| 【発明の名称】 |
Ｌ−ヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤 |
| 【発明者】 |
【氏名】足立 伊左雄
【氏名】加藤 敦
【氏名】足立 晶子
【氏名】木津 治久
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| 【要約】 |
【課題】Ｌ−ヒスチジン脱炭酸酵素活性の上昇に起因する種々の疾患（アレルギー疾患、炎症性疾患、消化性潰瘍あるいはヒスタミンの産生により引き起こされる病的状態等）の予防又は治療薬を提供すること。
【解決手段】 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉防已、茶葉、麻黄、丁子、蘇木、牡丹皮、大黄、黄ゴン及び甘草からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とするＬ−ヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤。
【請求項２】
粉防已を有効成分とするＬ−ヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤。
【請求項３】
式
【化１】
で表される化合物を有効成分とするＬ−ヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−ヒスチジン脱炭酸酵素活性の上昇に起因する種々の疾患の予防又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒスタミンは炎症、アレルギー、胃酸分泌、神経伝達ならびに腫瘍細胞の転移・増殖といった反応を調節する生体アミンである。ヒスタミン産生細胞としては肥満細胞や、好塩基球、ＥＣＬ細胞（ｅｎｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ）などがあり、これら細胞内にはヒスタミン生合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素（Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＨＤＣ）が存在している。ＨＤＣは誘導性の酵素であり、刺激に応じて数倍から百倍以上にも酵素活性が上昇し、種々のアレルギー疾患や炎症、消化性潰瘍などを引き起こす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
【０００４】
本発明の目的は、ＨＤＣ阻害活性を有する生薬を探索し、副作用の少ないＨＤＣ阻害剤、引いては、アレルギー疾患、炎症性疾患、消化性潰瘍あるいはヒスタミンの産生により引き起こされる病的状態などを低減させうる薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは前記課題を解決するために多くの生薬のＨＤＣ阻害活性を探索した結果、粉防已をはじめとする数種の生薬がＨＤＣ阻害活性を有することを見出した。
かかる知見に基づき完成した本発明の一つの態様は、粉防已、茶葉、麻黄、丁子、蘇木、牡丹皮、大黄、黄ゴン及び甘草からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とするＬ−ヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤である。
【０００６】
本発明者らはさらに粉防已からのＨＤＣ阻害物質の単離を目的として、分画、精製、構造解析を行い、粉防已より単離したｂｉｓｂｅｎｚｙｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ型アルカロイドがＨＤＣ阻害活性を有するとの知見を得た。
かかる知見に基づき完成した本発明の一つの態様は、下記式で表されるｂｉｓｂｅｎｚｙｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ化合物を有効成分とするＬ−ヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤である。
【０００７】
【化１】
【０００８】
本発明における「粉防已」とは、主に抗リュウマチ作用を期待し処方に配合される生薬である。「粉防已」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。粉防已の有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり２．０〜３．０ｇであり、好ましくは２．５〜３．０ｇである。
【０００９】
本発明における「茶葉」とは、利尿、脂肪分解抑制、清頭目を期待し処方に配合される生薬である。「茶葉」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。茶葉の有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり１．５〜２．０ｇであり、好ましくは１．５ｇである。
【００１０】
本発明における「麻黄」とは、主に解熱、鎮咳、鎮痛を期待し処方に配合される生薬である。「麻黄」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。麻黄の有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり１．２〜６．０ｇであり、好ましくは３．０〜４．０ｇである。
【００１１】
本発明における「丁子」とは、主に抗菌、抗ウイルス作用、子宮収縮作用を期待し処方に配合される生薬である。「丁子」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。丁子の有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり１．０〜１．５ｇであり、好ましくは１．５ｇである。
【００１２】
本発明における「蘇木」とは、主に高脂血症改善、止血を期待し処方に配合される生薬である。「蘇木」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。蘇木の有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり２．０〜２．５ｇであり、好ましくは２．０ｇである。
【００１３】
本発明における「牡丹皮」とは、婦人用薬の主薬として用いられ、末梢血液循環の改善、更年期障害の改善や瀉下効果を期待し処方に配合される。「牡丹皮」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。牡丹皮の有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり２．０〜５．０ｇであり、好ましくは４．０〜５．０ｇである。
【００１４】
本発明における「大黄」とは、主に抗菌、抗炎症作用や瀉下作用を期待し処方に配合される生薬である。「大黄」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。大黄の有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり０．５〜４．０ｇであり、好ましくは２．０〜３．０ｇである。
【００１５】
本発明における「黄ゴン」とは、主に利胆作用、抗炎症作用や肝障害予防作用を期待し処方に配合される生薬である。「黄ゴン」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。黄ゴンの有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり１．５〜３．０ｇであり、好ましくは２．０〜３．０ｇである。
【００１６】
本発明における「甘草」とは、主に清熱解毒、潤肺止咳、鎮痙を期待し処方に配合される生薬である。「甘草」は、原末のみならず、エキス等の抽出物あってもよく、その形態には特に限定はない。甘草の有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり１．０〜６．０ｇであり、好ましくは１．０〜３．０ｇである。
【００１７】
本発明において前記各生薬は単独で配合するのみならず、数種を組み合わせて配合してもよい。
本発明における「Ｌ−ヒスチジン脱炭酸酵素阻害剤」は、例えば、粉防已などのエキスを含有する内服用固形製剤（錠剤、散剤など）を調製し、１日１乃至数回患者に経口投与することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、Ｌ−ヒスチジン脱炭酸酵素活性の上昇に起因する種々の疾患（アレルギー疾患、炎症性疾患、睡眠、消化性潰瘍、腫瘍（転移抑制）、脳代謝改善あるいはヒスタミンの産生により引き起こされる病的状態等）の予防又は治療薬を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
【００２０】
以下、実験例を挙げて本発明を詳細に説明する。
１．酵素調製
雄Ｗｉｓｔａｒ系ラット５匹よりＨＤＣを調製した。操作は氷冷下、または、４℃で行った。富山医科薬科大学実験動物委員会の基準に基づいた動物に苦痛を与えない条件下（ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒで麻酔）で、開腹し胃を摘出した。２０倍容の０．０１ｍＭ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＬＰ）、１００μｇ／ｍＬ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、０．１ｍＭ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ（ＥＤＴＡ）、６ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．２５Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ含有０．１Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）でＷａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒを用いてホモジナイズした。このホモジネイトを４８，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清に硫酸アンモニウムを２５％飽和になるように徐々に加え、完全に溶解させた。３０分撹拌後、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離を行った。さらに、得られた上清に硫酸アンモニウムを５５％飽和になるように徐々に加え塩析を行った。６０分撹拌後、再度１０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。得られた沈殿を０．０１ｍＭ ＰＬＰ、１００μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、６ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ含有０．１Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨＨ６．８）で懸濁させ同様のｂｕｆｆｅｒで一晩透析した。得られた溶液を粗酵素として、４℃で保存し、適宜実験に使用した。
【００２１】
２．Ｌ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ脱炭酸酵素阻害活性測定
０．１Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８）２４０μＬ、０．０１ｍＭ ＰＬＰ １２０μＬ、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ；１０ｍｇ／ｍＬ）１２０μＬ、ａｌｋａｌｏｉｄ（１０ｍｇ／ｍＬ）１２０μＬ、に粗酵素３００μＬ加え撹拌した。３７℃、１５分プレインキュベートし、その後、基質である１０ｍＭ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ３００μＬを加え、３７℃、１２０分インキュベートした。ＨＤＣ活性は、生成したｈｉｓｔａｍｉｎｅをＰ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムにて分離し、ο−ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ法に基づきｈｉｓｔａｍｉｎｅを定量し、阻害活性を測定した。
【００２２】
（スクリーニング生薬）
スクリーニングに用いた生薬は次のとおりである。
蘇葉、枇杷葉、杏仁、サンザシ、紫根、荊芥、連翹、山梔子、防風、桔梗、細辛、竜胆、クコシ、牛膝、括楼根、附子、ヨクイニン、大棗、茯苓、沢瀉、ビャクシ、柴胡、当帰、麦芽、苦参、酸棗仁、忍冬、天麻、粳米、天門冬、薄荷、前胡、括楼仁、唐独活、木通、桑白皮、天南星、シツリシ、竜眼肉、五味子、茶葉、升麻、半夏、麦門冬、菊花、蝉退、蒼朮、呉茱萸、山椒、枳穀、陳皮、白朮、麻子仁、延胡索、枳実、粉防已、貝母、何首烏、蓮肉、丁子、辛夷、蘇木、牛蒡子、良姜、縮砂、紅花、麻黄、竹葉、カッコウ、黄柏、胡麻、ウコン、橘皮、杜仲、生姜、小麦、桃仁、冬瓜子、猪苓、竹茹、山茱萸、羌活、芍薬、人参、青皮、香附子、地骨皮、乾姜、牡丹皮、山薬、遠志、甘草、木香、センキュウ、インチンコウ、艾葉、地黄、厚朴、大黄、車前子、釣藤鈎、桂皮、オウゴン、黄耆、威霊仙、知母、呉茱萸、レイシ、黄連
【００２３】
３．生薬熱水抽出画分およびアルカロイド画分の調製
各生薬１００ｇを８００ｍＬの水で４０分間煎じ、シルクの布で濾過した。その生薬に再び４００ｍＬの水を加え４０分間煎じ、濾過した後凍結乾燥させた。アルカロイド画分は、生薬熱水エキスを得た後、上清を陽イオン交換カラムＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ＋ｆｏｒｍ）に付し、樹脂の５倍量の０．５Ｍアンモニア溶液で溶出させた後、濃縮乾固することにより得た。
【００２４】
上記各生薬（１１２種）の熱水可溶性画分を終濃度１ｍｇ／ｍＬになるように調製してＨＤＣ阻害活性を測定した。その中で粉防已、茶葉、ボクソク、麻黄、丁子、檳榔子、蘇木、牡丹皮、大黄、黄ゴン、甘草に明らかなＨＤＣ阻害活性が認められた。さらにこれら生薬のアルカロイド画分を調製し、同様にＨＤＣ阻害活性を測定したところ、粉防已、丁子では熱水抽出画分より活性の上昇が認められた（図１）。
【００２５】
４．粉防已からの活性物質の単離精製
粉防已２ｋｇ（乾燥重量）を熱水で１時間抽出を行なった。抽出液を冷却後、沈殿物をセライトで濾過した。濾液をクロロホルムで分配しクロロホルム層を得た。得られたクロロホルム層を濃縮後、Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０カラムにアプライし、クロロホルム：メタノール：水（１７：３：０．２→４０：１０：１→６：４：１）で順次溶出した。顕著な阻害効果が認められたクロロホルム：メタノール：水（４０：１０：１）で溶出される区分を減圧下で濃縮し、１．２０ｇの茶色のアメ状固体を得た。これをＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（１．９×９２ｃｍ）にアプライし、１分画が１０ｍｌとなるように１００％メタノールで溶出し分画した。同カラムおよびＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０カラムにてクロマトを繰り返し、活性画分を減圧濃縮した。得られた活性化合物（１０９．０ｍｇ）は、アルカロイドの呈色試薬であるドラーゲンドルフに陽性であり、ＴＬＣ上においてシングルスポットであった。
【００２６】
粉防已中の活性本体はｂｉｓｂｅｎｚｙｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ系アルカロイドであるＦａｎｇｃｈｉｎｏｌｉｎｅであった（下記式）。ＦａｎｇｃｈｉｎｏｌｉｎｅのＨＤＣに対する阻害活性を測定した結果、ＩＣ５０値は９４．３μｇ／ｍＬであった。またＨＤＣに対する阻害様式と阻害定数をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｐｌｏｔにより検討した結果、阻害様式は拮抗阻害でありＫｉ値は１６７μＭであった。
【００２７】
【化２】
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】熱水抽出画分とアルカロイド画分のＨＤＣ阻害活性の測定結果を示す。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５０５０２９４５８
【氏名又は名称】足立 伊左雄
【識別番号】５０５０２９４６９
【氏名又は名称】加藤 敦
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| 【出願日】 |
平成１６年１２月２０日（２００４．１２．２０） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１００１１５４０６
【弁理士】
【氏名又は名称】佐鳥 宗一
【識別番号】１０００７４１１４
【弁理士】
【氏名又は名称】北川 富造
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| 【公開番号】 |
特開２００６−１７６４８０（Ｐ２００６−１７６４８０Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１８年７月６日（２００６．７．６） |
| 【出願番号】 |
特願２００４−３８２７１０（Ｐ２００４−３８２７１０） |
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