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【発明の名称】 改良されたブロメライン製剤およびそれを含む医薬組成物
【発明者】 【氏名】陳玉舜

【氏名】侯建維

【氏名】林文宏
【要約】 【課題】簡単なプロセスにより製造される、改善された薬理効果を有する、ブロメラインの新しい剤型を提供する。

【解決手段】本発明は、有機酸と多糖間の架橋結合により構築される有機ネットワークポリマーでブロメラインがコーティングされている、改良されたブロメライン製剤に関する。本発明はまた、炎症の治療、疼痛の緩和、および／または免疫防御の増強を必要とする患者における、かかる治療のための本ブロメライン製剤を含む医薬組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子ビーム照射による有機酸および多糖間の架橋反応により構築される有機ネットワークポリマー中にはめ込まれたブロメラインを含む改良されたブロメライン製剤。
【請求項２】
電子ビーム照射がγ線によって作りだされる、請求項１に記載の改良されたブロメライン製剤。
【請求項３】
電子ビーム照射が60Ｃｏ照射によって作りだされる、請求項２に記載の改良されたブロメライン製剤。
【請求項４】
有機ネットワークポリマーを形成するための、電子ビーム照射による有機酸および多糖間の第１の架橋反応および有機ネットワークポリマー中にブロメラインをはめ込むための、電子ビーム衝撃により形成される有機ネットワークポリマーおよびブロメライン間の第２の架橋反応を含む、請求項１に記載の改良されたブロメライン製剤の製造方法。
【請求項５】
５ｋｇｙ〜１５ｋｇｙのγ線により電子ビーム衝撃が作りだされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
電子ビーム照射が60Ｃｏ照射により作りだされる、請求項５に記載の改良されたブロメライン製剤。
【請求項７】
有機酸が乳酸、リンゴ酸および酒石酸から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
多糖が酸性デンプンである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
有機酸および多糖が約１：２の重量比で混合される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
抗炎症に用いられる、請求項１に記載の改良されたブロメライン製剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
疼痛の緩和に用いられる、請求項１に記載の改良されたブロメライン製剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
免疫防御の増強に用いられる、請求項１に記載の改良されたブロメライン製剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロメラインが有機酸および多糖間の架橋結合により構築される有機ネットワークポリマーでコーティングされている、改良されたブロメライン製剤に関する。
【０００２】
本発明はまた、炎症の治療、疼痛の緩和、および／または免疫防御の増強を必要とする患者における、かかる治療のための本ブロメライン製剤を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ブロメラインは、パイナップルの茎から抽出されるプロテアーゼのグループの１つである。最初に見出されたブロメラインの治療効果は抗炎症作用であり、例えば、“Seligman B., Angiology 13:508-510 (1962);および Kelly GS, Alt Med Rev 1(4):243-257 (1996)"を参照されたい。血栓形成の減少、降圧、免疫機能の調節、抗微生物感染および癌細胞増殖の抑制などの、ブロメラインの他の薬理効果は文献に報告されており、例えば"Livio M et al, Drugs Exp Clin Res 4:49-53 (1978); Hale L,J Immuno 149:3809-3816 (1992); Chandler Dset al, Gut 43:196-202 (1998);およびTaussig SJ et al, Planta Medica 6:538-539 (1985)”を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
タンパク質の特性のために、ブロメラインは、胃などの消化管中で分解または変性を受ける可能性がある。生物学的利用率を向上させるために、ブロメラインは、耐酸性コーティングでコーティングされているかあるいは経口投与用カプセルにカプセル化されている。従って、本発明は、簡単なプロセスにより製造される、改善された薬理効果を有する、ブロメラインの新しい剤型を提供する。かかるブロメライン製剤において、ブロメラインの酸性環境における分解を防止する有機ネットワークポリマー中にブロメラインをはめ込む。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様において、本発明は、電子ビーム照射による有機酸および多糖間の架橋反応により構築される有機ネットワークポリマー中にはめ込まれたブロメラインを含む改良されたブロメライン製剤に関する。
【０００６】
他の態様において、本発明は、有機ネットワークポリマーを形成するための、電子ビーム照射による有機酸と多糖間の第１の架橋反応および有機ネットワークポリマーにブロメラインをはめ込むための、電子ビーム照射により形成される有機ネットワークポリマーとブロメライン間の第２の架橋反応を含む、改良されたブロメライン製剤を製造するための製造方法に関する。
【０００７】
他の態様において、本発明は、改良されたブロメライン製剤を含む医薬組成物に関する。好適な実施形態において、本医薬組成物は、抗炎症、疼痛の緩和および／または免疫防御の増強に用いられる。
【０００８】
本願の第１発明は、電子ビーム照射による有機酸および多糖間の架橋反応により構築される有機ネットワークポリマー中にはめ込まれたブロメラインを含む改良されたブロメライン製剤である。
【０００９】
本願の第２発明は、電子ビーム照射がγ線によって作りだされる、本願の第１発明に記載の改良されたブロメライン製剤である。
【００１０】
本願の第３発明は、電子ビーム照射が60Ｃｏ照射によって作りだされる、本願の第２発明に記載の改良されたブロメライン製剤である。
【００１１】
本願の第４発明は、有機ネットワークポリマーを形成するための、電子ビーム照射による有機酸および多糖間の第１の架橋反応および有機ネットワークポリマー中にブロメラインをはめ込むための、電子ビーム衝撃により形成される有機ネットワークポリマーおよびブロメライン間の第２の架橋反応を含む、本願の第１発明に記載の改良されたブロメライン製剤の製造方法である。
【００１２】
本願の第５発明は、５ｋｇｙ〜１５ｋｇｙのγ線により電子ビーム衝撃が作りだされる、本願の第４発明に記載の方法である。
【００１３】
本願の第６発明は、電子ビーム照射が60Ｃｏ照射により作りだされる、本願の第５発明に記載の改良されたブロメライン製剤である。
【００１４】
本願の第７発明は、有機酸が乳酸、リンゴ酸および酒石酸から選択される、本願の第４発明に記載の方法である。
【００１５】
本願の第８発明は、多糖が酸性デンプンである、本願の第４発明に記載の方法である。
【００１６】
本願の第９発明は、有機酸および多糖が約１：２の重量比で混合される、本願の第４発明に記載の方法である。
【００１７】
本願の第１０発明は、抗炎症に用いられる、本願の第１発明に記載の改良されたブロメライン製剤を含む医薬組成物である。
【００１８】
本願の第１１発明は、疼痛の緩和に用いられる、本願の第１発明に記載の改良されたブロメライン製剤を含む医薬組成物である。
【００１９】
本願の第１２発明は、免疫防御の増強に用いられる、本願の第１発明に記載の改良されたブロメライン製剤を含む医薬組成物である。
【発明の効果】
【００２０】
炎症は、人体における何らかの異常を知らせる重要な徴候である。生物学的、物理的または化学的な要因の如何を問わず、体組織が損傷を受けた場合、損傷組織周辺のマクロファージは異物を除去するために活性化される。同時に、マクロファージはまた、一酸化窒素、腫瘍壊死因子、インターロイキン、顆粒球−単球コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子および単球コロニー刺激因子などの、他の免疫防御システムを活性化するいくつかの因子も放出する。上記の因子の濃度は炎症組織において上昇していた。
【００２１】
１９７５年に、Carswellらは、細菌ＬＰＳをマウスに注射することにより腫瘍を致死させる因子が血清中で検出しうることを報告し、彼らはそれを腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と呼んだ。その後、Shalaby（１９８５）は、マクロファージにより産生されるＴＮＦをＴＮＦ−αと命名し、Ｔリンパ球により産生されるリンホトキシンをＴＮＦ−βと命名した。ＴＮＦ−αは単球およびマクロファージにより産生され、細菌ＬＰＳは、強力な刺激剤としての役割を果たす。細菌エンドトキシンは、しばしば消化器系における重篤な疾患を引き起こし、細菌ＬＰＳは主要なエンドトキシンである。動物試験により、ＬＰＳは胃内容排出を遅らせ、免疫反応の誘導に関連していることが示されている。身体がＬＰＳにより刺激された場合、防御および修復のプロセスに関与するＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、および他の因子の生成が誘導される。しかしながら、これらの因子の過剰な存在はまた、身体に好ましくない作用をもたらし、例えば、過剰なＴＮＦ−αの存在は、臓器疲労、毒素性ショックまたは死の原因となる場合もある。ＴＮＦ−α抗体の投与により、エンドトキシンによって引き起こされる毒素性ショック症候群の開始を効果的に抑制できることが示されている。研究者により、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６の生成が関連していることが指摘されている。ＬＰＳはＴＮＦ−αの合成を誘導し、ついでこれがＩＬ−１βの生成を誘導し、ついで後者がＩＬ−６の生成を誘導する。
【００２２】
２型シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）経路によるアラキドン酸の代謝により、プロスタグランジンおよびトロンボキサンが産生される。異なる種類の細胞により異なる種類のプロスタグランジンが産生される。たとえば、単球およびマクロファージは、多量のＰＧＥ２およびＰＧＦ２を産生し；好中球は中程度の量のＰＧＥ２を産生し；肥満細胞はＰＧＤ２を産生する。プロスタグランジンは、血管透過性亢進、血管拡張、および炎症反応に関連する好中球走化性の誘導を含む種々の生理効果を有する。
【００２３】
以下の実施例に記載されているような、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびプロスタグランジンの放出およびＣＯＸ−２の発現の抑制効果から、本ブロメライン製剤が抗炎症において顕著な改善効果を示すことは明らかである。

【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の他の態様および特徴は、以下の実施例の説明において明らかとなる。
これらの実施例は本発明の例示のために提供されるものであって、本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００２５】
実施例１に、改良されたブロメライン製剤の製造を示す。
【００２６】
デンプンおよび有機酸を２：１の重量比で混合し、混合物を撹拌しながら５分間８０℃に加熱した。撹拌している混合物を１５ｋｇｙの電子ビームで３秒間照射して有機ネットワークポリマーを形成させた。有機ネットワークポリマーの混合物を適量のＮａＨＣＯ3で中和して、約ｐＨ７にした。
【００２７】
中和混合物に同重量のブロメラインを３０℃で加え、ついで３分間撹拌した。混合物に１５ｋｇｙの電子ビームで３秒間の２回目の照射を受けさせ、有機ネットワークポリマーにブロメラインを組み込んで、ブロメライン製剤を得た。
【００２８】
ブロメライン製剤の残存活性を、ｐＨ３、４、５、６、および７の酸性環境下、３０℃で２時間試験した。ｐＨ３、４、５、６、および７での残存活性は、８２％、８６％、９２％、９５％、および９６％であり、これと比較して、コーティング無しのブロメラインの残存活性は、ｐＨ３および４、３０℃２時間で処理後において５０％未満であった。
【実施例２】
【００２９】
実施例１に、改良されたブロメライン製剤の抗炎症効果を示す。
【００３０】
Ａ．動物試験
【００３１】
雄ＳＤラット（それぞれ、体重約２５０ｇ）をBioLASCO Taiwan Co., Ltd.から購入した。ラットを２３℃、１２時間の昼夜サイクルで飼い、通常の餌を与えた。飲料水は逆浸透技術で前処理した。５セットのラットを別々に処理した（各セットは１０のラットを含む）。対照セットにおいて、実験期間中、ラットを通常の餌の状態で飼った。リポ多糖（ＬＰＳ）処理セットにおいて、ラットを通常の餌の状態で飼い、ついで各ラットの腹腔に大腸菌（Escherichia coli）ＬＰＳ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。残る３セットのラットにおいて、ＬＰＳの注射の前に、ラットの餌に異なる割合の改良されたブロメライン製剤（１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）を７日間補給した。ＬＰＳ注射後、ラットに２４時間の絶食をさせた。ついで、免疫学的検査のためのストレス負荷の前後に、各ラットの腹腔静脈から血液を採取した。データを、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。
【００３２】
ＥＬＩＳＡを用いて、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の濃度を定量した。図１〜３に示すように、ラットを細菌ＬＰＳでチャレンジした場合、改良されたブロメライン製剤を与えることにより、効果的にＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６の血清中濃度を減少させることができた。改良されたブロメライン製剤によるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６の血清中濃度の減少は、用量依存性を示した。以下の表１に示すように、中用量および高用量（５０および１００ｍｇ／ｋｇ）の、改良されたブロメライン製剤の投与により、処置マウスにおける顕著な抗炎症効果が示された。
【００３３】
【表１】


【００３４】
従って、これらの結果は、改良されたブロメライン製剤の抗炎症効果を示唆している。
【００３５】
プロスタグランジンＰＧＥ２放出およびＣＯＸ−２発現における、改良されたブロメライン製剤の細胞毒性および抑制効果を調べるためのモデルとして、我々はミクログリアＢＶ−２細胞を用いた。ＢＶ−２細胞系を、５％ＣＯ2の存在下、３７℃で、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補給したＤＥＭＥ中で培養した。集密培養物をトリプシン処理した。実験のために、細胞を温ＤＭＥＭ（フェノールレッド無添加）で２度洗浄し、ついで無血清培地中で処理した。全ての実験において、１×ＰＢＳ（燐酸緩衝生理食塩水）中のブロメライン製剤で細胞を処理した。
【００３６】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することにより細胞毒性を測定した。ＢＶ−２細胞を１ウエルあたり５×１０5細胞の密度で２４時間２４−ウェルプレート中でプレインキュベートし、ついで燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。種々の濃度のブロメライン製剤を加えたＢＶ−２細胞をＬＰＳで２４時間処理し、上澄みをＬＤＨ活性をアッセイするために用いた。０．１ｍｌの無細胞上澄みとＮＡＤＨおよびピルビン酸ナトリウムを含むリン酸カリウム緩衝液を混合して０．２ｍｌの最終容量にし、９６−ウェルプレートに加え、反応を開始した。自動ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ３４０マイクロタイタープレートリーダーで、４９０／６３０ｎｍでの吸光値の比率を読み取った。
【００３７】
生存細胞対ＬＰＳ対照の平均比率としてデータを表した。結果を図４に示す。ＬＤＨ放出アッセイの結果から、本ブロメライン製剤はＢＶ−２細胞に対して顕著な細胞毒性がないことが示されたが、これは本製剤がＢＶ−２細胞に対して無害であることを意味する。
【００３８】
種々の濃度のブロメライン製剤および１μｇ／ｍｌのＬＰＳを用いる、ＬＰＳ刺激ＢＶ−２細胞による、２４時間処理後のプロスタグランジンＰＧＥ２放出を、ＥＬＩＳＡイムノアッセイキット（R&D system, Minneapolis, USA）で測定した。アッセイの直線範囲は、１０〜１０００ｐｇ／ｍｌであった。本アッセイの直線範囲内に入る値にするために、ＢＶ−２細胞浮遊液を希釈または濃縮した。自動ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ３４０マイクロタイタープレートリーダーを用いて、４５０／５７０ｎｍでＰＧＥ２値を読み取った。生存細胞対対照の平均比率としてデータを表した。
【００３９】
図５に示すように、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍのブロメライン製剤で処理することにより、ＬＰＳ対照グループと比較して、ＬＰＳ刺激ＢＶ−２細胞によるＰＧＥ２放出は、それぞれ、２７％、５０％および８０％、顕著に減少した。
【００４０】
シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性およびＬＰＳ刺激ＢＶ−２細胞の発現に関するブロメライン製剤の効果を検出するために、種々の濃度のブロメライン製剤および１μｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、４時間のインキュベーション後に、ＢＶ−２細胞から製造業者が勧めるプロトコル従ってＴＲＩｚｏｌ（GIBCO BRL）を用いて、総ＲＮＡを精製した。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイによりＣＯＸ−２発現（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）を分析した。RNase Out（登録商標）（Invitrogen, USA）の存在下、ランダムプライマーを用いてＭ−ＭＬＶ逆転写酵素で総ＲＮＡ（０．５μｇ）を逆転写した。ＣＯＸ−２に対して特定のオリゴヌクレオチドを用いて１００ナノグラムの逆転写したＲＮＡをプライム化した：
ＣＯＸ−２：
（５’−ＧＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣ−３’および
５’−ＧＧＴＧＧＣＡＴＡＣＡＴＣＡＴＣＡＧＡＣＣ−３’）；
β−アクチン
（５’−ＧＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣ−３’および
５’−ＧＧＴＧＧＣＡＴＡＣＡＴＣＡＴＣＡＧＡＣＣ−３’）。
【００４１】
ABI PRISM 7000 Deetection System (Applied Biosystems, USA）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色することにより視覚化した。特定の遺伝子は、紫外光下、予測されるサイズにより確認した。結果を図６に示した。ブロメライン製剤はＣＯＸ−２の発現を抑制し、さらに、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）の一種として作用する、プロスタグランジンならびにＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの生合成および放出を抑制することが示唆された。

【実施例３】
【００４２】
実施例３に、ブロメライン製剤および市販品の比較抗炎症試験を示す。
【００４３】
実施例２に記載のプロスタグランジンＰＧＥ２放出アッセイにしたがって、同じ投与量を用いて、７つの市販品とブロメライン製剤の抗炎症効果を比較した。図７に示すように、本発明のブロメライン製剤（Cometrue）は、ＰＧＥ２の放出を５０％減少した。現在市販されているブロメライン製品と比較したところ、製品Ｂおよび製品ＥのみがＰＧＥ２放出抑制をそれぞれ４４％および１８％の減少効果を示したが、他の製品は、ＬＰＳ刺激ＢＶ−２細胞によるかかるＰＧＥ２放出抑制効果を示さなかった。本ブロメライン製剤は、実際に、従来の市販ブロメライン製品よりも改善された抗炎症効果を示した。

【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】細菌ＬＰＳ負荷（投与量２．５ｍｇ／ｋｇ，２４ｈ）後の、異なる処理をしたグループ（各グループについてＮ＝８のラット）の血清中のインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）濃度を示す図である。対照は細菌ＬＰＳで刺激を受けていないラットを表す。ＭＰは市販品で処理したラットを表す。
【図２】細菌ＬＰＳ負荷後の、異なる処理をしたグループ（各グループについてＮ＝８のラット）の血清中のインターロイキン−６（ＩＬ−６）濃度を示す図である。
【図３】細菌ＬＰＳ負荷後の、異なる処理をしたグループ（各グループについてＮ＝８のラット）の血清中の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）濃度を示す図である。
【図４】ミクログリアＢＶ−２細胞への処理（ＬＰＳ（用量１．０μｇ／ｍｌ，２４ｈ）、ブロメライン製剤１０μｇ／ｍｌ＋ＬＰＳ、ブロメライン製剤５０μｇ／ｍｌ＋ＬＰＳ、ブロメライン製剤１００μｇ／ｍｌ＋ＬＰＳを含む）の細胞毒性を示す図である。
【図５】ブロメライン製剤（０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌ）を用いる、ＬＰＳ刺激（用量１．０μｇ／ｍｌ，２４ｈ）ミクログリアＢＶ−２細胞によるプロスタグランジンＰＧＥ２放出量を示す図である。対照は細菌ＬＰＳにより刺激を受けていない細胞を表す。
【図６】ブロメライン製剤（０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌ）を用いる、ＬＰＳ刺激（用量１．０μｇ／ｍｌ，４ｈ）ミクログリアＢＶ−２細胞におけるＣＯＸ−２発現を示す図である。対照は細菌ＬＰＳにより刺激を受けていない細胞を表す。
【図７】同じ用量（５０μｇ／ｍｌ）における、ブロメライン製剤および７つの市販ブロメライン製品（Ａ〜Ｇ）の比較ＰＧＥ２放出試験を示す図である。
【出願人】 【識別番号】５０４２９４４６６
【氏名又は名称】康致生物科技股▲ふん▼有限公司
【出願日】 平成１７年６月１日（２００５．６．１）
【代理人】 【識別番号】１０００８２４１８
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 朔生
【公開番号】 特開２００６−３３５６７８（Ｐ２００６−３３５６７８Ａ）
【公開日】 平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【出願番号】 特願２００５−１６１８１５（Ｐ２００５−１６１８１５）