ダイエタリー製品において栄養補助剤として使用するためのγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びγ

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【発明の名称】	ダイエタリー製品において栄養補助剤として使用するためのγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びγ－ポリグルタメート
【発明者】	【氏名】グアン－フェイホ【氏名】ジェンヤン【氏名】トゥ－シウンヤン
【要約】	【課題】骨粗鬆症や骨折の予防に有効な、カルシウム含量の高い食品の摂取に効果的な、ダイエタリー製品における栄養補助剤の提供。【解決手段】ダイエタリー製品における栄養補助剤としてのγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及び／又は１以上のその塩(即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体及びγ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）の使用。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体又はγ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体、又はこれらの混合物のダイエタリー製品における栄養補助剤としての使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用において、前記ダイエタリー製品は栄養物質であり、前記ダイエタリー製品の全乾燥重量に対し０．００５重量％～１００重量％の前記栄養補助剤を含む、使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用において、前記ダイエタリー製品は食品又は飼料組成物であり、前記ダイエタリー製品の全乾燥重量に対し０．００５重量％～５重量％の前記栄養補助剤を含む、使用。
【請求項４】
請求項１に記載の使用において、前記γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体及びγ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体がそれぞれ、５０００～２．５×１０⁶の範囲の分子量を有する、使用。
【請求項５】
請求項１に記載の使用において、前記ダイエタリー製品は、デキストロース当量５～４０のマルトデキストラン、乳タンパク質、大豆タンパク質単離物、グルコース、ラクトース、スクロース、フルクトース、小鎖オリゴ－フルクトース、グルカン又は他のオリゴ－ポリ多糖、コラーゲン、コラーゲンゼラチン加水分解物、α－デンプン、大豆タンパク質加水分解物、デンプン部分加水分解物、グリセロール、プロピレングリコール、エタノール、アラビアガム、グアーガム、カラギーナン、セルロース、他の変性セルロース、及びこれらの混合物から成る群から選択される成分を更に含む、使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用において、前記ダイエタリー製品はソフトゲルカプセル又はハードゲルカプセル、錠剤、又は液剤の形態である、使用。

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内でのカルシウム吸収や骨のカルシウム吸収を向上させるためのγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体、又はこれらの混合物のダイエタリー製品における使用に関する。更に詳細には、本発明は、カルシウムの吸収促進や骨粗鬆症の予防、カルシウム損失の低減、骨強度の維持、成長や健康状態の改善のために、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体、又はこれらの混合物を、食品又は動物用飼料組成物中において錯形成吸着剤（complex adsorbent）又は栄養補助剤として使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
「トランスフォーミング増殖因子－β」（ＴＧＦ－β）はタンパク質ファミリーの一種であり、進化過程において高度に保存されており、広範な種類の細胞に影響を及ぼす。当初、ＴＧＦ－βは初代細胞培養を足場非依存的に増殖させる因子として特定された。インビボにおいてＴＧＦ－βは、結合組織の形成（deposition）を促進し、間充織細胞の増殖を誘起する。ＴＧＦ－βは、造血幹細胞（非特許文献１参照）やＮＫ細胞（非特許文献２参照）等の免疫系細胞の増殖及び分化に影響を及ぼす。ＴＧＦ－βはまた、癌や白血病等の過増殖を抑制するために投与することができる（特許文献１参照）。
【０００３】
特許文献２及び３の開示に従って、脱石灰した骨から尿素又は塩酸グアニジンを用いて「骨形成因子（ＢＭＰ）」を抽出・再沈澱させた。セイデンとトーマス（Seyedin and Thomas）は特許文献４において、カオトロピック剤を用いた抽出と、ｐＨ４．８でＣＭＣに吸着したフラクションからの活性物質を回収することにより骨形成刺激骨由来タンパク質を部分精製したことを報告している。この新規なタンパク質フラクションは「骨形成因子（osteogenic factor）」と称され、約３００００ダルトン未満の分子量を有すると特定された。
【０００４】
アクチビンは、二量体タンパク質であり、構造的にＴＧＦ－β１に類似するタンパク質ファミリーの一種で、インヒビンに類似している。インヒビンは、アクチビンサブユニットと他のアクチビンサブユニットとからなるヘテロ二量体である。アクチビンは、卵胞刺激ホルモンの放出（非特許文献３参照）やランゲルハンス島からのインスリン分泌（非特許文献４参照）、骨髄培養における赤芽球多能性前駆細胞（erythroid and multipotential progenitor cell）のコロニー形成（非特許文献５参照）を刺激し、また、インビボにおいて軟骨性骨の形成を誘起する（非特許文献６参照）ことが判明している。
【０００５】
骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）は高度にグリコシレート化及びサルフェート化されたリンタンパク質であり、石灰化した結合組織にのみ認められる。ポリグルタミン酸モチーフは、ヒドロキシアパタイトと細胞表面インテグリンとを結合する能力を有する。ＢＳＰは骨ニュークリエーターが有する生物物理学的及び化学的機能を有する。ヒドロキシアパタイト結合ポリグルタミン酸配列は二官能性の物質（entites）を提供するが、この物質により、ＢＳＰのターゲティングと骨表面への正常細胞及び転移細胞の付着が仲介される（非特許文献７参照）。
【０００６】
本技術分野において、可溶性、抗原性及び生物学的タンパク質クリアランスを変化させるためにポリマーと共有結合させて改変したタンパク質に関する文献がある（特許文献５、特許文献６、特許文献７及び特許文献８参照）。特許文献９（１９９２年１１月１１日公開）は、骨成長因子と標的組織への親和性を有するターゲティング分子とを含む組成物を開示しており、この骨成長因子及びターゲティング分子はクロスリンカーと化学的に結合している。クロスリンカーとしては合成親水性ポリマーが好ましい。これら分子は骨に対する親和性を有することが好ましい。骨成長因子としてはＴＧＦ－β、アクチビン、骨形成因子（ＢＭＰ）又は骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）が好ましい。標的とする組織の例としては骨や、軟骨、骨成長因子が標的とするその他の各種組織や細胞が挙げられる。これら組成物は、骨形成の促進目的での使用、及び骨粗鬆症や骨関節炎、加齢による骨量損失においてよく見受けられる骨損失の修復や処置における使用を意図したものである。
【０００７】
人体のカルシウム吸収は、基本的に二経路によることが知られている。即ち、能動輸送と受動輸送である。能動輸送経路は主としてビタミンＤ及び種々のホルモンの調節により制御されており、ここではカルシウムは小腸上部において濃度勾配とは逆勾配で吸収される。一方、受動輸送経路では、カルシウムは小腸下部で濃度勾配に従って吸収される。可溶性カルシウムが大量に存在する場合、小腸下部に対する受動輸送の比率が非常に高くなる。能動輸送経路では、可溶性カルシウムの濃度を増加させても一定量以上に吸収量を増加させることはできないが、受動輸送では腸内の可溶性カルシウムの濃度が増加するにつれ吸収が上昇する。腸内のカルシウム吸収率は１０～５０％であると報告されている。腸における乳タンパク質であるカゼインの酵素分解物である、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）は小腸の可溶性カルシウムの濃度を増加させ、これによりカルシウム吸収を促進させる（特許文献１０参照（１９９５年９月５日発行））。カルシウムは、ＣＰＰに含まれる酸性アミノ酸のカルボキシレート基とホスホセリンのホスフェート基に配位することにより可溶性の状態に維持される。
【０００８】
【特許文献１】ＵＳ４８１６４４２
【特許文献２】ＵＳ４２９４７５３
【特許文献３】ＵＳ４４５５２５６
【特許文献４】ＵＳ４４３４０９４
【特許文献５】ＵＳ４２６１９７３
【特許文献６】ＵＳ４３０１１４４
【特許文献７】ＵＳ４１７９３３７
【特許文献８】ＵＳ４８３０８４７
【特許文献９】ＣＡ２１０２８０８
【特許文献１０】ＵＳ５４４７７３２
【非特許文献１】オオタ（Ohta）ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７年），３２９巻，ｐ５３９
【非特許文献２】ルーク（Rook）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９８６年），１３６巻，ｐ３９１６
【非特許文献３】Ｗ．ベール（Vale）ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６年），３２１巻，ｐ７７６－７９
【非特許文献４】Ｙ．トツカ（Totsuka）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９８８年），１５６巻，ｐ３３５－３９
【非特許文献５】Ｊ．ユー（Yu）ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７年），３３０巻，ｐ７６５－６７
【非特許文献６】Ｍ．Ｅ．ジョイス（Joyce）ら，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．（１９９０年），１１０巻，ｐ２１９５－２２０７
【非特許文献７】ゲインズ（Ganes）ら，「骨シアロタンパク質」，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＯｒａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，１０巻（１），ｐ７９－９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
骨粗鬆症や骨折は、高齢者や閉経後の女性によく見られる代謝性疾患である。ダイエタリーカルシウムは、高齢者の骨粗鬆症の予防のためカルシウム要求量を考慮する場合や、骨強度や骨のミネラル密度を増加する際に不可欠である。骨粗鬆症は、骨損失を特徴とする疾患であり、骨折の危険性の増加や背中痛や関節痛に関連している。骨粗鬆症の予防には十分なダイエタリー栄養物、特にカルシウム含有量の高い食品の摂取が重要である。ダイエタリーカルシウムは吸収性及び生体利用性が非常に高く、年齢とともにカルシウム吸収が低下する事実を考えると、高齢者のカルシウム要求量を考慮するうえで重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体又はこれらの混合物を、ダイエタリーカルシウムの吸収と骨芽細胞の増殖とを促進する栄養補助剤として、食品や動物用飼料において使用することに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明において、栄養補助剤としてγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体又はこれらの混合物を使用すれば、錯体形成によってカルシウム、マグネシウムのいずれも効果的に溶解・安定化することができ、食品や飼料組成物に用いた場合、効果的にカルシウム及びマグネシウムの生体利用性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びγ－ポリグルタメート（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄⁺、Ｃａ⁺⁺及びＭｇ⁺⁺体）は生分解性であって、Ｌ－グルタミン酸から液内発酵プロセス（Ｈ．クボタ（Kubota）ら、「枯草菌Ｆ－２－０１によるポリ（γ－グルタミン酸）の生産（Production of Poly((-Glutamic Acid) by Bacillus subtitlis F-2-01）」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７（７）、１２１２－１２１３、１９９３及びＹ．オガワ（Ogawa）ら、「ジャー内発酵における枯草菌（ナットウ）によるγ－ポリグルタミン酸の効果的な生産（Efficient Production of (-Polyglutamic Acid by Bacillus subtilis (natto) in Jar Fermentation）」、６１（１０）、１６８４－１６８７、１９９７参照）によって生産される非毒性バイオポリマーである。γ－ポリグルタメート（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄⁺、Ｃａ⁺⁺及びＭｇ⁺⁺体）は吸水性に優れ、金属イオンのＣａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺、Ｚｎ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺、Ｓｅ⁺⁺⁺⁺及びＣｒ⁺⁺⁺に対し良好な配位能を有し、錯体を形成する。また、γ－ポリグルタメートのポリアニオン性は水系において前記金属イオンを溶解・安定化するという用途に関し研究されている。図１にγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ）及びγ－ポリグルタメート（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ⁴⁺、Ｃａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺体）の分子構造を示す。図２、図３及び図４に、¹Ｈ－ＮＭＲ、¹³Ｃ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲスペクトルをそれぞれ示す。これらスペクトル及び分析データを表１にまとめた。図５にｐＨ滴定曲線を示す。
【００１３】
【表１】

【００１４】
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）は、重合度が１０００から２００００までのグルタミン酸のバイオポリマーであり、グルタミック単位同士のγ－ペプチド結合のみから成る。γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びγ－ポリグルタメート（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄⁺、Ｃａ⁺⁺及びＭｇ⁺⁺体）は末端アミンと多数のα－カルボン酸／カルボキシレート基とを含む。γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びγ－ポリグルタメート（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄⁺、Ｃａ⁺⁺及びＭｇ⁺⁺体）はｐＨやイオン強度、その他のカチオン性種等の環境条件により、幾つかのコンホメーション状態、即ち、αヘリックス、ランダムコイル、βシート、ヘリックスコイル転移領域及び包み込まれた会合体（enveloped aggregation）として存在する。通常、円二色性（ＣＤ）を用いて、αヘリックス体の存在量を２２２ｎｍにおけるスペクトル強度の関数として測定する。ヘリックスコイル転移は均一な水溶液中で、約ｐＨ３～５から生じ、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）は非結合の形態となり、ｐＨがより高い５～７にシフトすると結合した形態となる。ランダムコイルから包み込まれた会合体への転移は、γ－ＰＧＡの大規模のコンホメーション変化によって二価以上の金属イオンとの配位錯体が形成の場合に生じる。
【００１５】
本発明者らの研究により、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びγ－ポリグルタメート（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄⁺、Ｍｇ⁺⁺及びＣａ⁺⁺体）は、錯体形成によりカルシウム及びマグネシウムのいずれも溶解・安定化させるのに有効であり、食品や動物用飼料に栄養補助剤として用いる場合、カルシウム及びマグネシウムの生体利用性を高めるのに有効であることが分かった。
【００１６】
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）はカルシウム塩やマグネシウム塩と反応し、安定した水溶性のカルシウムγ－ポリグルタメートやマグネシウムγ－ポリグルタメートをそれぞれ生成する。本発明者らは、インビトロの細胞培養研究により、配位錯体であるこれらカルシウムγ－ポリグルタメート及びマグネシウムγ－ポリグルタメートには高い吸収性、生体利用性があることを見出した。
【００１７】
γ－ＰＧＡへの金属吸着には二つの可能な機構、即ち、（Ａ）金属イオンとカルボキシル部位との直接相互作用及び（Ｂ）ＣＯＯ^-基により生じる静電ポテンシャル場による移動可能な重金属対イオンの保持が関与している。カルボキシレート基との相互作用の他に、アミド結合も弱い相互作用部位を提供することができる。γ－ＰＧＡの配座構造とイオン化に加え、水溶液中に存在する加水分解金属種の種類を知ることも重要である。種々の異なる化学種が生成するので、金属イオンに対する吸着能に差が生じ得る。
【００１８】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体又はこれらの混合物をカルシウム及びマグネシウムの錯形成吸着剤として添加し、可溶性及び生体利用性を向上させ腸におけるカルシウム吸収性を高めることを見出した。食料品によっては無機ミネラルの塩やミネラル粉末を含有させることによってミネラル分を増加させたのものもあるが、これらは他の共存物質と不溶な塩を生成する可能性がある。特定ミネラル種を過剰摂取すると他のミネラルの吸着を阻害する可能性があるため、体内のミネラル利用はあまり向上しない。例えば、カルシウムの大量摂取は鉄の吸収を阻害する。更に、食品がミネラル分を含み過ぎると食品の味という点において不利である。また、一般にミネラルは、小腸で吸収されるためには溶解した状態で存在しなければならないと考えられている。
【００１９】
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及び各種γ－ポリグルタメート（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄⁺、Ｃａ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺体）は小腸下部でミネラルに対し良好な溶解作用を有し、人体又は動物体内でカルシウム吸収を促進する。特に、本発明はγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体又はこれらの混合物のダイエタリー製品において栄養補助剤として使用することに関する。
【００２０】
本発明の一実施形態において、ダイエタリー製品は栄養物質であり、前記ダイエタリー製品の全乾燥重量に対し０．００５重量％～１００重量％の前記栄養補助剤を含む。他の実施形態において、ダイエタリー製品は食品又は飼料組成物であり、前記ダイエタリー製品の全乾燥重量に対し０．００５重量％～５重量％の前記栄養補助剤を含む。
【００２１】
本発明に係るダイエタリー製品は、５～４０デキストロース当量のマルトデキストラン、乳タンパク質、大豆タンパク質単離物、グルコース、ラクトース、スクロース、フルクトース、小鎖オリゴ－フルクトース、グルカン又は他のオリゴ－ポリ多糖、コラーゲン、コラーゲンゼラチン加水分解物、α－デンプン、大豆タンパク質加水分解物、デンプン部分加水分解物、グリセロール、プロピレングリコール、エタノール、アラビアガム、グアーガム、カラギーナン（caragheneen）、セルロース及び他の変性セルロース、及びこれらの混合物から成る群から選択される成分を更に含むことができる。更に、前記ダイエタリー製品はソフトゲルカプセル又はハードゲルカプセル、錠剤又は液剤の形状とすることができる。
【００２２】
本発明によれば、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体及びγ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体の分子量は、それぞれ５０００～２．５×１０⁶の範囲である。本発明者らは、インビトロの研究において１５０×１０³～４５０×１０³ダルトンの範囲の分子量をそれぞれ有するγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体及びγ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体が骨芽細胞の増殖を促進することを見出し、インビボの研究において産卵鶏のパフォーマンスとブロイラー鶏の成長を向上させることを見出した。
【００２３】
市販目的量のγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）は、液内発酵プロセスにより、枯草菌（納豆菌）（Bacillus subtilis. Bacillus subtilis var. natto)（Ｈ．クボタ（Kubota）ら、「枯草菌Ｆ－２－０１によるポリ（γ－グルタミン酸）の生産（Production of Poly((-Glutamic Acid) by Bacillus subtitlis F-2-01）」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７（７）、１２１２－１２１３、１９９３及びＹ．オガワ（Ogawa）ら、「ジャー内発酵（Jar Fermentation）における枯草菌（ナットウ）によるγ－ポリグルタミン酸の効果的な生産（Efficient Production of (-Polyglutamic Acid by Bacillus subtilis (natto) in Jar Fermentation）」、６１（１０）、１６８４－１６８７、１９９７参照）を用いて生産することができ、また、バシラス・リシェニフォルミス（Bacillus licheniformis）（ＪＰ０５－３１６９９９（１９９３年３月１２日公開）参照）を用いＬ－グルタミン酸及びグルコースを主な供給原料として使用して生産することができる。微生物培養培地には、炭素源、窒素源、各種無機ミネラル分及び他の栄養分が含まれている。通常、炭素源の一部としてＬ－グルタミン酸量を３～１２％、グルコースを５～１２％の濃度範囲で用い、クエン酸を０．２～２％の濃度で用い、ペプトンと硫酸アンモニウム又は尿素とを窒素源として用い、酵母抽出物を栄養源として用い、Ｍｎ⁺⁺、Ｍｇ⁺⁺やＮａＣｌをミネラル源として用いる。培養は、適切な通気と撹拌の下、３０～４０℃の温度で維持し、ｐＨを尿素溶液又は水酸化ナトリウム溶液を用いて６～７．５に維持する。培養時間は通常４８～８４時間である。γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）は細胞外に蓄積される。
【００２４】
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及びその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）は通常、発酵用ブロスから一連の手続により抽出するが、その手続には超遠心や加圧ろ過により細胞を分離し、３～４倍のエタノールを添加してγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）やその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）を沈澱させる工程が含まれる。沈澱物を水に再度溶解し、新たにエタノールを使用しγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）やその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）を沈澱させる。この溶解－沈澱ステップを数回繰り返し、純粋なγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）やその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）を回収する。
【００２５】
通常、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）やその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）は、水やエタノール、メタノール等の適切な溶媒に溶解し、ｐＨは５．０～７．５に調節する。定常的に撹拌しながら、この溶液に、適切に選択した多官能化学架橋剤、例えばポリグリセロールポリグリシジルエーテルやソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパントリアクリレートを添加する。添加量は、架橋剤の種類やヒドロゲルに要求される品質により異なるが、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）又はその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）の重量の０．０１～２０％の範囲である。通常、ゲル化反応は５０～１２０℃の反応温度で１～４時間で完了するが、使用する器具や条件により異なる。次に、生成したヒドロゲルを凍結乾燥し、乾燥した架橋γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）或いはその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）を生成する。これは、超吸水能を有し、非水溶性であり、水中で完全に膨張すると、無色透明で生分解可能なヒドロゲルを形成する。
【００２６】
分子量が５０００～９０００００のγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）又はその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）は、選択された特定の反応条件（ｐＨ、温度、反応時間、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）濃度）で制御された酸加水分解により生成することができる。ｐＨについては、ＨＣｌやＨ₂ＳＯ₄、他の有機酸等の適切な酸類（acidulants）でｐＨ２．５～６．５の範囲にすることができる。加水分解の温度は、５０～１２０℃の範囲にすることができる。反応時間は０．５～５時間とすることができ、そして分子量１×１０⁶以上のγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）の濃度は、適宜必要ないかなる濃度とすることもできる。高純度で、低分子量から中程度の分子量のγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）又はその塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）を選択的に生成するためには、反応終了後、透析や膜ろ過による更なる精製と乾燥を行う必要がある。酸加水分解速度はｐＨが低い程、温度が高い程、また、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）の濃度が高い程速い。γ－ポリグルタメート塩（即ち、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体及びγ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体）は、選択したγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）を、選択したＮａ⁺、Ｋ⁺、ＮＨ₄⁺、Ｃａ⁺⁺又はＭｇ⁺⁺の金属イオン塩基性水酸化物溶液又は酸化物と反応させることにより生産することができ、ｐＨは必要に応じて５．０～７．２の所望の値に調節できる。
【実施例】
【００２７】
本発明を更に詳細に説明するため、以下に実施例を示し、本発明がどのように非常に改善されたカルシウム吸収を達成し、骨の成長と強度に健康上の利点をもたらし、カルシウム損失を減らし、骨粗鬆症の症状を軽減するのかを示す。しかしながら、本発明の範囲はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２８】
＜実施例１＞インビトロにおける細胞培養の研究－骨芽細胞の増殖促進
分子量９８０×１０³ダルトンのγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）ＨＭ、分子量８８０×１０³ダルトンのγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＨＭ及び分子量２５０×１０³ダルトンのγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＬＭを本研究に使用した。
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及び／又はγ－ポリグルタメートＮａ⁺体１０ｍｇを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有Ｆ－１２ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）１ｍＬに加え段階希釈を適切に行うことにより、同一組成の栄養培地中におけるγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及び／又はγ－ポリグルタメートＮａ⁺体の濃度が異なる（０．１％～４．９×１０^-5％）培地を調製し、各サンプル２００μＬを９６ウェル培養プレートに三連で添加した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のみを含むＦ－１２ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）をコントロールとして用いた。
【００２９】
指数増殖期のヒト骨髄幹細胞から骨芽細胞のサンプルを、１２００ｒｐｍで６分間遠心することにより生育培地から分離し、１０ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（０．０１Ｍホスフェート、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有Ｆ－１２ＤＭＥＭ培地中で再度懸濁し、細胞密度を１×１０⁵個／ｍＬとした。活発に増殖している細胞の懸濁液２００μＬを各サンプルウェルに加えた。９６ウェル培養プレートのサンプルをボルテックスミキサーで十分に混合し、５％ＣＯ₂雰囲気下ＲＨ７５％、３４℃で４８時間インキュベートした。ＭＴＴ［３－（４,５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２,５－ジフェノールテトラゾリウムブロミド］溶液（１ｍｇ／ｍＬ）２０μLを各ウェルに加え、十分に混合し再度４時間インキュベートした。１０％ＳＤＳ／０．０１ＮＨＣｌ緩衝液１００μＬを各サンプルウェルに加え、室温で一晩結晶を溶解させた。各サンプルウェルの光学濃度（ＯＤ_570nm）を測定、記録し、骨芽細胞の増殖向上について計算した。
【００３０】
骨芽細胞のミトコンドリアの脱水素酵素はＭＴＴ塩（無色のテトラゾリウム塩）と反応し、青色のホルマザン塩の結晶を生成することができる。次いで、ホルマザンの結晶はＳＤＳと反応し、可溶性の青色ホルマザンに変化した。青色ホルマザンの色の強度は骨芽細胞の増殖量を表す。骨芽細胞の増殖の向上は次に示すように計算できる。
増加(ＭＴＴ)％＝(（ＯＤ₅₇₀）ａ－（ＯＤ₅₇₀）ｃ)／(ＯＤ₅₇₀)ｃ×１００％
(ＯＤ₅₇₀)ａ：サンプルウェルの光学濃度
(ＯＤ₅₇₀)ｃ：コントロールウェルの光学濃度
【００３１】
＜実施例２＞
実施例１から得た増殖向上率の結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】

【００３３】
結果から明らかなように、０．３９ｐｐｍという低濃度においても骨芽細胞の増殖は、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＨＭの場合で１３０％以上、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＬＭの場合で８０％以上、γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）ＨＭの場合で１２５％以上、向上した。より高分子量のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＨＭの場合に、より良好な増殖向上が示された。
【００３４】
＜実施例３＞インビトロにおける細胞培養の研究－骨の形成促進
分子量９８０×１０³ダルトンのγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）ＨＭ、分子量８８０×１０³ダルトンのγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＨＭ及び分子量２５０×１０³ダルトンのγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＬＭを本研究に使用した。
【００３５】
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及び／又はγ－ポリグルタメートＮａ⁺体１０ｍｇを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有Ｆ－１２ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）１ｍＬに加え段階希釈を適切に行うことにより、栄養培地中におけるγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）及び／又はγ－ポリグルタメートＮａ⁺体の濃度が異なる（０．１％～３．１×１０^-3％）培地を調製し、各サンプル１ｍＬを６ウェル培養プレートに三連で添加した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）のみを含むＦ－１２ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）をコントロールとして用いた。
【００３６】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有Ｆ－１２ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）２ｍＬを各サンプルウェルに添加し十分に混合した。
指数増殖期のヒト骨髄幹細胞から骨芽細胞のサンプルを、１２００ｒｐｍで６分間遠心することにより成長培地から分離し、１０ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（０．０１Ｍリン酸、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有Ｆ－１２ＤＭＥＭ培地中で再度懸濁し、細胞密度を１×１０⁵個／ｍＬとした。活発に増殖している細胞の懸濁液１ｍＬを各サンプルウェルに加えた。６ウェル培養プレートのサンプルをボルテックスミキサーで十分に混合し、５％ＣＯ₂雰囲気下ＲＨ７５％、３４℃で７日間インキュベートした。次いで、トリプシン溶液２００μＬを各ウェルに添加し、３４℃で約３０秒間反応させた。Ｆ－１２ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）１ｍＬを各サンプルウェルに添加し十分に混合した。懸濁した細胞を回収除去した。ｐＮＰＰ（１００μＬ）／ｐ－ニトロフェニルホスフェート溶液（ＳＫ－５９００、ベクター社）（２ｍＬ）を含有する０．０１Ｍ重炭酸／炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ１０）１ｍＬを添加し、十分に混合して室温で３０分間反応させ、０．１ＭＮａＯＨ溶液１ｍＬを添加し反応を停止させた。４１０ｎｍでの吸光度を測定し記録した。
【００３７】
＜実施例４＞
実施例３から得た結果を次の表３に示した。
【００３８】
【表３】

【００３９】
アルカリホスファターゼ活性は骨芽細胞が存在することを示すものである。アルカリホスファターゼ活性は細胞が石灰化する前に高くなり、細胞密度は骨前駆体の分化及び骨形成を規定する。ヒト骨髄幹細胞を１週間培養した場合、骨芽細胞の存在を示すアルカリホスファターゼ活性が出現する（ヴァインレープ（Weinreb）Ｍ．、スキナー（Schinar）Ｄ．Ｍ．及びロダン（Rodan）Ｇ．Ａ．１９９０、「ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより可視化したラットの骨発達におけるオステオデンティン及びオステオカルシンの発現、アルカリフォスファターゼの異なるパターン（Different Pattern of Alkaline Phosphatase、Osteodentin, and Osteocalcin Expression in Developing Rat Bone Visualized by in situ Hybridization）」、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．５：８３８－８４２；ヤオ（Yao）Ｋ．Ｌ．、トデスカン（Todescan）Ｒ．Ｊｒ．及びソデック（Sodek）Ｊ．、１９９４、「成熟ラットの培養骨髄細胞による石灰化組織形成中のマトリックスタンパク質合成における一時的変化及びｍＲＮＡの発現（Temporal Changes in Matrix Protein Synthesis and mRNA Expression during Mineralized Tissue Formation by Adult Rat Bone Marrow Cells in Culture）」、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９：２３１－２４０；及びヘスベルトソン（Hesbertson）Ａ．及びオービン（Aubin）Ｊ．Ｅ．１９９５、「デキサメタゾンはラットの骨髄基質培養物のサブポピュレーション構成を変化させる（Dexamethasone, Alters the Subpopulation Make-Up of Rat Bone Marror Stromal Cultures)」Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１０：２８５－２９４参照）。
【００４０】
表３の結果はγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＨＭ及びγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ヒドロゲルの双方が骨芽細胞の増殖促進において効果的であることを示しており、最適濃度はそれぞれγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＨＭの場合で５００ｐｐｍ（０．０５％）とγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ヒドロゲルの場合で６．２ｐｐｍ（０．００６２％）である。低分子量のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＬＭもまた骨芽細胞の増殖を促進するが、１０００ｐｐｍ（０．１％）という非常に高い濃度である。この結果は、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体が、骨芽細胞とその前駆体による生体利用可能なカルシウムの吸収を効果的に促進することを示唆しており、骨の成長においてγ－ポリグルタメートＮａ⁺体の強い親水性と活性コイルコンホメーションが、骨成長因子（ＴＧＦ－β、アクチビン、骨形成因子（ＢＭＰ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）等）の機能を、この因子と効果的に錯体形成することにより促進し、骨芽細胞へ因子を輸送し、骨を形成及び成長させる。
【００４１】
＜実施例５＞インビボにおける屋外給餌実験－ユアン－アン(Yuan-an)養鶏場での放牧養鶏（産卵鶏）
７３週齢の産卵鶏を本研究に用いた。全８区画（１区画８０００羽）を用いた。通常飼料（アホ（Aho）P.W. 2002, 「米国鶏肉産業案内（Introduction to the US chicken meat industry）」801～818頁、「商用鶏肉・鶏卵の生産（Commercial Chicken Meat and Egg Production）」、第５版、ベル（Bell）, D. D.及びウェーバー・ジュニア（Weaver, junior）W.D.編、Kluwer Publishing；ノーウェル（Norwell） BS、ヘブンスタイン（Havenstein） G.B.ら、1994, 「１９５７年、１９９１年の「典型的」ブロイラー餌を給餌したときの、生育、生存率、飼料要求率に関する１９５７年対１９９１年の比較（Growth, livability, and feed conversion of 1957 vs 1991 broilers when fed "typical" 1957 and 1991 broiler diets）」、Poult. Sci. 73: 1785-1794）を４週間与え、次の４週間は１００ｐｐｍのγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＬＭ（分子量２００×１０³～４００×１０³）を含有する通常飼料を与え、次いで２週間、通常飼料を与え、これら期間に亘って鶏卵サンプルを集めた。鶏卵サンプルについて、卵殻強度、卵殻厚、卵白及び卵黄のｐＨ、卵白高を決定し、ＨＵ値（鶏卵の品質の凡その鮮度指数又は健全性指数）を算出した
【００４２】
＜実施例６＞
実施例５で得た結果を表４、５及び６に示した。
【００４３】
【表４】

【００４４】
【表５】

【００４５】
注：１．７３週齢の産卵鶏を用いた。
２．４区画（８０００羽／区画）を用いた。
３．「^*」は鶏卵１０個の平均値である。
４．ＨＵ値は次のように定義される：
ＨＵ＝ハウユニット・・・補正された卵アルブミンの高さの値
＝100＊log（H－Ｇ＊0.5（30＊Ｗ＊0.37－100）／100＋1.9
ここで、Ｈ－アルブミンの高さ（ｍｍ）
Ｗ－卵重（ｇ）
Ｇ－３２．２、重力定数
５．ＫＧＦ－卵殻強度の単位
【００４６】
【表６】

【００４７】
表４、５及び６の結果から、卵黄、卵白の強度及び卵殻強度に顕著な改善が示された。これは、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体を含有する飼料を与えた期間のＨＵ値の差の減少及びＫＧＦ値の差の減少に示されている。γ－ポリグルタメートＮａ⁺体を含有する飼料を与えた期間では、卵殻厚、卵白高、卵黄色の全てが改善された。
【００４８】
＜実施例７＞インビボにおける屋外給餌実験－イーチャン（Yee－Thiang）養豚場での放牧養豚
γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体及びγ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体の栄養的・健康的側面について子豚（２群２セット）を用いた放牧養豚を３９日間行って調べた。標準飼料に対し１００ｐｐｍの濃度でγ－ポリグルタメートＮａ⁺体及びγ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体を飼料補助剤として含む。表７に結果を示す。
【００４９】
＜実施例８＞
表７に実施例７の結果を示す。
【００５０】
【表７】

【００５１】
表７の結果より、γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体は体脂肪の減少及び子豚の飼料要求率（feed-to meat conversion）の減少に有効であるが、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体ではこの飼料要求率が若干増加し、子豚の体脂肪減少においては効果はほとんど認められないことが明らかとなった。
【００５２】
＜実施例９＞インビボにおける屋外給餌実験－トン－サン（Tong San）養鶏場での放牧養鶏（ブロイラー）
γ－ポリグルタメートＮａ⁺体の栄養的・健康的側面をブロイラーの雛（４群２セット）を用いた放牧養鶏を２５日間行い調べた。標準飼料に対し１００ｐｐｍの濃度で分子量２５０×１０³のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＬＭを飼料補助剤として含む。表８に結果を示す。
【００５３】
＜実施例１０＞
表８に実施例９の結果を示す。
【００５４】
【表８】

【００５５】
この結果、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体はカルシウム吸収を促進し、ブロイラーの雌雄両方の全体重を増加させる。２５日間の給餌において、開始時体重ｋｇ当りの終了時体重の平均はγ－ポリグルタメートＮａ⁺体を含有させた通常飼料（ヘブンスタイン（Havenstein） G.B.ら、1994, 「１９５７年、１９９１年の「典型的」ブロイラー餌を給餌したときの、生育、生存率、飼料要求率に関する１９５７年対１９９１年の比較（Growth、livability、and feed conversion of 1957 vs 1991 broilers when fed "typical" 1957 and 1991 broiler diets）」、Poult. Sci. 73: 1795-1794）を与えた群では４．７１２ｋｇで、通常飼料（コントロール）を与えた群では４．６２９ｋｇである。脛骨の長さは、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体を含有した飼料を適用した試験のブロイラー雄については９．３８ｃｍ、ブロイラー雌については９．１８ｃｍであり、通常飼料を適用したコントロールのブロイラー雄については９．２５ｃｍ、ブロイラー雌については９．１０ｃｍである。脛骨中のカルシウム含有量は通常飼料を適用したコントロールのブロイラー雄については１７．６６％、ブロイラー雌については１６．６９％である。
【００５６】
＜実施例１１＞インビトロにおける細胞培養研究－３Ｔ３－Ｌ１細胞モデルによるＧＴＦ（ブドウ糖耐性因子）活性の促進
本細胞培養実験には、分子量８８０×１０³のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＨＭ及び分子量２５０×１０³のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＬＭを用いた。
脂肪前駆細胞である３Ｔ３－Ｌ１のサンプルを解凍し、これを３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベーターにおいて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコＭＥＭ）培地中で一週間培養し、次いで分化培養を行った。分化培養培地ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭＩＢＭＸ、１μＭＤＸ及び１μg/ｍＬインスリン含有）における２日間の培養の後、脂肪前駆細胞を通常の１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に移し、更に１０日間９０％を超える細胞が成熟脂肪細胞に変化するまで培養を継続した。ここで、細胞の形状は当初の星形から油滴状へと変化するため、培養プレートの下部に白色油状物質として視覚的に観察することができる。細胞分化完了後、次の実験を続ける。
【００５７】
この成熟脂肪細胞をまず、３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベーターにおいて２％ＦＢＳを含有した無糖のＤＭＥＭ培地中で１時間培養し、ＰＢＳ（０．０１Ｍリン酸緩衝溶液、ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、異なる濃度のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体を含むテストサンプル２００μＬ及び１０ｎＭインスリンと２．５ｇ／Ｌグルコースとを含むＫＢＲ溶液２００μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂で２時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、清澄な上清を採取し、グルコース濃度をグルコースアナライザーを用いて分析した。反応前後のグルコース量の差は脂肪細胞による全グルコース摂取量で定義される。摂取されたグルコースの増加率は次に示すようにＧＴＦ活性として定義される。
ＧＴＦ活性の増加（％）＝（（サンプルによるグルコース摂取量－コントロールによるグルコース摂取量）／コントロールによるグルコース摂取量）×１００％
【００５８】
＜実施例１２＞
図６に、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体の分子量の変化の実施例１１のＧＴＦ活性へ及ぼす効果を示す。
この結果、高分子量、低分子量両方のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体でＧＴＦ活性が増加することが示され、より高分子量のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＨＭは約３００ｐｐｍで２１％という最も高い増加率を示し、低分子量のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体ＬＭは、濃度が１５０～６００ｐｐｍの範囲内において約３３．５％という最高のＧＴＦ活性を示した。
【００５９】
この結果は、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体が脂肪細胞のＧＴＦによるグルコースの消費を促進し、これは生体に対し、成長を維持し、健康上の効果を与えるのに非常に有効でありヒトの糖尿病の症状をコントロールするうえで、良好な生物学的機能を発揮し得ることを明らかに示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】（Ａ）γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ、Ｈ体）、（Ｂ）Ｍ（Ｉ）γ－ポリ－（Ｌ）－グルタメートの繰り返し単位［Ｍ（Ｉ）γ－（Ｌ）－ＰＧＡ］：γ－ポリグルタメートＫ⁺体、γ－ポリグルタメートＮａ⁺体及びγ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体、（Ｃ）Ｍ（ＩＩ）_1/2γ－ポリ－（Ｄ）－グルタメートの繰り返し単位［Ｍ（ＩＩ）_1/2γ－（Ｄ）－ＰＧＡ］：γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体及びγ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体（Ｍ（Ｉ）＝Ｋ⁺、Ｎａ⁺、又はＮＨ₄⁺；Ｍ（ＩＩ）＝Ｃａ⁺⁺又はＭｇ⁺⁺）の化学構造。
【図２】ｐＨ中性、温度３０℃のＤ₂Ｏにおける各種（Ａ）γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、（Ｂ）γ－ポリグルタメートＫ⁺体、（Ｃ）γ－ポリグルタメートＮＨ₄⁺体の４００ＭＨｚ¹Ｈ－ＮＭＲスペクトル。化学シフトは内部標準からｐｐｍ単位で測定。Ｘは不純物ピークを示す。それぞれ、縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃｍ^-1）を示す。
【図３】ｐＨ中性、温度３０℃のＤ₂Ｏにおける各種（Ａ）γ－ポリグルタメートＫ⁺体、（Ｂ）γ－ポリグルタメートＮａ⁺体、（Ｃ）γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体及び（Ｄ）γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体の¹³Ｃ－ＮＭＲスペクトル。化学シフトは内部標準からｐｐｍ単位で測定。
【図４】ＫＢｒペレットによる（Ｃ）γ－ポリグルタメートＣａ⁺⁺体及び（Ｄ）γ－ポリグルタメートＭｇ⁺⁺体の赤外（ＦＴ－ＩＲ）吸収スペクトル。
【図５】各種（Ａ）γ－ＰＧＡと０．２ＮＮａＯＨ、（Ｂ）γ－ＰＧＡとＣａ（ＯＨ）₂及び（Ｃ）γ－ＰＧＡと５ＮＮＨ₄ＯＨの２５℃でのｐＨ滴定曲線。
【図６】実施例１１において例示した各種分子量のγ－ポリグルタメートＮａ⁺体のブドウ糖耐性因子（ＧＴＦ）活性へ及ぼす効果。縦軸はＧＴＦ活性の増加（％）、横軸はγ－ポリグルタメートＮａ⁺体濃度（ｐｐｍ）を示す。

【出願人】	【識別番号】５０３４６７９２０【氏名又は名称】トンハイバイオテクノロジーコーポレイション【氏名又は名称原語表記】ＴＵＮＧＨＡＩＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【出願日】	平成１７年５月１６日（２００５．５．１６）
【代理人】	【識別番号】１１０００００８４【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所【識別番号】１０００６８７００【弁理士】【氏名又は名称】有賀三幸【識別番号】１０００７７５６２【弁理士】【氏名又は名称】高野登志雄【識別番号】１０００９６７３６【弁理士】【氏名又は名称】中嶋俊夫【識別番号】１００１１７１５６【弁理士】【氏名又は名称】村田正樹【識別番号】１００１１１０２８【弁理士】【氏名又は名称】山本博人【識別番号】１０００８９０４８【弁理士】【氏名又は名称】浅野康隆【識別番号】１００１０１３１７【弁理士】【氏名又は名称】的場ひろみ【識別番号】１００１３４９３５【弁理士】【氏名又は名称】大野詩木
【公開番号】	特開２００６－３１６０２２（Ｐ２００６－３１６０２２Ａ）
【公開日】	平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【出願番号】	特願２００５－１４２１６８（Ｐ２００５－１４２１６８）