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【発明の名称】 ウレアーゼ阻害剤
【発明者】 【氏名】宮崎 寿次
【住所又は居所】大阪府大阪市西区新町１丁目１番１７号 長瀬産業株式会社内

【氏名】塩尻 正俊
【住所又は居所】兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号 長瀬産業株式会社研究開発センター内
【要約】 【課題】ウレアーゼが有する活性をより効果的に阻害するとともに、生体に対する安全性が向上し、かつその原材料の入手が容易である、ウレアーゼ阻害剤を提供すること。

【解決手段】食品分野、医薬品分野あるいは化成品分野等で利用可能な、ウレアーゼ阻害剤が開示されている。本発明のウレアーゼ阻害剤は、フロログルシノール、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、８，８’−ビエコール、およびエクストロノールからなる群より選択される少なくとも１種のフェノール化合物を有効成分として含有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フロログルシノール、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、８，８’−ビエコール、およびエクストロノールからなる群より選択される少なくとも１種のフェノール化合物を有効成分として含有する、ウレアーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記フェノール化合物が海藻由来のものである、請求項１に記載のウレアーゼ阻害剤。
【請求項３】
前記フェノール化合物が海藻抽出物の形態で含有されている、請求項１に記載のウレアーゼ阻害剤。
【請求項４】
前記海藻が、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ、サガラメ、ツルアラメ、クロメ、カジメ、ワカメ、アオワカメ、ヒロメ、アイヌワカメ、およびチガイソ；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ、ヒジキ、およびアカモク；褐藻類まがまつも目もずく科のモズクおよびオキナワモズク；ならびに、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻である、請求項２または３に記載のウレアーゼ阻害剤。
【請求項５】
ウレアーゼの活性を阻害するための食品である旨の表示を付した飲食物であって、フロログルシノール、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、８，８’−ビエコール、およびエクストロノールからなる群より選択される少なくとも１種のフェノール化合物を有効成分として含有する、飲食物。
【請求項６】
前記フェノール化合物が海藻由来のものである、請求項５に記載の飲食物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明はウレアーゼ阻害剤に関し、より詳細には、尿素の加水分解を触媒し、アンモニアの産生を促すウレアーゼの活性を効果的に阻害する、ウレアーゼ阻害に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウレアーゼは尿素の加水分解を触媒し、アンモニアを産生させる酵素である。ウレアーゼが有するこのような活性は、種々の局面において問題を来たすと言われている。
【０００３】
一つの問題として、胃炎が指摘されている。胃の中に生存するヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ；Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）は、それ自身が有するウレアーゼによって、尿素をアンモニアに分解し、その結果としてＨ．ｐｙｌｏｒｉ陽性者は陰性者に比べて胃液中のアンモニア濃度が有意に高く、これによって胃粘膜が傷害される危険性が指摘されている。実際の臨床においては、胃液中のアンモニア濃度と胃炎スコアとの間には有意な相関性が認められることが報告されている。また、インビトロにおいても胃上皮細胞に対するアンモニア傷害が証明されている。そこで、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ陽性胃炎または胃潰瘍患者において予測される長期アンモニア曝露による胃粘膜傷害の治療薬として、ウレアーゼ阻害薬の開発が考えられている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
他の問題として、肝硬変に基づく肝性昏睡が指摘されている。肝性昏睡は、肝硬変等の肝障害時に認められる意識障害であり、主因子はアンモニアであると考えられている。肝臓において合成された尿素の約７０％はそのまま腎臓を経て尿中に排泄され、残りの約３０％の尿素は消化管内に分泌される。消化管内に分泌された尿素が消化管内に存在するウレアーゼによって分解されるとアンモニアが生成される。その後、生成されたアンモニアは生体内に吸収され、その大部分は肝臓にて尿素に再合成される。しかし、肝硬変等の肝疾患を患った患者の場合、肝臓における尿素合成能が低下しているため、血中アンモニア濃度が上昇し、意識障害（肝性昏睡）に発展し得ることが考えられている。このように肝性昏睡の原因がアンモニアであり、血中アンモニア濃度増大の原因の一つとして消化管ウレアーゼが指摘されている点から、ウレアーゼの阻害が肝性昏睡の治療に有効であると考えられている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
さらに他の問題として、オムツ臭いおよびオムツかぶれが指摘されている。糞便中に存在するウレアーゼは尿中の尿素を分解し、アンモニアを産生させる。オムツの中で糞便と尿とが混合されると、ウレアーゼと尿素との反応によりアンモニアが産生され、それが大気中に拡散して悪臭を放つ。また、産生されるアンモニアによって皮膚ｐＨが上昇し、糞便中のプロテアーゼやリパーゼを活性化させ、オムツかぶれを誘発させることが知られている。このようなアンモニア臭およびオムツかぶれを抑制または防止するために、特許文献２は、フラボン類、フラボノール類、ジヒドロフラボノール類、カテキン類などの化合物を有効成分として含有するアンモニア臭抑制剤およびオムツかぶれ防止剤を開示している。
【０００６】
上記のように種々の問題が指摘されている一方、ウレアーゼの活性を阻害する目的で、様々なウレアーゼ阻害剤が提案かつ開発されている。代表的なウレアーゼ阻害剤としては、例えば、ベンツイミダゾール系化合物を用いるもの（特許文献３）、カルボスチル誘導体を用いるもの（特許文献４）、ジチオジベンゾヒドロキサム酸誘導体を用いるもの（特許文献５）、イソチアゾール誘導体を用いるもの（特許文献６）、ルスカスなどの植物抽出物を用いるもの（特許文献７）、ダイオウ属等の植物抽出物を用いるもの（特許文献８）、およびアカシア属等の植物抽出物を用いるもの（特許文献９）が挙げられる。
【０００７】
しかし、上記のような成分を用いるウレアーゼ阻害剤は、生体に対する副作用有無の点で、すべてが必ずしも安全とはいえず、かつ植物抽出物由来の成分を用いるウレアーゼ阻害剤においては、工業生産に際し、原料となる植物体自体の入手が比較的容易であるか否か、かつウレアーゼの活性に対して効果的な阻害効果を有しているか否かを考慮すれば、この点で未だ充分とは言い難い。
【０００８】
【非特許文献１】高橋ら、「アルサー・リサーチ（Ｕｌｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，２００３年，第３０巻，第２号，ｐｐ．１０６−１０９
【特許文献１】特開平６−２５６３７５号公報
【特許文献２】特開２００４−０９１３３８号公報
【特許文献３】特開平７−０２５７６７号公報
【特許文献４】特開平７−１０１８６２号公報
【特許文献５】特開平１０−３１６６５１号公報
【特許文献６】特開２００１−２４７４６２号公報
【特許文献７】特開平８−０１９５９５号公報
【特許文献８】特開２０００−１５４１４５号公報
【特許文献９】特開２００２−０２９９７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、ウレアーゼが有する活性をより効果的に阻害するとともに、生体に対する安全性が向上し、かつその原材料の入手が容易である、ウレアーゼ阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、フロログルシノール、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、８，８’−ビエコール、およびエクストロノールからなる群より選択される少なくとも１種のフェノール化合物を有効成分として含有する、ウレアーゼ阻害剤である。
【００１１】
１つの実施形態では、上記フェノール化合物は海藻由来のものである。
【００１２】
１つの実施形態では、上記フェノール化合物は海藻抽出物の形態で含有されている。
【００１３】
さらなる実施形態では、上記海藻は、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ、サガラメ、ツルアラメ、クロメ、カジメ、ワカメ、アオワカメ、ヒロメ、アイヌワカメ、およびチガイソ；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ、ヒジキ、およびアカモク；褐藻類まがまつも目もずく科のモズクおよびオキナワモズク；ならびに、紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；からなる群より選択される少なくとも１種の海藻である。
【００１４】
本発明はまた、ウレアーゼの活性を阻害するための食品である旨の表示を付した飲食物であって、フロログルシノール、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、８，８’−ビエコール、およびエクストロノールからなる群より選択される少なくとも１種のフェノール化合物を有効成分として含有する、飲食物である。
【００１５】
１つの実施形態では、上記フェノール化合物は海藻由来のものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、尿素の加水分解を触媒しアンモニアを産生させるというウレアーゼの活性をより効果的に阻害するとともに、生体に対する安全性をも向上させることができる。このため、本発明のウレアーゼ阻害剤は日常的な使用がより可能となり、食品分野、医薬分野などの種々の分野における汎用性を高めることができる。本発明のウレアーゼ阻害剤はまた、胃炎、肝硬変に基づく肝性昏睡、オムツ臭い・オムツかぶれのような、ウレアーゼが触媒して尿素をアンモニアに分解することより生じ得る各種疾患等の予防または治療の目的に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
まず、本発明のウレアーゼ阻害剤について説明する。
【００１８】
本発明のウレアーゼ阻害剤は、フェノール化合物を有効成分として含有する。
【００１９】
本発明に用いられるフェノール化合物は、フロログルシノールそのもの、あるいは一般に海藻タンニン（フロロタンニン）とも呼ばれるポリフェノールの一種である。さらに、このポリフェノールは、フロログルシノールを基本骨格単位とする、フロロタンニン類全体を包含する化合物である。本発明に用いられるフェノール化合物としては、例えば、以下の式：
【００２０】
【化１】


【００２１】
で表されるフロログルシノール（ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ）そのもの、エコール（ｅｃｋｏｌ）、フロロフコフロエコールＡ（ｐｈｌｏｒｏｆｕｃｏｆｕｒｏｅｃｋｏｌ Ａ）、ジエコール（ｄｉｅｃｋｏｌ）、８，８’−ビエコール（８，８’−ｂｉｅｃｋｏｌ）、エクストロノール（ｅｃｋｓｔｏｌｏｎｏｌ）に例示されるフロロタンニン、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
【００２２】
本発明に用いられるフェノール化合物は、市販されているか、または後述するような海藻から当業者に周知の手法を用いて容易に得ることができる。特に、本発明に用いられるフェノール化合物は入手が容易であるとの理由から海藻由来のものが好ましい。また、本発明に用いられるフェノール化合物は、海藻抽出物の形態で使用されてもよい。
【００２３】
本発明に用いられ得る海藻の例としては、褐藻類のこんぶ目こんぶ科、褐藻類こんぶ目ちがいそ科、褐藻類ひばまた目ほんだわら科、褐藻類ながまつも目もずく科、または紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻が挙げられる。
【００２４】
上記海藻に包含される、具体的な例としては、褐藻類こんぶ目こんぶ科のマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、褐藻類こんぶ目ちがいそ科のアラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、サガラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ ａｒｂｏｒｅａ）、ツルアラメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｌｏｎｉｆｅｒａ）、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｋｕｒｏｍｅ）、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｃａｖａ）、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、アオワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）、ヒロメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アイヌワカメ（Ａｌａｒｉａ ｐｒａｅｌｏｍｇａ）、およびチガイソ（Ａｌａｒｉａ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ）；褐藻類ひばまた目ほんだわら科のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｌｕｖｅｌｌｕｍ）、ヒジキ（Ｈｉｚｉｋｉａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、およびアカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｈｏｒｎｅｒｉ）；褐藻類まがまつも目もずく科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｕｓ）およびオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎ ｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）；ならびに紅藻類スギノリ目すぎのり科に属する海藻；が挙げられる。特に、海藻自体の生産量が比較的多く入手が容易であり、かつ上記フェノール化合物を海藻抽出物の形態で使用する場合において当該フェノール化合物をより多く含有する画分がより得られ易いという理由から、アラメ、クロメ、ワカメ、ヒジキが好ましい。
【００２５】
本明細書において、海藻とは、これらの海藻の全草自体、あるいは根、茎、および葉を包含する少なくとも一つの部位を包含していう。本発明に用いられる海藻の形態は、未加工のもの、断片、細片または粉末を包含する。さらに、本発明に用いられ得る海藻は、乾燥物または生の状態のもののいずれをも包含する。
【００２６】
また、本明細書において、抽出物とは、上記のような海藻を、水、極性または非極性の溶媒、あるいはこれらの混合物を抽出溶媒として用い適切な条件で抽出された抽出物を意味する。抽出物の形態は特に限定されず、抽出液、あるいは当該抽出液を当業者が通常用いる手段により濃縮または乾燥して得られる粉末またはペースト状物も含まれる。
【００２７】
本発明において、上記フェノール化合物を海藻由来の抽出物から取り出して用いるか、あるいは当該抽出物の形態で用いる場合、当該海藻由来の抽出物は、好ましくは（１）上記海藻を水で抽出して得られた水粗抽出物を含有する、５０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清由来のもの；であるか、あるいは（２）上記海藻を、１０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコールまたはアルコール水溶液中で抽出して得られたアルコール抽出物由来のもの；である。
【００２８】
本発明に用いられ得る上記（１）「海藻を水で抽出して得られた水粗抽出物を含有する、５０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清由来のもの」は、上記海藻を、後述するような操作を通じて水中で一旦抽出して水粗抽出物を得た後、次いで、これにＣ１〜Ｃ３アルコールまたはＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液と合わせた、５０％（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコール液から、上清を分取して得ることができる。Ｃ１〜Ｃ３アルコールの例としては、メタノール、エタノール、およびプロパノールが挙げられる。
【００２９】
他方、本発明に用いられ得る上記（２）「海藻を、１０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコールまたはアルコール水溶液中で抽出して得られたアルコール抽出物由来のもの」は、上記海藻を、後述するような操作を通じてＣ１〜Ｃ３アルコールそのもの、あるいは所定濃度（好ましくは１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、より好ましくは１５（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％）に調整されたＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液中で抽出することにより得ることができる。Ｃ１〜Ｃ３アルコールの例としては、メタノール、エタノール、およびプロパノールが挙げられる。
【００３０】
この海藻由来の抽出物は、当該抽出物に含まれる固形分の重量を基準として、上記フェノール化合物を好ましくは１０重量％以上、より好ましくは１５重量％〜１００重量％、さらにより好ましくは３０重量％〜９９重量％、さらにより好ましくは６０重量％〜９９重量％の割合で含有する。ここで、本明細書中に用いられる用語「抽出物に含まれる固形分の重量」とは、上記抽出物から、当該抽出物に含まれる液体成分を取り除く（例えば、蒸発させる）ことにより、固体成分として残存し得る物質の重量を指して言う。当該抽出物がこのような範囲でフェノール化合物含量を満足することにより、ウレアーゼに対する阻害作用は著しく向上する。
【００３１】
本発明のウレアーゼ阻害剤において、当該阻害剤に用いられる上記フェノール化合物をより多く含有する海藻由来の抽出物は、特に限定されないが、例えば、以下の第一の方法または第二の方法を用いて製造することができる。
【００３２】
第一の方法について説明する。
【００３３】
第一の方法においては、まず、上記海藻を水中に所定時間浸漬することにより、水粗抽出物が製造される。
【００３４】
この浸漬における当該海藻と水との量比（抽出容量）は特に限定されないが、例えば、海藻１００ｇ（乾燥重量）に対して、好ましくは１リットル〜１０リットル、より好ましくは２リットル〜５リットルの水が使用される。
【００３５】
使用される水は、例えば、室温の（特に加熱も冷却もなされていない）水または熱水であり、特に熱水を用いる場合、その温度（抽出温度）は、好ましくは６０℃〜１００℃、より好ましくは８０℃〜１００℃、さらにより好ましくは９０℃〜１００である。なお、上記海藻を浸漬している間は、本発明に用いられる上記フェノール化合物がより抽出されやすくする目的で、熱水の温度を低下させることのないよう、当業者に公知の手段を用いて加熱することにより温度を維持することが好ましい。
【００３６】
水中に浸漬する時間（抽出時間）は、使用する抽出温度によって変化するため、必ずしも限定されないが、例えば、熱水をほぼ１００℃に維持する場合、好ましくは１分〜１２０分、より好ましくは１０分〜６０分である。抽出時間をこのような範囲内で行うことにより、本発明に用いられる上記フェノール化合物がより効率良く抽出され得るとともに、不要物の過度の抽出を防止することができる。
【００３７】
上記浸漬の後、例えば、室温まで放冷され、濾過または遠心分離により海藻が取り除かされる。こうして水粗抽出物を得ることができる。なお、得られた水粗抽出物は、その後、予め不純物を除去する目的で、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒と合わせ、有機層が取り除かれた水層由来のものであってもよい。さらに、得られた水粗抽出物は、後述の工程に対し、そのまま用いられてもよく、あるいは必要に応じ、当業者に公知の手段を用いて水分を蒸発させた乾固物またはペースト状物の形態で用いられてもよい。
【００３８】
次いで、当該水粗抽出物と上記Ｃ１〜Ｃ３アルコールまたはＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液とが合わされ、好ましくは５０（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは６０（ｖ／ｖ）％〜９８（ｖ／ｖ）％の当該アルコール濃度を有するＣ１〜Ｃ３アルコール液が調製される。ここで、調製され得るＣ１〜Ｃ３アルコール液の濃度は、好ましくはこのような範囲において、当業者によって任意の濃度に設定され得る。すなわち、使用する海藻の種類、使用部位、産地、採取時期、採取後の保存状態等によって、本発明において有用な、ウレアーゼを阻害するフェノール化合物の含量が変動することが考えられる。また、後述する一連の抽出操作においても、得られる成分含量に誤差が生じることもある。よって、当業者は、このような条件に応じて、当該調製され得るアルコール液の濃度を好ましくはこのような範囲内で任意に設定することができる。
【００３９】
より具体的には、当該水粗抽出物を、１個〜３個の炭素原子を有するアルコールまたは所定濃度に調製された１個〜３個の炭素数を有するアルコール水溶液（含水アルコール）と合わすことにより、上記のようなアルコール濃度を有するアルコール液が調製される。このような操作において使用可能な１個〜３個の炭素原子を有するアルコールの例としては、メタノール、エタノールおよびプロパノール、ならびにそれらの組合せが挙げられる。生体に対する安全性をさらに向上させることを考慮すれば、エタノールを用いることが好ましい。このようなアルコールまたは含水アルコールの使用量は、合わせる水粗抽出物の量によって変化するため特に限定されない。
【００４０】
その後、このＣ１〜Ｃ３アルコール液の上清が分取される。
【００４１】
上記アルコール濃度に設定されたアルコール液を調製することにより、当該アルコール液に不溶な物質が沈殿する場合がある。上清の分取はこの沈殿物を除去する目的で行われ、上清は当業者に周知の方法（例えば、濾過または遠心分離）によって取り出すことができる。
【００４２】
次に第二の方法について説明する。
【００４３】
当該第二の方法においては、上記海藻を１０（ｖ／ｖ）％以上のＣ１〜Ｃ３アルコールまたはアルコール水溶液中に所定時間浸漬することにより抽出が行われ、アルコール抽出物が製造される。
【００４４】
上記に使用されるＣ１〜Ｃ３アルコールまたはアルコール水溶液は、好ましくは１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、より好ましくは１５（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％に設定されたＣ１〜Ｃ３アルコール水溶液であることが好ましい。
【００４５】
この浸漬における当該海藻と熱水との量比（抽出容量）は特に限定されないが、例えば、海藻１００ｇ（乾燥重量）に対して、好ましくは０．５リットル〜５リットル、より好ましくは０．５リットル〜２リットル，さらにより好ましくは１リットルの上記Ｃ１〜Ｃ３アルコールまたはアルコール水溶液が使用される。
【００４６】
使用されるアルコールの温度（抽出温度）は特に限定されないが、好ましくは０℃〜５０℃、より好ましくは１℃〜３０℃であり、さらにより好ましくは１５℃〜２５℃である。
【００４７】
上記Ｃ１〜Ｃ３アルコールまたはアルコール水溶液に浸漬する時間（抽出時間）は、好ましくは２時間〜４８時間、より好ましくは４時間〜２４時間である。抽出時間をこのような範囲内で行うことにより、本発明に用いられる上記フェノール化合物がより効率良く抽出され得るとともに、不要物の過度の抽出を防止することができる。
【００４８】
上記浸漬の後、遠心分離または濾過により海藻が取り除かされる。こうしてアルコール抽出物を得ることができる。なお、得られたアルコール抽出物は、その後、予め不純物を除去する目的で、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒と合わせ、有機層が取り除かれた水層由来のものであってもよい。さらに、得られたアルコール抽出物は、後述の精製工程に対し、そのまま用いられてもよく、あるいは必要に応じ、当業者に公知の手段を用いてアルコール分あるいは水分を蒸発させた濃縮物の形態で用いられてもよい。
【００４９】
このようにして、上記第一の方法および第二の方法のいずれを用いても、本発明に用いられる上記フェノール化合物をより多く含有する海藻由来の抽出物を製造することができる。なお、得られた海藻由来の抽出物は、本発明におけるウレアーゼ阻害作用を高める目的で精製が行われてもよい。この精製は、例えば、上記で得られた上清を、当業者に周知の手段を用いて濃縮することにより濃縮物を得た後、好ましくは４０（ｖ／ｖ）％〜９０（ｖ／ｖ）％、より好ましくは５０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％のＣ１〜Ｃ３アルコール（好ましくはエタノール）水溶液を溶出液として用いるカラムに通すことによって行われる。このカラムクロマトグラフィーに有用な吸着剤は、好ましくは芳香族系吸着剤であり、より具体的な例としては、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤が挙げられる。スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤は、例えば、ダイヤイオンＨＰ２０という商品名で三菱化学（株）より市販されている。
【００５０】
上記クロマトグラフィーを行うことにより、よりウレアーゼ阻害作用が高められた（すなわち、本発明に用いられる上記フェノール化合物含有量が高められた）画分を抽出することができる。得られた画分は、本発明のウレアーゼ阻害剤としてそのまま使用することができる。
【００５１】
なお、上記で得られた海藻抽出物または画分から、さらに本発明に用いられるフェノール化合物を単離する場合は、例えば、以下のような第２のカラムクロマトグラフィー（例えば、Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａら、フィッシャーズ・サイエンス（Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９６年，第６２巻，ｐ．９２３−９２６を参照のこと）を用いることができる。
【００５２】
すなわち、上記で得られた海藻抽出物または画分は、例えば、シリカゲルを吸着剤として充填されたカラムに供される。使用する溶出液の例としては、クロロホルム／メタノール／蒸留水の組合せが挙げられる。さらに、得られた第二の画分は、例えば、シリカゲルを薄層板とし、かつ展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／蒸留水／酢酸を用いる、薄層クロマトグラフィーによって、上記フロログルシノール、エコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、８，８’−ビエコール、およびエクストロノールにそれぞれ単離することができる。
【００５３】
本発明のウレアーゼ阻害剤は、経口による投与または摂取を目的としたもの、あるいは皮膚外用剤を目的としたもののいずれの目的にも使用することができる。また、本発明のウレアーゼ阻害剤は、例えば、衛生用品（例えば、紙オムツ、生理用品、ウェットティッシュ）等における、消臭または防臭用の添加剤、および／またはかぶれまたは肌荒れ防止のための添加剤として使用することができる。本発明のウレアーゼ阻害剤は、このような衛生用品のみに限定されず、尿素からウレアーゼの作用によってアンモニアが発生する場所において、その発生またはその発生により生じる不快臭（アンモニア臭）の防止または低減、あるいは皮膚に接触して生じる皮膚障害の抑制または低減のために使用することができる。
【００５４】
本発明のウレアーゼ阻害剤はまた、有効成分である上記海藻由来の抽出物以外に、目的に応じて他の成分を含有していてもよい。本発明に含有され得る他の成分の例としては、水；アルコール；食肉加工品；米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、コンブ、ワカメ、テングサなどの一般食品材料およびそれらの粉末；デンプン、水飴、乳糖、グルコース、果糖、スクロース、マンニトールなどの糖類；香辛料、甘味料、食用油、ビタミン類などの一般的な食品添加物；界面活性剤；賦形剤；着色料；保存料；コーティング助剤；ラクトース；デキストリン；コーンスターチ；ソルビトール；結晶性セルロース；ポリビニルピロリドン；油分；保湿剤；増粘剤；防腐剤；香料；ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。本発明のウレアーゼ阻害剤はさらに、必要に応じて他の薬剤（漢方薬を包含する）を含有していてもよい。このような他の成分および／または他の薬剤の含有量は、特に限定されず、当業者によって適切な量が選択され得る。
【００５５】
さらに、本発明のウレアーゼ阻害剤は、必ずしもインビボまたはインビトロのいずれに限定されることなく、さらにウレアーゼに対する活性を阻害させたい任意の用途において広範に利用され得る。すなわち、本発明のウレアーゼ阻害剤は、特に限定されないが、例えば、健康食品などの食品組成物に添加される添加物の一種として使用されてもよく、家畜または養殖魚などの生産分野に利用される飼料組成物として、そのままあるいは他の飼料用材料と組み合わせて使用されてもよく、あるいは医薬品、医薬部外品などの医薬組成物として、そのままあるいは他の医薬組成物と組み合わせて使用されてもよく、さらに、オムツ、ウェットティッシュ、生理用品等の衛生用品を構成する基材（化成品基材）に添加される添加物の一種として使用されてもよい。
【００５６】
本発明のウレアーゼ阻害剤が食品組成物として使用される場合、その形態には固定食品に限定されず、飲料（例えば、液体飲料）のようなものを包含される。より具体的な例としては液状、ペースト状、固形状等の形態でなる、茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、乳飲料、菓子類、シロップ類、果実加工品、野菜加工品、漬物類、畜肉製品、魚肉製品、珍味類、缶・ビン詰類、即席飲食物、内服液、肝油ドロップ、口中清涼剤、ゼリーなどが挙げられるが特にこれらに限定されない。本発明のウレアーゼ阻害剤を含有するこのような食品組成物は、当業者に公知の手法を用いて製造され得る。
【００５７】
本発明のウレアーゼ阻害剤が外用剤として使用される場合、その形態は特に限定されず、液状、ゲル状、粉末状、等の形態で使用することができ、また、当該阻害剤をローション剤、スプレー剤、ムース剤等に配合することもできる。
【００５８】
本発明のウレアーゼ阻害剤が化成品基材に対して使用される場合、使用可能な基材は特に限定されないが、例えば、織物、編物、不織布などの布帛；紙；吸水性プラスチックが挙げられる。
【００５９】
なお、本発明のウレアーゼ阻害剤、あるいは上記フェノール化合物または上記フェノール化合物を含有する海藻由来の抽出物が食品組成物中に含有される場合、当該食品組成物は、各種機能を有する旨の表示を付した食品（例えば、特定保険用食品または特別用途食品）として使用することができる。このような表示に付される機能の例としては、表現方法自体は特に限定されないが、ウレアーゼの活性を阻害する；胃炎を予防する；胃の不快感を予防、解消または緩和する；胃の調子を整える；胃痛、胃の不快感など、胃の調子が気になる方に適した食品；肝性昏睡を予防または治療する；などが挙げられる。表示は、使用者にとって上記のような機能が実質的に理解され得る様式で表されておればよく、例えば、当該食品の外装または内装パッケージ、商品カタログ、ポスターなどに対して行われ得る。
【００６０】
本発明のウレアーゼ阻害剤が医薬組成物として使用される場合、その投与剤形は特に限定されず、日本薬局方に記載の方法にしたがって適切な剤形に加工される。投与剤形のより具体的な例としては、経口投与を目的とする医薬組成物の場合、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、細粒剤、徐放剤、液剤などの剤形が挙げられ、そして非経口投与を目的とする医薬組成物の場合、注射剤、輸液剤、点眼剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤などの剤形が挙げられる。用量は、対象となる者の体重等の条件によって容易に変動し得るため、当業者によって適宜選択され得る。
【００６１】
本発明のウレアーゼ阻害剤は、その使用形態に応じて当該分野で通常用いる方法によって製造され、その形態に応じた方法で適宜に適量摂取または適用することができる。なお、当該分野において、ウレアーゼにはナタマメ由来のウレアーゼ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ由来のウレアーゼ、および腸内細菌由来の各種ウレアーゼなどの各種類が存在することが知られている。また、これらのウレアーゼには、その由来によって基質であるウレアに対する親和性に若干の差異があることも知られているが、本発明のウレアーゼ阻害剤は、ウレアーゼの種類および／またはその由来に依存することなく、任意のウレアーゼが有する作用を効果的に阻害することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によって具体的に記述する。しかし、これらによって本発明は制限されるものではない。
【００６３】
＜実施例１：フェノール化合物を含有するクロメ抽出物の製造＞
クロメの乾燥粉末４００ｇを、１２００ｍＬのメタノール中に添加し、室温で２４時間かけて抽出を行った。次いで、遠心分離（３０００ｒｐｍ，２０分間）することにより、粗抽出物を分取し、ロータリーエバポレーターにて濃縮し、乾固させた。その後、得られた乾固物に、２４０ｍＬのメタノール、４８０ｍＬのクロロホルムおよび１８０ｍＬの蒸留水を添加し、分液して上層を取り出した。さらに、この取り出した上層に、３００ｍＬの酢酸エチルを加え、分液して酢酸エチル層を取り出した。この酢酸エチルによる分液を２回繰り返した。合わせた酢酸エチル層をロータリーエバポレーターで濃縮し、乾固させることにより、フェノール化合物を含有するクロメ抽出物（ｋ１）を得た（収率：使用した乾燥粉末の重量を基準として３．２％）。
【００６４】
＜実施例２：クロメ抽出物からのフェノール化合物（フロロタンニン）の単離＞
実施例１で得られたクロメ抽出物（ｋ１）１０ｇを、Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａら、フィッシャーズ・サイエンス（Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９９６年，第６２巻，ｐ．９２３−９２６に記載の方法に準じ、Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００（和光純薬工業（株）製）を含有するカラム（１０ｍｍφ×３００ｍｍ）に添加し、溶出液としてクロロホルム／メタノール／蒸留水（容量比５０：３０：７）を用いて溶出した。
【００６５】
上記カラムクロマトグラフィーにより、本発明に用いられるフェノール化合物の一成分である、３量体のエコールを分離することができた。その他のフェノール化合物については、上記カラムクロマトグラフィーで得られた画分を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、対応するスポットを掻きとって、それぞれメタノールで溶出かつ精製することにより、５量体のフロロフコフロエコールＡ、６量体のジエコールおよび６量体の８，８’−ビエコールにそれぞれ分離した。なお、このＴＬＣに使用した条件は以下の通りである：薄層板としてシリカゲル６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ社製）を使用し、展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／蒸留水／酢酸（容量比５０：２５：４：３）を使用し、ＵＶ２５４ｎｍにて検出した。
【００６６】
得られたエコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、および８，８’−ビエコールの収率は、使用した上記クロメ抽出物（ｋ１）の重量を基準として、それぞれ６％、７％、１０％および２％であった。
【００６７】
＜実施例３：ウレアーゼ阻害活性の評価＞
上記で得られた各種フェノール化合物を５０％エタノールで溶解し、蒸留水を用いて２倍段階で順次希釈し、当該各種フェノール化合物の希釈サンプル溶液を得た。
【００６８】
上記サンプル溶液の１０μｌを、マイクロプレートに入れ、そして当該マイクロプレートに、４７．５Ｕ／ｍｌのナタマメ由来のウレアーゼ（和光純薬工業（株）製）を１０μｌ添加し、３７℃で１０分間プレインキュベートした。次いで、このマイクロプレートに、尿素含有反応溶液（尿素１０７ｍｇを１０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した溶液、サリチル酸ナトリウム２ｇおよび０．１ｇのニトロプルシドナトリウムを５０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した溶液の混合溶液でその容量比が１：７のもの）８０μｌを添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートに、アンモニア反応試薬（５０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５０μｌの次亜塩素酸と０．７５ｇの水酸化ナトリウムとを溶解してなる溶液）８０μｌを添加し、２５℃で１０分間インキュベートした後、得られた評価サンプル溶液の５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６９】
一方、コントロールとして、上記各種フェノール化合物を添加しなかったこと以外は、上記評価方法と同様にして、コントロール評価を行った。さらに、ブランクとして、ウレアーゼ溶液の代わりに、１０μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いたこと以外は、上記評価方法と同様にして、ブランク評価を行った。
【００７０】
上記で得られた評価サンプル溶液、コントロール評価溶液、およびブランク評価溶液の吸光度に対し、以下の式：
【００７１】
【数１】


【００７２】
を用いて、上記実施例２で得られたエコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、および８，８’−ビエコール、ならびにフロログルシノール（和光純薬工業（株）製）のフェノール化合物のウレアーゼ阻害率（％）を算出し、当該各種フェノール化合物の使用濃度と阻害率との関係から、使用したウレアーゼを５０％阻害する当該各種フェノール化合物の濃度（ＩＣ５０）を求めた。得られた結果を表１に示す。なお、クロメ抽出物（ｋ１）のＩＣ５０値は６．４μｇ／ｍＬであった。
【００７３】
さらに、上記で得られたクロメ抽出物（ｋ１）の１０ｍｇを正確に量りとり、当該クロメ抽出物の総フロロタンニン量を、フロログルシノールを標準物質として用いるＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法（日本食品科学工学会誌，２００２年，第４９巻，ｐｐ．５０７−５１１）により測定した。上記クロメ抽出物の総フロロタンニン量は、１１５．２％であった。
【００７４】
【表１】


【００７５】
表１に示されるように、本発明に用いられるフェノール化合物に包含されるエコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、８，８’−ビエコール、およびフロログルシノールはいずれも、マイクログラムオーダーでの優れたウレアーゼ阻害活性を有していることがわかる。さらに、実施例１で得られたクロメ抽出物中に含まれるエコール、フロロフコフロエコールＡ、ジエコール、および８，８’−ビエコールは、市販のフロログルシノールよりも、特に優れたウレアーゼ阻害活性を有しており、これらフロロタンニン（フェノール化合物）を含むクロメ抽出物も優れたウレアーゼ阻害剤として有用であることがわかる。
【００７６】
＜実施例４：食品組成物の調製＞
上記実施例１で得られたクロメ抽出物を用いて、以下の組成を有する食品組成物を調製した。
【００７７】
成分 重量（ｇ）
実施例１で得られたクロメ抽出物 ０．６
大豆サポニン ２．０
黒酢エキス ２．０
リンゴファイバー ２．０
レシチン １．０
フラクトオリゴ糖 ２．０
果糖 １．０
粉末酢 ０．１
シクロデキストリン １．０
蜂蜜 １．０
骨粉 １．０
デキストリン ４．９。
【００７８】
各成分を流動造粒機中で混合した後、水を噴霧して造粒を行い、入風温度８０℃で乾燥して、顆粒状食品を得た。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明のウレアーゼ阻害剤は、食品として広く用いられ得る海藻に含まれるフェノール化合物を有効成分として含有するため、安全性が高く、日常的な使用が可能であり、食品分野、医薬分野あるいは化成品分野などの種々の分野における汎用性を高めることができる。本発明のウレアーゼ阻害剤はまた、胃炎、肝硬変に基づく肝性昏睡、オムツ臭い・オムツかぶれのような、ウレアーゼが触媒して尿素をアンモニアに分解することより生じ得る各種疾患等の予防または治療あるいはアンモニア臭の消臭による不快感の排除等の目的に利用することができる。
【出願人】 【識別番号】０００２１４２７２
【氏名又は名称】長瀬産業株式会社
【住所又は居所】大阪府大阪市西区新町１丁目１番１７号
【出願日】 平成１７年３月２日（２００５．３．２）
【代理人】
【公開番号】 特開２００６−２４１０３９（Ｐ２００６−２４１０３９Ａ）
【公開日】 平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願番号】 特願２００５−５６９８０（Ｐ２００５−５６９８０）