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【発明の名称】 微小血管新生阻害物質及びその製造法
【発明者】 【氏名】芦野 洋美

【氏名】中嶋 宏
【要約】 【課題】緑藻に由来する成分を通常の摂取範囲で投与し、生体に対して毒性がなく安全性の高い微小血管新生病の阻害作用を顕著に現しうる組成物としての健康食品、健康飲料、治療薬を提供する。

【解決手段】鶏卵胚漿尿膜法による活性測定法において３０％以上の微小血管新生阻害活性を有する緑藻画分を主成分とする健康保健食品並びに飲料。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏卵胚漿尿膜法において３０％以上の微小血管新生の伸展阻害活性を有する緑藻画分。
【請求項２】
緑藻画分が酸性多糖画分であることを特徴とする請求項１記載の緑藻画分。
【請求項３】
酸性多糖画分がキシロアラビノガラクタン硫酸であることを特徴とする請求項２項記載の緑藻画分。
【請求項４】
請求項１乃至３項記載の緑藻画分を主成分とすることを特徴とする、微小血管新生の活性化を伴う疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
微小血管新生の活性化に起因する疾患が、眼内血管新生疾患である請求項４に記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
眼内血管新生疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性である請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
緑藻がミル目の海藻である請求項１乃至３項記載の緑藻画分。
【請求項８】
緑藻がミル目の海藻である請求項４乃至６項記載の予防又は治療剤。
【請求項９】
緑茶、ウーロン茶、バナバ茶、杜仲茶、ハト麦茶、昆布茶、紅花茶、イチョウ葉茶、ギムネマ茶、ドクダミ茶、プーアル茶、蓮子心、山扁豆及び黄精からなる群から選ばれる少なくとも１つ由来の煎じ液を請求項１乃至３項に記載の緑藻画分に添加した混合物。
【請求項１０】
請求項１乃至３項に記載の緑藻画分又は混合物を主成分とすることを特徴とする健康食品又は特殊用途食品。
【請求項１１】
飲料又はドリンク剤であることを特徴とする請求項１０に記載の健康食品。
【請求項１２】
緑藻を微粉砕、乾燥後、麹菌と混合、保温処理して得られる混合物を用いた請求項８乃至請求項１０の混合物又は食品。
【請求項１３】
麹菌がアスペルギルス属オリゼである請求項１２の混合物又は食品。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小血管新生病の阻害作用、特に眼内血管新生疾患の予防改善、糖尿病性網膜症、黄斑変性などの疾患の予防及び治療に有効な作用を有する緑藻混合物に関する。また、本発明は、緑藻の呈味性を改善することによる飲料、健康・保健食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは、既存の血管から新しい血管ネットワーク、すなわち新生血管が形成される現象である。血管新生は生体における種々の生理的および病的状態、すなわち、黄体形成、胎盤形成や炎症、創傷治癒、慢性リウマチ、腫瘍増殖などの過程で認められる。殊に日本人の死亡原因の第一位である腫瘍の増殖に新生血管網は不可欠である。また眼科領域においては、やはり日本人の失明原因第一位である糖尿病性網膜症や近年急激な増加傾向を示している加齢黄斑変性症、未熟児網膜症などでも血管新生が促進され、その結果、眼球として最も重要な組織透明性が損なわれる硝子体出血や網膜剥離を起こし失明に至らしめる。したがって眼科領域においても、血管新生は機能障害を惹起する原因となっている。
【０００３】
病的な血管新生を阻害する事の重要性は上記の各種の疾病予防、治療の目的で極めて重要であり、各種の血管新生阻害剤ならびに活性を示す物質が報告されている（例えば、特開２００２−３０８７７（特許文献１参照），特開２００２−３０８７６８（特許文献２参照），特開２００２−２８４６８６（特許文献３参照），特開２００１−１１４６９９（特許文献４参照），特開２００１−３０２６６３（特許文献５参照），特開２００１−０６４１７３（特許文献６参照）など）。このように、血管新生の阻害作用を有する治療薬および予防的食品の創出が注目されている。
【特許文献１】特開２００２−３０８７７号公報
【特許文献２】特開２００２−３０８７６８号公報
【特許文献３】特開２００２−２８４６８６号公報
【特許文献４】特開２００１−１１４６９９号公報
【特許文献５】特開２００１−３０２６６３号公報
【特許文献６】特開２００１−０６４１７３号公報
【０００４】
この為に、血管新生阻害の活性を評価する方法として種々の方法が報告されてきている。具体的には、マウス背部皮下法（例えば、非特許文献１参照）、培養血管内皮細胞の遊走能測定法（例えば、非特許文献２参照）、内皮細胞の増殖測定法（例えば、非特許文献３参照）、内皮細胞のタンパク分解酵素測定法（例えば、非特許文献４参照）、内皮細胞の管腔形成測定法（例えば、非特許文献５参照）、大動脈輪切り法（例えば、非特許文献６参照）、鶏卵胚漿尿膜法（ＣＡＭ法と以下略記する。例えば、非特許文献７参照）
【非特許文献１】キャンサ−・リサ−チ誌、１９８７年４７巻５０２１ページ
【非特許文献２】ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー誌、１９９９年２７４巻３５５６２ページ
【非特許文献３】（ジャーナル・オヴ・セル・バイオロジー誌、１９７８年７７巻７７４ページ
【非特許文献４】イクスペリメンタル・セル・リサーチ誌、１９８５年１５６巻３７９ページ
【非特許文献５】ジャーナル・オヴ・セル・バイオロジー誌、１９８８年１０７巻１５８９ページ
【非特許文献６】ラボラトリー・インヴェスチゲ−ション誌、１９９０年６３巻１１５ページ
【非特許文献７】イクスペリメンタル・パソロジー誌、１９８６年３０巻１４３ページ
などの種々の方法が報告されてきている。
【０００５】
マウス背部皮下法は、腫瘍細胞を封入したチェンバーを皮下に埋め込むため、腫瘍により惹起される血管新生の評価に向いた方法とされている。血管内皮細胞を用いた測定法はどの疾病に対応するということはなく一般的である一方、動物を用いた測定法はそれぞれの疾病対策に好適な血管新生活性測定法であるとされている。また、内皮細胞の管腔形成法はシャーレ内でチューブが観察できる利点があり、高頻度に用いられる方法であるものの、数段階ある血管新生ステップの一つに過ぎず、実質的な血管を用いた方法ではなく、疑似管腔によるものである欠点が指摘されている。この場合、主にヒト臍帯静脈（ＨＵＶＥＣ）を使用することが多いが、これは微小血管ではないため、眼内血管新生にも腫瘍の血管新生の活性測定に適していない。
【０００６】
さらにまた、大動脈輪切り法はシャーレ内で１０日間培養して観察するので培養系と動物実験系の中間に位置する方法であるが、漿尿膜法のように血管新生のネットワーク全体としての観察が出来ない欠点を有している。また組織として観ることもできない。当然ながら、周皮細胞や平滑筋細胞も形成されないなどの欠点があり、眼内血管新生病に対応した測定系とは言うことができない。
【０００７】
一方、ＣＡＭ法は、微小新生血管の伸長阻害を特異的に調べうるという特徴から、とくに眼内血管新生疾患である糖尿病性網膜症、黄斑変性などの疾患の予防及び治療剤の活性を評価する方法として推奨されている方法である。ＣＡＭ法においては、（ｉ）一定面積のまとまりをもった血管ネットワークが観察できる。（ｉｉ）生体内そのままの血管を（殺さずに）観察できる。（ｉｉｉ）発生における血管新生の一部ではあるが、胚そのものではなく、上面に存在するため、胚と区別して観察し易い。（ｉｖ）発生における血管新生であるため、腫瘍や血管新生促進因子を用いずに自然な血管新生が観られる。そのため血管新生に対する阻害作用を観察するのに極めて適した系である。（ｖ）血管医学のトランスレ−ショナルリサーチが急務となっている現在、比較的独立した部分の血管網を観察でき、組織を調べることのできる稀な系であるため、動物実験として有用である。（ｖｉ）漿尿膜は漿膜上皮細胞層／微小血管層／間充織細胞層／尿膜上皮細胞層の４つの異なる層から構成されている。未刺激の漿尿膜では微小血管層中に多数の内皮細胞が存在し、密な管腔構造を形成している。その微小血管の周囲には内皮細胞を覆うようにして平滑筋細胞がまばらに観察される。この状態は眼内血管新生病において、周皮細胞が内皮細胞から離れて血管新生が起こり易くなった状態に近いと考えられる。眼内血管新生では、周皮細胞が内皮細胞の増殖を制御して脆弱な血管新生が起きるのを防いでいる。その状態は、他の身体の部分（動脈など）の主たる血管系のように、しっかりした平滑筋細胞に覆われたものとは異なっており、漿尿膜のような状態に近いと推測される。（ｖｉｉ）漿尿膜は癌を含む様々な血管新生の測定に適していると思われる。
【０００８】
以上が、眼内血管新生病を標的とした阻害効果の検出にＣＡＭ法が適しているといえる理由である。今一つの眼内血管新生病を標的とした測定法として、動物の角膜そのものを用いる方法も知られてはいるが、この方法には、動物一匹で２検体しかデータがとれないという欠点がある。また、生きた動物を用いることから動物への苦痛という大きな問題点がある。動物愛護の観点から、近年この方法を避けることが推奨されている。
【０００９】
つぎに、海藻類の血管新生阻害効果の物質の検索については、特開平７−１６０９２（特許文献７参照）において我々は紅藻類のアマノリ属に存在する硫酸多糖で血管新生阻害活性のあることを報告した。また、さらに精査したところ、抗血液凝固多糖類の研究の中で、松原らはナガミルに血管内皮細胞による管腔形成を阻害する活性が併存する事実を見いだしたとの報告がみられる（例えば、非特許文献８、９参照）。
【特許文献７】特開平７−１６０９２号公報
【非特許文献８】ジャーナル・アプライド・フィコロジー誌、２００３年１５巻８７ページ
【非特許文献９】インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・マクロモレキュール誌、２００１年、２８巻、３９５ページ
【００１０】
しかし、本ナガミルには食経験が認められないので、安全性の保証に大きな欠点を有する海藻である。また、上記引用文献によれば、活性成分はわずかにグルコースを含むガラクタン硫酸であり、本発明の成分であるキシロアラビノガラクタン硫酸とは全く異なった物質であり、当業者によって本発明を類推する根拠とは全くならない結果であった。
【００１１】
さらに、ナガミル成分の活性測定には、上記に言及したＨＵＶＥＣによる疑似管腔形成測定法が用いられていて、これは微小血管に対する活性を評価できていない。上記文献ではまた、大動脈輪切り法も用いられているが、血管をネットワークとして観察できておらず、部分的に特定化された条件における評価にのみ限定された系を使っているという問題が残されている。従って、本文献での活性測定は微小血管新生の活性化による疾患の予防及び治療とくに、眼科領域の疾病に有効な血管新生阻害活性評価とはなっていない根本的な問題点があった。上記各例のように、血管新生が関与する疾患の治療剤の研究としては、癌の治療を目的とした薬物に関するものがほとんどであり、微小血管新生の活性化による疾患の予防及び治療、とくに眼科領域の疾病に有効な薬物の研究は極めて少ない。この分野の重要性から鑑みて、微小血管新生阻害活性の新規物質の検索が強く望まれており、この為には生体に近い系での評価が不可欠であり、ＣＡＭ法による活性測定法が最適であるといえる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上述の学術的背景の下に、微小血管新生阻害活性の新規物質の検索を主目的とする活性評価法として、ＣＡＭ法を中心的に用いる方法を採用した。ＣＡＭ法によって鶏卵漿尿膜を用いることにより、急速に血管新生が進んでいる時期を選んで使用でき、かつ測定に要する時間もおよそ２日間弱と短い（孵卵器に入れる時期から算出しても、６日間くらいである）。漿尿膜では１００余りの多くの検体を一度に調べることができ、動物実験としては圧倒的に有用な系である。緑藻類、中でもミル目にＣＡＭによる微小血管新生阻害活性の著効画分を分別する。
【００１３】
且つ、上記緑藻からの活性画分に茶成分をさらに混合することにより、海藻特有の青臭さを低減することがわかり、呈味性の大幅な改善の事実をも見いだすに至り、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）鶏卵胚漿尿膜法において３０％以上の微小血管新生の伸展阻害活性を有する緑藻画分。
（２）緑藻画分が酸性多糖画分であることを特徴とする緑藻画分。
（３）酸性多糖画分がキシロアラビノガラクタン硫酸であることを特徴とする緑藻画分。
（４）緑藻画分を主成分とすることを特徴とする、微小血管新生の活性化を伴う疾患の予防又は治療剤。
（５）微小血管新生の活性化に起因する疾患が、眼内血管新生疾患である予防又は治療剤。
（６）眼内血管新生疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性である予防又は治療剤。
（７）緑藻がミル目の海藻である緑藻画分。
（８）緑藻がミル目の海藻である予防又は治療剤。
（９）緑茶、ウーロン茶、バナバ茶、杜仲茶、ハト麦茶、昆布茶、紅花茶、イチョウ葉茶、ギムネマ茶、ドクダミ茶、プーアル茶、蓮子心、山扁豆及び黄精からなる群から選ばれる少なくとも１つ由来の煎じ液を緑藻画分に添加した混合物。
（１０）緑藻画分又は混合物を主成分とすることを特徴とする健康食品又は特殊用途食品。
（１１）飲料又はドリンク剤であることを特徴とする健康食品。
（１２）緑藻を微粉砕、乾燥後、麹菌と混合、保温処理して得られる混合物を用いた混合物又は食品。
（１３）麹菌がアスペルギルス属オリゼである混合物又は食品。
【発明の効果】
【００１３】
本発明者はＣＡＭ法によって、各種海藻類を材料として鋭意研究を行った結果、驚くことに、緑藻類、中でもミル目にＣＡＭによる微小血管新生阻害活性の著効画分を分別し、微小血管新生の活性化に起因する疾患、とくに糖尿病性網膜症、黄斑変性症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、血管新生緑内障などの眼内血管新生性疾患の予防及び治療剤として期待される新事実を見出した。本発明のＣＡＭ法によって活性を見出だされた緑藻画分は、これを基本的に毎日摂取することにより、生体に対して毒性がなく安全性の高い微小血管新生病の予防効果を期待出来る健康食品、健康飲料を提供出来る。また、治療薬としての有効成分を提供する事が出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、鶏卵胚漿尿膜法による活性測定法において３０％以上の微小血管新生阻害活性を有する緑藻画分（「本発明の緑藻画分」ともいう）を主成分とする、微小血管新生の活性化に起因した疾患の予防及び治療剤に関するものである。
また、上記疾患の予防及び治療に有用な作用を有する健康保健食品並びに飲料を提供することにある。且つ、これらの呈味性を改善して食用、飲用に供しやすくするためのものである。
【００１５】
以下、本発明の内容について詳述する。
まず、ＣＡＭ法による血管新生阻害活性の測定について詳述する。これは田中らの方法（イクスペリメンタル・パソロジー誌、１９８６年３０巻１４３ページ）に準じる。すなわち、受精後０日齢の孵化卵を用い、卵殻表面を洗浄し、湿潤な転卵機内（３７．９℃、）で、３日間転卵する。３日後、転卵機から孵化卵を取り出し、落下細菌を避けられるフード等（クリーンベンチ等）内で、気室側の卵殻上部を７５％エタノール綿で消毒し、この卵殻表面に錐等で約０．１ｃｍ程度の穴を開ける。一方下方側面も消毒後穴を開けて、注射器を用いて卵白を２ｍｌ除き、滅菌シールで封をする。気室側の穴からピンセットで卵殻を直系１．５ｃｍ位取り除き、キャップを被せて一晩、湿潤な３７．９℃に保ったインキュベータ−内で孵卵する。
【００１６】
１６時間から２０時間後、フード内でキャップを外し漿尿膜を観察し、漿尿膜の直径が２から３ｍｍの卵のみを選びだす。内径３ｍｍのシリコンリングを漿尿膜上にのせ、滅菌した１％メチルセルロース生理食塩水１０・１に溶解した検体を、リング内に滴下する。キャップを被せて４０から４５時間、湿潤な３７．９℃に保ったインキュベータ−内に置く。
【００１７】
効果判定は以下のようにして行う。インキュベータ−から４０から４５時間後、卵を取り出して、漿尿膜内にイントラリピッド（三菱ウェルファーマー社製）を細い注射針を用いて注入する。この注入によって漿尿膜上の血管を観察し易くし、漿尿膜の無血管領域の直径を自動ノギスで測定する。この時写真を撮る。無血管領域が４ｍｍ以上の場合、血管新生は阻害されたものと評価する。総数７個以上の受精鶏卵を用いたときの、無血管領域４ｍｍ以上を示した個数の割合を、微小血管新生阻害作用の指標とし、３０％以上を有効であると判定する。有効個数は多いほど活性は強いと判定される。
【００１８】
ついで本発明にかかる緑藻画分について詳述する。用いられる緑藻としては、アオサ目、シオグサ目、ミドリゲ目、イワズタ目、ハネモ目、カサノリ目およびミル目よりなる群から選ばれた少なくとも１種の緑藻に由来する海藻類である。中でも活性画分の含量が多い事から、ミル目が好適に用いられる緑藻ミルとしては、ヒゲミル、サキブトミル、クロミル、ミル（コジウム・フラジル）、モツレミル、ヒラミル、ハイミル、タマミル、コブシミルをあげることが出来る。これらの緑藻は天然の物に限らず、深層水を主とした栄養源として利用する人工栽培によるものも用いることが出来る。
【００１９】
ミルなどの緑藻から、ＣＡＭ活性画分を調整する方法としては、海藻を水にて十分洗浄後、乾燥、ついで０．５ミリほどの砕片に破砕し、エタノール等の溶媒還流下で３０分ないし５時間洗浄、脱色処理をする。海藻分を濾取後、以下の方法でさらに精製を行うことも出来る。
【００２０】
すなわち、室温ないし８０℃で、３０分ないし５時間水にて抽出、濾過、遠心分離して上澄みを集める。遠心分離後の沈殿をさらに、室温下３０分ない３時間水にて抽出、濾過、遠心分離して上澄みを集める（この操作を２ないし８回繰り返す）。集められた上澄み液にアセトンを加え、沈殿精製させたものを濾取し、減圧にて乾燥する。
【００２１】
さらに必要な場合には、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーにより分画精製する。例示の充填剤としては、ダウエックス１，デアシダイトＦＦ、ＥＣＴＥＯＬＡ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロースなどの陰イオン交換樹脂が推奨される。カラムから有効成分の溶出には、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＮａＣＯ３，ＭｇＣｌ２等の塩類を用いることができる。溶出画分は溶出に用いられた塩類を透析膜により脱塩後、エキスとして採取される。緑藻ミルからの活性画分は緑藻の中でも特にＣＡＭ活性が強いため好ましい材料である。
【００２２】
例えばＤＥＡＥ−セルロースカラムから溶出される画分のうち２Ｍ〜３ＭのＮａＣｌ濃度の画分が、比較的に活性の高い画分であることから、本発明の緑藻画分は酸性多糖画分を含む。また、藻類の酸性多糖に関する従来の知見からこの活性の高い画分は硫酸多糖、とくにキシロアラビノガラクタンとされる（ジャーナルオブアプライドファイコロジー誌、１９９５年７巻３３９ページ）。
【００２３】
上記の方法によって得た画分には、ＣＡＭ法による特異性から、とりわけ微小血管新生が関与する疾患（微小血管新生病）の予防又は治療剤を提供するものであり、その疾患の例としては、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、血管新生緑内障などの眼内血管新生性疾患などがあげられる。いままで、血管新生が関与する疾患の研究としては、癌の治療を目的とした薬物の研究が数多く行われているが、眼内血管新生性疾患に有用な薬物の研究は少なく、本発明の主たる目的は、この眼内血管新生性疾患に有用な薬物を提供することにある。むろん、本発明は血管新生性疾患に広くて適用できるものであり、眼内血管新生性疾患に対象が限定されるものではない。
【００２４】
活性画分を含む混合物は、経口でも非経口でも投与することが出来るが、注射剤などの非経口投与の場合には、画分をさらにカラム法などにより精製することが望まれる。経口投与剤型としては、タブレット剤、ドリンク剤、顆粒または散剤が、非経口投与としては例えば、点眼剤としての投与などがあげられる。
【００２５】
緑藻ないしミルのＣＡＭ活性画分を主成分としたタブレットを成形するためには、上記のようにして得た活性画分を含むエキス又は微粉末に、賦型剤及び各種の添加剤、例えば、クリーミーパウダー、麦芽糖、セルロース粉末、シュガーエステル、リン酸カリウム、澱粉グリコール酸ナトリウム、焼成カルシウム、ボレー粉、シクロデキストリン、クエン酸マグネシウムなどを添加剤混合した後、直接粉末圧縮法で打錠成形することによって製造することが出来る。
【００２６】
ドリンク剤は、上記の活性画分のエキス又は微粉末と水を主成分として混合して調整する。エキスを用いた場合には、澄明なドリンク剤となるが、粉末を使用した場合には、濁ったドリンク剤が得られる。後者の場合、粉末の速やかな沈降を防止する目的で、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、カラギーナンなどの増粘剤を若干添加することが好ましい。さらに、特にドリンク剤の場合、（勿論他の組成物においても用いることも可能であるが）呈味性の改善のため、下記の添加剤を加えることが出きる。すなわち茶の成分を添加することにより、味覚に親しみが得られ、海藻特有の青臭さや不快臭を改善することが出来、飲用しやすくなる。用いられる茶としては、例えば、緑茶、ウーロン茶、バナバ茶、杜仲茶、鉄観音茶、ハトムギ茶、アマチャヅル茶、マコモ茶、昆布茶、紅花茶、イチョウ葉茶、ギムネマ茶、ドクダミ茶、プーアル茶、連子心、山扁豆、黄精等から１種ないし３種ほど選択して配合することが出来る。そして本発明は、それらの煎じ液を本発明の緑藻画分に添加した混合物も含む。茶の煎じ方としては、定法でよい。
【００２７】
上記組成物の必須の成分である、緑藻のエキス又は微粉末と、水との混合割合は、限定的ではないが、両者の重量比で、１対５０から１対１００００の範囲が適当であるが，好ましくは１対１００〜１対１０００が推奨される。
【００２８】
本発明の健康食品、飲料の投与量は特に制限されず、投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択することが出きる。
【００２９】
つぎに緑藻をあらかじめ麹菌と処理する理由について述べる。上記のように本発明者が見出したＣＡＭ活性画分は、酸性多糖類を含むものである。ここで多糖類はしばしば体内吸収性が不良である。これを改良する目的で、緑藻を微粉砕し乾燥して得られる微粉末を麹菌と処理することも出来る。本方法には、定法によってあらかじめ乾燥した緑藻粉砕物を、水を加えて、１０ないし５０重量％になるように調整した後、麹菌を１ないし３０重量％、好ましくは５から１５重量％混合し、２５℃から６５℃、好ましくは３５℃から４０℃に５時間から３日間好ましくは５時間から２４時間、ｐＨ４．０からｐＨ７．５、好ましくはｐＨ４．５からｐＨ６．０で保温処理をする。麹菌としては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ムコール属、リゾープス属、モナスカス属、アブシディア属に属する微生物で、食して害のない菌をいう。麹菌処理した緑藻からＣＡＭ法により本発明の緑藻画分を得ることも出来る。あるいは、ＣＡＭ法で、本発明の緑藻画分を得た後、麹菌処理しても良い。
【実施例１】
次に本発明の実施例を示すが、本発明は下記の例に限定されるものではない。（緑藻画分の調整例）
【００３０】
まず海藻を水にて十分洗浄後、乾燥する。乾燥緑藻２００ｇを約０．５ミリ大の砕片に破砕し、エタノール２５０ｍｌを用いて３回、加熱還流下４時間洗浄、脱色処理をした。固形画分を濾取後、以下の方法でさらに精製を行った。
室温で、４時間、水６Ｌで抽出し、濾過、遠心分離して上澄みを集めた。遠心分離後の沈殿をさらに４回、同じ条件で６Ｌの水にて抽出、濾過、遠心分離して上澄みを集めた。 このようにして集められた上澄み液を約３００ｍｌ程度に濃縮後、これにアセトンを少しずつ添加して沈殿を析出させる。（約１００ｍｌを要する）。この操作を３回繰り返し、集められた精製沈殿物を濾取した。濾取物を減圧にて乾燥して、得られた粉末は約１０ｇであった。（この段階を画分Ａと称する）。
【００３１】
さらに精製を続ける場合は、以下の操作を行う。すなわち、カラム長６０ｍｍ、カラム径３０ｍｍ、充填剤としてダウエックス１（Ｘ２，２００メッシュ）にカラムに、画分Ａを１ｇを採取し、水約５０ｍｌに溶解した物を供給した。カラムからの成分溶出は、溶離液として、塩化ナトリウム溶液を用い、塩濃度を変化させることで、分画した。それぞれの溶離液は１Ｌずつ使用した。
【００３２】
溶出画分は表１のように７画分のエキスとして採取された。各画分をそれぞれＢ−１〜Ｂ７と命名した）。表１には、例示としてコジウム・フラジルの結果を示した。各重量は脱塩後の乾燥重量を示す。
【表１】


【実施例２】
【００３３】
実施例１で得られた緑藻画分を用いて、ＣＡＭ法での微小血管新生に対する阻害活性を鶏卵胚漿尿膜を用いて調べた。
即ち、上述のように、まず受精４日目の漿尿膜（選別しておいた直径が２〜３ｍｍ程度のもの）上に、内径３ｍｍ、外径４ｍｍ厚さ１ｍｍのシリコン製リングをのせる。上記画分を１ｍｇ／１０μｌになるように１％メチルセルロース生理食塩水に溶解し、この溶液１０μｌをピペットでリング内の漿尿膜上に滴下する。キャップを被せて湿潤な３７．９℃に保ったインキュベーター内に置く。判定は４０から４５時間後、漿尿膜内にイントラリピッド（三菱ウェルファーマー社製）を２７ゲージの注射針を用いて注入し、漿尿膜上の血管を観察した。漿尿膜において実験総個数あたり、４ｍｍ以上の無血管領域（血管新生の阻害）の認められた個数が幾つあるかの割合を、各画分毎に表２に示した。また血管新生阻害活性のあるＢ−５およびＢ−６で処理した漿尿膜と対照とを図１に示した。
【表２】


【００３４】
以上の結果から活性が３０％以上の画分として、Ｂ−５， Ｂ−６，Ｂ−７
がミル（コジウム・フラジル）に含まれていることが判明した。
【実施例３】
【００３５】
他の緑藻類の画分について、実施例１および実施例２と同様にして調整しＣＡＭ法により活性を評価した。結果は表３に示した。
【表３】


【実施例４】
（麹菌での処理例）
【００３６】
実施例で用いたＡ画分５ｇを水５０ｍｌに分散させ、これに米麹１０ｇを添加しホモゲナイズした。３７℃で一晩放置し、メンブレンフィルターで不要物を濾別した。得られた溶液は麹菌処理後のエキスとして食用に用いられる。
【実施例５】
（製剤例）
【００３７】
（イ）エキスの製造例：
緑藻１００ｇを約５ｍｍ片に切断後、乾燥機で４０℃、１日乾燥、これを熱水２００ｇで、１００℃、１０分間煮出し、濾過してエキスを抽出した。または、実施例４と同様な方法で麹菌処理後のエキスとして製造出来る。
（ロ）粉末の製造例：
緑藻１００ｇを水で十分に洗浄後、天日で５日〜７日乾燥し（水分率約１０％以下）、約５ｍｍ片に切断する。これを直径３／８インチのステンレス球を封入した三井鉱山（株）社製の攪拌式粉砕器、アトライタに入れ３０分間処理した。得られた粉末は８８ミクロンオールパスであった。
（ハ）タブレットの製造例：
上記（ロ）にて得られた粉末４００ｇにオリゴ糖４００ｇ、リン酸カルシウム３０ｇ、蔗糖脂肪酸エステル１７０ｇを加え、Ｖ型混合機で２０分間混合した後、ロータリープレスで８００ｋｇｒ／ｃｍ２で加圧成形し、１錠１００ｍｇの錠剤を作成した。
（ニ）ドリンク剤の製造例：
上記製造例（イ）で製造した熱水抽出エキス１０ｇ、ジャスミン茶の煎じ液２０ｇを水９７０ｃｃに溶解し、濾過した。
【実施例６】
（呈味性の改善）
【００３８】
実施例５と同様にして調整した緑藻ミルの抽出エキスと水を重量比で１対５０の割合で溶解して調整したドリンク剤にさらに、表４に示した各種の茶の煎じ液を５部、５部で混合し、２０人のパネラーによる官能試験を実施した。検査は無添加品を先ずパネラーに飲用してもらい、そのあとで、表４の各種のもの（無添加も含む）を内容明示せずに飲用してもらい、その後アンケート方式で評価した。
【表４】




【００３９】
その結果、全ての場合に、茶の煎じ液を加えない場合に比べて優位に、薬味臭（海藻の青臭さ）が改善された。苦み・渋みも感じることが少なく、飲み易さの改善が示された。
【実施例７】
（血管内皮細胞の生存能力から見た活性評価）
【００４０】
ウシ肺微小血管内皮細胞は、１０％ウシ胎児血清およびＣＳ−Ｃ増殖因子を含むセルシステムズ社製培地ＣＳ−Ｃコンプリートメディウム（ＣＳ−４ＺＯ−５００）によって、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養、増殖させた。この血管内皮細胞を９６穴プレートに５，０００個／穴になるように播き、およそ１６時間経ち接着後、血清を含まないメディウムで洗い、３％血清を含む同じ培地を加え、これにミル由来の各画分を加え、７２時間培養した。プロメガ社製ＭＴＴアッセイキットＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６を用いて生存細胞を評価した。本アッセイは生存細胞にのみ取り込まれるテトラゾリウム塩を細胞がフォルマザン産物へ変換することを利用した高感度で簡便な方法である（ジャーナルオブイムノロジーメソッド誌、１９８３年６５巻５５ページ）。染色液テトラゾリウム塩を細胞に添加後、４時間培養し、溶解液を加え一晩加湿下に置き溶解させた後、プレートリーダーを用い５７０ｎｍで測定した。（表５，図２）
【表５】


【００４１】
上表から明らかに本発明の画分は微小血管内皮細胞の生存能力に影響を及ぼさず、微小血管新生阻害剤として安全に用いられることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２における各画分のＣＡＭ活性の測定結果を示す生物の形態を示す写真である。
【図２】実施例２における各画分の血管内皮細胞の生存能力から見た細胞毒性評価を示す図である。Ｂ−５，Ｂ−６は実施例２の画分Ｂ−５，Ｂ−６である。
【出願人】 【識別番号】５９１０６３３９４
【氏名又は名称】財団法人 東京都医学研究機構
【出願日】 平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【代理人】
【公開番号】 特開２００６−１７６４８７（Ｐ２００６−１７６４８７Ａ）
【公開日】 平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願番号】 特願２００４−３８２７９２（Ｐ２００４−３８２７９２）