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【発明の名称】 膵細胞の再生に関係するＲｅｇＩＩＩβを誘導しうる物質の評価方法
【発明者】 【氏名】馬場 明道

【氏名】橋本 均

【氏名】新谷 紀人

【氏名】杉本 幸彦
【要約】 【課題】膵島の機能低下や脱分化の原因となる膵細胞の過形成を抑制する物質若しくはインスリンの過分泌を抑制する物質を提供すること。

【解決手段】PACAPは膵細胞過形成の抑制剤及び／又はインスリン過分泌の抑制剤として有用である。更にPACAPの刺激によるRegIIIβの発現を指標とすることにより、膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤の評価等に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドを含有することを特徴とする膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤。
【請求項２】
下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド並びにビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体及びスルフォニル尿素薬から選ばれる１種又は２種以上を含有することを特徴とする糖尿病予防又は治療剤。
【請求項３】
糖尿病治療に際して、ビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体及びスルフォニル尿素薬から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする医薬組成物と同時、別個、または連続して使用することを特徴とする、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド含有医薬組成物。
【請求項４】
RegIIIβを発現する細胞に被検物質を接触させ、当該接触によりRegIIIβの発現の変化を指標とすることを特徴とする、膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制する物質を評価する方法。
【請求項５】
１）RegIIIβを発現する細胞と被検物質とを接触させる工程、
２）工程１）で被検物質と接触させた細胞を、高濃度グルコース存在下で再度培養する工程、及び
３）工程２）で培養後、RegIIIβの発現量又はRegIIIβを発現する細胞の増殖率を調べる工程、
を含むことを特徴とする請求項４に記載の評価方法。
【請求項６】
工程２）において、RegIIIβ発現細胞と被検物質を再度培養する際に、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド存在下で培養することを特徴とする請求項５に記載の評価方法。
【請求項７】
RegIIIβを発現する細胞、該細胞と被検物質の接触に適した試薬、該細胞を高濃度グルコース存在下で培養するに適した試薬及び下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドを含有することを特徴とする、請求項４〜６いずれかに記載の評価方法を行うためのキット。
【請求項８】
請求項４〜６いずれかに記載の評価方法によって得られた物質を含有することを特徴とする膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤。
【請求項９】
請求項４〜６いずれかに記載の評価方法によって得られた膵細胞過形成抑制作用及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有する物質、並びにビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体及びスルフォニル尿素薬から選ばれる１種又は２種以上を含有することを特徴とする糖尿病予防又は治療剤。
【請求項１０】
糖尿病治療に際して、ビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体及びスルフォニル尿素薬から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする医薬組成物と同時、別個、または連続して使用することを特徴とする、請求項８に記載の膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤、更には膵細胞過形成抑制作用及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有する物質を評価する方法及び該評価方法によって得られた膵細胞過形成抑制作用及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有する物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（Pituitary adenylate cyclace-activating polypeptide；PACAP）は、セレクチン／グルカゴン／vasoactive intestinal polypeptide（VIP）ファミリーに属する神経ペプチドで、その生理作用は下垂体・副腎髄質ホルモンの合成・分泌調節や神経細胞・性細胞の分化・成長促進作用など多彩な役割を担うことが知られている（非特許文献１参照）。膵臓においてはPACAP免疫陽性神経が膵島に投射すること、PACAP受容体サブタイプのうちPACAPに親和性の高いPAC1受容体と、PACAPとVIPの両者に同程度の親和性を示すVPAC2受容体の発現が膵臓β細胞にみられること、単離膵島からのグルコース誘導性インスリン分泌を10-14Ｍという極めて低濃度で促進することが知られている。
【０００３】
またPACAPは様々な細胞で、細胞保護作用あるいは、分化、増殖の促進作用を持つことから、膵臓β細胞においてもこのような作用がみられることが予測されるが、上記のように、PACAPは生体内で様々な作用を持つため、PACAP投与による糖代謝について調べた実験ではその結果の解釈は複雑となっている（非特許文献２参照）。
【０００４】
最近、PACAPが膵臓においてどのような作用を有するか調べるために、ヒトインスリンプロモーター制御下で膵臓特異的にPACAPを過剰発現させるトランスジェニックマウス（Tg/+）が作製され、このマウスが同腹の野生型（+/+）マウスより高いグルコース依存性のインスリン分泌能を示すことを見出している（非特許文献３参照）。
【０００５】
さらに、優性遺伝形式で肥満、糖尿病を発症するagouti yellowマウス（Ay/+）とTg/+マウスとの掛け合わせによって得られるTg/+：Ay/+マウスがAy/+マウスに比べ、膵臓重量が大きくなるとともに、膵島重量が小さくなっていることを見出している（特許文献１参照）。
【０００６】
しかしながら、PACAPシグナル系には未だに選択的な低分子アゴニストが存在しないことなどから、in vivoにおけるPACAPの膵島への作用は未だに明らかになっていない点が多い。
【０００７】
Regenerating gene（Reg）は、再生膵島に特異的に発現している遺伝子として単離され、β細胞の再生増殖因子とされている（非特許文献４参照）。RegにはＩ〜ＩＶの４つのサブタイプが存在し、RegIIIβは、再生膵島に発現している因子として発見され、膵島の再生に関与することが報告されている（非特許文献５参照）。最近、RegIIIβは、主にストレスや炎症で誘導される因子としても報告されている（非特許文献６参照）。
【０００８】
一方、Regレセプターは、正常な膵島や再生膵島などに発現し、再生・増殖のシグナルはRegレセプターを介することが報告されている（非特許文献７参照）。
【０００９】
しかしながら、膵島の機能低下や脱分化の原因となる膵細胞の過形成を抑制する因子に関しては何の報告もされていない。
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−３０４７７８号公報
【非特許文献１】別冊・医学のあゆみ，２００１，７９−８４
【非特許文献２】Am J Physiol 1998 May 274 (5 Pt 1)：E834-42
【非特許文献３】Diabetes(2003) 52：1155-1162
【非特許文献４】Diabetes(1984) 33：401
【非特許文献５】J Biol Chem (1988) 263：2111-2114
【非特許文献６】World J Gastroenterol (2003) 9：2635-2641
【非特許文献７】J Biol Chem (2000) 275：10723-10726
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、膵島の機能低下や脱分化の原因となる膵細胞の過形成を抑制する物質若しくはインスリンの過分泌を抑制する物質を提供することにある。また、本発明の別の側面によれば、簡便に精度良く、膵細胞の過形成を抑制する物質を評価する方法及び当該評価を行うための評価用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、PACAPが高グルコースの存在下でReg遺伝子の発現を誘導し、膵細胞の過形成及びインスリンの過分泌を抑制することを見出した。さらに、従来、膵島の再生・増殖に関与すると考えられていたReg遺伝子が、高グルコース条件下においては、予想外にも膵細胞の過形成の抑制に関与していること、及び、当該知見により、高グルコース条件下おけるReg遺伝子の発現が、膵細胞の過形成を抑制する物質を評価する際の指標とすることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１３】
すなわち本発明は、
（１）下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドを含有することを特徴とする膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤。
（２）下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド並びにビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体及びスルフォニル尿素薬から選ばれる１種又は２種以上を含有することを特徴とする糖尿病予防又は治療剤。
（３）糖尿病治療に際して、ビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体及びスルフォニル尿素薬から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする医薬組成物と同時、別個、または連続して使用することを特徴とする、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド含有医薬組成物。
（４）RegIIIβを発現する細胞に被検物質を接触させ、当該接触によりRegIIIβの発現の変化を指標とすることを特徴とする、膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制する物質を評価する方法。
（５）１）RegIIIβを発現する細胞と被検物質とを接触させる工程、２）工程１）で被検物質と接触させた細胞を、高濃度グルコース存在下で再度培養する工程、及び３）工程２）で培養後、RegIIIβの発現量又はRegIIIβを発現する細胞の増殖率を調べる工程、を含むことを特徴とする上記（４）に記載の評価方法。
（６）工程２）において、RegIIIβ発現細胞と被検物質を再度培養する際に、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド存在下で培養することを特徴とする上記（５）に記載の評価方法。
（７）RegIIIβを発現する細胞、該細胞と被検物質の接触に適した試薬、該細胞を高濃度グルコース存在下で培養するに適した試薬及び下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドを含有することを特徴とする、上記（４）〜（６）いずれかに記載の評価方法を行うためのキット。
（８）上記（４）〜（６）いずれかに記載の評価方法によって得られた物質を含有することを特徴とする膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤。
（９）上記（４）〜（６）いずれかに記載の評価方法によって得られた膵細胞過形成抑制作用及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有する物質、並びにビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体及びスルフォニル尿素薬から選ばれる１種又は２種以上を含有することを特徴とする糖尿病予防又は治療剤。
（１０）糖尿病治療に際して、ビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体及びスルフォニル尿素薬から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする医薬組成物と同時、別個、または連続して使用することを特徴とする、上記（８）に記載の膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドは、膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤として有用である。また、本発明の評価方法によれば、簡便に精度良く膵細胞過形成抑制する又はインスリン過分泌抑制する物質を評価することができ、これにより、膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤のスクリーニングが可能である。当該スクリーニングで得られた物質は膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤として使用することができる。更に、公知の糖尿病治療薬であるスルフォニル剤は、副作用として膵細胞の機能低下によるインスリン分泌障害を引き起こすことから、本発明の膵細胞過形成抑制剤及び／又はインスリン過分泌抑制剤と併用して用いることで優れた糖尿病予防・治療剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書で用いられる「下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド」（以下、PACAPと略す）は、哺乳動物由来のPACAPを意味し、ヒトの治療に用いる場合には、ヒト由来のPACAPが好ましい。PACAPは公知のタンパクであり、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号：１に記載する。
【００１６】
本発明のPACAPには、以下に記載のペプチドも含まれる。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列のうち１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などにより変異したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、配列番号：１で表されるペプチドと同様の機能を有するペプチド、
（ｂ）配列番号：１で表されるペプチドとの相同性が少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するペプチドであって、配列番号：１で表されるペプチドと同様の機能を有するペプチド、
（ｃ）配列番号：１をコードするＤＮＡ配列のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含有するＤＮＡ配列によりコードされるペプチドであって、配列番号：１で表されるペプチドと同様の機能を有するペプチド。
【００１７】
ここで、ペプチドにおけるアミノ酸の変異数は、配列番号：１で表されるペプチドの機能が保持される限り制限されないが、１又は数個であることが好ましい。
【００１８】
また、「ストリンジェントな条件下」とは、Molecular Cloning : A Laboratory Manual 3rd Ed. (2001)等に記載に従って、適宜調整することができる。具体的には、例えば、0.1×SSCと0.1％SDSとを含有する溶液中、65℃で洗浄が行われる条件が挙げられる。
【００１９】
本明細書における「同様の機能を有するペプチド」とは、高濃度グルコース条件下で培養されたRegIII発現細胞に、被検対象のペプチドを投与し、培養した後、RegIIIの発現が上昇することを機能を有するペプチドを意味する。
【００２０】
また、本明細書でいうこれらのペプチドは、ヒトやそれ以外の哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、サル等）に由来するペプチドであってもよく、合成されたものであってもよい。更に、これらペプチドの塩であっても、アミド化またはエステル化されたものであってもよい。
【００２１】
該ペプチドの塩としては、生理学的に許容される無機酸（例えば、塩酸、リン酸）、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）または塩基（例えば、アルカリ金属）等との塩が挙げられるが、特に生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。
【００２２】
該ペプチドを医薬組成物として使用する場合は、通常行われる手段に従って、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして、あるいは無菌性溶液、懸濁液剤などの注射剤とすることができる。
【００２３】
該ペプチドの投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば経口投与の場合は、糖尿病患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与する場合は、例えば、糖尿病患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射することができる。
【００２４】
本発明のペプチドは、生体内に存在する内因性のリガンド若しくはそれと同様の機能を有するペプチドであるので、安全で低毒性な膵細胞過形成抑制剤やインスリン過分泌抑制剤として使用することができる。
【００２５】
また、本発明のペプチドは、膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有するので、糖尿病の進行により生じる膵細胞の機能低下を軽減することができる。
【００２６】
したがって、本発明のペプチドを既知の糖尿病治療薬と併用した場合には、インスリンの分泌不全を抑制しつつ、糖尿病予防又は治療をすることが可能である。
【００２７】
本発明において使用できる既知の糖尿病治療薬としては、例えば、メトフォルミン、ブフォルミン、フェンフォルミン等のビグアナイド薬、アカルボース、ボグリボース等のαグルコシダーゼ阻害薬、トリグリタゾン、ピオグリタゾン等のチアゾリン誘導体、トルブタミド、グリクラジド、グリベンクラミド等のスルフォニル尿素薬が挙げられる。
【００２８】
特に膵臓のβ細胞に作用し、インスリンの分泌を促進させる働きを有する薬剤、例えばスルフォニル尿素薬と併用した場合には、スルフォニル尿素薬投与による副作用として一般的に知られている膵細胞の機能低下を軽減することができ、優れた糖尿病予防又は治療剤として使用することができる。
【００２９】
本発明のペプチドと既知の糖尿病治療薬を併用する場合は、１つの製剤中に含有させて投与しても良いし、個々の薬剤を同時、別個、または連続して投与してもよい。
【００３０】
また、本発明の「膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制する物質を評価する方法」は、RegIIIβ発現細胞に被検物質を接触させ、当該接触によるRegIIIβの発現量又はRegIIIβを発現する細胞の増殖率の変化を指標とする方法であればよく、当該RegIIIβ発現細胞が高濃度グルコース存在下で培養されたものであれば、より高精度に膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制する物質の評価をすることが可能である。具体的には、例えば、以下のような行程で評価を行うことができる。
１）RegIIIβを発現する細胞と被検物質とを接触させる工程、
２）工程１）で被検物質と接触させた細胞を、高濃度グルコース存在下で再度培養する工程、及び
３）工程２）で培養後、RegIIIβの発現量又はRegIIIβを発現する細胞の増殖率を調べる工程。
【００３１】
工程３）において、RegIIIβ発現量の向上あるいはRegIIIβを発現する細胞の増殖率の抑制が確認されれば、被検物質は膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制効果を有する候補物質とすることができる。
【００３２】
更に工程２）において、RegIIIβ発現細胞と被検物質を再度培養する際に、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド存在下で行えば、生体内における状態をより反映させた評価が可能となる。
【００３３】
すなわち、本発明で得られた知見を利用することにより、膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有する物質を評価し、スクリーニングすることが可能である。
【００３４】
本発明において、「RegIIIβを発現する細胞」としては、哺乳動物の膵細胞、例えばINS−1細胞（ラット膵β細胞株）やMIN−6細胞（マウス膵β細胞株）、RegIIIβをコードするＤＮＡを導入したトランスフェクト細胞等が使用可能である。当該トランスフェクト細胞へのRegIIIβをコードするＤＮＡの導入は、内因性のRegIIIβを発現する細胞であっても、発現しない細胞であってもよい。
【００３５】
RegIIIβをコードするＤＮＡの導入は、適当なベクターに当該DNAを連結させて、公知の方法により、哺乳細胞や昆虫細胞等の適当な細胞に導入することができる。具体的には、例えば、Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley & Sons Section 16.1−16.9等に記載の方法に従って行うことができる。
【００３６】
また、RegIIIβを発現する細胞と被検物質との接触は、被検物質の存在下で当該細胞を培養してもよいし、公知の方法により、被検物質を細胞内に直接又は間接的に導入すること等により可能である。
【００３７】
RegIIIβを発現する細胞を培養する培地及び培養気相は、当該細胞を維持又は培養することが可能な培地及び気相であればよく、これらの培地には、必要に応じて、抗生物質、成長因子等を加えることができる。
【００３８】
本明細書における「高濃度のグルコース」とは、使用されるRegIIIβ発現細胞や培養条件等によって異なるが、上記工程２）において、再度培養をPACAP存在下で行い、RegIIIβの発現量の増加を確認することができるグルコース濃度を意味する。当該グルコース濃度で上記評価方法を実施すれば、高い精度で膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有する物質の評価を行うことができる。
【００３９】
RegIIIβを発現する細胞の培養は、具体的には、例えば、ラット膵β細胞株であるＩＮＳ−１細胞を用いる場合には、10 mM HEPES, 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 50 μM β-mercaptoethanol, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycinを含むRPMI1640培地（GIBCO）を用いて、5％ CO2/95% air, 37℃のインキュベーター内で行うことができる。当該培養を、２５ｍＭ以上の濃度のグルコース存在下で行えば、RegIIIβの発現量が増加を指標として高い精度で膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有する物質の評価を行うことが可能である。
【００４０】
また、本発明は、上記のRegIIIβを発現する細胞、該細胞と被検物質の接触に適した試薬、該細胞を高濃度グルコース存在下で培養するに適した試薬及び下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドを含有する上記評価方法を行うためのキットを提供する。該キットを使用すれば、迅速、簡便に、且つ、高い精度で膵細胞過形成抑制作用及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有する物質をスクリーニングすることが可能である。
【００４１】
本発明の評価方法に供される被検物質としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が用いられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。またペプチドライブラリーや化合物ライブラリー等を用いることもできる。
【００４２】
本発明の評価方法によってスクリーニングされた物質は、膵細胞過形成抑制及び／又はインスリン過分泌抑制作用を有するので、糖尿病の進行により生じる膵細胞の機能低下を軽減することができる。
【００４３】
したがって、本発明のペプチドを既知の糖尿病治療薬、例えば、ビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害薬、チアゾリン誘導体、スルフォニル尿素薬と併用した場合には、インスリンの分泌不全を抑制しつつ、糖尿病の予防又は治療をすることが可能となる。
【００４４】
特にＳＵ剤等のインスリンの分泌を促進させる働きを有する薬剤と併用した場合には、副作用を軽減することができ、安全で低毒性な糖尿病治療・予防薬として使用することができる。
【００４５】
該評価方法によって得られる得られる化合物は塩であってもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される無機酸（例えば、塩酸、リン酸）、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）または塩基（例えば、アルカリ金属）等との塩が挙げられるが、特に生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。
【００４６】
該化合物を医薬組成物として使用する場合は、通常行われる手段に従って、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして、あるいは無菌性溶液、懸濁液剤などの注射剤としてすることができる。
【００４７】
該化合物の投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば経口投与の場合は、糖尿病患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与する場合は、例えば、糖尿病患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射することができる。
【００４８】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１：実験動物の作製
実験動物の作製は、特開２００３−３０４７７８号公報に記載に従って行った。C57BL/6Jマウス（+/+）（清水実験材料）を遺伝的背景とした膵β細胞特異的PACAP過剰発現トランスジェニックマウス（Tg/+, Diabetes(2003)52:1155-1162）と、 糖尿病モデルマウスであるKKAｙマウス（Aｙ/+）（日本クレア）を交配させ、 交雑第一世代F1マウス（+/+, Tg/+, Aｙ/+, Tg/+: Aｙ/+）を得た。4種類の遺伝子型は毛色（Aｙ遺伝子を有するマウスは黄色体毛を呈する）と尾から抽出したゲノムDNAを用いたPCRにより判定した。全ての動物は室温22℃±1℃、照明12時間(8:00〜20:00)の飼育条件下で飼育し、食餌および水は自由に摂取させた。動物の飼育および実験はすべて、大阪大学動物実験指針に従って行った。
【００５０】
実施例２：血中パラメーターの測定
午前9:00〜11:00の間にマウスの尾静脈より血液を採取した。血漿グルコース、 インスリン、 トリグリセリド濃度は、それぞれGlucose CII-Test（和光純薬）、 Sensitive Rat insulin RIA Kit(LINKO)、 Triglyceride INT kit（Sigma）を用いて測定した。
【００５１】
結果を図１に示した。Ay/+マウスとTg/+:Ay/+マウスにおいて, 体重, 血糖値, 血中トリグリセリド値が, 週齢及び糖尿病の進行とともに劇的に上昇した。しかし血漿インスリン値の上昇は, PACAPを過剰発現させたTg/+:Ay/+マウスにおいて, Ay/+マウスの約40％にまで抑制されており, Tgアレルの導入によってAyアレルで惹起される高インスリン血症が一部改善されることが明らかとなった。
【００５２】
実施例３：組織形態の定量的測定
摘出した膵臓を4%パラホルムアルデヒド含有PBSに1日、 30%シュクロース含有PBSに2日浸潤し、 液体窒素にて凍結させた後、 切片を作製するまで-80℃にて保存した。厚さ16μmの連続切片を作製し、 ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色を行った。
【００５３】
結果を図２に示した。Ay/+マウスの膵島は野生型に比べて、劇的に過形成しており、 またこれに対してTg/+:Ay/+マウスではAy/+マウスに比べて膵島の面積が縮小する傾向にあった。
【００５４】
更に、Nikon TE300顕微鏡（Nikon Inc.）およびMac Scope image analysis software（mitani C0）を用いて、 膵臓切片上の膵島の数、 面積を測定し、統計的に解析を行った。
【００５５】
結果を図３に示した。平均膵島面積（図３Ａ）, 全膵臓の単位面積当たりに存在する膵島の数（図３Ｂ）, 膵島の量（全膵臓面積に占める全膵島の割合を膵臓の湿重量にかけた値）（図３Ｃ）のそれぞれが、 Ay/+マウスでは+/+、 Tg/+マウスと比較して劇的に増加していたが、 Tg/+:Ay/+マウスでは全て抑制されていた。
【００５６】
また膵臓インスリン含量も、Ay/+マウスに比べてTg/+:Ay/+マウスは約61%低い値を示しており（それぞれ13.7 ± 3.7, 5.4 ±1.7 μg/g pancreas）、 血漿インスリン値の上昇が、 Tg/+:Ay/+マウスで抑制されていることと一致した。
【００５７】
更に、 個々の膵島の大きさのヒストグラム解析（図３Ｄ）を行ったところ、 +/+、 Tg/+マウスでは正規分布様のヒストグラムパターンを示すのに対して、Ay/+アレルを有する肥満マウスでは分布パターンが右側にシフトし、 特に100,000 μm2以上の膵島の数が劇的に増加することが明らかとなった。
【００５８】
またAy/+で特徴的にみられる100,000 μm2以上の膵島の数は、 Tg/+の導入で有意に低下していた。
【００５９】
以上のような一連の組織化学的解析により、膵島におけるPACAPの過剰発現によって、KKAy マウスにおける2型糖尿病態下での膵島過形成が抑制されることが見出された。
【００６０】
実施例４
（１）膵島からのRNA抽出とRNA増幅
膵臓切片をnon-coat slide glass に貼付し、-18℃において75% EtOH、30秒処理で固定した。室温にてDEPC処理水に30秒、75% EtOHに30秒、95% EtOHに30秒、100% EtOHに30秒、xyleneに7分浸潤し、15分間風乾した。デシケーター内で15分間減圧乾燥した後、シリカゲル入りのサンプルボックスで保存した。PixCell IIe Laser Capture Microdissection System (Arcturus)を用いて、β細胞を豊富に含む膵島の中心部50〜70個を切り出し、CapSureTM(Arcturus)に吸引(laser caputure)した。Pico Pure RNA Isolation Kit(Arcturus)を用いてtotal RNAを調整し、RiboAmpTM OA RNA Amplification Kit(Arcturus)を用いてRNAの一次増幅を行った。一次増幅産物のSpot assayにより200ng以上の存在が認められたサンプルについて二次増幅を行った。一次増幅産物RNAからSuperscript II(invitrogen)によりcDNAを合成し、Oligo-dT T7primerを用いて2種類のcDNAを合成した。Enzo High Yield RNA Transcript labeling kit(Enzo Diagnostics)により、ビオチン化cRNAを合成した。
【００６１】
（２）Gene Chip解析
作製したcRNAとU74Av2 Gene Chip(Affymetrix)とのハイブリダイゼーションを行った。Gene Chipはfluidics system(affimetrix)を用いて自動的に洗浄し、streptavidin-phycoerythrinにより染色した後、Hewlett-Packard Gene array Scannerによりスキャンした。Data image fileを用いて、遺伝子転写レベル(Average Difference)をMicroarray analysis suite software(Affymetrix)により決定した。本解析は1匹のマウスにつき1 chipを使用して、各遺伝子型につき3匹ずつ施行している。Micro Excelを用いて、各スポットにおける遺伝子転写レベル(Average Difference)の平均値を遺伝子型ごとに算出した。
【００６２】
4種類のF1マウスをそれぞれ比較し、average differenceの値が50倍以上増加していた遺伝子を表1に示した。+/+マウスとAy/+マウスを比較した場合では、Ay/+マウスでcarboxypeptidase H、islet amyloid polypeptide、7B2 proteinなどがup regulationしていた。Ay/+マウスとTg/+:Ay/+マウスを比較した場合では、Tg/+:Ay/+マウスでRegIIIβ, rpL7, aldolase2などがup regulationしていた。
【００６３】
【表１】


【００６４】
実施例５：マウス膵島遺伝子発現の定量解析
膵島由来RNAを二次増幅したRNAから、逆転写酵素Superscript II(invitrogen)によってcDNAを生成した。これらのcDNAサンプルを鋳型として、各遺伝子に特異的なプライマーおよびDyNAmoTM SYBR GreenｑPCR Kitを用い、DNA Egine Opticon 2 System によってreal-time quantitative PCR解析を行った。反応条件は95℃10 秒, 57℃20秒, 72℃ 20 秒を40サイクルとした。内部標準としてglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)遺伝子の発現量を同様に解析し、PCRには以下の配列のプライマーを用いた。
【００６５】
RegIIIβ:
forward, CTG CCT TAG ACC GTG CTT TC（配列番号：２）
reverse, CCC TTG TCC ATG ATG CTC TT（配列番号：３）
Carboxy peptidase H:
forward, CAC GTA AAT ACA CCC GGA CA（配列番号：４）
reverse, TTT CTT CCC ATC CAA AGT GC（配列番号：５）
IAPP:
forward, CTC TCT GTG GCA CTG AAC CA（配列番号：６）
reverse, GGA CTG GAC CAA GGT TGT TG（配列番号：７）
GAPDH:
forward, CTC ATG ACC ACA GTC CAT GC（配列番号：８）
reverse, CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC（配列番号：９）
【００６６】
結果を図４に示した。Gene Chip解析と同様の結果がReal-time quantitative RT-PCRによっても確認された。まずポジティブコントロールとしてPACAPの発現を解析したところ+/+, Ay/+と比較してTg/+, Tg/+:Ay/+でmRNAの発現が上昇していた（図４Ａ）。
【００６７】
またcarboxypeptidase H（図４Ｃ）、islet amyloid polypeptide (IAPP)（図４Ｂ）、pancreatitis-associated protein (RegIIIβ)（図４Ｄ）についても、Gene Chip解析と同様の結果が得られ、本実験における遺伝子発現変化を定量的に確認することができた。
【００６８】
ところで本実験系では、Ay/+マウスで発現変動し、Tg/+:Ay/+マウスで+/+マウスと同様のレベルになっている遺伝子はなかった。したがってTgアレルによる膵島過形成の抑制は、Ayアレルで惹起された遺伝子変動を正常化するというよりは、むしろ別の遺伝子を新規に誘導することで達成されることが示された。
【００６９】
実施例６
（１）INS-1細胞培養
ラット膵β細胞株であるINS-1細胞は、10 mM HEPES, 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 50 μM β-mercaptoethanol, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycinを含むRPMI1640培地（GIBCO）を用いて、5％ CO2/95% air, 37℃のインキュベーター内で培養した。継代には0.25% トリプシン/0.02% EDTAを含むPBSを用い、7日に1度行った。
【００７０】
（２）細胞増殖の解析
細胞を1×105 cells/wellの濃度で48 well plateに播種し48時間培養した。PBSで細胞を洗浄後、グルコースおよび血清を除き0.1% BSAを添加したRPMI-1640培地(テスト培地)で12〜15時間培養した。それぞれの濃度のPACAPを含むテスト培地に0，3，11，25mMとなるようにグルコースを加えて20時間培養し、[3H]thymidine（Amersham）を1 μCi/wellとなるように加えてさらに4時間培養した。細胞をPBSで2回洗浄後、10% trichloroacetic acid（TCA）で2回洗浄し、さらに30分のTCA処置により細胞を固定した。0.1NのNaOHで化溶化し、それぞれの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００７１】
その結果を図５に示した。3 mM, 11 mMのグルコース濃度条件下ではPACAPによる細胞増殖への影響は認められなかったが、高グルコース濃度条件下（25 ｍM）においてはPACAPによって約20％の細胞増殖抑制が認められた。また高グルコース濃度条件下において、PACAPは濃度依存的にINS-1細胞の増殖抑制することが示された。
【００７２】
（３）INS-1細胞遺伝子発現の定量解析
PACAP処置後のINS-1細胞からグアニジンチオシアネート酸性フェノール法によりtotal RNAを調整し、逆転写酵素M-MLV (GIBCO BRL)によってcDNAを作製した。マウス膵島の際と同様の条件でreal-time quantitative PCR解析を行った。内部標準としてβ-actin遺伝子の発現量を同様に解析し、PCRには以下の配列のプライマーを用いた。
【００７３】
RegIIIβ:
forward, GCT TCA TTC TTG GCA TCC AT（配列番号：１０）
reverse, AGA TGG GTT CCT CTC CCA GT（配列番号：１１）
β-actin:
forward, ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA（配列番号：１２）
reverse, GCC ACA GGA TTC CAT ACC CA（配列番号：１３）
【００７４】
結果を図６に示した。Real-time quantitative RT-PCRにより定量したところ、3 mM, 11 mMのグルコース濃度条件下ではPACAP添加による発現変化は認められなかった。
【００７５】
しかし高グルコース濃度条件下（25ｍM）において、4時間後からPACAPによるRegIIIβの発現誘導がみられ、その後48時間後まで持続的な発現上昇がみられた。3mMグルコース濃度条件下ではPACAPの有無に関係なく、24時間後から急激にRegIIIβのmRNA発現が上昇した。これは低濃度グルコース条件によってINS-1細胞が傷害され、増殖因子であるRegIIIβが発現誘導されたためであると考えられる。
【００７６】
これらの結果より、高血糖状態においてPACAPは、RegIIIβを特異的に発現上昇させ、膵β細胞の増殖に対して抑制的に働いていると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明により、膵細胞過形成及び／又はインスリン過分泌に関連する疾患の治療又は予防が可能である。更に、ＳＵ剤等の糖尿病治療剤による副作用を軽減することが可能となり、優れた糖尿病治療薬を提供することが可能である。
【００７８】
また、前記膵細胞過形成及び／又はインスリン過分泌に関連する疾患の治療又は予防に有効な薬剤等の評価やスクリーニングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１はPACAP-Tgマウス（以下Tgマウス）とKKAyマウスとの交配によって得られたF1マウスについて、体重および各血清成分の経時的変化を調べた結果を示す（実施例２）。
【図２】図２は上記F1マウスの膵臓について、ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色を行った結果を示す（実施例３）。
【図３】図３は上記F1マウスについて、平均膵島面積（図３Ａ）、 全膵臓の単位面積当たりに存在する膵島の数（図３Ｂ）、膵島の量（全膵臓面積に占める全膵島の割合を膵臓の湿重量にかけた値）（図３Ｃ）、膵島の大きさのヒストグラム解析（図３Ｄ）を測定した結果を示す（実施例３）。
【図４】図４は上記F1マウスの膵島における遺伝子の発現変化をReal-time quantitative RT-PCRによって、定量的に確認した結果を示す（実施例５）。
【図５】図５は膵β細胞由来細胞株INS-1細胞における、PACAPによる細胞増殖への影響を液体シンチレーションカウンターで測定した結果を示す（実施例６）。
【図６】図６は膵β細胞由来細胞株INS-1細胞における、PACAPによるRegIIIβのmRNA発現変化をReal-time quantitative RT-PCRにより定量した結果を示す（実施例６）。
【出願人】 【識別番号】０００００２８１９
【氏名又は名称】大正製薬株式会社
【識別番号】５００１８０４４４
【氏名又は名称】馬場 明道
【出願日】 平成１７年１月１２日（２００５．１．１２）
【代理人】 【識別番号】１００１１５４０６
【弁理士】
【氏名又は名称】佐鳥 宗一

【識別番号】１０００７４１１４
【弁理士】
【氏名又は名称】北川 富造
【公開番号】 特開２００６−１９３４４５（Ｐ２００６−１９３４４５Ａ）
【公開日】 平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【出願番号】 特願２００５−４８９３（Ｐ２００５−４８９３）