| 【発明の名称】 |
二形性真菌の酵母型生育誘導剤 |
| 【発明者】 |
【氏名】松本 達二
【氏名】三上 健
【氏名】渡部 俊彦
【氏名】小笠原 綾子
【氏名】又平 芳春
【氏名】三澤 義知
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| 【要約】 |
【課題】安全性が高く、充分な真菌症の諸症状改善効果を期待できる二形性真菌の酵母型生育誘導剤を提供する。
【解決手段】形態二形性を示す二形性真菌の菌糸型生育に起因する真菌感染症の諸症状を軽減、改善すべく、有効量のキトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物、グルクロン酸、グルコサミニトール、ラクトシルアミン、ガラクトシルラクトサミン及びそれらの塩から選ばれた少なくとも１種を混入せしめることで、その二形性真菌の菌糸型生育を抑制し、酵母型生育を誘導する。前記オリゴ糖及びオリゴ糖の還元物は、その糖重合度が２〜８であるであることが好ましい。また、上記二形性真菌がカンジダ症の起因菌であるカンジダ属真菌、特にカンジダ アルビカンス（Candida albicans）であれば、カンジダ症の諸症状を軽減し、改善することができる。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生育細胞において酵母型と菌糸型との形態二形性を示す二形性真菌の酵母型生育誘導剤であって、キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物、グルクロン酸、グルコサミニトール、ラクトシルアミン、ガラクトシルラクトサミン及びそれらの塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする二形性真菌の酵母型生育誘導剤。
【請求項２】
前記キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物は、その糖重合度が２〜８である請求項1記載の二形性真菌の酵母型生育誘導剤。
【請求項３】
前記二形性真菌が、カンジダ属に属する真菌である請求項1又は２記載の二形性真菌の酵母型生育誘導剤。
【請求項４】
前記二形性真菌が、カンジダ アルビカンス（Candida albicans）である請求項1〜３記載の二形性真菌の酵母型生育誘導剤。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物、グルクロン酸、グルコサミニトール、ラクトシルアミン、ガラクトシルラクトサミン及びそれらの塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有する二形性真菌の酵母型生育誘導剤に関する。より詳しくは、生育細胞において酵母形と菌糸形との形態二形性を示す二形性真菌について、その菌糸型生育を抑制する二形性真菌の酵母型生育誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
形態二形性を示す、いわゆる二形性真菌は、栄養増殖時において、単球あるいは楕円球状の酵母様に増殖する酵母型生育と、フィラメント状の菌糸様に増殖する菌糸型生育との双方の生育形態を可逆的に転換して増殖することができる。
【０００３】
このような生育形態の可逆的な転換は、二形性真菌細胞がおかれる環境中、ｐＨ、栄養分、物理的因子等の特定の環境因子あるいはその変化によって誘導されることから、それらの二形性真菌が進化の過程で環境に適応するために獲得し維持している形質であると考えられている。したがって、その環境応答現象の統一的なメカニズムは明らかとされていないが、これらの二形性真菌に広く保存された機構が存在していると考えられている。
【０００４】
一般に、真菌は、健常者に対して病原性が低いものの、体の抵抗力が弱ったり、体内の常在菌叢のバランスが崩れたときに感染症を引き起こす、いわゆる日和見感染症の原因菌となることが多い。
【０００５】
真菌の感染症では、寄生組織に付着した真菌が増殖し組織を侵食することによってその症状が引き起こされるのが一般的であり、皮膚や爪などに発生する表在性真菌症や、皮下組織、消化管、肺等の内臓、又は、全身性に、体の深部組織を侵襲する内臓真菌症（深在性真菌症）などに分類される。内臓真菌症は重篤な基礎疾患や制癌剤等のために抵抗力が著しく低下している患者等に発症する場合が多い。
【０００６】
人に病原性を示し、難治性の、あるいは、重篤な感染症を引き起こす病原性真菌としてはカンジタ属、アスペルギルス属、クリプトコックス属、トリコスポロン属等に属するものが代表的に挙げられ、カンジタ属、アスペルギルス属に属する真菌は上述の二形性真菌であることが知られている。
【０００７】
これらのうちカンジダ症の起因菌であるカンジダ アルビカンス（Candida albicans）に代表されるカンジダ属真菌は、健常人に症状を引き起こすことなく寄生している人の常在菌であり、その真菌症の発症時には、その付着、侵食部位の皮膚上、消化管、口腔、肺、眼内組織、女性の膣内、血液やリンパ液中等の組織に寄生した真菌が増殖し組織を侵食することによって症状が引き起こされ、時に重篤な症状となることもある。
【０００８】
二形性真菌では、その菌糸型の形態的特徴から、菌が寄生する組織への機械的侵襲は菌糸型生育時において誘発されるものと考えられている。また、カンジダ アルビカンス（Candida albicans）では、薬剤によってその菌糸型生育が誘発されるように遺伝子改変された変異株を用いて、その菌糸型生育時にマウスに対する病原性が促進され、一方、その酵母型生育を誘導することによって病原性が抑制されることが報告されている（下記非特許文献１参照）。したがって、生育状態を酵母型に誘導することで、菌が寄生する組織への付着や機械的侵襲性を抑制し、菌の病原性を抑止することができると期待されている。
【０００９】
二形性真菌の生育状態を酵母型に誘導する試みとしては、下記特許文献１に、酵母形細胞と菌糸形細胞とに可逆的に転換する二形性真菌がカンジダ属である場合に、ファルネゾール、ファルゾネエイト、ファルネシル アセテイト、ファルネセン、またはネロリドールを成分中に含んでいることを特徴とする二形成真菌であるカンジダ属に対する形態転換制御活性機能剤が開示されている。
【００１０】
上記ファルネゾール等は、植物等に含まれる芳香性精油の成分であり、直鎖状の不飽和炭化水素を主鎖に有する炭素数１５のドデカトリエン又はドデカテトラエン構造を有する化合物である。
【００１１】
一方、カニ、エビ等の甲殻類の殻等から調整することができる天然素材であるキチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを構成糖とする直鎖状の重合構造をその基本構造としてなる天然多糖類である。また、キトサンは、キチンに構成的に含まれるＮ−アセチル残基を加水分解、除去して得られる多糖類であり、Ｄ−グルコサミン（２−アミノ−Ｄ−グルコース）を構成糖とする直鎖状の重合構造をその基本構造としてなる天然多糖類である。
【００１２】
そのキチンやキトサンのβ−１，４グルコシド結合を加水分解して得られるオリゴ糖であるキチンオリゴ糖又はキトサンオリゴ糖は、構成糖の重合度が２〜数十程度のオリゴ糖の総称であり、天然素材としての様々な利用・応用が期待されている。
【００１３】
例えば、キトサンオリゴ糖の抗菌活性について、下記特許文献２及び特許文献３には、キトサンオリゴ糖を有効成分とする齲蝕予防・抑制剤が開示されている。また、下記特許文献４には、本出願人によって、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖及びその塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする肝機能障害予防改善剤が開示されている。
【００１４】
また、下記特許文献５には、キトサンオリゴ糖の特性を失うことなく、着色を防止し、特に水溶液状態での安定性を高めた還元キトサンオリゴ糖（キトサンオリゴ糖アルコール体）も提案されている。そして、下記特許文献６には、原料に由来する部分アセチル化キトオリゴ糖などの不純物を効率よく除去することができると共に製造過程におけるキトサンオリゴ糖の着色を防止することができ、高純度のキトサンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖アルコール体を効率よく製造できる方法が開示されている。
【００１５】
更に、下記特許文献７には、Ｎ−アセチルグルコサミンのアルコール体であるＮ−アセチルグルコサミニトール、及び／又は、キトオリゴ糖の還元物を含有する新規な食品素材、特に非う蝕及び難消化性の特性を有する新規な食品素材が開示されている。
【非特許文献１】Stephan P. Saville et al. Eukaryotic Cell, 2003 Vol.2 (5) p.1053-1060
【特許文献１】特許第３０５６７３０号公報
【特許文献２】特開２００４−９１４１３号公報
【特許文献３】特開２００４−２５６５５７号公報
【特許文献４】特開平１０−２８７５７２号公報
【特許文献５】特公平４−７４３５８号公報
【特許文献６】特開２００３−２１２８８９号公報
【特許文献７】特許第２５２９１６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
真菌は真核生物でありその細胞生理上の基本機構が高等生物と類似していることから、抗真菌活性を有する化合物は人等の細胞にも作用してしまうという問題がある。したがって、真菌に対して選択的に作用し副作用の少ない抗真菌剤を得ることには、その細胞生理上の基本機構が高等生物とは異なる細菌に対する化合物（いわゆる抗生物質）と比べて、一般に困難性が伴う。
【００１７】
従来からの抗真菌剤は真菌の細胞の増殖を抑制し、あるいは、真菌の細胞を死滅せしめる抗真菌活性を有する化合物であり、その活性は高いものの、上記理由から副作用の問題や、また、耐性菌の面から長期の投薬には適さないという問題があった。
【００１８】
本発明は上記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は安全性が高く、充分な真菌症の諸症状改善効果を期待できる二形性真菌の酵母型生育誘導剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、生育細胞において酵母形と菌糸形との形態二形性を示す二形性真菌について、その菌糸型生育を、キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖還元物などの特定の糖類によって抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
すなわち、本発明の二形性真菌の酵母型生育誘導剤は、生育細胞において酵母型と菌糸型との形態二形性を示す二形性真菌の酵母型生育誘導剤であって、キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物、グルクロン酸、グルコサミニトール、ラクトシルアミン、ガラクトシルラクトサミン及びそれらの塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする。
【００２１】
本発明によれば、真菌細胞が増殖するために必要な細胞外部からの栄養源に、有効量の上記特定の糖類を混入せしめることで、二形性真菌の菌糸型生育を抑制し酵母型生育を誘導することができる。
【００２２】
本発明においては、上記キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物は、その糖重合度が２〜８であることが好ましい。これによれば、活性の低いキトサンオリゴ糖及びキチンオリゴ糖が除かれているので、より比活性の高いものとすることができる。
【００２３】
上記二形性真菌が、カンジダ属に属する真菌であれば、本発明の真菌の酵母型生育誘導剤を効果的に用いることができる。
【００２４】
また、上記二形性真菌が、カンジダ アルビカンス（Candida albicans）であれば、本発明の二形性真菌の酵母型生育誘導剤を更に効果的に用いることができる。
【００２５】
すなわち、これらによれば、カンジダ属に属する真菌、特にカンジダ アルビカンス（Candida albicans）の菌糸型生育に起因する真菌感染症の諸症状を、軽減し、改善することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の二形性真菌の酵母型生育誘導剤を用いることにより、二形性真菌が菌糸型の生育形態で増殖することを抑制することができ、これらの二形性真菌の病原性を抑制し、これらの二形性真菌に起因される感染症、例えば二形性真菌がカンジダ属真菌であればカンジダ症の諸症状を軽減し、改善する効果が期待できる。また、安全性の高い糖類なので、医薬品、飲食品、うがい薬、皮膚塗布用クリーム、化粧料、飼料、餌料、農薬等に添加して常用的に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明において、キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物は、カニ、エビ等の甲殻類の殻等から常法によって調製されるキチンを、化学的又は生化学的に処理することによって得ることができる。その際、本出願人による上記特許文献４又は特許文献６に開示される方法によれば、より好適に製造することができる。
【００２８】
すなわち、キトサンオリゴ糖は、キチンを熱濃アルカリ処理して得られるキトサンを部分加水分解して得られるキトサンの部分加水分解物を、塩酸、酢酸、蟻酸等の酸とともに加熱した後、酸を除去するか、又は中和脱塩し、結晶化等により粉末化するか、あるいは、希酸に溶解後、キトサナーゼ、D-グルコサミニダーゼ等のキトサン分解酵素を作用させる等の方法によって得ることができる。また、キチンオリゴ糖は、キチンを酸又は酵素によって部分加水分解して得ることができる。
【００２９】
キトサンオリゴ糖及びキチンオリゴ糖を還元処理して末端構成糖が糖アルコール体である還元物（オリゴ糖アルコール体）とする方法は、公知の方法を採用できるが、例えば Campbell, B. J. et al: J. Chromatogr., 622, 137-146（1993）に記載された方法に従って水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を用いる方法や、P. Karrer and J. Meyer: Helvetica, 20, 626（1937）、又は Yoshio Matsushita: Bull. Chem. Soc. Jpn., 24, 144-147（1950）に記載された金属触媒による水素還元法を用いることができる。
【００３０】
上記のようにして得られたキトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物は、必要に応じてカラムクロマトグラフィーや溶剤分画等の方法によって分画、精製することにより、所望の平均分子量のものを高濃度に含有する組成物を得ることができる。
【００３１】
本発明に用いられるキトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物は、低分子化されているオリゴ糖であればよいが、好ましくは平均分子量２００〜４，０００のものが用いられ、より好ましくは平均分子量６００〜１，４００のものが用いられる。
【００３２】
例えば、「ＣＯＳ−ＹＳ」（商品名、焼津水産化学工業株式会社製）は、上記の方法によって得られ、キトサンオリゴ糖の重合度が２〜８程度の混合物、すなわちキトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオース、キトヘキサオース、キトヘプタオース、キトオクタオース等の混合物であり、好ましく用いることができる。また、重合度が２〜６の混合物であればより好ましい。
【００３３】
また、例えば、「NA-COS-Y」（商品名、焼津水産化学工業株式会社製）は、上記の方法によって得られ、Ｎ−アセチルグルコサミンと、重合度が２〜８程度のキチンオリゴ糖、すなわちＮ−アセチルキトビオース、Ｎ−アセチルキトトリオース、Ｎ−アセチルキトテトラオース、Ｎ−アセチルキトペンタオース、Ｎ−アセチルキトヘキサオース、Ｎ−アセチルキトヘプタオース、Ｎ−アセチルキトオクタオース等の混合物であり、好ましく用いることができる。また、重合度が２〜５の混合物であればより好ましい。
【００３４】
本発明においては、上記のようにオリゴ糖又はオリゴ糖の還元物を混合物の状態で使用することもできるが、カラムクロマトグラフィーや溶剤分画等の方法によって所望の重合度のものに更に分画、精製してもよい。その際、本出願人による上記特許文献６に開示される方法によれば、より好適に製造することができる。
【００３５】
上記方法により調整されたキトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物は、調整後に大量の塩類を含む場合は脱塩処理することが好ましい。脱塩の方法は、公知の方法を採用できるが、ＮａＣｌ阻止率が５５．０〜９９．５％のＲＯ膜を用いて行なうことが好ましい。また、イオン交換クロマトグラフィーにより分画、精製した各画分に含まれる溶液が塩又はアルカリを呈する場合は、中和した後に脱塩処理することが好ましい。
【００３６】
一方、グルコサミンの糖アルコール体であるグルコサミニトールは、グルコサミンを上述の還元方法で還元することにより得ることができる。グルコサミンの由来については特に制限されないが、例えばキチンの酸による完全加水分解や、特開２００４−２８３１４４号公報に開示されているクロロウィルスを用いた発酵法により得ることができる。
【００３７】
また、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）はグルコースの６位の炭素がカルボキシル基を構成する単糖であって、ヒアルロン酸、コンドロイチン、フコイダン等の構成糖として、動植物界において広く分布しており、これらを含む天然物からの抽出、分解による方法、又は、合成法、発酵法等によって得ることができるが、その由来、製法は特に制限されるものではない。グルクロン酸、グルクロン酸アミドやグルクロン酸ナトリウム等は医薬品原料としても市販されており、それらを用いても良い。
【００３８】
また、ラクトシルアミン（Ｌａｃ−ＮＨ２）はラクトースを構成するグルコースの１位の炭素にアミノ基を有する二糖類であって、例えば、ラクトースを水、又はＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）等の溶媒に溶解し、過剰量の炭酸水素アンモニウムを添加することによって得ることができる。
【００３９】
更に、ガラクトシルラクトサミン（Galb1-4Ｇalb1-4GlcＮ）は、２個のガラクトースと１個のグルコースがβ−１，４グルコシド結合によって直鎖状に構成される重合度３のオリゴ糖であって、そのグルコースの２位の炭素にアミノ基を有する３糖類であって、例えば、ラクトースとグルコサミン混合水溶液にBacillus circulans由来のβ‐ガラクトシダーゼを添加することにより得られる。
【００４０】
本発明の二形性真菌の酵母型生育誘導剤においては、上記の手段によって得られるキトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物、グルクロン酸、グルコサミニトール、ラクトシルアミン、ガラクトシルラクトサミンを有効成分とすることができる。
【００４１】
上記有効成分は、遊離体であってもよく、また、その活性に影響を与えない限りで塩を形成したものであってもよい。塩としては、各種無機塩や有機酸塩等であって、例えば、キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、グルコサミニトール、ラクトシルアミン、ガラクトシルラクトサミンであれば、塩酸塩、乳酸塩、酢酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩等が挙げられ、グルクロン酸であれば、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられるが、特に最終製品の塩形態を限定するものではない。
【００４２】
本発明の二形性真菌の酵母型生育誘導剤を真菌感染の予防改善に用いる場合は、上記有効成分を、医薬品、飲食品、うがい薬、皮膚塗布用クリーム、化粧料、飼料、餌料、農薬等に添加、配合して用いることができる。また、上記有効成分として実質上直接摂取又は投与することもできる。
【００４３】
例えば、人に医薬用として使用する場合、経口、肺への吸入、皮膚上への塗布、外粘膜への塗付等の各種の投与方法のいずれかを採用して、有効量の上記有効成分を真菌の細胞が増殖するために必要な細胞外部からの栄養源に混入せしめ、その菌糸型生育を抑制し二形性真菌の酵母型生育を誘導することができる。
【００４４】
なお、その場合、医薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加剤を用いて、噴霧剤、皮膚塗布用クリーム剤、徐放性製剤、散剤、錠剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤等の製剤とすることができる。また、安定剤、増粘剤、増量剤、着色剤及び芳香剤の様な補助的添加剤を含有してもよい。
【００４５】
上記有効成分の１日当りの投与、摂取、塗布量は種々の条件により異なるが、各々体重１ｋｇ当たり、経口の場合０．１〜３００ｍｇ、肺への吸入の場合０．１〜３００ｍｇ、皮膚上への塗布の場合１０〜１，５００ｍｇ、外粘膜への塗付の場合１０〜１，５００ｍｇが好ましく、経口の場合１〜３０ｍｇ、肺への吸入の場合１〜３０ｍｇ、皮膚上への塗布の場合１０〜１５０ｍｇ、外粘膜への塗付の場合１０〜１５０ｍｇがより好ましい。また、うがい薬の場合は、上記有効成分を、好ましくは０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌ含有する溶液で口腔内を一定時間浸すように用いればよい。
【００４６】
なお、キトサンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖の還元物、キチンオリゴ糖、キチンオリゴ糖の還元物の安全性については、既に確認されているところであるが、本出願人による試験においても、ラットにおける経口投与での急性毒性は、両者ともＬＤ50＞5g／kg以上であり、その安全性が確認されている。
【００４７】
また、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、グルコサミニトール、ラクトシルアミン（Ｌａｃ−ＮＨ２）、ガラクトシルラクトサミン（Galb1-4Ｇalb1-4GlcＮ）についても、その毒性は低く、人の医薬用として使用する場合は適宜その有効性を鑑みて投与、摂取すればよい。
【００４８】
一方、上記有効成分を、飲食品、飼料、餌料、化粧料等に配合して使用することもできる。その場合、飲食品、飼料、餌料、化粧料等のそれぞれの主目的に対して影響を与えない程度に配合することが好ましい。具体的には、それらへの固形分当りの配合量としては、飲食品、飼料、餌料で０．０１〜８０重量％、化粧料で０．０１〜４０重量％が好ましい。なお、上記有効成分はいずれも容易に水に溶解するので、添加、配合が容易である。
【００４９】
本発明の二形性真菌の酵母型生育誘導剤を適用する二形性真菌としては、生育細胞において酵母形と菌糸形との形態二形性を示す二形性真菌であればよいが、そのようなものの例として、カンジダ属に属する真菌のほかにも、アスペルギルス属、スポロトリックス属が例示できる。
【実施例】
【００５０】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
<試験例１>
（カンジダ アルビカンスの生育形態に対するキトサンオリゴ糖の影響）
所定重合度のキトサンオリゴ糖のそれぞれについて、その酵母型生育誘導について比較した。また、対照としてＤ−グルコサミン（２−アミノ−Ｄ−グルコース；ＧｌｃＮ）について比較した。
【００５２】
各キトサンオリゴ糖には、上記低糖重合度のキトサンオリゴ糖混合物である「ＣＯＳ―ＹＳ」（商品名、焼津水産化学工業株式会社製）を、イオン交換カラムクロマトグラフィーによって所定の重合度のものに分画、精製したキトビオース（ＣＯＳ２）、キトトリオース（ＣＯＳ３）、キトテトラオース（ＣＯＳ４）、キトペンタオース（ＣＯＳ５）、キトヘキサオース（ＣＯＳ６）の塩酸塩を用いた。なお、その純度はいずれも９７．５％以上であり、それぞれその活性に影響を与えない範囲の濃度で所定の重合度以外のキトサンオリゴ糖を含有するものであった。
【００５３】
これらキトサンオリゴ糖（ＣＯＳ２−６）、あるいは、対照としてＤ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）をカンジダ アルビカンスの液体栄養培地であるＲＰＭＩ１６４０（グルコースを０．２％含有）（日水製薬株式会社製）に配合し、予め、サブロー培地（ペプトン１％、グルコース４％、ｐＨ５．６〜５．８）を用いて２７℃で振とう培養することで酵母型に生育調整したカンジダアルビカンスを１×１０５ （cells/ml） の細胞濃度で植菌し、３７℃、５％ＣＯ２の好気的条件下で一晩培養後、菌の形態を顕微鏡下に観察し酵母型生育菌の菌数を測定した。形態の判定については、単球もしくは楕円球状の菌体を酵母型、糸状の菌体を菌糸型として、変態過程の細胞であるGerm tubeをもつ菌体については母細胞である酵母型の直径よりも長い場合は菌糸型、それ以外を酵母型とした。なお、各キトサンオリゴ糖を配合した培養液の７．２〜７．５であり、中性付近のｐＨであった。
【００５４】
液体栄養培地であるＲＰＭＩ１６４０に配合するキトサンオリゴ糖（ＣＯＳ２−６）、あるいは、Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）の配合濃度を、その重量を一定として（Ａ）最終濃度２０ｍｇ／ｍｌ、あるいは、そのモル濃度を一定として（Ｂ）最終濃度１０ｍＭとし、酵母型生育菌の菌数の総菌数に対する割合を酵母型生育誘導活性として比較した。
【００５５】
その結果を表1に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】
表１に示すように、何も添加しない場合は、酵母型生育を示す菌の割合は０．１％程度であり、この培養条件下においてはカンジダ アルビカンスが菌糸型生育によって増殖していることが分かる。また、対照であるＤ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）を添加した場合においても、酵母型生育を示す菌の割合は配合濃度条件（Ａ）の重量濃度一定の条件下で８．０％、（Ｂ）のモル濃度一定の条件下で０．４％であり、その生育形態にほとんど変化は見られなかった。
【００５８】
それに対して、キトサンオリゴ糖（ＣＯＳ２−６）を添加した場合においては、酵母型生育を示す菌の割合は配合濃度条件（Ａ）の重量濃度一定の条件下で１００％、（Ｂ）のモル濃度一定の条件下で４３．５〜１００％であり、キトサンオリゴ糖に有為な酵母型生育誘導活性がみとめられた。また、特にＣＯＳ３やＣＯＳ４において酵母型生育を示す菌の割合が高く、オリゴ糖の重合度に依存した酵母型生育誘導活性がみられた。
【００５９】
<試験例２>
（カンジダ アルビカンスの生育形態に対するキチンオリゴ糖の影響）
所定重合度のキチンオリゴ糖のそれぞれについて、その酵母型生育誘導について比較した。また、対照としてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）について比較した。
【００６０】
各キチンオリゴ糖には、上記低糖重合度のキチンオリゴ糖混合物である「ＮＡＣＯＳ―Ｙ」（商品名、焼津水産化学工業株式会社製）を、活性炭カラムクロマトグラフィーによって所定の重合度のものに分画、精製したＮ−アセチルキトビオース（ＮＡＣＯＳ２）、Ｎ−アセチルキトトリオース（ＮＡＣＯＳ３）、Ｎ−アセチルキトテトラオース（ＮＡＣＯＳ４）、Ｎ−アセチルキトペンタオース（ＮＡＣＯＳ５）を用いた。なお、その純度はいずれも９７．５％以上であり、それぞれその活性に影響を与えない範囲の濃度で所定の重合度以外のキチンオリゴ糖を含有するものであった。
【００６１】
これらキチンオリゴ糖（ＮＡＣＯＳ２−５）、あるいは、対照としてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を用いて、試験例１と同様の試験を行った。なお、各キチンオリゴ糖を配合した培養液のｐＨは７．２〜７．３であり、中性付近のｐＨであった。酵母型生育誘導活性を比較した結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
【００６３】
表２に示すように、対照であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を添加した場合において、酵母型生育を示す菌の割合は配合濃度条件（Ａ）の重量濃度一定の条件下で７．１％、（Ｂ）のモル濃度一定の条件下で６．４％であり、その生育形態にほとんど変化は見られなかった。また、重合度２、３のＮＡＣＯＳ２やＮＡＣＯＳ３を添加した場合においても、酵母型生育を示す菌の割合は低かった。
【００６４】
それに対して、キチンオリゴ糖（ＮＡＣＯＳ４、５）を添加した場合においては、酵母型生育を示す菌の割合は（Ａ）の重量濃度一定の条件下でそれぞれ２５．８％、２６．８％、（Ｂ）のモル濃度一定の条件下でそれぞれ２４．４、２１．９％であり、重合度４、５のキチンオリゴ糖には、試験例１でのキトサンオリゴ糖の活性よりは弱いものの、有意な酵母型生育誘導活性がみとめられた。
【００６５】
<試験例３>
上記試験例１において高比活性を示したＣＯＳ３について、液体栄養培地に添加する配合濃度を、３、６、１２ｍｇ／ｍｌとし、試験例１と同様の試験を行い、その酵母型生育誘導活性の配合濃度依存性を検討した。また、ＣＯＳ３の構成糖であるＤ−グルコサミンの分子内ヘミアセタール性を失ったＣＯＳ３の還元物であるキトトライオールの塩酸塩についても検討した。その結果を表３に示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
表３に示すように、ＣＯＳ３の添加量を増加させることで、酵母型生育を示す菌の割合を増加させることができることが明らかとなった。また、その活性よりは弱いものの、キトトライオールについても酵母型生育誘導活性がみとめられた。
【００６８】
<試験例４>
種々の糖関連化合物について試験例１と同様の試験を行い、酵母型生育誘導活性を検討し、その活性を何も添加しない対照に対して相対評価した。
【００６９】
【表４】
【００７０】
表４に示すように、重合度３のオリゴ糖の末端構成糖のグルコースの２位にアミノ基を有するガラクトシルラクトサミン（Galb1-4Ｇalb1-4GlcＮ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、グルコサミンの糖の還元物であるグルコサミニトール（ＣＨ１Ｈ）、又は糖重合度２−５のキトサンオリゴ糖の還元物（ＣＨ２Ｈ−ＣＨ５Ｈ）、ラクトシルアミン（Ｌａｃ−ＮＨ２）において、有意な酵母型生育誘導活性がみとめられた。ここで、糖重合度２〜５の各キトサンオリゴ糖の還元物（ＣＨ２Ｈ〜ＣＨ５Ｈ）は、上記キトサンオリゴ糖ＣＯＳ２〜６やキチンオリゴ糖ＮＡＣＯＳ２〜５と同様に、糖重合度２−５程度に調整されたキトサンオリゴ糖の還元物を、更に、クロマトグラフィーによって分子量分画することで調製したものである。
【００７１】
なお、表４に示すオリゴ糖の略式構成構造においては、オリゴ糖が、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はグルコサミン塩酸塩（ＧｌｃＮＨＣｌ）を構成糖として有し、それらが相互にβ−１，４グルコシド結合（β１―４）あるいはα―１，６グルコシド結合（α１―６）して構成されたものであることを示す。また、ＧｌｃＡＮ（6COOH-GlcNHCl）とはグルコサミン酸である。
【００７２】
<試験例５>
グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、キトサンオリゴ糖の還元物（ＣＨ４Ｈ及びＣＨ５Ｈ）、ラクトシルアミン（Ｌａｃ−ＮＨ２）について、液体栄養培地に添加する配合濃度を、０．１、１、１０ｍｇ／ｍｌとし、試験例１と同様の試験を行い、酵母型生育誘導活性を検討した。
【００７３】
【表５】
【００７４】
表５に示すように、ラクトシルアミン（Ｌａｃ−ＮＨ２）とキトサンオリゴ糖の還元物（ＣＨ４Ｈ及びＣＨ５Ｈ）においては１０ｍｇ／ｍｌまで濃度依存的な酵母型生育誘導活性がみられた。一方、アミノ基を持たないグルクロン酸（ＧｌｃＡ）は１０ｍｇ／ｍｌでは活性が見られるものの、１ｍｇ／ｍｌの濃度では活性がみられず、構成糖にアミノ基を有する他のものよりその比活性が弱いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、医薬品、飲食品、うがい薬、皮膚塗布用クリーム、化粧料、飼料、餌料、農薬等に添加して使用することができる二形性真菌の酵母型生育誘導剤を提供することができる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】３９００３３１４５
【氏名又は名称】焼津水産化学工業株式会社
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| 【出願日】 |
平成１６年１１月３０日（２００４．１１．３０） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００８６６８９
【弁理士】
【氏名又は名称】松井 茂
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| 【公開番号】 |
特開２００６−１５１８９３（Ｐ２００６−１５１８９３Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１８年６月１５日（２００６．６．１５） |
| 【出願番号】 |
特願２００４−３４６４６２（Ｐ２００４−３４６４６２） |
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