、蒸留水０．５μＬに再溶解させる。
【０１０３】
同じく、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３ＳＦに対して、そのクローニング・サイト中に存在する、二つのＳｆｉＩ制限酵素サイトを、下記の手順で制限酵素ＳｆｉＩにより切断する。
【０１０４】
【表４−１】
【０１０５】
前記初期反応液を、５０℃、３時間保持し、酵素反応を行わせる。次いで、反応液に、ＳｆｉＩ 酵素液を０．５μＬ添加した後、さらに、５０℃、２時間保持し、酵素反応を継続させる。その後、反応液から、酵素消化されたＤＮＡを、イソプロパノール沈澱させ、回収する。回収されたＤＮＡを、蒸留水５μＬに再溶解させる。
【０１０６】
前記の初回の消化反応において、制限酵素ＳｆｉＩによる切断が完了していない部分が残留する可能性がある。その残留部分の切断を完了させる目的で、下記の手順で、二回目の消化反応を行う。
【０１０７】
【表４−２】
【０１０８】
前記初期反応液を、５０℃、２時間保持し、酵素反応を行わせる。その後、反応液から、酵素消化されたＤＮＡを、イソプロパノール沈澱させ、回収する。回収されたＤＮＡを、蒸留水０．５μＬに再溶解させる。
【０１０９】
予め、制限酵素ＳｆｉＩによる酵素消化処理を施し、調製した、両端が制限酵素ＳｆｉＩによる消化端を有する、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片と、リニア化処理されたｐＢＩＧ２１１３ＳＦのベクター断片とを、下記の手順でライゲーション反応により連結して、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを構築する。該Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターの構成を図１１に模式的に示す。
【０１１０】
このライゲーション反応は、下記の条件で行っている。なお、利用しているＴ４リガーゼ、反応緩衝液は、市販の酵素キット（New England Biolabs）のものを使用している。
【０１１１】
【表４−３】
【０１１２】
この反応液を、１６℃、一晩（１４時間）保持し、Ｔ４リガーゼ酵素により、制限酵素ＳｆｉＩによる酵素消化端を連結させる。この反応後、反応液は、そのまま、大腸菌への野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターの導入による、形質転換に利用している。
【０１１３】
（コロニーＰＣＲによる目的のＤＮＡが挿入されているバイナリー・ベクターを保持する大腸菌クローンの選別）
構築された、前記野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを含む液を用いて、大腸菌を形質転換する。大腸菌へのバイナリー・ベクターの導入は、エレクトロポレーション法を用いて行う。Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌ ＤＨ１０Ｂ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の懸濁液２０μＬに、ライゲーション反応液０．５μＬを加えた後、エレクトロポレーション用セル中に入れ、エレクトロポレーション処理を施す。
【０１１４】
処理後、カナマイシンを５０ｍｇ／Ｌ含む寒天培地上で、宿主大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を培養し、コロニーを形成させる。形質転換に用いるＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターには、マーカー遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍr）が設けられているので、このカナマイシン耐性を示す各コロニーは、何れも、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターが導入され、該バイナリー・ベクター中のカナマイシン耐性遺伝子が発現していると判断される。
【０１１５】
なお、ライゲーション反応液中には、目的とする野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターに加えて、クローニング・サイトにＤＮＡ断片が挿入されていないＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターも含まれている。従って、前記カナマイシン耐性を示す各コロニーのうち、実際に、目的とする野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターを保持している形質転換菌株を、コロニーＰＣＲにより選別する。
【０１１６】
このコロニーＰＣＲによる選別では、下記の表５−１、表５−２に記載する条件で、コロニーを形成している形質転換菌株が有するＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行い、挿入されているＤＮＡ断片に相当するＰＣＲ増幅産物の有無を確認する。コロニーを形成している形質転換菌株を採取し、破砕し、下記の反応液に加えて、該菌体中に含まれるＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅反応を行う。
【０１１７】
その際、ＰＣＲ用プライマーには、それぞれ、下記の塩基配列を有する、
上流用プライマーとして、プライマーＧＳ１７：
（配列番号：１０） ５’−GTACGTATTTTTACAACAATTACCAAC−３’
下流用プライマーとして、プライマーＧＳ１８：
（配列番号：１１） ５’−GGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGC−３’
を用いる。
【０１１８】
【表５−１】
【０１１９】
【表５−２】
【０１２０】
ＰＣＲ増幅後、反応液の一部（５μＬ）を採取し、電気泳動により、ＰＣＲ増幅産物の有無、そのサイズを分析する。
【０１２１】
前記カナマイシン耐性を示す各コロニーのうち、３３コロニーを無作為に選別し、各３コロニーを一つのグループとして、計１１のグループ（グループＮｏ．１〜１１）として、各グループ中に、目的とする野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターが導入されているコロニーが含まれているか、否かを確認した。すなわち、各グループを構成する３コロニーから、少量の菌体を採取し、混合して、上記の条件に準じて、ＰＣＲ増幅反応を行った。その結果、いずれのグループも、目的とする野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片に由来する塩基長７４２ｂｐに相当するＰＣＲ増幅産物が見出された。
【０１２２】
次に、塩基長７４２ｂｐに相当するＰＣＲ増幅産物のみが明確に確認されるグループのうち、グループＮｏ．８，１０，１１の三グループの合計９のコロニーについて、それぞれ、シングル・コロニーＰＣＲを行った。その結果、８つのコロニー：クローンＮｏ．８−４，８−５，８−６，Ｎｏ．１０−７，１０−８，Ｎｏ．１１−１，１１−２，１１−３において、塩基長７４２ｂｐに相当するＰＣＲ増幅産物が見出された。
【０１２３】
すなわち、少なくとも、クローンＮｏ．８−４，８−５，８−６，Ｎｏ．１０−７，１０−８，Ｎｏ．１１−１，１１−２，１１−３は、カナマイシン耐性を示し、目的とする野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片に由来する塩基長７４２ｂｐに相当するＰＣＲ増幅産物を与えることから、目的とする野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターが導入されている形質転換大腸菌株として、選別された。
【０１２４】
（各大腸菌クローンのサブ・カルチャーと、増殖されたバイナリー・ベクターの回収）
選別された目的のＤＮＡが挿入されているバイナリー・ベクターを保持する大腸菌クローン８種；Ｎｏ．８−４，８−５，８−６，Ｎｏ．１０−７，１０−８，Ｎｏ．１１−１，１１−２，１１−３の各コロニーから、採取した形質転換大腸菌を、カナマイシンを５０ｐｐｍ添加したＬＢ培地４ｍＬに植菌して、形質転換大腸菌を増殖させ、プラスミド・ベクターの増殖を行う。植菌後、３７℃で１８時間培養した時点で、培養を停止し、遠心により集菌する。集菌した菌体は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５で洗浄した後、集菌した形質転換大腸菌を破砕し、ＤＮＡを回収し、目的の分子量約１４ｋｂｐを有する環状ＤＮＡ分子（プラスミド・ベクター）を単離、精製する。
【０１２５】
各大腸菌クローンのサブ・カルチャーから、回収された約１４ｋｂｐプラスミドを含む液について、そのＤＮＡ含有濃度を測定した結果を、表５−３に示す。
【０１２６】
【表５−３】
【０１２７】
（プラスミドＰＣＲと、得られるＰＣＲ産物のシークエンスによる挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の確認）
各大腸菌クローンのサブ・カルチャーから回収された、目的のＤＮＡが挿入されているバイナリー・ベクターを含む液について、その一部を用いて、３倍希釈した後、該バイナリー・ベクター中の二つのＳｆｉＩ制限酵素サイト間の塩基配列に関して、実際に、シークエンスを行う。すなわち、上流側のＳｆｉＩサイトＡから下流側のＳｆｉＩサイトＢに向かって、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡが、センス方向に挿入されていることの確認を行う。
【０１２８】
先ず、回収されたバイナリー・ベクター（プラスミド）を鋳型として、その二つのＳｆｉＩ制限酵素サイト間に挿入されているＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する。回収されたプラスミド液を３倍希釈する。この３倍希釈液を利用して、下記の表６−１、表６−２に示す条件でＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ用プライマーには、それぞれ、下記の塩基配列を有する、
上流用プライマーとして、プライマーＧＳ１７：
（配列番号：１０） ５’−GTACGTATTTTTACAACAATTACCAAC−３’
下流用プライマーとして、プライマーＧＳ１８：
（配列番号：１１） ５’−GGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGC−３’
を用いる。
【０１２９】
【表６−１】
【０１３０】
【表６−２】
【０１３１】
ＰＣＲ増幅後、反応液の一部を採取し、電気泳動により、ＰＣＲ増幅産物のサイズを分析する。上記８種のクローンＮｏ．８−４，８−５，８−６，Ｎｏ．１１−１，１１−２，１１−３，Ｎｏ．１０−７，１０−８から回収されたプラスミドは、いずれも、図５に示すように、挿入する予定のＤＮＡ断片のサイズ７４２ｂｐに相当するサイズのＰＣＲ増幅産物のバンドが明確に観測されている。
【０１３２】
調製した各プラスミド・ベクター中に含まれる、前記ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を確認するため、当該ＰＣＲ増幅された領域を鋳型として、別途ＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、シークエンス解析用試料を作製する。
【０１３３】
その際、シークエンス用プライマーとして、それぞれ、
フォワード・プライマー：ＧＳ１７
（配列番号：１０） ５’−GTACGTATTTTTACAACAATTACCAAC−３’
リバース・プライマー：ＧＳ１８
（配列番号：１１） ５’−GGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGC−３’
を用いて、前記塩基長７４２ｂｐの領域を鋳型とする片鎖増幅産物を調製する。該７４２ｂｐのＤＡＮ断片部分の塩基配列解析用に調製した、シークエンス解析用試料は、定法に従って、ＰＣＲ反応液にイソプロパノールを添加し、増幅産物の一本鎖ＤＮＡを沈澱させ、沈殿物として回収する。回収された増幅産物の一本鎖ＤＮＡは、バッファ液に再溶解し、シークエンス解析用試料とする。
【０１３４】
該７４２ｂｐのＤＡＮ断片部分から調製した、シークエンス解析用試料は、市販のシークエンス装置：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにかけ、５’末端側からの配列解析、ならびに、３’末端側からの配列解析をそれぞれ行う。
【０１３５】
５’末端側からの配列解析結果と、３’末端側からの配列解析結果とを総合し、二つのＳｆｉＩ制限酵素サイト間のクローニング・サイトに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列が、目的のＣｐ−ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードする塩基であること、また、ＰＣＲ増幅時の誤りを含まないことを確認する。
【０１３６】
ここでは、上記８種のクローンＮｏ．８−４，８−５，８−６，Ｎｏ．１１−１，１１−２，１１−３，Ｎｏ．１０−７，１０−８のうち、５種のクローンＮｏ．８−４，８−５，Ｎｏ．１１−３，Ｎｏ．１０−７，１０−８から回収されたバイナリー・ベクターに対して、前記のシークエンスによる、挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列の確認を行った。その結果、４種のクローンＮｏ．８−４，８−５，Ｎｏ．１１−３，Ｎｏ．１０−７から回収されたバイナリー・ベクターは、実際に、上流側のＳｆｉＩサイトＡから下流側のＳｆｉＩサイトＢに向かって、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡが、センス方向に挿入されていることが確認された。
【０１３７】
（Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターの導入による形質転換アグロバクテリウム菌株の作製）
前記シークエンス解析の結果、実際に、目的のＤＮＡが目的の方向に挿入されているバイナリー・ベクターであることが確認された、バイナリー・ベクターＮｏ．８−４ならびにＮｏ．１１−３を用いて、形質転換アグロバクテリウム菌株を作製する。アグロバクテリウム菌へのバイナリー・ベクターの導入は、エレクトロポレーション法を用いて行う。Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｌｌ ＧＶ３１０１の懸濁液４０μＬに、各バイナリー・ベクターの回収液２μＬを加えた後、エレクトロポレーション用セル中に入れ、エレクトロポレーション処理を施す。
【０１３８】
処理後、カナマイシンを５０ｐｐｍ含む寒天培地上で、アグロバクテリウム菌を培養し、コロニーを形成させる。予め、形質転換に用いるバイナリー・ベクターに関しては、目的のＤＮＡが目的の方向に挿入されているので、このカナマイシン耐性を示す各コロニーは、何れも、用いたバイナリー・ベクターが導入され、該バイナリー・ベクター中のカナマイシン耐性遺伝子が発現していると判断される。
【０１３９】
バイナリー・ベクターＮｏ．８−４、あるいはＮｏ．１１−３が導入されている形質転換菌株を培養する、それぞれの寒天培地上のコロニーを採取し、ＬＢ液体培地に懸濁する。この形質転換アグロバクテリウム菌株の懸濁液の一部を、種菌液として使用する。なお、形質転換アグロバクテリウム菌株の懸濁液の残る部分には、グリセロールを最終濃度１５％加えた後、−８０℃で保存する。
【０１４０】
（形質転換アグロバクテリウム菌株の感染による形質転換植物の創製）
形質転換アグロバクテリウム菌株の種菌を、カナマイシンを５０ｍｇ／Ｌ添加したＬＢ培地２００ｍＬに蒔種し、一晩振盪培養する。得られる培養液中から、菌体を回収する。回収された菌体は、５％Ｓｕｃｒｏｓｅを添加したＭＳ培地に懸濁し、菌体懸濁液を調製する。
【０１４１】
この事例では、前記バイナリー・ベクターＮｏ．８−４、ならびにＮｏ．１１−３をそれぞれ導入して作製した、形質転換菌株Ｎｏ．８−４、ならびに、形質転換菌株Ｎｏ．１１−３の菌体懸濁液を、植物体の形質転換に用いている。
【０１４２】
感染させる植物体は、土壌に種を播種後、約１．５ヶ月間栽培をした、シロイヌナズナ野生型Ｃｏｌ−Ｏを用いる。その生育した植物体の地上部に、前記菌体懸濁液を噴霧して、該植物体地上部の成長点に形質転換アグロバクテリウム菌を感染させる。
【０１４３】
前記感染処理を施した植物体を、他の植物体と隔離した上で、さらに、２ヶ月栽培し、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ１種子を収穫する。各植物個体から採集されたＴ１種子は、個別の容器中に保存する。
【０１４４】
各植物個体から採取したＴ１種子をそれぞれ、０．５ｇ、ハイグロマイシンを濃度２０ｐｐｍを添加する水性培地を浸した脱脂綿上に播き、発芽を行わせる。該ハイグロマイシン選抜培地上で、発芽した幼苗体は、選択マーカーのハイグロマイシン耐性遺伝子を保持している。このハイグロマイシン耐性の有無に基づき、一次選抜を行った幼苗体を、さらに２週間程度栽培し、本葉が出た時点で、鉢の土壌に移植する。
【０１４５】
この時点で、本葉の表皮に、ダーク・ライトを照射下において、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰに特有の黄緑色の蛍光を発する個体を選別する。選別された、ダーク・ライトを照射下において、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰに特有の黄緑色の蛍光を発する個体中、前記形質転換菌株Ｎｏ．１１−３により形質転換された植物体由来のＴ１種子から生育した植物個体（１１−３−３）と、野生型Ｃｏｌ−Ｏの種子から生育した植物個体とを、通常の白色光の照射下で対比して観察した結果を図６に、また、暗所において、ダーク・ライトを照射下において、対比して観察した結果を図７に、それぞれ示す。選別された植物個体（１１−３−３）は、暗所において、ダーク・ライトを照射下、その葉の表皮から、黄緑色の蛍光を発していることが確認される。一方、野生型Ｃｏｌ−Ｏの植物個体は、暗所において、ダーク・ライトを照射下においては、全く識別することができない。
【０１４６】
この葉の表皮細胞中において、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの組み換え発現を確認する、表現型スクリーニングによる二次選抜で選別された個体について、他の個体と隔離した上で、さらに、３ヶ月栽培し、各植物個体を自家交配して、それぞれのＴ２種子を収穫する。
【０１４７】
なお、前記表現型スクリーニングによる二次選抜で選別された植物個体複数について、生育し、花弁が形成される段階に達した時点で、該植物体の外観形状を、通常の白色光の照射下で対比して観察した結果を図８の（ａ）、図９の（ａ）に、また、暗所において、ダーク・ライトを照射下において、対比して観察した結果を図８の（ｂ）、図９の（ｂ）に、それぞれ示す。いずれの形質転換植物個体も、通常の白色光の照射下で観察する限り、該植物体の外観形状は、野生型Ｃｏｌ−Ｏの植物体の外観比較し、なんらの差異も見出せない。一方、暗所において、ダーク・ライトを照射下において観察すると、形質転換植物個体は、葉・茎の表皮、ならびに、花弁の表皮から、黄緑色の蛍光を発していることが確認される。
【０１４８】
形質転換菌株Ｎｏ．１１−３により形質転換された植物体由来のＴ１種子から、ハイグロマイシン耐性の有無に基づき、一次選抜を行った幼苗体６個体中、前記表現型スクリーニングによる二次選抜で選別された植物個体数は、３個体であった。また、形質転換菌株Ｎｏ．８−４により形質転換された植物体由来のＴ１種子から、ハイグロマイシン耐性の有無に基づき、一次選抜を行った幼苗体２４個体中、前記表現型スクリーニングによる二次選抜で選別された植物個体数は、１７個体であった。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明は、蛍光を発する形質転換植物を創製する、特には、植物体の葉などの多量のクロロフィル（葉緑素）を含む器官においても、高い効率で蛍光を発する形質転換園芸植物の創製する際、好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの蛍光スペクトルと、励起スペクトルを示す図である。
【図２】改変蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰ−Ｈ５２Ｆの蛍光スペクトル、ならびに励起スペクトルを示す図である。
【図３】Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの結晶構造を示す図であり、結晶の単位格子中に二量体として存在するＣｐＹＧＦＰの全体構造をリボンモデル表示したステレオ図である。
【図４】Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質Ｃｐ ＹＧＦＰの「ＧＹＧ」から形成されるｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ構造の蛍光団と、その近傍に位置するアミノ酸残基；Ｈｉｓ52、Ｔｙｒ59、Ａｒｇ85、Ｔｈｒ136、Ａｓｎ170、Ｇｌｕ207の側鎖の配置、ならびに、推定される水素結合、水素結合を介して、固定されている水分子の酸素原子の位置を示す部分構造図である。
【図５】シングル・コロニーＰＣＲ法において、ＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片に相当するＰＣＲ産物が得られた大腸菌コロニー１１−１，１１−２，１１−３，８-４，８-５，８−６，１０−７，１０−８に関して、それぞれの大腸菌コロニーから、プラスミドを抽出し、抽出されたプラスミドを鋳型に用いたプラスミドＰＣＲ法によって、ＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片に相当するＰＣＲ産物が得られることを確認した結果を示す。
【図６】バイナリー・ベクター１１−３で形質転換したアグロバクテリアをフローラル・ディッピング法で感染させたイロイヌナズナから採取したＴ１種子を、ハイグロマイシン添加選択培地上に播種し、発芽と、その後の生育の良否に基づき、ハイグロマイシン耐性の有無に関して、選択を行った後、ハイグロマイシン耐性を示す個体（１１−３−３）を、鉢内に通常の土壌に移植し、本葉が出た時期に、昼光光源の照射状態で、全体の概観を観測した、デジタル・カメラの画像プリント・アウトを示す。同鉢内には、参照として、野生型のイロイヌナズナを一株移植し、全体的な外観形状を比較している。
【図７】図６示す、ハイグロマイシン耐性を示す個体（１１−３−３）を、鉢内に通常の土壌に移植し、本葉が出た時期に、ダーク・ライト（紫外線光源）を照射した際、該本葉の表面で発する、組み換え発現型Ｃｐ ＹＧＦＰに由来する蛍光を観測した、デジタル・カメラの画像プリント・アウトを示す。
【図８】ハイグロマイシン耐性の有無による一次選択後、土壌に移植し、本葉が出た時期に、ダーク・ライト（紫外線光源）を照射した際、該本葉の表面で発する、組み換え発現型Ｃｐ ＹＧＦＰに由来する蛍光の有無による、表現型スクリーニングを施して、蛍光を発する個体として、二次選択された個体（１１−３−３）に関して、開花時期に、（ａ）全体的な外観形状、（ｂ）ダーク・ライト（紫外線光源）を照射した際、植物体全体における組み換え発現型Ｃｐ ＹＧＦＰに由来する蛍光の有無を観測した、デジタル・カメラの画像プリント・アウトを示す。
【図９】ハイグロマイシン耐性の有無による一次選択後、土壌に移植し、本葉が出た時期に、ダーク・ライト（紫外線光源）を照射した際、該本葉の表面で発する、組み換え発現型Ｃｐ ＹＧＦＰに由来する蛍光の有無による、表現型スクリーニングを施して、蛍光を発する個体として、二次選択された個体（８−４）に関して、開花時期に、（ａ）全体的な外観形状、（ｂ）ダーク・ライト（紫外線光源）を照射した際、植物体全体における組み換え発現型Ｃｐ ＹＧＦＰに由来する蛍光の有無を観測した、デジタル・カメラの画像プリント・アウトを示す。
【図１０】Ｘ線結晶構造解析により決定された、Ｃｈｉｒｉｄｉｕｓ ｐｏｐｐｅｉ由来のＧＦＰ様蛍光タンパク質ＣｐＹＧＦＰの結晶構造と、既に報告されているＤｓＲｅｄの結晶構造、ａｑＧＦＰの結晶構造との比較に基づき、対応する二次構造を構成するアミノ酸配列のアライメントを行った結果を示す。ＣｐＹＧＦＰの結晶構造において特定された、各二次構造の部分配列を、配列下に付記する。
【図１１】Ｔ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクター：ｐＢＩＧ２１１３ＳＦに対して、そのクローニング・サイト中に存在する、二つのＳｆｉＩ制限酵素サイトを利用して、野生型Ｃｐ ＹＧＦＰの完全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したＴ−ＤＮＡ型バイナリー・ベクターの構成を模式的に示す図である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００２３２０９２
【氏名又は名称】ＮＥＣソフト株式会社
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| 【出願日】 |
平成１８年７月２５日（２００６．７．２５） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１００１２３７８８
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 昭夫
【識別番号】１００１０６１３８
【弁理士】
【氏名又は名称】石橋 政幸
【識別番号】１００１２７４５４
【弁理士】
【氏名又は名称】緒方 雅昭
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| 【公開番号】 |
特開２００８−２２８１７（Ｐ２００８−２２８１７Ａ） |
| 【公開日】 |
平成２０年２月７日（２００８．２．７） |
| 【出願番号】 |
特願２００６−２０１８８１（Ｐ２００６−２０１８８１） |
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