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【発明の名称】 血糖値上昇抑制等組成物、血糖値上昇抑制等食品、および血糖値上昇抑制等組成物の製造方法
【発明者】 【氏名】奥 恒行

【氏名】上田 成一
【要約】 【課題】アルギン酸分解物を含有した血糖値上昇抑制等組成物を提供することを課題とする。

【解決手段】本発明にかかる血糖値上昇抑制等組成物は、ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を含有したことを特徴としている。より具体的には、前記アルギン酸分解物が、エタノール７５％で沈殿しない比較的小分子のアルギン酸分解物であることを特徴としている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を含有したことを特徴とする血糖値上昇抑制等組成物。
【請求項２】
前記アルギン酸分解物が、エタノール７５％で沈殿しない比較的小分子のアルギン酸分解物である請求項１に記載の血糖値上昇抑制等組成物。
【請求項３】
ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を含有したことを特徴とする血糖値上昇抑制等食品。
【請求項４】
前記アルギン酸分解物が、エタノール７５％で沈殿しない比較的小分子のアルギン酸分解物である請求項３に記載の血糖値上昇抑制等食品。
【請求項５】
ケーキ、クッキー、チョコレート、ガム、カステラ、パン、アイスクリーム、プディング、ゼリー、ババロア、クリーム、キャラメル、ジャム、餡、飴、羊羹、最中、および菓子のいずれかである請求項３または４に記載の血糖値上昇抑制等食品。
【請求項６】
清涼飲料、炭酸飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、およびジュースのいずれかである請求項３または４に記載の血糖値上昇抑制等食品。
【請求項７】
ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）をアルギン酸存在下で培養してアルギン酸分解物を生成させる生成工程と、前記生成工程で得られた前記アルギン酸分解物をエタノール７５％で沈殿させる沈殿工程と、前記沈殿工程において沈殿しない上清を濃縮して比較的小分子のアルギン酸分解物を得る取得工程とを備えたことを特徴とする血糖値上昇抑制等組成物の製造方法。
【請求項８】
ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を含有したことを特徴とする二糖類水解酵素活性阻害組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖値上昇抑制等組成物、血糖値上昇抑制等食品、および血糖値上昇抑制等組成物の製造方法に関し、詳しくは、海洋微生物ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を含有した血糖値上昇抑制等組成物、血糖値上昇抑制等食品、およびこの海洋微生物ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）を用いて得られる血糖値上昇抑制等組成物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、我国の糖尿病患者は増加傾向にあり、１９９７年の厚生労働省の実態調査によれば、その数は６９０万人であって、潜在的糖尿病患者（糖尿病予備軍）を加えた総数は１６００万人に達すると見込まれている。
【０００３】
このような糖尿病患者および糖尿病予備軍（以下「糖尿病患者等」ともいう。）の増加に対しては、その発症予防、特に一次予防の重要性が指摘され、このような糖尿病患者等は、日本人の食生活を含めた生活行動が変わらなければ、今後さらに増加すると予測されている。すなわち、糖尿病の発症は、生活習慣とりわけ食習慣に起因することから、日常の食生活において糖尿病の発症を予防することが重要である。そのためには、糖尿病予防効果を有する食品の開発が望まれる。
【０００４】
糖尿病の発症には、血糖値の上昇や耐糖能低下などが共通に認められることから、このような現象を抑制あるいは防止することが不可欠である。しかしながら、食品成分（組成物）の中にこれらを効果的に改善する作用を備えたものは多くない。
【０００５】
また、糖尿病患者に対しては、一般に抗糖尿病剤に分類される医薬品が治療に用いられている。
例えば、消化管粘膜に存在する二糖類分解酵素（α−グルコシダーゼ）の作用を阻害し、ブドウ糖の生成を抑制することにより血糖値の上昇を抑制するα−グルコシダーゼ阻害剤が、糖尿病患者の治療に使用されている。また、近年では、インスリン抵抗性改善薬も用いられている。しかしながら、これらの抗糖尿病剤には、作用効果、副作用、安全性等の観点から種々の問題がある。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１７９５８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、従来から、糖尿病予防効果を有する食品の開発が望まれてはいたが、食品成分中に血糖値の上昇や耐糖能低下などを抑制あるいは防止する作用を備えたものは多くないという問題があった。また、合成系の抗糖尿病剤についても、作用効果、副作用、安全性等の観点から種々の問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたものであって、アルギン酸分解物を含有した血糖値上昇抑制等組成物（二糖類水解酵素への阻害効果により、血糖値の上昇を抑制し、インスリン分泌刺激を低減させ得る組成物）を提供することを課題とする。また、本発明は、アルギン酸分解物を含有した血糖値上昇抑制等食品を提供することを課題とする。さらに、本発明は、血糖値上昇抑制等組成物の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、二糖類水解酵素活性阻害組成物（二糖類水解酵素活性を阻害する組成物）を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にかかる血糖値上昇抑制等組成物は、上記課題を解決するためになされたものであって、ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を含有したことを特徴としている。
【００１０】
また、本発明にかかる血糖値上昇抑制等組成物においては、前記アルギン酸分解物が、エタノール７５％で沈殿しない比較的小分子のアルギン酸分解物であることが好ましい。
【００１１】
本発明にかかる血糖値上昇抑制等食品は、上記課題を解決するためになされたものであって、ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を含有したことを特徴としている。
【００１２】
また、本発明にかかる血糖値上昇抑制等食品においては、前記アルギン酸分解物が、エタノール７５％で沈殿しない比較的小分子のアルギン酸分解物であることが好ましい。
【００１３】
さらに、本発明にかかる血糖値上昇抑制等食品は、例えば、ケーキ、クッキー、チョコレート、ガム、カステラ、パン、アイスクリーム、プディング、ゼリー、ババロア、クリーム、キャラメル、ジャム、餡、飴、羊羹、最中、および菓子のいずれかであることが好ましい。また、本発明にかかる血糖値上昇抑制等食品は、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、およびジュースのいずれかであることが好ましい。
【００１４】
本発明にかかる血糖値上昇抑制等組成物の製造方法は、上記課題を解決するためになされたものであって、ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）をアルギン酸存在下で培養してアルギン酸分解物を生成させる生成工程と、前記生成工程で得られた前記アルギン酸分解物をエタノール７５％で沈殿させる沈殿工程と、前記沈殿工程において沈殿しない上清を濃縮して比較的小分子のアルギン酸分解物を得る取得工程とを備えたことを特徴としている。
【００１５】
本発明にかかる二糖類水解酵素活性阻害組成物は、ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を含有したことを特徴としている。また、本発明にかかる二糖類水解酵素活性阻害組成物においては、前記アルギン酸分解物が、エタノール７５％で沈殿しない比較的小分子のアルギン酸分解物であることが好ましい。
この二糖類水解酵素活性阻害組成物は、二糖類水解酵素の阻害効果を有するため、糖尿病、肥満、高脂血症、心臓病といった生活習慣病の予防あるいは治療に寄与する、薬剤や加工食品等を構成することができる。すなわち、この二糖類水解酵素活性阻害組成物は、血糖値上昇抑制等組成物、肥満抑制組成物等になり得る。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、血糖値の上昇や耐糖能低下などを抑制あるいは防止する組成物（血糖値上昇抑制等組成物、二糖類水解酵素活性阻害組成物）を、ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を用いて得ることができる。
また、本発明によれば、ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を用いて構成された血糖値上昇抑制等食品あるいは抗糖尿病剤を得ることができる。したがって、食習慣に起因する糖尿病の発症を効果的に抑制すると共に、副作用等の心配が少ない抗糖尿病剤を得ることができる。
さらに、本発明によれば、比較的容易な方法によって、血糖値の上昇や耐糖能低下などを抑制あるいは防止する組成物（血糖値上昇抑制等組成物）を構成することが可能な血糖値上昇抑制等組成物の製造方法を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１８】
本実施形態においては、長崎周辺海域から分離したアルギン酸分解微生物ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物を用いて、血糖値上昇抑制等組成物、および血糖値上昇抑制等食品、ならびに二糖類水解酵素活性阻害組成物を構成する。
【００１９】
まず、本実施形態においては、アルギン酸分解酵素を産生する微生物の探索を行った。その探索方法および微生物の分離方法等の具体的な方法は、ここでは省略するが、本実施形態においては、長崎県海環境から分離した微生物のうち、アルギン酸分解能が高い微生物ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）を用いることとした。
【００２０】
長崎周辺海域から分離したアルギン酸分解微生物であるＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）は、アルギン酸を添加した特定の培地で好気的条件下にて振とう培養すると、高分子アルギン酸を分解する。そこで、本実施形態においては、微生物ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）をアルギン酸存在下（アルギン酸−Ｎａ０．５％存在下）で大量培養して、アルギン酸分解物の分画・調製に用いた。
【００２１】
次いで、このアルギン酸分解物をエタノール７５％濃度において分画し、高分子アルギン酸分解物を除去して、小分子アルギン酸分解物を調製した。つまり、アルギン酸分解物をエタノール７５％で沈殿させ、この上清に含まれる分子量数万以下の小分子物質を濃縮して、小分子アルギン酸分解物（本発明の「比較的小分子のアルギン酸分解物」に相当）を調製した。
【００２２】
上記のようにして得られた上清濃縮物である小分子アルギン酸分解物を、ゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析したところ、分子量１００００以下のものが含まれることが確認された。また、Sephadex G-25カラムで分析した結果、分子量は約１０００程度であった。
【００２３】
本実施形態においては、以上のようにして得られた小分子アルギン酸分解物を用いて、血糖値上昇抑制等組成物、二糖類水解酵素活性阻害組成物を構成している。ここで「血糖値上昇抑制等組成物」および「二糖類水解酵素活性阻害組成物」とは、小分子アルギン酸分解物を含有した組成物は勿論のこと、小分子アルギン酸分解物そのものをも含む概念である。
【００２４】
本発明者らは、この血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）の効果を確認するために、ラット小腸粘膜微絨毛膜の二糖類水解酵素に対する阻害効果を観察した。その結果、本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物は、スクラーゼに対して顕著な阻害効果を示し、さらにマルターゼ、イソマルターゼ、ラクターゼ、トレハラーゼに対しても、一定の阻害効果を示した。本発明者らは、これらの阻害は拮抗的に行われることも明らかにした。
【００２５】
以下、実験方法等を具体的に説明する。
【００２６】
＜ラット小腸粘膜微絨毛膜の調製＞
本発明者らは、二糖類水解酵素に対する血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）の阻害効果を確認するために、ラット小腸粘膜微絨毛膜を調整した。ラット小腸粘膜からの微絨毛膜の調整は、Kesslerらの方法（Kessler M, Acuto O, Etrelli C, Murer H, Smenza G (1978) A mondified procedure for the rapid preparation of efficiently transporting vesicles from small intestinal brush membranes. Biochim Biophys Acta 506:136-154）に準じて行った。
【００２７】
はじめに、１４日間飼育した成体雄ラット３０匹（体重約３００ｇ）を断頭・放血後、直ちに腹部を切開して全小腸を取り出し、氷冷した生理食塩水に浸した。
【００２８】
次いで、シリンジ（２０ｍＬ）を用い、小腸管内を２〜３回生理食塩水で洗浄し、小腸管を縦に切り開き、ペーパータオルで水分を除去後、氷冷ガラスプレート上でスライドグラスを用いて粘膜を剥離した。この粘膜の重量を測定した後、５０ｍＭマンニトール入り２ｍＭ Tris-Cl緩衝液（ｐＨ７．１）を３０倍容量加え、前日から冷却しておいたミキサー容器に入れ、２０〜３０秒間のインターバルで約９０秒間ミキシング処理を行って均質化させた。このホモジネートに１０ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、氷冷下で２０分間放置した。
【００２９】
次いで、この懸濁液を３０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、得られた上清をさらに２７０００×ｇ、４℃で３０分間遠心した。その後、沈殿物の小腸粘膜微絨毛膜画分を洗浄するために、１００ｍＭマンニトール入り１０ｍＭ Tris-Cl緩衝液（ｐＨ７．１）で懸濁し、２７０００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、この操作を再度繰り返した。次いで、得られた沈殿物を適当量の生理食塩水で懸濁して、２７０００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、二糖類水解酵素に対して阻害効果を有するTrisをNaClで置換した。
【００３０】
そして、精製した微絨毛膜画分を再び適当量の生理食塩水で懸濁し、実験に使用するまで−８０℃で凍結保存した。
【００３１】
＜二糖類水解酵素に対するアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害実験＞
二糖類水解酵素であるスクラーゼ、マルターゼ、イソマルターゼ、トレハラーゼおよびラクターゼは、グルコースオキシダーゼを用いるDahlqvistの方法（Dahlqvist A. (1964) Method for assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochem 7:8-25）を一部改変した奥らの方法（Oku T, Konishi F, Hosoya N (1982) Mechanism of inhibitory effect of unavailable carbohydrate on intestinal calcium absorption. J Nutr 112:410-415）で測定した。
【００３２】
それぞれの基質として、スクロース、マルトース、パラチノース、トレハロースおよびラクトースを、０．１Ｍマレイン酸−NaOH緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて１１２ｍＭに調整した。酵素標本としては、適当に希釈したラット小腸粘膜微絨毛膜懸濁液を用いた。イソマルトースは、構造が不安定で分解しやすいので、同じ１，６結合でありイソマルターゼによって水解され、構造が安定なパラチノースをイソマルターゼ活性の測定に使用した。
【００３３】
小試験管（１０ｍＬ）に適当に希釈したラット小腸粘膜微絨毛膜懸濁液０．１ｍＬを分注し、これに適当に希釈したアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）溶液を１０μＬ加えて混合した。３７℃で約１分間プレインキュベートした後、基質液０．１ｍＬを加えて、適当な時間反応させた。反応後、ＴＧＯ試薬（それぞれの最終濃度が、グルコースオキシダーゼ１０Ｕ／ｍＬ、ペルオキシダーゼ５Ｕ／ｍＬ、４−アミノアンチピリン０．０５ｍＭ／ｍＬ、ｐ−フェノールスルホン酸ナトリウム０．４ｍＭ／ｍＬとなるように０．５Ｍ Tris-Cl緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したもの）を２．４ｍＬ加えて、さらに１０分間反応させた。その後、４Ｎ水酸化ナトリウム液を２〜３滴加えて反応を停止させ、ＵＶ−１２４０分光光度計（島津製作所製）を用いて波長５００ｎｍにおける吸光度を測定した。また、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）による阻害効果を確認するためのコントロールとして精製水１０μＬを加えた。グルコース標準溶液としてグルコースを水で調整したものを使用した。
【００３４】
各酵素比活性は、タンパク質１ｍｇあたり１時間に加水分解された基質量をμｍｏｌｅ数（μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）で表した。
【００３５】
＜二糖類水解酵素に対するアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序について＞
いずれの基質も、０．１Ｍマレイン酸−NaOH緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、０〜３００ｍＭの範囲に調整した。酵素標本としては適当に希釈したラット小腸粘膜微絨毛膜懸濁液を用いた。
【００３６】
小試験管（１０ｍＬ）に適当に希釈したラット小腸粘膜微絨毛膜懸濁液０．１ｍＬを分注し、適当に希釈したアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）を１０μＬ加えて、混合した。３７℃で約１分間プレインキュベートした後、濃度を変化させた基質液を０．１ｍＬ加え、二糖類水解酵素活性阻害の測定と同様に操作した。
【００３７】
＜阻害効果とその阻害機序＞
以下に、上述した実験結果に基づいて、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の二糖類水解酵素活性への阻害効果と、その阻害機序について、具体的に説明する。
【００３８】
ラット小腸粘膜微絨毛膜を用いて行った、スクラーゼ、マルターゼ、イソマルターゼ、トレハラーゼ並びにラクターゼ活性に対するアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害実験の結果を、図１〜図５に示した。加えて、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序を確認するために、基質濃度を変えて反応速度を測定した結果をLineweaver-Burkプロットで表したものを、図６〜図１０に示した。
【００３９】
＜スクラーゼ活性に対する阻害効果＞
スクロースは、グルコースとフルクトースがα−１，２結合した二糖類であり、ショ糖とも呼ばれ、砂糖として身近な存在である。スクラーゼは、スクロースのα−１，２結合を加水分解する酵素である。このスクラーゼは、空腸上部で活性が最も高い。
【００４０】
ここで、図１は、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）を添加しないとき（阻害剤無添加時）の二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（スクラーゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。この図１から明らかなように、阻害剤無添加時（図１の棒グラフＬ１０参照）におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のスクラーゼ比活性は８５μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hrであった。
【００４１】
アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の２倍希釈液を添加した場合（図１のグラフＬ１１参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ１０）と比較して、活性は約８２％（６９μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下した。また、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の１．３倍希釈液を添加した場合（図１のグラフＬ１２参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ１０）と比較して、活性は約５３％（４５μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下した。さらに、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液を添加した場合（図１のグラフＬ１３参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ１０）と比較して、活性は約４４％（３７μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下し、半分以上が阻害された。
【００４２】
図６は、スクラーゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。この図６に示すように、阻害剤無添加時（図６のグラフＬ６０参照）の回帰直線と、阻害剤添加時（図６のグラフＬ６１（アルギン酸分解物原液の２倍希釈液添加時）、グラフＬ６２（アルギン酸分解物原液の１．３倍希釈液添加時）参照）の回帰直線は、１／Ｖ軸上で収束した。このことは、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序が、スクラーゼに対して拮抗阻害であることを示している。
【００４３】
＜マルターゼ活性に対する阻害効果＞
マルトースは麦芽糖であり、グルコース２分子がα１，４結合している。マルターゼ活性は、スクラーゼ、イソマルターゼ並びにグルコアミラーゼによるマルトース水解能の総和である。
【００４４】
ここで、図２は、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）を添加しないとき（阻害剤無添加時）の二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（マルターゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。この図２から明らかなように、阻害剤無添加時（図２の棒グラフＬ２０参照）におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のマルターゼ比活性は４３２μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hrであった。
【００４５】
アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の２倍希釈液を添加した場合（図２のグラフＬ２１参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ２０）と比較して、活性は約８１％（３５１μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下した。また、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の１．３倍希釈液を添加した場合（図２のグラフＬ２２参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ２０）と比較して、活性は約７０％（３０２μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下した。さらに、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液を添加した場合（図２のグラフＬ２３参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ２０）と比較して、活性は約６４％（２８５μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下し、三分の一程度の低下を示した。マルターゼに対するアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害効果はスクラーゼに対する効果よりも弱く、原液を用いた場合であっても阻害効果は３０％程度であった。
【００４６】
図７は、マルターゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。この図７に示すように、阻害剤無添加時（図７のグラフＬ７０参照）の回帰直線と、阻害剤添加時（図７のグラフＬ７１（アルギン酸分解物原液の２倍希釈液添加時）、グラフＬ７３（アルギン酸分解物原添加時）参照）の回帰直線は、１／Ｖ軸上で収束した。このことは、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序が、スクラーゼと同様に、マルターゼに対して拮抗阻害であることを示している。
【００４７】
＜イソマルターゼ（パラチナーゼ）活性に対する阻害効果＞
イソマルトースは、グルコース２分子がα−１，６結合した二糖類で、イソマルターゼは、α−１，６グルコシド結合を効率よく切る酵素である。イソマルターゼは、空腸の広い領域で略一定に分布している。
【００４８】
ここで、図３は、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）を添加しないとき（阻害剤無添加時）の二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（イソマルターゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。この図３から明らかなように、阻害剤無添加時（図３の棒グラフＬ３０参照）におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のイソマルターゼ比活性は１３μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hrであった。
【００４９】
アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の２倍希釈液を添加した場合（図３のグラフＬ３１参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ３０）と比較して、活性は約８０％（１１μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）（五分の一程度）に低下した。また、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の１．３倍希釈液を添加した場合（図３のグラフＬ３２参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ３０）と比較して、活性は約６９％（９μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）（三分の一程度）に低下した。さらに、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液を添加した場合（図３のグラフＬ３３参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ３０）と比較して、活性は約５５％（７μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下し、約５０％の低下（阻害）を示した。
【００５０】
図８は、イソマルターゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。この図８に示すように、阻害剤無添加時（図８のグラフＬ８０参照）の回帰直線と、阻害剤添加時（図８のグラフＬ８１（アルギン酸分解物原液の２倍希釈液添加時）、グラフＬ８３（アルギン酸分解物原液添加時）参照）の回帰直線は、１／Ｖ軸上で収束した。このことは、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序が、イソマルターゼに対して拮抗阻害であることを示している。
【００５１】
＜トレハラーゼ活性に対する阻害効果＞
トレハロースは、グルコース２分子がα−１，１結合したもので、きのこ類に比較的多く含まれている。トレハラーゼは、トレハロースのα−１，１結合に対し特異的に働く酵素である。
【００５２】
ここで、図４は、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）を添加しないとき（阻害剤無添加時）の二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（トレハラーゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。この図４から明らかなように、阻害剤無添加時（図４の棒グラフＬ４０参照）におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のトレハラーゼ比活性は７７μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hrであった。
【００５３】
アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の２倍希釈液を添加した場合（図４のグラフＬ４１参照）には、図４のグラフＬ４１に示すように、全く阻害を受けず、トレハラーゼ比活性は７７μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hrであった。また、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の１．３倍希釈液を添加した場合（図４のグラフＬ４２参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ４０）と比較して、活性は約９２％（７１μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下した。さらに、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液を添加した場合（図４のグラフＬ４３参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ４０）と比較して、活性は約７８％（６０μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下した。このことから、阻害物質の濃度を高めることによって、トレハラーゼは阻害を受けることが明らかとなった。
【００５４】
図９は、トレハラーゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。この図９に示すように、阻害剤無添加時（図９のグラフＬ９０参照）の回帰直線と、阻害剤添加時（図９のグラフＬ９２（アルギン酸分解物原液の１．３倍希釈液添加時）、グラフＬ９３（アルギン酸分解物原液添加時）参照）の回帰直線は、１／Ｖ軸上で収束した。このことは、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序が、トレハラーゼに対して拮抗阻害であることを示している。
【００５５】
＜ラクターゼ活性に対する阻害効果＞
ラクトースは、牛乳などの乳類に含まれ、ガラクトースとグルコースとから構成される。ラクターゼは、ラクトースのβ−１，４結合を切る酵素である。
【００５６】
ここで、図５は、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）を添加しないとき（阻害剤無添加時）の二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（ラクターゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。この図５から明らかなように、阻害剤無添加時（図５の棒グラフＬ５０参照）におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のラクターゼ比活性は１３μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hrであった。
【００５７】
アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の２倍希釈液を添加した場合（図５のグラフＬ５１参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ５０）と比較して、活性は約７５％（１０μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下した。また、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液の１．３倍希釈液を添加した場合（図５のグラフＬ５２参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ５０）と比較して、活性は約５８％（７２μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下した。さらに、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）原液を添加した場合（図５のグラフＬ５３参照）には、阻害剤無添加時（グラフＬ５０）と比較して、活性は約４１％（５μmoles of substrate hydrolyzed/mg protein/hr）に低下し、約６割の阻害を受けた。
【００５８】
図１０は、ラクターゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。この図１０に示すように、阻害剤無添加時（図１０のグラフＬ１００参照）の回帰直線と、阻害剤添加時（図１０のグラフＬ１０１（アルギン酸分解物原液の２倍希釈液添加時）、グラフＬ１０３（アルギン酸分解物原液添加時）参照）の回帰直線は、１／Ｖ軸上で収束した。このことは、アルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序が、ラクターゼに対して拮抗阻害であることを示している。
【００５９】
＜まとめ＞
ラット小腸粘膜微絨毛膜を用いた二糖類水解酵素に対する阻害効果実験において、本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物が、スクラーゼおよびマルターゼ等に対して、強い阻害効果を有することが確認された。具体的には、上述したように、血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）原液を添加した場合における二糖類水解酵素活性に対する阻害率は、スクラーゼ約５６％、マルターゼ約３４％、イソマルターゼ約４５％、トレハラーゼ約２２％、ラクターゼ約５９％であった。また、血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）のラット小腸粘膜微絨毛膜の二糖類水解酵素に対する阻害は拮抗阻害であった。
【００６０】
本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）によれば、上述したように、スクラーゼ、マルターゼ、イソマルターゼ、トレハラーゼ、ラクターゼに対して、拮抗阻害を示した。このことから、本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物は、ラット小腸粘膜微絨毛膜の二糖類水解酵素に対しては拮抗阻害作用を有することが明らかである。また、小分子アルギン酸分解物の濃度に依存して阻害効果が高まることから、小分子アルギン酸分解物の濃度が高まるように調製すれば、さらに強い阻害効果を有する血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）を得ることができる。
【００６１】
ところで、生活習慣病の一つである糖尿病は、インスリンの絶対的あるいは相対的不足によって生じる代謝疾患である。インスリンは主に、肝臓や筋肉におけるグリコーゲン合成の促進、糖利用の促進、脂肪組織での糖質からの脂肪合成を促進する作用がある。その結果、血中のブドウ糖濃度の低下を引き起こす。
【００６２】
上記実験に用いた二糖類は、分子内にグルコースを有するので、各二糖類水解酵素の作用により、これらの二糖類からグルコースが産出される。糖尿病の状態は、小腸で分解されたグルコースが細胞内に取り込まれ、このグルコースが血中に多量に存在する状態である。インスリンは、血糖上昇によって分泌が促進されるので、II型糖尿病ではインスリンが不足状態となる。
【００６３】
そこで、上記のような糖尿病の予防・治療を行うための手段として、本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）の利用が好適となる。
【００６４】
本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）の二糖類水解酵素への阻害効果を利用すれば、小腸における二糖類の分解を抑制し、遊離するグルコース量の減少により血中グルコース濃度の上昇が緩和され、インスリンの分泌も緩やかにすることができる。つまり、本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物をスクロースやマルトース等と一緒に摂取すれば、血糖上昇が抑制され、インスリン分泌刺激を低減させることができる。これは、この血糖値上昇抑制等組成物が、糖尿病の予防・治療を目的とした、薬剤や加工食品等に利用可能であることを示している。
【００６５】
また、血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）の二糖類水解酵素への阻害効果により、インスリン分泌が抑制され、脂肪合成を抑える効果も期待できる。したがって、本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物を用いれば、肥満に対する予防・治療を目的とした、薬剤や加工食品等を構成することも可能である。
【００６６】
さらに、脂肪合成が抑制されることにより、肥満が予防されることによって、高脂血症や心臓病のリスクも低減する。したがって、本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物を用いれば、高脂血症や心臓病に対する予防・治療を目的とした、薬剤や加工食品等を構成することも可能である。
【００６７】
以上のように、本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）（二糖類水解酵素活性阻害組成物）によれば、二糖類水解酵素の阻害効果を有することにより、糖尿病、肥満、高脂血症、心臓病といった生活習慣病の予防あるいは治療に寄与する、薬剤や加工食品等を構成することができる。
【００６８】
本実施形態にかかる血糖値上昇抑制等組成物は、上記の通り、二糖類水解酵素の阻害効果を有することによって、糖尿病、肥満、高脂血症、心臓病といった生活習慣病の予防あるいは治療に寄与する。したがって、薬剤として利用可能なのは、勿論のこと、ショ糖を甘味料として添加する食品（クッキーや菓子類等）等の作成段階で、小分子アルギン酸分解物を適当量（ショ糖使用量によって添加すべき量は変化する）添加することによって、糖尿病等を予防可能な食品（血糖値上昇抑制等食品）を構成することができる。効率よく効果（血糖値上昇抑制等の効果）を引き出すためには、小分子アルギン酸分解物の濃度やショ糖等との比率がポイントとなる。
【００６９】
このようにして構成された血糖値上昇抑制等食品としては、例えば、ケーキ、クッキー、チョコレート、ガム、カステラ、パン、アイスクリーム、プディング、ゼリー、ババロア、クリーム、キャラメル、ジャム、餡、飴、羊羹、最中、および菓子等のいずれかがあげられる。また、飲料物たる血糖値上昇抑制等食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、およびジュース等のいずれかがあげられる。
【００７０】
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、必要に応じて種々の変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７１】
例えば、上記実施形態においては、アルギン酸分解物をエタノール７５％濃度において分画し、高分子アルギン酸分解物を除去して、小分子アルギン酸分解物を調製した場合について説明したが、本発明はこの構成に限定されない。すなわち、ＳＵＮ５３菌（受託番号：NＩＴＥ Ｐ−１４）によるアルギン酸分解物には血糖値上昇抑制等物質が含有されているが、この物質の取り出し方法は上述の方法に限定されず、例えば、アルギン酸分解物をゲルろ過法や限外ろ過装置等によって処理し、小分子アルギン酸分解物を調整することも可能である。
【００７２】
また、上記実施形態においては、アルギン酸の複合分解物の場合について説明したが、本発明はこの構成に限定されず、精製された単離物質でもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明にかかる血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）（二糖類水解酵素活性阻害組成物）は、二糖類水解酵素活性を阻害するので、糖質含有食品と一緒に摂取すれば、血糖上昇抑制とインスリン分泌抑制が起こり、糖尿病予防あるいは高血糖の抑制等の効果が期待できる。また、この血糖値上昇抑制等組成物を利用した糖尿病等予防食品は、高齢化社会における医療費削減にも寄与するものと考えられる。
【００７４】
先にも説明した通り、厚生労働省の糖尿病患者調査によれば、糖尿病患者および糖尿病予備軍の総数は約１６００万人にもなる。また、この数は、年々増加の一途を辿っており、日本人の食生活を含めた生活行動が変わらなければ、今後さらに増加すると予測されている。
【００７５】
このような状況において、本発明にかかる血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物）、およびこれを含有した血糖値上昇抑制等食品は、その効果的な適用によって、糖尿病患者の増加を抑制するものと考えられる。つまり、本発明にかかる小分子アルギン酸分解物を用いれば、副作用等がなく安全性が高い、糖尿病予防食品等の保健機能食品を開発可能であるため、その需要は高まるものと考えられる。
【００７６】
また、アルギン酸は、昆布やわかめ等の藻類に含まれているので、本発明にかかるアルギン酸分解物が薬剤や食品（あるいは食品素材）として利用されるようになると、商品として価値が低い傷物の昆布やわかめ等もこれ（血糖値上昇抑制等組成物（小分子アルギン酸分解物））の原料として用いることが可能となる。したがって、本発明は、海洋資源の有効利用にも大きく寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の効果を示すグラフであって、アルギン酸分解物を添加しないときの二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（スクラーゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。
【図２】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の効果を示すグラフであって、アルギン酸分解物を添加しないときの二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（マルターゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。
【図３】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の効果を示すグラフであって、アルギン酸分解物を添加しないときの二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（イソマルターゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。
【図４】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の効果を示すグラフであって、アルギン酸分解物を添加しないときの二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（トレハラーゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。
【図５】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の効果を示すグラフであって、アルギン酸分解物を添加しないときの二糖類水解酵素活性を１００としたときの相対活性（ラクターゼ比活性）と阻害率との関係を示したグラフである。
【図６】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序を示すグラフであって、スクラーゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。
【図７】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序を示すグラフであって、マルターゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。
【図８】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序を示すグラフであって、イソマルターゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。
【図９】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序を示すグラフであって、トレハラーゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。
【図１０】本実施形態にかかるアルギン酸分解物（血糖値上昇抑制等組成物）の阻害機序を示すグラフであって、ラクターゼに対するLineweaver-Burkプロットを示したものである。
【符号の説明】
【００７８】
Ｌ１０…阻害剤無添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のスクラーゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ１１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のスクラーゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ１２…阻害剤（原液の１．３倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のスクラーゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ１３…阻害剤（原液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のスクラーゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ２０…阻害剤無添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のマルターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ２１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のマルターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ２２…阻害剤（原液の１．３倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のマルターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ２３…阻害剤（原液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のマルターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ３０…阻害剤無添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のイソマルターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ３１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のイソマルターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ３２…阻害剤（原液の１．３倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のイソマルターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ３３…阻害剤（原液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のイソマルターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ４０…阻害剤無添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のトレハラーゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ４１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のトレハラーゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ４２…阻害剤（原液の１．３倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のトレハラーゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ４３…阻害剤（原液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のトレハラーゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ５０…阻害剤無添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のラクターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ５１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のラクターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ５２…阻害剤（原液の１．３倍希釈液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のラクターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ５３…阻害剤（原液）添加時におけるラット小腸粘膜微絨毛膜のラクターゼ比活性値を示す棒グラフ
Ｌ６０…阻害剤無添加時における回帰直線（スクラーゼ）
Ｌ６１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時における回帰直線（スクラーゼ）
Ｌ６２…阻害剤（原液の１．３倍希釈液）添加時における回帰直線（スクラーゼ）
Ｌ７０…阻害剤無添加時における回帰直線（マルターゼ）
Ｌ７１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時における回帰直線（マルターゼ）
Ｌ７３…阻害剤（原液）添加時における回帰直線（マルターゼ）
Ｌ８０…阻害剤無添加時における回帰直線（イソマルターゼ）
Ｌ８１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時における回帰直線（イソマルターゼ）
Ｌ８３…阻害剤（原液）添加時における回帰直線（イソマルターゼ）
Ｌ９０…阻害剤無添加時における回帰直線（トレハラーゼ）
Ｌ９２…阻害剤（原液の１．３倍希釈液）添加時における回帰直線（トレハラーゼ）
Ｌ９３…阻害剤（原液）添加時における回帰直線（トレハラーゼ）
Ｌ１００…阻害剤無添加時における回帰直線（ラクターゼ）
Ｌ１０１…阻害剤（原液の２倍希釈液）添加時における回帰直線（ラクターゼ）
Ｌ１０３…阻害剤（原液）添加時における回帰直線（ラクターゼ）
【出願人】 【識別番号】５０５２２５１９７
【氏名又は名称】長崎県公立大学法人
【出願日】 平成１７年１月１２日（２００５．１．１２）
【代理人】 【識別番号】１００１３１８９７
【弁理士】
【氏名又は名称】荒木 憲一
【公開番号】 特開２００６−１９３４４８（Ｐ２００６−１９３４４８Ａ）
【公開日】 平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願番号】 特願２００５−５１５０（Ｐ２００５−５１５０）