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【発明の名称】 虚血後血管新生促進剤
【発明者】 【氏名】多久和 陽

【氏名】尾山 治
【要約】 【課題】虚血後の血管新生を促進し、血流を改善することにより、各種虚血性疾患の予防又は治療に有用な医薬を提供する。

【解決手段】スフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩を含有する虚血後血管新生促進剤、虚血後血流改善剤、及び虚血性疾患の予防又は治療剤。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩を含有する虚血後血管新生促進剤。
【請求項２】
生分解性ポリマーを基剤として用いた徐放性製剤である請求項１記載の虚血後血管新生促進剤。
【請求項３】
スフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩と生分解性ポリマーとを有機溶媒に溶解した後、有機溶媒を除去することにより得られる請求項２記載の虚血後血管新生促進剤。
【請求項４】
徐放性マイクロカプセルである請求項２又は３記載の虚血後血管新生促進剤。
【請求項５】
生分解性ポリマーが乳酸−グリコール酸共重合体である請求項２〜４のいずれか１項に記載の虚血後血管新生促進剤。
【請求項６】
虚血後血流改善剤である請求項１〜５のいずれか１項に記載の虚血後血管新生促進剤。
【請求項７】
虚血性疾患の予防又は治療剤である請求項１〜５のいずれか１項に記載の虚血後血管新生促進剤。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種虚血性疾患の予防又は治療に有用な虚血後血管新生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞、心不全、狭心症、脳梗塞、血管性痴呆、閉塞性動脈硬化症、バージャー病などに代表される心臓、脳及び末梢における虚血性疾患に治療及び予防には、虚血後の血管新生を促進する虚血後血管新生促進剤が有効である。
【０００３】
一方、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は血漿中に存在する脂質メディエーターであり、培養細胞において細胞増殖促進作用、細胞遊走調節作用、アポトーシス抑制作用等を有することが知られている。Ｓ１ＰはＳ１Ｐ１〜Ｓ１Ｐ５の５つのサブタイプのＥｄｇファミリーＧ蛋白共役型受容体を介して多彩な生理効果を発揮する。そのうち、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２及びＳ１Ｐ３の３つのサブタイプは全身に広く分布している。生体内におけるＳ１Ｐの主要な産生酵素はスフィンゴシンキナーゼ１（ＳＰＨＫ１）である。
【０００４】
Ｓ１Ｐ１受容体ノックアウトマウスは胎生期に血管形成不全による出血により死亡し（非特許文献１）、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２及びＳ１Ｐ３のトリプルノックアウトマウスでは更にその傾向が強くなることが報告されている（非特許文献２）。したがって、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）情報伝達系は胎生期血管成熟に必須の役割を担っていると考えられている。しかしながら、成体における虚血後血管新生については、Ｓ１Ｐの役割は十分解明されていない。
【０００５】
【非特許文献１】Liu Y, Wada R, Yamashita T, Mi Y, Deng CX, Hobson JP, Rosenfeldt HM, Nava VE, Chae SS, Lee MJ, Liu CH, Hla T, Spiegel S, Proia RL. Edg-1, the G protein-coupled receptor for sphingosine-1-phosphate, is essential for vascular maturation. J. Clin. Invest., 2000 Oct; 106(8): 951-61
【非特許文献２】Kono M, Mi Y, Liu Y, Sasaki T, Allende ML, Wu YP, Yamashita T, Proia RL. The Sphingosine-1-phosphate Receptors S1P1, S1P2, and S1P3 Function Coordinately during Embryonic Angiogenesis. J. Biol. Chem., 2004 Jul 9; 279(28):29367-73
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、虚血後の血管新生を促進し、血流を改善することにより、各種虚血性疾患の予防又は治療に有用な医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）スフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩を含有する虚血後血管新生促進剤。
（２）生分解性ポリマーを基剤として用いた徐放性製剤である前記（１）に記載の虚血後血管新生促進剤。
（３）スフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩と生分解性ポリマーとを有機溶媒に溶解した後、有機溶媒を除去することにより得られる前記（２）に記載の虚血後血管新生促進剤。
（４）徐放性マイクロカプセルである前記（２）又は（３）に記載の虚血後血管新生促進剤。
（５）生分解性ポリマーが乳酸−グリコール酸共重合体である前記（２）〜（４）のいずれかに記載の虚血後血管新生促進剤。
（６）虚血後血流改善剤である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の虚血後血管新生促進剤。
（７）虚血性疾患の予防又は治療剤である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の虚血後血管新生促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、虚血後の血管新生を促進し、血流を改善することにより、各種虚血性疾患の予防又は治療に有用な医薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるスフィンゴシン−１−リン酸は、天然型（Ｄ（＋）体）、非天然型（Ｌ（−）体）、又はそれらの混合物のいずれでもよい。また、スフィンゴシン−１−リン酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、及び亜鉛塩等の無機塩基との塩、並びに有機塩基との塩が挙げられる。
【００１０】
本発明に用いるスフィンゴシン−１−リン酸は、例えば、リン酸、五酸化二リン、ポリリン酸、オキシ塩化リン等を用いる一般的なリン酸エステル化法（油化学２３，２−８（１９７４）等）、スフィンゴシルホスホリルコリンにホスホリパーゼＤを作用させる方法（J. Biol. Chem., 269, 3181-3188(1994)）、スフィンゴシン等にスフィンゴシンキナーゼを作用させる方法等によって製造できる。また市販品を用いてもよい。
【００１１】
本発明の虚血後血管新生促進剤及び虚血後血流改善剤は、虚血後の血管新生を促進し、血流を改善することにより、心筋梗塞、心不全、狭心症、脳梗塞、血管性痴呆、閉塞性動脈硬化症、バージャー病などの各種虚血性疾患の治療剤として用いることができる。また、虚血症状が見られたときに投与すれば、これらの虚血性疾患の進行と虚血による障害を未然に防止することができる。
【００１２】
以下、本発明の医薬製剤の投与量及び製剤化について説明する。
スフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩はそのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物及びヒトに投与することができる。投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤、貼付剤等の非経口剤が挙げられる。
【００１３】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。
【００１４】
この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。
【００１５】
結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールが挙げられる。
【００１６】
崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。
【００１７】
界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０が挙げられる。
【００１８】
滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００１９】
流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムが挙げられる。
【００２０】
注射剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、注射剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。更に、必要に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。
【００２１】
その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤、貼付剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。
【００２２】
また、本発明の製剤を徐放性製剤として用いる場合には、生分解性ポリマーを基剤として用いることが好ましい。
【００２３】
前記生分解性ポリマーの具体例としては、例えばα−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸等）等の１種以上から無触媒脱水重縮合で合成され、遊離のカルボキシル基を有する重合体あるいはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）、無水マレイン酸系重合体（例えば、スチレン−マレイン酸重合体等）等が挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよい。また、前記α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−，Ｌ−，ＤＬ−体のいずれも用いることができる。これらの中で、末端に遊離のカルボキシル基を有する生分解性ポリマー、例えばα−ヒドロキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸等）から合成された重合体（例えば、乳酸−グリコール酸共重合体等）、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル等が好ましい。生分解性ポリマーは、更に好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類から合成された重合体、特に好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体である。
【００２４】
生分解性ポリマーとして乳酸−グリコール酸共重合体又は単重合体を用いる場合、その組成比（モル％）は約１００／０ないし約４０／６０が好ましく、約８５／１５ないし約５０／５０が更に好ましい。本明細書においては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など単重合体のみならず乳酸−グリコール酸共重合体も含めて、単に乳酸−グリコール酸重合体と称することがある。前記乳酸−グリコール酸重合体の重量平均分子量は、約３，０００ないし約２５，０００が好ましく、更に約５，０００から約２０，０００が特に好ましい。
【００２５】
前記徐放性製剤は、好ましくは、スフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩と前記生分解性ポリマーとを有機溶媒に溶解した後、有機溶媒を除去することにより得ることができる。
【００２６】
前記徐放性製剤の製造に用いる有機溶媒は、沸点１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素など）、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオールなど）、酢酸エチル、アセトニトリルなどが挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒を単独で用いる場合、例えばジクロロメタン、アセトニトリルなどが好ましい。有機溶媒を混合溶媒として用いる場合、例えばハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロメタン、クロロホルムなど）と、アルコール類（例えば、エタノール、メタノール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオールなど）あるいはアセトニトリルとの組み合わせが好ましい。特に、ジクロロメタンとアセトニトリルとの組み合わせが汎用される。ハロゲン化炭化水素と、アルコール類あるいはアセトニトリルとの混合比（体積比）は約４０：１〜約１：１であり、好ましくは約２０：１〜約１：１である。特に、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタンなど）を単独で用いることが望ましい。
【００２７】
前記徐放性製剤としては、スフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩とマイクロカプセル基剤（好ましくは、生分解性ポリマー）とを含有する微粒子であればよく、その具体例としては、例えば１個の粒子中に１個の薬物コアーを含有するマイクロカプセル、１個の粒子中に多数の薬物コアーを含有する多核マイクロカプセル、又は分子状で薬物がマイクロカプセル基剤に溶解あるいは分散しているようなマイクロスフェア等が挙げられる。
【００２８】
前記徐放性製剤の製造における有機溶媒の除去方法としては、例えば（ａ）水中乾燥法（Ｏ／Ｗ法）、（ｂ）相分離法（コアセルベーション法）、（ｃ）噴霧乾燥法及びこれらに準じた方法などが用いられる。
【００２９】
本発明の製剤は、剤形、投与経路等により異なるが、１日１〜数回から１〜数回／週〜月の投与が可能である。
【００３０】
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人でスフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩の重量として１〜２００ｍｇを、１日数回に分けての服用が適当である。
【００３１】
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人でスフィンゴシン−１−リン酸又はその薬学的に許容される塩の重量として１日１〜５０ｍｇの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］
成体における虚血後血管新生のモデルとしては、下肢虚血モデル（Couffinhal T, Silver M, Zheng LP, Kearney M, Witzenbichler B, Isner JM. Mouse model of angiogenesis. Am. J. Pathol., 1998 Jun; 152(6): 1667-79）、心筋梗塞モデル、脳虚血モデルなどが確立されている。以下の実施例では、マウス下肢虚血モデルを用い、急性骨格筋虚血に対するスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の血管新生作用を、Ｓ１Ｐ筋肉内投与、及び生理的にＳ１Ｐ合成が亢進しているＳＰＨＫ１トランスジェニックマウスを用いて検討した。
【００３４】
（１）方法
マウス
８−１２週齢、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ及び、ＳＰＨＫ１トランスジェニックマウスを用いた。トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド）については同腹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを対照とした。
【００３５】
一側下肢虚血モデルの作成
術前日に除毛クリームにて腹部〜下腿の除毛を行った。ペントバルビタール（７０ｍｇ／ｋｇ）麻酔、下腹部左傍正中切開にて左下肢筋を露出させた。大腿動静脈を剥離し、そけい靱帯直下及び膝窩動脈分岐下にて８−０絹糸にて結紮、側枝と共に切除した。創内を生理食塩水で洗浄、止血確認後、創を４−０絹糸にて縫合した。
【００３６】
Ｓ１Ｐ徐放性製剤の作成
乳酸−グリコール酸共重合体（和光純薬工業株式会社製ＰＬＧＡ−７５１０；ＤＬ−乳酸／グリコール酸の組成比（モル％）７５：２５、重量平均分子量１０，０００）６０ｍｇをジクロロメタン（和光純薬）１ｍｌに溶解、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｂｉｏｍｏｌ社製）１ｍｇをジクロロメタン（和光純薬）１ｍｌ中にソニケーターを用いて分散し、両者を合わせた上、０．４ｍｌのジクロロメタンで洗い込み、２．４ｍｌの溶液とした。この油層に対し、２．５％ポリビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ社製）１２ｍｌを加え、プローブソニケーターにてＯ／Ｗのエマルジョンを作成した。ポリビニルアルコールは乳化剤として添加した。このエマルジョンをマグネティックスターラーを用いて室温にて一夜攪拌し、ジクロロメタンを蒸発させることにより、ＰＬＧＡマイクロカプセルを固化させた。超遠心（４４０００ＲＰＭ、５分間）にて固化したＰＬＧＡマイクロカプセルを回収し、精製水に分散するという過程を３回繰り返し、ポリビニルアルコールを除去した。最終的に２ｍｌの精製水に溶解、真空凍結乾燥してデシケーター中に陰圧下にて保存した。対照群にはスフィンゴシン−１−リン酸を含まないマイクロカプセルを用いた。用時精製したマイクロカプセル１ｍｇを滅菌した生理食塩水５００μＬに溶解して注射液とした。
【００３７】
薬剤投与
０．１％ＢＳＡ（fatty acid free）含有生理食塩水にスフィンゴシン−１−リン酸のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を１／２０００（容量比）加え、注射液とした。対照群では０．０５％ＤＭＳＯ、０．１％ＢＳＡ含有生理食塩水を用いた。大腿内側に４ヶ所、内外側腓腹筋にそれぞれ１ヶ所ずつの計６ヶ所に２７Ｇ注射針を用いて１０μｌずつ術直後より毎日投与した。
【００３８】
徐放性製剤を用いた実験では、生理食塩水０．５ｍｌにマイクロカプセル１ｍｇを溶解し注射液とし、術直後に１回大腿内側に４ヶ所、内外側腓腹筋にそれぞれ１ヶ所ずつの計６ヶ所に２７Ｇ注射針を用いて１０μｌずつ投与した。
【００３９】
レーザードップラー血流計による血流測定
マウスをペントバルビタールにて麻酔し、３８℃の恒温槽上に置いたケージ内で約１０分間加温後、３７℃のホットプレート上にてレーザードップラー血流計（Moor Instruments社（英国）製）を用いて血流測定を行った。下腿部〜指先までの血流を両側について血流を定量し、患側／健側比にて表した。
【００４０】
毛細血管密度の定量
術後１０日目に深麻酔にてマウスを屠殺し、下腿三頭筋を非固定で凍結標本とした。横断面をラット抗マウスＣＤ３１抗体（Pharmingen社製）及びＡＢＣキット（Vectastain社製）を用いて免疫組織染色を行った。光学顕微鏡４００倍視野で１０視野につき単位面積当たりの毛細血管数をカウント、平均した。
【００４１】
統計
多群比較には一元配置分散分析を、２群比較にはStudentのｔ検定を用いた。
【００４２】
（２）結果・考察
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の非徐放化製剤を連日投与したときの患側／健側比の変化を図１に示す。血流は術後７日目ではスフィンゴシン−１−リン酸１０−８Ｍ投与群において、対照群よりも血流が２．５倍に増加していた。
【００４３】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の徐放性製剤を単回投与したときの患側／健側比の変化を図２に示す。徐放性製剤とした場合には、単回投与でも５日目及び７日目に有意差（ｐ＜０．０５）をもって血流増加が認められた。
【００４４】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の非徐放化製剤を連日投与したときの１０日目の毛細血管密度を図３に示す。
【００４５】
更に、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の主要な産生酵素であるスフィンゴシンキナーゼ１（ＳＰＨＫ１）のトランスジェニックマウスを作出し同様の検討を行ったところ、術後９日目において同腹野生型個体に比べ約１．５倍の血流量の増大を認めた（図４）。
【００４６】
以上より、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は成体虚血組織において血管新生促進作用及び血流増加作用を示すことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の非徐放化製剤を連日投与したときの患側／健側血流比の変化を示す図である。
【図２】スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の徐放性製剤を単回投与したときの患側／健側血流比の変化を示す図である。
【図３】スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の非徐放化製剤を連日投与したときの１０日目の毛細血管密度を示す図である。
【図４】ＳＰＨＫ１トランスジェニックマウス（ＳＫ）と同腹野生型個体（ＷＴ）における術後の患側／健側血流比の変化を示す図である。
【出願人】 【識別番号】５０４１６０７８１
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
【出願日】 平成１７年５月１８日（２００５．５．１８）
【代理人】 【識別番号】１０００９１０９６
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔

【識別番号】１０００９６１８３
【弁理士】
【氏名又は名称】石井 貞次

【識別番号】１００１１８７７３
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 節

【識別番号】１００１０１９０４
【弁理士】
【氏名又は名称】島村 直己
【公開番号】 特開２００６−３２１７４０（Ｐ２００６−３２１７４０Ａ）
【公開日】 平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願番号】 特願２００５−１４５４２２（Ｐ２００５−１４５４２２）