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【発明の名称】 アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤、及びアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる飲食品
【発明者】 【氏名】滝本 博明

【氏名】熊沢 義雄

【氏名】武川 和琴
【要約】 【課題】花粉症、通年性アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息等のＩ型アレルギー性疾患の症状に対して優れた抑制効果を有し、長期間服用しても副作用の心配のないアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤、及びアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる飲食品を提供する。

【解決手段】エンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体を有効成分として含有し、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされているアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤。エンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体を有効成分として含有し、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされており、製品又はその説明書にアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる旨の表示を付された飲食品。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体を有効成分として含有し、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされていることを特徴とするアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤。
【請求項２】
前記１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２〜１０ｇとされている請求項１記載のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤。
【請求項３】
前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）はFERM BP-10284（産業技術総合研究所・特許微生物寄託センター寄託番号）である請求項１又は２記載のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤。
【請求項４】
好酸球浸潤を抑制するものである請求項１〜３のいずれか１つに記載のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤。
【請求項５】
IL-4産生を抑制する一方、インターフェロン-γ産生を亢進するものである請求項１〜４のいずれか１つに記載のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤。
【請求項６】
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体を有効成分として含有し、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされており、製品又はその説明書にアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる旨の表示を付したことを特徴とする飲食品。
【請求項７】
前記１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２〜１０ｇとされている請求項４記載の飲食品。
【請求項８】
前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）はFERM BP-10284（産業技術総合研究所・特許微生物寄託センター寄託番号）である請求項６又は７記載の飲食品。
【請求項９】
製品又はその説明書に、更に、好酸球浸潤を抑制するために用いられる旨の表示を付した請求項６〜８のいずれか１つに記載の飲食品。
【請求項１０】
製品又はその説明書に、更に、IL-4産生を抑制する一方、インターフェロン-γ産生を亢進するために用いられる旨の表示を付した請求項６〜１０のいずれか１つに記載のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる飲食品。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体を有効成分として含有するアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤、及びアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
花粉、ダニ、ハウスダスト等は代表的なアレルゲン物質であり、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等の様々なアレルギー疾患を引き起こすことが知られている。特に、花粉症は患者数も多く、社会問題にもなっている。
【０００３】
通常、このようなアレルギー疾患の治療には、ステロイド剤、非ステロイド剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤等の外用あるいは内服が行われている。これらの薬剤は優れた抗アレルギー効果を有するものの、副作用が強いためその使用には制限があり、長期間の使用は好ましいものとは言えなかった。
【０００４】
一方、近年、腸内フローラの研究が進展し、腸内フローラが宿主の健康や疾病に密接に関係していることが明らかとなり、乳酸菌やビフィズス菌等をプロバイオティクスとして様々な疾病の予防や症状の改善のために用いる試みが盛んに行われている。
【０００５】
例えば、乳酸球菌の１種であるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）は免疫賦活作用を有していることが知られており、下記特許文献１には、エンテロコッカス・フェカリス等の乳酸菌の菌体を有効成分とするＩｇＥ抗体産生抑制剤が開示されており、該ＩｇＥ抗体産生抑制剤の１日当りの投与量は、菌体重量で約１０〜１０００ｍｇであることが記載されている（段落番号００１３参照）。
【０００６】
また、下記特許文献２には、ヒトの腸内細菌群より分離された乳酸菌として、エンテロコッカス・フェカリス（AD101株）、ラクトバチルス・ロイテリー（AD0002株）のうち１種類以上の菌体における、ヒスタミン遊離抑制効果を有するＩ型アレルギー抑制剤、及びＩＶ型アレルギー抑制剤が開示されている。そして、該アレルギー抑制剤の１日当りの摂取量は、乾燥重量として５０ｍｇから１ｇであることが記載されている（段落番号００１５参照）。
【特許文献１】特開平９−２９５９号公報
【特許文献２】特開２０００−９５６９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１、２に記載されたようなエンテロコッカス・フェカリスを有効成分として含有する従来のアレルギー抑制剤は、副作用の心配はないものの、充分満足できる効果が得られないことも多かった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息等のＩ型アレルギー性疾患の症状に対して優れた抑制効果を有し、長期間服用しても副作用の心配のないアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤、及びアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体を有効成分として含有し、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされていることを特徴とする。
【００１０】
上記アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤においては、前記１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcusfaecalis）の加熱殺菌菌体量が２〜１０ｇとされていることが好ましい。
【００１１】
また、前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）はFERM BP-10284（産業技術総合研究所・特許微生物寄託センター寄託番号）であることが好ましい。
【００１２】
また、上記アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤は、好酸球浸潤を抑制するものであることが好ましく、更に、IL-4産生を抑制する一方、インターフェロン-γ産生を亢進するものであることが好ましい。
【００１３】
一方、本発明の飲食品は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体を有効成分として含有し、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされており、製品又はその説明書にアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる旨の表示を付したことを特徴とする。
【００１４】
上記飲食品においては、前記１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２〜１０ｇとされていることが好ましい。
【００１５】
また、前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）はFERM BP-10284（産業技術総合研究所・特許微生物寄託センター寄託番号）であることが好ましい。
【００１６】
また、製品又はその説明書に、更に、好酸球浸潤を抑制するために用いられる旨の表示を付したものであることが好ましく、更には、IL-4産生を抑制する一方、インターフェロン-γ産生を亢進するために用いられる旨の表示を付したものであることが好ましい。
【００１７】
本発明のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤及び飲食品は、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれるエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体量が２ｇ以上であり、それによって、生理活性効果が充分に期待できる量のエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体を確実に摂取することができ、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息等のＩ型アレルギー性疾患の症状に対して優れた抑制効果が期待できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の産生を抑制することにより、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息等のＩ型アレルギー性疾患の症状に対して優れた抑制効果が期待できるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤及び飲食品を提供することができる。本発明のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤及び飲食品は安全性が高いので、小児や子供等にも好適に用いることができる。
【００１９】
また、好酸球浸潤を抑制することによってケミカルメディエーターの遊離抑制によるアレルギー反応の抑制という効果が期待でき、更には、IL-4産生を抑制する一方、インターフェロン-γ産生を亢進することによって、Th1/Th2バランスの改善という効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤及び飲食品において用いられるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）としては、FERM BP-10284（産業技術総合研究所・特許微生物寄託センター寄託番号、識別のための表示 Enterococcus faecalis EC-12）、ATCC 19433、ATCC 14508、ATCC 23655、IFO 16803、IFO 16804等の菌株が例示でき、中でもFERM BP-10284株が好ましく例示できる。
【００２１】
また、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体は、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcusfaecalis）を常法に従って培養して得られた培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の方法により菌体を回収し、水洗後、水等に懸濁して８０〜１２０℃、３秒〜３０分間加熱処理した後、必要に応じて濃縮、乾燥することにより調製できる。エンテロコッカス・フェカリス（FERM BP-10284）の加熱処理による殺菌菌体粉末は、商品名「ＥＣ−１２」（コンビ株式会社製）として市販されているので、このような市販品を用いることもできる。
【００２２】
本発明のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤は、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされ、好ましくは２〜１０ｇとされ、更に好ましくは４〜８ｇとされる。
【００２３】
１日当りの摂取量中に含まれるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２ｇ未満であると充分な抗アレルギー効果が期待できず、１０ｇを超えると軟便傾向を示す場合がある。なお、エンテロコッカス・フェカリス（FERM BP-10284）加熱殺菌菌体の２ｇ当りの菌体数は１×１０１３個である。
【００２４】
また、本発明において、「製品に表示された」とは、製品の容器、袋、箱等の包装材料等に直接表示されたものを意味し、「その説明書に表示された」とは、製品の袋や箱等に同封された印刷物、製品パンフレット等に表示されたものを意味する。
【００２５】
本発明のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤は、上記の菌体の他に、必要に応じて、賦形剤、甘味料、酸味料、ビタミン類、ミネラル類、オリゴ糖類、食物繊維等を添加して、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状又はゼリー状として調製することができる。
【００２６】
また、本発明のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる飲食品は、上記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体を有効成分として含有し、製品又はその説明書に表示された１日当りの摂取量中に含まれる前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされており、製品又はその説明書にアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制のために用いられる旨の表示を付したものである。
【００２７】
本発明の飲食品の種類としては、特に限定されないが、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状又はゼリー状に調製された健康飲食品、パン、うどんやラーメン等の各種麺類、納豆、清涼飲料、ドリンク剤やゼリー飲料等の各種飲料、ゼリー、グミ、キャンディー、ビスケット、インスタントスープやインスタント味噌汁等の各種インスタント食品、レトルト食品、電子レンジ対応食品等が例示できる。
【００２８】
本発明の飲食品においては、上記１日当りの摂取量中に含まれるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体量が２ｇ以上とされ、好ましくは２〜１０ｇとされ、更に好ましくは、４〜８ｇとされる。
【００２９】
上記飲食品におけるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱殺菌菌体の添加方法は、特に制限はなく、各飲食品に用いられる他の原料と一緒に最初から添加することができる。したがって、加熱処理（加熱殺菌、焼成、蒸煮等の菌が死滅するような温度条件下での処理）が必要な飲食品に添加しても効果が損われることがない。
【実施例１】
【００３０】
市販のエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体粉末（商品名「ＥＣ−１２」、コンビ株式会社製、以下「ＥＣ−１２」と略称する）を用いて、喘息誘発モデルマウスに対する抗アレルギー効果を以下の方法で調べた。
【００３１】
（１）動物
７週齢の雌性BALB/cマウス（日本SLCより購入）を３群（１群６匹）に分けた。
【００３２】
（２）サンプルの調製
「ＥＣ−１２」を蒸留水に懸濁し、サンプル１（濃度0.4mg/ml）を調製し、試験期間中、試験群１に0.5mlずつ毎日経口投与（200μg/mouse）した。同様にしてサンプル２（濃度4mg/ml）を調製し、試験群２に0.5mlずつ毎日経口投与（2mg/mouse）した。また、コントロール群には滅菌水を0.5mlずつ毎日経口投与した。
【００３３】
（３）喘息誘発モデルマウス
各群のマウスに卵白アルブミン（OVA）100μgと水酸化アルミニウムゲル1.6mgの混合物を、０及び７日目に皮下投与した。１４、１５、１６日目にOVA 10μgを点鼻投与した。１８日目に解剖し、血清、肺洗浄液、肺及び脾臓を採取した。
【００３４】
（４）脾細胞の調製と培養
脾細胞は2x106/mlに調整し、抗CD3単クローン抗体（mAb）（145-2C11）（日本ベクトン・ディッキソン株式会社製）により３日間刺激後、培養上清中のIFN−γ、IL-４量をELISAで調べた。
【００３５】
（５）抗体価及びサイトカインの測定
抗体価及びIFN−γは、OVAあるいは抗マウスIFN−γ mAb（Ｒ４−６Ａ２）（日本ベクトン・ディッキソン株式会社製）をコーティングした96穴プレートに段階希釈した試料を添加した。検出抗体として、AP標識抗マウスIgG1（ＩＣＮ社製）、IgG2a抗体（ＺＹＭＥＤ社製）あるいはbiotin標識抗マウスIFN−γ抗体（ＡＮ−１８）（日本ベクトン・ディッキソン株式会社製）とAP標識streptavidin（ＺＹＭＥＤ社製）を用い、p-nitrophenyl phosphateを基質として発色させ、3N NaOHで反応停止後、マイクロプレートリーダーで450/540ｎｍの吸光度を測定した。
【００３６】
IgEは抗マウスIgE mAb日本ベクトンディッキンソン株式会社製）をコーティングし、段階希釈した試料を添加した。検出にはbiotin標識OVAとHRP標識streptavidin（ＺＹＭＥＤ社製）を用い、商品名「TMB Microwell Peroxidase」（フナコシ株式会社製）で発色させ、2N H２SO４で反応停止後、450／540ｎｍの吸光度を測定した。
【００３７】
IL−4は、商品名「OptEIATMSet」（BD Bioscience社製）を用いて測定した。
【００３８】
（６）細胞数の計測
喘息誘発モデルマウス１８日目の肺洗浄液中の全白血球数及び好酸球数を計測した。全白血球数はチュルク液で染色して血球計算板にて計測し、好酸球はギムザ染色液で染色して顕微鏡で計測した。
【００３９】
（７）肺の組織切片
各マウスから肺を採取し、４％ paraformaldehydeで固定した。パラフィン包埋後、薄切りHematoxylin-Eosin染色した。
【００４０】
（８）結果
図１に、肺胞洗浄液中の全白血球数と好酸球数を計測した結果を示す。図１から、好酸球数は、コントロール群に比べて試験群１及び試験群２では減少していることが分かる。特に試験群２では、コントロール群と有意差（ｐ＜0.001）が認められた。一方、全白血球数について各群において差は認められなかった。
【００４１】
喘息誘発モデルマウスの１８日目の脾細胞をin vitroで抗CD3 mAbにより３日間刺激した後の培養上清中のIFN−γ量を測定した結果を図２に、IL−４量を測定した結果を図３に示す。図２、３から、試験群２では、コントロール群に比べてIFN−γ量が増加傾向にあり、IL−４量は減少傾向にあることが分かる。一方、試験群１では、顕著な傾向が見られなかった。
【００４２】
喘息誘発モデルマウス１８日目の血清中OVA特異的抗体価を測定した結果を図４に示す。図４から、試験群２では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＥ量が有意に減少し、特にＩｇＥ量が顕著に減少していることが分かる。一方、試験群１では、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＥ量が減少する傾向にあることが分かる。
【００４３】
コントロール群及び試験群２のマウスの肺を病理学的に比較した結果を図５に示す。図５（Ａ）から、コントロール群では炎症局所の白血球浸潤が観察された。一方、図５（Ｂ）から、試験群２では顕著に白血球の浸潤が抑制されていた。
【００４４】
以上の結果から、喘息モデルマウスに、所定量（2mg/mouse）のエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体を経口投与することにより、１）好酸球浸潤が顕著に抑制され、２）Th2サイトカインが関与する抗体応答も顕著に抑制され、３）脾細胞のIFN-γ産生量が増加し、IL-4の産生が抑制されることが分かった。
【００４５】
ここで、Th1/Th2バランスは恒常性維持に重要な因子の一つであり、喘息患者はT細胞の応答がTh2優位な状態になっていることが知られている。しかし、所定量のエンテロコッカス・フェカリスの加熱殺菌菌体粉末を経口投与することにより、マクロファージ活性化を介してTh1/Th2バランスが回復し、病態が改善されることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体産生抑制剤及び飲食品は、健康食品として直接摂取できるだけでなく、様々な飲食品に容易に添加することができる機能性食品素材として利用することができる。また、副作用の心配がないので、特に小児や子供に対して好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】各群のマウスの肺胞洗浄液中の全白血球数と好酸球数を計測した結果を示す図である。
【図２】各群のマウスの脾細胞をin vitroで抗CD3 mAbにより３日間刺激した後の培養上清中のIFN−γ量を測定した結果を示す図である。
【図３】各群のマウスの脾細胞をin vitroで抗CD3 mAbにより３日間刺激した後の培養上清中のIL−４量を測定した結果を示す図である。
【図４】各群のマウスの血清中OVA特異的抗体価を測定した結果を示す図である。
【図５】コントロール群及び試験群２のマウスの肺の組織切片を示す図である。
【出願人】 【識別番号】３９１００３９１２
【氏名又は名称】コンビ株式会社
【識別番号】５９８０４１５６６
【氏名又は名称】学校法人北里学園
【出願日】 平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【代理人】 【識別番号】１０００８６６８９
【弁理士】
【氏名又は名称】松井 茂
【公開番号】 特開２００６−２５７０４０（Ｐ２００６−２５７０４０Ａ）
【公開日】 平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願番号】 特願２００５−７８８０４（Ｐ２００５−７８８０４）