トップ :: C 化学 冶金 :: C07 有機化学

【発明の名称】 Ｔ細胞レセプターＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列
【発明者】 【氏名】ジングウ、ゼッド．ツァン
【課題】一般的には多発性硬化症のような自己免疫疾患の治療に有用なペプチドを提供する。

【解決手段】Ｖβ１３．１Ｔ細胞のサブセットのＴ細胞レセプターに見いだされるよう共通モチーフである「ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフ」（アミノ酸配列ＬｅｕＧｌｙＡｒｇＡｌａＧｌｙＬｅｕＴｈｒＴｙｒ）を含んでなるペプチド。このモチーフと同一のペプチドを用いて患者にワクチン接種し、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹが関連する自己免疫疾患を治療または予防することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる、８〜３２アミノ酸長のペプチド。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドを含んでなる、自己免疫疾患の治療剤。
【請求項４】
自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項３に記載の治療剤。
【請求項５】
ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを発現するＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞を有するヒトに投与される、請求項３または４に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】【発明の背景】
【０００１】
1. 発明の分野
本発明は、一般的には多発性硬化症（ＭＳ）のような自己免疫疾患の治療の分野に関する。
【０００２】
更に詳細には、本発明は、幾人かのＭＳ患者で見られるＴ細胞レセプター配列、およびその検出法に関する。
【０００３】
2. 関連技術の説明
ヒトおよび他の哺乳類において、Ｔ細胞レセプターはＴ細胞上に見いだされる。Ｔ細胞レセプターはαおよびβ鎖を含んでなり、β鎖は下記のＮ末端からＣ末端までの領域Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ−Ｃβを含んでなる。Ｔ細胞レセプターは、本来Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ領域で変動する。
【０００４】
抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってＴ細胞に提示されると、偶々抗原を認識した可変領域（Ｖβ−Ｄβ−Ｊβなど）を含むＴ細胞レセプターはＡＰＣ上で抗原に結合する。従って、Ｔ細胞レセプターを有するＴ細胞が活性化する（クローン拡張）。
【０００５】
多くの自己免疫疾患の病因は、通常は生体によって提示される抗原に対する自己免疫Ｔ細胞応答にあると考えられている。このような疾患の一例は多発性硬化症（ＭＳ）であり、これはミエリン抗原、特にミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対するＴ細胞応答で発生すると一般に考えられている。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞はイン・ビボで活性化することが見いだされており、対照被験者とは異なり、ＭＳ患者の血液や脳脊髄液に一層高い前駆体頻度で存在する。これらのＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＴＮＦおよびγ−インターフェロンを産生する。これらのＴｈ１サイトカインは、炎症細胞の中枢神経系への移行を促進し、ＭＳでのミエリン破壊性炎症反応を悪化させる。
【０００６】
多くの調節機構を、ＭＳの治療に用いることができる。一つの方法は、細胞外ドメインを有する限定された数のＴ細胞の１個以上を用いるワクチン接種である。Vandenbarkの米国特許第５，６１４，１９２号明細書には、Ｔ細胞レセプターの第二の相補性決定領域（ＣＤＲ２）の少なくとも一部を含んでなる１５〜３０個のアミノ酸の免疫原性Ｔ細胞レセプターペプチドを用いる自己免疫疾患の治療が開示されている。Zhangの同時係属米国特許出願明細書（６０／０９９，１０２）には、免疫原性Ｔ細胞レセプターペプチドを免疫原性Ｔ細胞活性化マーカーペプチドと組み合わせて用いることによる自己免疫疾患の治療が開示されている。
【０００７】
Ｔ細胞レセプターペプチドを用いるワクチン接種を改良することができる一つの領域は、ＭＳのような自己免疫疾患患者のＴ細胞レセプターにどの共通モチーフが見いだされるかを決定することによるものである。このようなモチーフが見いだされれば、患者にモチーフと同一のペプチドをワクチン接種して治療を容易にすることができる。
【０００８】
従って、自己免疫疾患の患者のＴ細胞レセプターに見いだされる共通モチーフのアミノ酸配列を有することが望ましい。また、ＰＣＲのような通常の方法によって患者試料中のこれらのモチーフを容易に検出できることも望ましい。更に、検出されたモチーフと同一のペプチドを用いて、自己免疫疾患患者を治療することが望ましい。
【０００９】
本発明は、Ｖβ１３．１Ｔ細胞のサブセットのＴ細胞レセプターに見いだされるような共通モチーフである「ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフ」であって、アミノ酸配列Lue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr（配列番号：３）を有するもの、並びにＰＣＲによるその容易な検出法を開示する。このモチーフは、ＭＢＰのアミノ酸８３〜９９（以後、「ＭＢＰ８３−９９」）を認識する幾つかのＴ細胞の幾つかのＴ細胞レセプターに見いだされる。Ｖβ１３．１Ｔ細胞のこのサブセットに関するモチーフは、以後「Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ」と表されることがある。このモチーフと同一のペプチドを用いて患者にワクチン接種し、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹが関連する自己免疫疾患を治療または予防することができる。このような自己免疫疾患には、ＭＳがある。
【発明の概要】
【００１０】
一態様では、本発明は、配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的なまたはそれから誘導される配列に関する。更に好ましいものは、配列番号： の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。
最も好ましいものは、配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなる、長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。
【００１１】
一連の他の態様では、オリゴヌクレオチドを、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹＴ細胞に見いだされる核酸配列の増幅または検出に用いることができる。これらの態様の一サブシリーズでは、オリゴヌクレオチドをプライマーペアであって、 (a) 長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる第一のプライマー、またはそれに相補的な配列、および
(b) 配列(a)を含まない長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである第二のプライマーであって、この第二のプライマー配列はＴ細胞レセプターＴ細胞におけるＶβ１３．１遺伝子（配列番号：２）のＶβ〜Ｊβの領域に見いだすことができるもの
を含んでなりまたはから誘導され、
(a)および(b)の配列がＴ細胞レセプター遺伝子の同一鎖上には見られないことを特徴とする、プライマーペアに用いられる。
【００１２】
好ましくは、上記第一のプライマーは、配列番号：１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。最も好ましいものは、配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなる、長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。
【００１３】
これらの態様のもう一つのサブシリーズでは、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブであって、
(a) 長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列、および
(b) 標識残基
を含んでなる、オリゴヌクレオチドプローブとして用いられる。
【００１４】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続したヌクレオチド、またはそれに相補的な配列を含んでなる。最も好ましいものは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１のヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含んでなる。標識残基は、好ましくは３２Ｐまたはジゴキシゲニンから選択される
【００１５】
もう一つの態様では、本発明は、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを発現するＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞の検出法であって、
(i) ＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞から核酸試料を得て、
(ii) 核酸試料を、
(a) 長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含んでなり、配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる第一のプライマー、またはそれに相補的なまたはそこから誘導される配列、および
(b) (a)の配列を含まずかつＶβ１３．１Ｔ細胞（配列番号：２）におけるＶβ１３．１遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域に見いだされる長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含んでなる第二のプライマー
から選択されまたは誘導されるプライマーペアと接触させ、
(a)および(b)の配列がＶβ１３．１遺伝子の同一鎖上には見られず、
(iii) ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出する
ことを特徴とする、方法に関する。
【００１６】
好ましくは、第一のプライマーは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであって、配列番号： の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続したヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。最も好ましいものは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、配列番号：１のヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含んでなる。
【００１７】
更にもう一つの態様では、本発明は、自己免疫疾患の治療法であって、
(a) ヒトからＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞を得て、
(b) 上記の方法によってＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出し、核酸が検出される場合には、
(c) Lue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr（配列番号：３）ペプチドをヒトに投与する
ことを特徴とする、方法に関する。
【００１８】
更にもう一つの態様では、本発明は、自己免疫疾患の監視法であって、
(a) ヒトからＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞を得て、
(b) 上記の方法によってＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出し、核酸が検出される場合には、
(c) 核酸を定量する
ことを特徴とする、方法に関する。
【００１９】
図面は本明細書の一部を形成しており、本発明の幾つかの態様を更に説明する目的で包含される。本発明は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによって更に良好に理解されるであろう。
【好ましい態様の説明】
【００２０】
本発明の理解を助けるために、幾つかの用語を下記に定義する。
【００２１】
「ＰＣＲ」は、米国特許第４，６８３，２０２号明細書（１９８７年７月２８日、Mullinsに発行）に総括的に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、上記特許請求の範囲の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。ＰＣＲは、選択されたオリゴヌクレオチドまたはプライマーを重合剤（例えば、ポリメラーゼ）および４種類のヌクレオチドトリホスフェートの存在下にて核酸鋳型にハイブリダイゼーションし、伸張生成物をプライマーから形成させる増幅技術を意味する。次に、これらの生成物を変性させ、循環反応の鋳型として用い、存在する核酸の数および量を増幅し、続いて行うそれらの検出を容易にする。様々なＰＣＲ技術を利用することができ、本発明による方法と共に用いることができる。
【００２２】
「プライマー」とは、鋳型分子上の特異的ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ合成の開始点として作用することができる天然または合成のいずれのオリゴヌクレオチドをも意味する。
【００２３】
「から誘導される（複数の）プライマーまたは（複数の）プローブ」という用語に関する「から誘導される」とは、プライマーまたはプローブが上記の（複数の）ヌクレオチド配列に限定されず、上記の（複数の）配列に対する変化がＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列、すなわちLue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr（配列番号：３）をコードするＴ細胞レセプターＤＮＡの検出においてプライマーとして作用する能力を保持している程度までヌクレオチド付加、欠失、または置換などの上記の（複数の）ヌクレオチド配列における変動をも包含することを意味する。
【００２４】
「免疫原性」とは、ペプチドの記載に用いるときには、ペプチドがＴ細胞依存性、抗体または両方の免疫応答を誘発することができることを意味する。「抗原性」とは、ペプチドを、遊離の形態で抗体によってまたは抗原特異的Ｔ細胞の場合にはＭＨＣ分子に関して認識することができることを意味する。
【００２５】
「免疫関連疾患」とは、免疫系が疾患の病因に関与している疾患を意味する。
免疫関連疾患のサブセットは、自己免疫疾患である。本発明によって考えられる自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、グレーヴズ病、炎症性腸疾患、自己免疫ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、およびある種の糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の開示により、当業者であれば、本発明の組成物および方法によって治療可能な自己免疫疾患を容易に理解することができる。「Ｔ細胞依存性疾患」とは、Ｔ細胞が生体に通常に見られるペプチドを認識する結果として、生体で引起こされる疾患を意味する。
【００２６】
「治療」または「治療する」とは、動物を疾患から保護することを表すときには、疾患の予防、抑制または抑圧を意味する。疾患の予防は、疾患の誘発前に動物に本発明の組成物を投与することを伴う。疾患の抑制は、疾患の誘発後であるが臨床的出現の前に動物に本発明の組成物を投与することを伴う。疾患の抑圧は、疾患の臨床的出現の後に動物に本発明の組成物を投与することを伴う。ヒト医薬では、疾患誘発の経過において本発明の組成物を投与するときを常に知ることはできないことを理解されるであろう。
【００２７】
一態様では、本発明は、
(a) 配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸である第一のプライマー、および
(b) (a)の配列を含まずかつＶβ１３．１Ｔ細胞におけるＴ細胞レセプター遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域に見いだされる長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである第二のプライマー
の配列またはから誘導される配列を含んでなるプライマーペアであって、
(a)および(b)の配列がＴ細胞レセプター遺伝子の同一鎖上には見られないことを特徴とする、プライマーペアに関する。
【００２８】
好ましくは、上記第一のプライマーは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号： の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続したヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。最も好ましいものは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。
【００２９】
本発明によるプライマーは、ヒトＶβ１３．１Ｔ細胞のＴ細胞レセプターをコードする遺伝子の断片であって、アミノ酸モチーフLue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr（配列番号：３）を含んでなる断片を増幅するようにデザインされている。ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含んでなるＴ細胞レセプターをコードするＶβ１３．１Ｔ細胞由来の遺伝子は、登録番号ＡＦ１１７１３２でGenBankに寄託されている。ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含んでなるＴ細胞レセプターをコードするＶβ１３．１Ｔ細胞由来の遺伝子の配列は、本明細書では配列番号：２として示す。本発明による方法では、Ｖβ１３．１Ｔ細胞からのＴ細胞レセプター遺伝子の約４００bpの断片は、第一のプライマーがＣＤＲ３領域にあり、第二のプライマーがＣβ領域にある二種類のプライマーを用いて増幅される。Ｔ細胞レセプター遺伝子のＶβ−Ｄβ−Ｊβは、ＣＤＲ３とＣβ領域の間にある。好ましい態様では、プライマーは上記のプライマーペアである。
【００３０】
本発明によるプライマーは、プライマー(a)および(b)から誘導されるオリゴヌクレオチドも包含する。配列がこれらのプライマーの一方と実質的に同一の配列を有するかまたは含み、上記とほぼ同一のＶβ１３．１Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子のＶβ−Ｄβ−Ｊβ領域のＣＤＲ３またはＣβ領域に選択的にアニールする能力を保持している場合には、この配列はプライマー(a)または(b)から誘導される。更に詳細には、このプライマーは、Ｖβ１３．１Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子のＶβ−Ｄβ−Ｊβ領域の同定された領域に対する選択性を保持している限り、プライマー(a)または(b)とは長さまたは配列に沿った１以上の位置における核酸の種類が異なっていてもよい。例えば、このプライマーは、少なくとも１５ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドであってもよく、１５ヌクレオチドはプライマー(a)−(b)の配列から選択されまたは誘導された一連の１５個の連続した核酸と同一である。このプライマーは、プライマー(a)−(b)の配列から選択されまたは誘導された配列を有する部分を含んでなる約３０ヌクレオチド以下の任意のオリゴヌクレオチドであってもよい。プライマー中のヌクレオチドの数は、プライマー合成およびＰＣＲ手続きにおける選択性を保持するのに十分な高さでありかつ効率性および操作性を保持するのに十分な低さであるべきである。プライマーは、プライマー(a)−(b)の配列の変化がＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹの検出においてプライマーとして作用する能力を保持している程度までヌクレオチド欠失、付加または置換などの変動を有することができる。
【００３１】
本発明によるＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ検出法は、試料中の任意のＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹの存在を検出する手続きにおいて、上記プライマーの対を用いる。Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹの存在について試験を行う試料は、核酸であり、好ましくはＤＮＡである。このＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲによって予め増幅されたＤＮＡ、または任意の他の形態のＤＮＡであることができる。試料は、Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子を発現する任意の動物またはヒトの体組織から直接または間接的に単離することができる。好ましい体組織は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。試料がゲノムＤＮＡである場合には、これは体組織から直接単離することができる。試料がｃＤＮＡであるときには、これは体組織から直接単離したｍＲＮＡの逆転写によって間接的に単離される。試料がＰＣＲによって予め増幅されたＤＮＡであるときには、これはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは任意の他の形態のＤＮＡの増幅によって間接的に単離される。
【００３２】
好ましい態様では、Ｖβ１３．１Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子の一部であって、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする配列を含んでなる部分を増幅して、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ（5'-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3'（配列番号：１））の存在を検出する能力を高める。増幅は、試料中の部分を高感度で選択的および迅速に増幅するいずれか特定のＰＣＲ技術または装置を用いてＰＣＲ反応によって行うことができる。
【００３３】
例えば、ＰＣＲ増幅は、下記の成分：５μl１０×ＰＣＲ緩衝液II（１００mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５００mMＫＣｌ）、３μｌ２５mMＭｇＣｌ２、１μl１０mMｄＮＴＰ混合物、０．３μlＴａｑポリメラーゼ（５U/μl）（AmpliTaq Gold, Perkin Elmer, ノーウォーク, コネティカット）、プライマーＡ３０ピコモル、およびプライマーＢ３０ピコモルを含む反応混合物を調製する手続きの後に行うことができる。本発明の開示を考慮すれば、当業者であれば、適当なプライマーＡおよびＢを選択し、Ｖβ１３．１Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子の部分をＰＣＲ増幅することができるであろう。上記混合物は、試料ＤＮＡ１μlを増幅するのに適している。以後、増幅を行うＤＮＡを、「鋳型」と呼ぶことができる。
【００３４】
試料ＤＮＡを上記反応混合物に加えたならば、ＰＣＲ反応を、９５℃で１分間（変性）、５６℃で２０秒間（アニーリング）、および７２℃で４０秒間（伸張）の全部で３５サイクルの増幅プロフィールで行うことができる。
【００３５】
ＰＣＲ反応において、鋳型を熱変性し、アニーリングして、二種類のオリゴヌクレオチドプライマーとすることができる。オリゴヌクレオチドは、増幅を行う核酸配列の領域を一括している。熱に安定なＤＮＡポリメラーゼは、反応混合物に含まれる。ポリメラーゼは、適当な相補的ヌクレオチドを加えることによって相補的ＤＮＡにアニーリングしたプライマーを伸張する。好ましいポリメラーゼは、少なくとも９５℃の温度で安定であるという特徴を有し、５０〜６０の加工性(processivity)を有し、毎分５０ヌクレオチドを上回る伸張速度を有する。
【００３６】
約４０ＰＣＲサイクルが、典型的なＰＣＲ増幅反応で用いられる。しかしながら、ある種のＰＣＲ反応では、１５〜２０サイクル程度または５０サイクル程度を処理することができる。それぞれのサイクルは、鋳型を約９５℃を上回る温度にまで加熱する溶融段階からなっている。
【００３７】
次に、ＰＣＲ反応の温度を下げて、プライマーを鋳型にアニーリングする。このアニーリング段階では、反応温度を約５５℃〜７２℃に約２０秒間調節する。
特定の反応によっては、これより長または短時間処理することもできる。
【００３８】
次に、ＰＣＲ反応の温度を上げて、ポリメラーゼによってプライマーの伸張を最大にする。この伸張段階では、反応温度を、約７０℃〜７５℃に約４０秒間調節する。特定の反応によっては、これより高温または低温、および／またはこれより長または短時間処理することもできる。
【００３９】
更に、一回目のサイクルを開始する前に、反応混合物に初期変性を約５分〜１５分間行うことができる。同様に、最後のサイクルを終了した後に、反応混合物に最終伸張を約５分〜１０分間行うこともできる。
【００４０】
増幅は、二段階ＰＣＲを用いて行うことができる。この手法では、第一のＰＣＲ増幅反応を行って、目的とする領域より大きくかつを含んでなる第一の領域を増幅する。次に、第二のＰＣＲ増幅反応を、第一の領域を鋳型として用いて行い、目的とする領域を増幅する。第一のＰＣＲ反応からのいずれのプライマーも第二のＰＣＲ反応で用いることができるときには、第二のＰＣＲ反応は「セミ−ネステド(semi-nested)」である。第一のＰＣＲ反応からのプライマーのいずれも第二のＰＣＲ反応で用いることができないときには、第二のＰＣＲ反応は「ネステド(nested)」である。
【００４１】
本発明の方法を行う好ましい方法では、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを二段階ＰＣＲによって増幅する。第一のＰＣＲ反応では、試料をＴ細胞レセプター遺伝子のＶβ領域にアニーリングする第一のプライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子のＣβ領域にアニーリングする第二のプライマーを用いて、反応混合物および上記のプロフィールを用いて増幅する。第一のＰＣＲ反応は、約６００bpである第一の領域を増幅し、ＶβからＶβ−Ｄβ−Ｊβ接合を介してＣβへ伸張する。第二のＰＣＲ反応はネステドまたはセミ−ネステドであり、第一の領域の一部は、プライマー(a)−(b)を用いて部分増幅される。第二のＰＣＲ反応では、目的とする領域を増幅する。
【００４２】
試料中のＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹをコードする任意のＤＮＡを増幅した後、増幅生成物を検出する。この検出は、多数の方法によって行うことができる。例えば、増幅生成物の一部を電気泳動ゲルに装填し、これに電場をかけて、大きさによってＤＮＡ分子を分離することができる。もう一つの方法では、増幅生成物の一部を、ＳＹＢＲグリーン、臭化エチジウム、またはＤＮＡに結合して検出可能なシグナルを発する別の分子で染色したゲルに装填する。例えば、私有化エチジウムはＤＮＡに結合し、紫外光線で照明すると可視光線を放射する。乾燥ゲルは、増幅した鋳型の配列の一部に相補的な放射能−または化学−標識オリゴヌクレオチド（以後、「オリゴヌクレオチドプローブ」と呼ぶことができる）を含み、これからゲルをフィルムに暴露することによってオートラジオグラフを行うこともできた。
【００４３】
もう一つの態様では、本発明は、
(a) 配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸、および
(b) 標識残基
を含んでなる、オリゴヌクレオチドプローブに関する。
【００４４】
好ましくは、「(a)」は、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続したヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。最も好ましくは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。好ましくは、標識残基は、３２Ｐまたはジゴキシゲニンから選択される。
【００４５】
本発明のプライマーを用いて生成された増幅生成物の検出に有用な典型的な放射能標識したオリゴヌクレオチドを、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ領域から取り出す。Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ領域を、上記の二段階のセミネステドＰＣＲによって増幅し、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする配列に相当するプライマーを用いるときには、約１０以上のヌクレオチド、好ましくは約１８以上のヌクレオチドを有し、増幅したＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ領域のいずれかの鎖の一部に相補的な任意のオリゴヌクレオチドを用いることができる。更に好ましくは、オリゴヌクレオチド5'-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3'（配列番号：１）またはそれに相補的な核酸配列が、プローブとして用いられる。
【００４６】
本発明は、第一のプライマー(a)で長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドまたはそれに相補的な核酸配列を含んでなる、試験キットでもある。
【００４７】
好ましい態様では、この試験キットは、第二のプライマー(b)をも含んでなり、第二のプライマーは、(a)のオリゴヌクレオチドの配列を含まず、Ｔ細胞におけるＶβ１３．１Ｔ細胞レセプター遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域に見いだされる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの核酸配列であり、
(a)および(b)の配列がＴ細胞レセプター遺伝子の同一鎖上には見られない。
【００４８】
更に好ましくは、上記第一のプライマーは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１５〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。最も好ましいものは、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであり、配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な配列である。
【００４９】
この態様では、試験キットは、上記のＰＣＲ技術によるＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ ＤＮＡの増幅に有用な少なくとも一種類の試薬をも含んでなる。このキットに配合することができる代表的試薬としては、緩衝液、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、正の対照に対するＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ ＤＮＡ、および負の対照に対する非−Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。試験キットに配合することができる他の試薬は、当業者には知られている。
【００５０】
もう一つの好ましい態様では、試験キットは標識残基をも含んでなる。好ましくは、標識残基は３２Ｐまたはジゴキシゲニンである。
【００５１】
本発明は、自己免疫疾患の治療法をも含んでなる。この疾患は、少なくとも幾人かの患者については、ＬＧＲＡＧＬＴＹを含んでなるＴ細胞レセプターがＶβ１３．１Ｔ細胞上に見いだされるものである。他の種類のＴ細胞、および／またはＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含んでなるＴ細胞レセプターを欠くＶβ１３．１Ｔ細胞を患者が有することもある。
【００５２】
自己免疫疾患の治療法は、
(a) ヒトからＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞を得て、
(b) Ｔ細胞中にＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出し、核酸が検出されるときには、
(c) Lue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr（配列番号：３）ペプチドをヒトに投与する
ことを特徴とする。
【００５３】
自己免疫疾患は、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含んでなるＴ細胞レセプターがＶβ１３．１Ｔ細胞上に見いだされる任意の自己免疫疾患であることができる。
本発明により考えられる自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、グレーヴズ病、炎症性腸疾患、自己免疫ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、およびある種の糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい自己免疫疾患は多発性硬化症（ＭＳ）である。
【００５４】
ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸が上記の方法によって検出されるときには、自己免疫疾患はLue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr（配列番号：３）を含んでなるペプチドを投与することによって治療することができる。このペプチドは、単独で、またはＴ細胞活性化マーカーペプチドと組み合わせて投与することができる。好ましくは、ペプチドは、Zhangの米国特許出願明細書６０／０９９，１０２の開示に準じてＴ細胞活性化マーカーペプチドと組み合わせて投与されるのであり、上記特許出願明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。ペプチドを投与することにより、免疫原性応答を生じ、患者はＶβ１３．１Ｔ細胞上に見いだされるＴ細胞レセプターのＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを認識してこれに結合する抗体およびＴ細胞レセプターを発現することができる。
【００５５】
Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹはＭＳに罹っている患者およびこの疾患にかかっていない正常な被験者のいずれにも存在することができるので、Lue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr（配列番号：３）ペプチドをＭＳ患者および正常な被験者のいずれにも投与することができると考えられる。
【００５６】
もう一つの態様では、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸が上記方法によって検出されるときには、自己免疫疾患は核酸を定量することによって監視することができる。ＰＢＭＣのような試料に含まれる核酸の量が多くなれば、Ｖβ１３．１Ｔ細胞の数は増加し、自己免疫疾患の症状の予想される重さも大きくなる。また、増加したＶβ１３．１Ｔ細胞水準の提示および症状の出現の間の時間によっては、臨床医は症状の重さを最小限にし、および／または症状が現れる前に疾患を治療する目的で治療を行う機会を得ることができる。
【００５７】
下記の例は、本発明の好ましい態様を例示する目的で挙げられている。当業者であれば、下記の例に開示されている技術は、発明の実施において良好に機能するように本発明者によって見いだされた技術を表し、従って、その実施の好ましい様式を構成すると考えることができることが理解されるであろう。しかしながら、当業者は、本発明の開示に関して、開示されている特定の態様に多くの変更を行うことができ、本発明の精神および範囲から離反することなく類似または同様な結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【００５８】
例１
Ｔ細胞レセプターＶβ−Ｄβ−Ｊβ ＤＮＡ配列、および様々なＭＳ患者から誘導されるＭＢＰ８３−９９特異的Ｔ細胞クローンの間で共有される配列モチーフ ２０ＣＤ４＋独立Ｔ細胞クローンのパネルを、７名のＭＳ患者から作成した。
総てのＴ細胞クローンは、抗原提示細胞としてＤＲＢ１＊１５０１をトランスフェクションしたマウス繊維芽腫細胞（Ｌ細胞）を用いて測定したＨＬＡ−ＤＲ２に関してミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ８３−９９）の８３〜９９ペプチドを認識した。Ｔ細胞クローンを、Ｖα−およびＶβ−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）におけるＴＣＲ Ｖ遺伝子転位について特性決定した後、Ｖα−ＪαおよびＶβ−Ｄβ−Ｊβ結合領域について配列決定した。結合領域の配列を、表１および２に示す。
【００５９】
表１は、Ｖα遺伝子ファミリーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのパネルを用いる逆転写ＰＣＲによりＶα遺伝子の用法に準じて特性決定した２０名の独立ＭＢＰ８３−９９特異的Ｔ細胞クローンのパネルを用いる分析の結果をまとめている（使用したユニークプライマーの配列は、それぞれのクローンに相当するＤＮＡ配列に下線を施すことによって示す）。それぞれのクローンの「Ｖα」、「ｎ」、「Ｊα」および「Ｃα」部分のアミノ酸配列を、下記のように表１に示し、「ｎ」部分は下線を施し、「Ｖα」および「Ｊα」配列は「ｎ」配列の両側で肉太活字で示し、「Ｃα」配列は下線を施さない通常フォントで示す。増幅したＰＣＲ生成物をジゴキシゲニン標識ＣαｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションした後、ＤＮＡ配列について分析した。
【００６０】
表２は、２０名の独立ＭＢＰ８３−９９特異的Ｔ細胞クローンのパネルの分析結果をまとめている。クローンを２６のＶβ遺伝子ファミリーに特異的な一組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる逆転写ＰＣＲによってＶβ遺伝子の用法について分析した（それぞれのクローンの特異的プライマーの配列は、相当するＤＮＡ配列に下線を施すことによって示す）。それぞれのクローンの「Ｖβ」、「Ｄ」、「Ｊβ」および「Ｃβ」部分を下記のように表２に示し、「Ｄ」部分は下線を施し、「Ｖβ」および「Ｊβ」配列は、「Ｄ」配列の両側で肉太活字で示し、残りの配列である「Ｃβ」配列は通常フォントで示す（下線を施したりまたは肉太活字にしたりしない）。増幅したＰＣＲ生成物をジゴキシゲニン標識ＣβｃＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションした後、ＤＮＡ配列について分析した。
【００６１】
【表１】






【００６２】
【表２】










【００６３】
ＶαおよびＶβ転位は個々のＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローンの間で変化したが、所定の被験者由来のこれらの独立Ｔ細胞クローンの多くは、同一のＶα−ＪαおよびＶβ−Ｄβ−Ｊβ結合領域の配列を有する同一のＶαおよびＶβ鎖を共有した。この知見は、以前に報告された(Vandevyver 1995, Wucherpfenning 1994)所定のＭＳ患者でのＭＢＰ８３−９９特異的Ｔ細胞のイン・ビボでのクローン伸張と一致する。
【００６４】
興味深いことには、表１および２に示したように、ある患者（ＭＳ−１）由来の独立Ｔ細胞クローン（クローンＥ２．６）は、別の患者（ＭＳ−２）から得た４個のＴ細胞の３個（クローンＣ３．１、Ｄ７．１６およびＦ３．４）を有する同じＶβ１３．１およびＶα１７を共有した。これらのＴ細胞クローンのＶβ１３．１は、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ接合領域内に同一のＤＮＡ配列を共有した。
【００６５】
例２
Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、元のＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローン並びに元のＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローンを含むＰＢＭＣに含まれる相当するＤＮＡ配列の検出に極めて特異的かつ高感度であった
１４個のオリゴヌクレオチドプライマーの組を独立ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ結合領域内でＤＮＡ配列に準じて合成した後、ＲＴ−ＰＣＲでのそれらの特異性について検討した。これらのオリゴヌクレオチドプライマーのＤＮＡ配列を、表３に示す。
【００６６】
【表３】


【００６７】
これらのＶβ−Ｄβ−Ｊβ特異的プライマーは元のＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローンに含まれるＤＮＡ配列のみに結合し、関連のないＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローン由来の配列には結合せず（図２）、元のＶβ−Ｄβ−ＪβＤＮＡ配列に対する特異性が高いことを示唆していた。唯一の例外はクローンＭＳ１−Ｅ２．６およびクローンＭＳ２−Ｃ３．１について見られ、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ結合ＤＮＡ配列に結合した同一プライマーがこれらの両Ｔ細胞クローンによって共有された。
【００６８】
Ｖβ−Ｄβ−Ｊβオリゴヌクレオチドプライマーが特異的でありかつＰＣＲ検出系の感度が高いことを考慮し、５′ＶβプライマーおよびＶβ−Ｄβ−Ｊβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるこの二段階ＰＣＲ検出系を用いて、ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローンが生じる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）標本に含まれる相当するＶβ−Ｄβ−ＪβＤＮＡ配列を検出することができるかどうかを検討した。二種類の別々の実験の結果は、元のＰＢＭＣ標本におけるＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列の正の検出を示した。従って、これらの知見は、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ配列が指紋として役に立つＰＣＲ検出系が、同一ＤＮＡ配列のプロービングによる末梢血単核細胞に含まれるＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞のトレースにおいて特異的かつ敏感であることを示していた。
【００６９】
例３
様々なＭＳ患者および健常被験者由来のＰＢＭＣ標本での共通のＶβ−Ｄβ−ＪβＤＮＡ配列の検出
次に、ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ結合領域に相当するＤＮＡ配列を、ＭＳ患者および健常被験者の群から無作為に選択したＰＢＭＣ標本で検出することができるかどうかを検討した。（第一のＰＣＲにおける）相当するＶβファミリーに特異的なプライマーおよび（第二のセミ−ネステドＰＣＲにおける）Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ配列に特異的なプライマーを用いる同じＰＣＲ増幅系を用いた。これを、相当するＶβ−Ｄβ−Ｊβプローブを有するサザンブロット分析と組み合わせて、ハイブリダイゼーションを行った。二段階ＰＣＲ検出系の特異的要件およびＶβ−Ｄβ−Ｊβプライマーおよびプローブの特異性を考慮すれば、同一ＤＮＡ配列は特異的ＴＣＲＶβ鎖に由来し、目的とするＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列と同一または類似している。
【００７０】
これらの結果は、一種類のＶβ−Ｄβ−Ｊβオリゴヌクレオチドプライマー（ＭＳ１−Ｅ２．６，Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ）のみが、様々なＭＳ患者から得た４８個のＰＢＭＣ標本の１５個（３１％）において相補的ＴＣＲＶβ１３．１ＤＮＡ配列を検出することを示唆した。従って、この知見は、これらのＭＳ患者にＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹを発現するＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞が含まれることを示唆している。同様の実験条件下で、同じプライマーは健常被験者由来の２０個のＰＢＭＣ標本の５個（２５％）でも相当するＤＮＡ配列を検出した。残りの１３個のＶβ−Ｄβ−Ｊβプライマーは、同じパネルのＰＢＭＣ標本での任意の配列シグナルの同定に失敗した。これらの結果は、三つの別々の実験で再現性を有していた。同定したＤＮＡ生成物は、Ｖβ１３．１を発現するＴ細胞由来のＥ２．６プライマーによって増幅したが、Ｖβ１３．１特異的プライマーを最初のＰＣＲで用いて増幅したからである。
【００７１】
更に、同定したＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を、ＰＢＭＣ標本がＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を含むことが示された５名のＭＳ患者由来の２４個の短期ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞系の１３個（５４％）でも増幅した。これらの結果から、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ ＤＮＡ配列がＭＢＰ８３−９９を認識するＴ細胞由来のＰＢＭＣ標本で検出されることを確かめた。この知見は、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を発現するＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞が幾人かのＭＳ患者で見られるＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞系の総てまたは大半であることも示している。
【００７２】
Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ配列が指紋として用いられる組合せＰＣＲ−ＤＮＡハイブリダイゼーション検出系は、同一のＶβ−Ｄβ−Ｊβ結合配列を検出することによって抗原特異的Ｔ細胞のトレースに強力な手段を提供した。検出系の特異性が高くかつ高感度であることにより、末梢血Ｔ細胞中の特異的Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ配列が同定された。本研究は、ＭＢＰの主要抗原８３−９９ペプチドを認識し、同一のＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列を均一に発現するＶβ１３．１Ｔ細胞の共通のサブセットはＭＳ患者の約３０％に存在することを初めて立証した。この結論は、本明細書に記載の段階的実験に基づいてなされる。第一に、同一のＤＮＡ配列（Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ）が、様々なＭＳ患者由来の独立したＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローン中に見いだされた。第二に、様々なＭＳ患者から得たＰＢＭＣ標本のＴＣＲＶβ１３．１から増幅したｃＤＮＡ生成物で、配列を同定した。第三に、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を含むことが示されたＰＢＭＣ標本由来の短期独立ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞系で、配列を検出した。Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を発現するＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞は、幾人かのＭＳ患者由来のＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞系の総てまたは大半であると思われる。最後に、ＰＢＭＣ標本におけるＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列の存在は、組換えＤＮＡクローニングおよび直接ＤＮＡ配列決定によって立証された。
【００７３】
更に、共通のＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を発現するＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞は、健常被験者中にも存在することは、意外なことではない。これまでに報告された研究は、主要抗原８３−９９ペプチドを認識するＴ細胞などのＭＢＰ反応性Ｔ細胞は健常被験者にも存在することを示唆している(Zhang 1994, Ota 1990)。しかしながら、これらのＴ細胞は、健常被験者とは異なり、ＭＳ患者ではイン・ビボでの活性化およびクローン伸張を行うという機能上の差異がある(Zhang, 1994)。
【００７４】
共通のＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列を共有するこれらのＶβ１３．１ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞は、幾人かのＭＳ患者で見られるＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞の有意な画分を表すことがある。この可能性は、２回の刺激サイクルの後にＭＳ患者由来の短期ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞系の４０％にＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列が存在するという観察によって支持される。
【００７５】
同定した共通のＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列を定量的ＰＣＲ検出系で特異的マーカーとして用いて、ＭＳ患者の大きな群の血液および脳脊髄液におけるＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞の共通のサブセットを検出し、イン・ビボでのクローン伸張およびこの疾患と潜在的に関連したイン・ビボ活性を観察することができる。この方法は、通常の細胞培養に基づいた分析法より優れており、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞のイン・ビトロでの選択および伸張は、細胞培養に固有の様々な阻害因子によって妨げられることが多いからである。これは、直接エクス・ビボ分析を用いてＭＢＰ反応性Ｔ細胞を定量するときには、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度がＭＳ患者で予想外に高いことが見いだされた細菌の研究と一致している(Hafler as last author JEM 1997)。
【００７６】
更に、ＴＣＲに相当する合成ペプチドは、ＭＳ患者でのＭＢＰ反応性Ｔ細胞に対する抗イディオタイプＴ細胞を誘導することが示された(Chou et al., J.I.)。従って、共通ＣＤＲ３配列を含むＴＣＲペプチドは、抗イディオタイプＴ細胞を誘導して、ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞が共通ＣＤＲ３配列モチーフを有する患者の群におけるＭＢＰ８３−９９反応性Ｔ細胞の特異的サブセットを抑制する大きな可能性を有することがある。このような共通ＣＤＲ３ペプチドで免役することは、ＭＳ患者における可能な治療手続きとしてのＣＤＲ３ペプチドまたは個体依存性のＣＤＲ３ペプチドと比較して遊離である(Vandenbark 1996)。
【００７７】
本明細書に開示し、特許請求した総ての組成物および／または方法は、本発明の開示を考慮すれば、過度の実験なしに作成し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して説明してきたが、組成物および／または方法、および本明細書記載の方法の段階または段階の順序において本発明の概念、精神および範囲から離反することなく変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。更に具体的には、化学的および生理学的に関連しているある種の薬剤を本明細書記載の薬剤の代わりに用いることができ、同一または類似の結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかなこれら総ての同様な置換基および改質は、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【００７８】
本発明は以下の通りである。
（１）配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる、長さが約１５〜３０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸。
（２）配列番号：１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含んでなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸。
（３）配列番号：１の配列を含んでなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸。
（４）(a) 配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第一のプライマー、またはそれに相補的な核酸、および
(b) (a)の配列を含まずかつＴ細胞レセプターＴ細胞におけるＶβ１３．１遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域に見いだされる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの核酸を含んでなる第二のプライマー
を含んでなるプライマーペアであって、
上記第一および第二のプライマーの配列がＴ細胞レセプター遺伝子の同一鎖上には見られないことを特徴とする、プライマーペア。
（５）Ｖβ１３．１遺伝子配列が配列番号：２である、（４）に記載のプライマーペア。
（６）(a) 配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸、および
(b) 標識残基
を含んでなる、オリゴヌクレオチドプローブ。
（７）標識残基が３２Ｐまたはジゴキシゲニンから選択される、（６）に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
（８）Ｔ細胞レセプターＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを発現するＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞の検出法であって、
(a) ＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞から核酸試料を得て、
(b) 核酸試料を、
(i) 配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第一のオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸、および
(ii) 第一のオリゴヌクレオチドの配列を含まずかつＴ細胞レセプターＴ細胞におけるＶβ１３．１遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域に見いだされる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第二のオリゴヌクレオチド
から選択されまたは誘導されるプライマーペアと接触させ、
第一および第二のオリゴヌクレオチドの配列がＴ細胞レセプター遺伝子の同一鎖上には見られず、
(c) ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出することを特徴とする、方法。
（９）Ｖβ１３．１遺伝子が配列番号：２である、（８）に記載の方法。
（１０） 核酸試料の断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する、（８）に記載の方法。
（１１）検出段階が、
(a) 配列番号：１の配列を含んでなるオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸、および
(b) 標識残基
を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブを用いてプロービングすることを含んでなる、（１０）に記載の方法。
（１２）検出段階が、オートラジオグラフィーを含んでなる、（１０）に記載の方法。
（１３）長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第一のオリゴヌクレオチドであって、配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる上記第一のオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸を含んでなる試験キット。
（１４）上記第一のオリゴヌクレオチドの配列を含まず、Ｔ細胞レセプターＴ細胞のＶβ１３．１遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域に見いだされる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第二のオリゴヌクレオチドをも含んでなり、第一および第二のオリゴヌクレオチドの配列がＴ細胞レセプター遺伝子の同一鎖上には見られない、（１３）に記載の試験キット。
（１５）Ｖβ１３．１遺伝子配列が配列番号：２である、（１４）に記載の試験キット。
（１６）標識残基をも含んでなり、標識残基が３２Ｐまたはジゴキシゲニンから選択される、（１３）に記載の試験キット。
（１７）ヒトの自己免疫疾患の治療法であって、
(a) ヒトからＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞を得て、
(b) ＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞から核酸試料を得て、
(c) 核酸試料を、
(i) 配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる、長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第一のオリゴヌクレオチド、および
(iii) 上記第一のオリゴヌクレオチドの配列を含まずかつＴ細胞レセプターＴ細胞のＶβ１３．１遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域に見いだされる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第二のオリゴヌクレオチド
から選択されまたは誘導されるプライマーペアと接触させ、
(d) ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出し、核酸が検出される場合には、
(e) Lue Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr（配列番号：３）ペプチドをヒトに投与する
ことを特徴とする、方法。
（１８）Ｖβ１３．１遺伝子配列が配列番号：２である、（１７）に記載の方法。
（１９）投与段階が、Ｔ細胞活性化マーカーペプチドの投与も含んでなる、（１７）に記載の方法。
（２０）自己免疫疾患の監視法であって、
(A) ヒトからＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞を得て、
(B)(i) ＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１Ｔ細胞から核酸試料を得て、
(ii) 核酸試料を、
(a) 配列番号：１の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでなる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第一のオリゴヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸、および
(b) 上記第一のオリゴヌクレオチドの配列を含まずかつＴ細胞レセプターＴ細胞のＶβ１３．１遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域に見いだされる長さが約１５〜３０ヌクレオチドの第二のオリゴヌクレオチドであって、
上記第一および第二のオリゴヌクレオチドの配列はＴ細胞レセプター遺伝子の同一鎖上には見いだされないもの
から選択されまたは誘導されるプライマーペアと接触させることによってＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出し、
(c) ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出し、核酸が検出される場合には、
(C) 核酸の量を定量する
ことを特徴とする、方法。
（２１）Ｖβ１３．１遺伝子配列が配列番号：２である、（２０）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＰＢＭＣ由来のＰＣＲ生成物のクローニングおよび配列決定の実験手続き。ＰＢＭＣ標本由来のｃＤＮＡを５′Ｖβ１３．１プライマーによって増幅し、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの発現について陽性の四種類のＰＢＭＣ標本由来の３′ＪβプライマーをＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１に連結し、E. coliに形質転換した。プラスミドＤＮＡを、Ｍ１３プライマーおよびＬＧＲＡＧＬＴＹ特異的プライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲによって視認し得る増幅を示した陽性プラスミドを、Ｖβ１３．１プライマーを用いてＶβＤβＪβ配列について配列決定した。
【図２】単一のアラニン置換を有する類似ペプチドに対する二種類のＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞の反応性パターン。同一のＶβ１３．１転位（ＭＳ７−Ｅ２．６およびＭＳ２７−Ｃ３．１について）および類似のＶα−Ｊα結合配列（ＭＳ７−Ｅ２．６およびＭＳ２７−Ｃ３．１について）を示した２対のＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローンを、［３Ｈ］−チミジン組込み分析法におけるアラニン置換ペプチドのパネルに対する反応性について検討した。ＤＲＢ１＊１５０１を発現するマウス繊維芽腫細胞系を、抗原提示細胞の供給源として用いた。それぞれの類似体ペプチドに対するクローンの増殖応答を７２時間後に測定し、結果を組込まれたCPMとして示す。隈取りしたボックスは、類似体ペプチドに応答してＴ細胞クローンの増殖が＞５０％減少したことを表している。
【図３】元のおよび関連のないＴ細胞クローンを用いるＣＤＲ３オリゴヌクレオチドの特異性の交差検討。ＴＣＲ ＶＤＪ領域に特異的なオリゴヌクレオチドの組を、元のＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローン並びに同一および異なる被験者由来の関連のないＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞クローンに含まれる既知の標的ＤＮＡ配列の検出における特異性について検討した。ＣＤＲ３に特異的なオリゴヌクレオチドを前進プライマーとして３′−Ｃβプライマーを復帰プライマーとして用いてＰＣＲ反応を行った。無地ボックスは、元のＴ細胞クローンまたは同一のＣＤＲ３配列を共有する（複数の）Ｔ細胞クローンに含まれるＤＮＡ配列の陽性検出を表す。総てのプライマーを、関連のないＣＤＲ３配列（無地ボックス）を有する無作為に選択されたＴ細胞クローンのＤＮＡ生成物へのそれらの結合についても検討した。
【図４】ＭＳ患者由来の無作為に選択したＰＢＭＣ標本におけるモチーフＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹに相補的な標的ＤＮＡ配列の検出。無作為に選択したＭＳ患者（n＝４８）からのＰＢＭＣ標本から調製したｃＤＮＡを、５′−Ｖβ１３．１特異的プライマーおよび３′−Ｃβプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで最初に増幅した。次に、増幅したＰＣＲ生成物を、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフに特異的なジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションした。元のＭＢＰ８３−９９クローン（ＭＳ７−Ｅ２．６）および関連のないＴ細胞クローン（ＭＳ３２−Ｂ９．８）を、それぞれ正および負の対照として用いた。ＭＳ−７およびＭＳ−２７は元のＰＢＭＣ標本であり、これからクローンＭＳ７−Ｅ２．６（表１のＭＳ−７）およびクローンＭＳ２７−Ｃ３．１（表１のＭＳ−２７）を誘導した。星印は、ＤＲＢ１＊１５０１の正の発現を示す。
【図５】正常被験者由来の無作為に選択したＰＢＭＣ標本におけるＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの検出。２０名の正常被験者（ＮＳ）から得たＰＢＭＣ標本を、図４の凡例に記載されているのと同一条件で分析した。元のクローン（ＭＳ７−Ｅ２．６）および関連のないＴ細胞クローン（ＭＳ３２−Ｂ９．８）を、それぞれ正および負の対照として用いた。星印は、ＤＲＢ１＊１５０１の正の発現を示す。
【図６】ＭＳ患者および正常被験者由来のＰＢＭＣ標本におけるＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの発現の半定量的比較。モチーフＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹの発現を、ＭＳおよび正常被験者のＰＢＭＣ由来のそれぞれのｃＤＮＡにおけるＣβ発現に関して半定量的ＰＣＲによって分析した。相対発現レベルを、（ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフ／Ｃβの発現）×１００％として計算した。
【図７】ＭＳ患者由来の短期ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞系におけるＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの検出。独立した短期ＭＢＰ８３−９９Ｔ細胞系のパネルを、ＭＢＰの合成８３〜９９ペプチドを用いて５名のＭＳ患者から生成させた。これら総てのＴ細胞系を、ＭＢＰ８３−９９ペプチドに対するそれらの特異的反応性を確かめた（ＭＢＰ８３−９９に対するＣＰＭ／対照ＣＰＭ＞５）。ｃＤＮＡ生成物を、ＰＣＲにおいて５′−Ｖβ１３．１特異的プライマーおよび３′−Ｃβプライマーを用いて増幅した。次に、増幅したＰＣＲ生成物を、サザンブロット分析でＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフに相当するジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションした。元のＭＢＰ８３−９９クローン（ＭＳ７−Ｅ２．６）および関連のないＴ細胞クローン（ＭＳ３２−Ｂ９．８）由来のｃＤＮＡ生成物を、それぞれ正および負の対照として用いた。
【出願人】 【識別番号】５９３２０９７３６
【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスィン
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
【出願日】 平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【代理人】 【識別番号】１０００７５８１２
【弁理士】
【氏名又は名称】吉武 賢次

【識別番号】１０００９１４８７
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝

【識別番号】１０００９４６４０
【弁理士】
【氏名又は名称】紺野 昭男

【識別番号】１００１０７３４２
【弁理士】
【氏名又は名称】横田 修孝
【公開番号】 特開２００７−３０８５０２（Ｐ２００７−３０８５０２Ａ）
【公開日】 平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願番号】 特願２００７−１５２０６６（Ｐ２００７−１５２０６６）