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【発明の名称】 ハスの破砕物または抽出物を含む抗アレルギー剤
【発明者】 【氏名】後藤 清
【住所又は居所】埼玉県さいたま市大字小深作字小深作前３４１番地 株式会社トーヨー技術研究所内

【氏名】和合 治久
【住所又は居所】埼玉県狭山市北入曽１３６３番地 有限会社生体機能研究所内
【要約】 【課題】ハスの破砕物または抽出物を含む抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー食品。

【解決手段】本発明は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー食品。抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー用食品は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患の改善、治療を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー剤。
【請求項２】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせが、レンコンの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせである請求項１記載の抗アレルギー剤。
【請求項３】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー用食品添加剤。
【請求項４】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー用食品。
【請求項５】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせが、レンコンの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせである請求項４記載の抗アレルギー用食品。
【請求項６】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む花粉症改善剤。
【請求項７】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む花粉症改善用食品添加剤。
【請求項８】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む花粉症改善用食品。
【請求項９】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む血清中ＩｇＥ濃度低下剤。
【請求項１０】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む血清中ＩｇＥ濃度低下用食品添加剤。
【請求項１１】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む血清中ＩｇＥ濃度低下用食品。
【請求項１２】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むＩＬ−４産生抑制剤。
【請求項１３】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むＩＬ−４産生抑制用食品添加剤。
【請求項１４】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むＩＬ−４産生抑制用食品。
【請求項１５】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むＴＮＦ産生抑制剤。
【請求項１６】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むＴＮＦ産生抑制用食品添加剤。
【請求項１７】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むＴＮＦ産生抑制用食品。
【請求項１８】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む粉類から製造される、パン、ケーキ、クッキーおよびせんべいからなる群から選択される食品。
【請求項１９】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むヨーグルト。
【請求項２０】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む即席麺、即席みそ汁および即席スープからなる群から選択される即席食品。
【請求項２１】
ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むもち。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハス（Ｎｅｌｕｍｂｏｉｄｅａ ｎｕｃｉｆｅｒａ）の破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー用食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、多くの先進国では、花粉症、気管支喘息あるいはアトピー性皮膚炎などのＩ型アレルギー反応による疾患が増加しており、社会問題となっている。
Ｉ型アレルギー反応には、人間の持つ５種類の抗体の中で、特にＩｇＥと称される抗体が深く関与しており、アレルギー体質の者はこの抗体をアレルギー体質でない正常人よりも多く産生する傾向がある。ＩｇＥの産生は、タイプ２のヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ２）に由来するインターロイキン４（ＩＬ−４）やインターロイキン１３（ＩＬ−１３）によって促進されるが、近年、タイプＩのヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ１）に由来するインターロイキン２（ＩＬ−２）やインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）によってこれが抑制されることが報告されている。従って、ＩｇＥ産生を抑制し、アレルギー体質を改善するには、ＩＬ−４やＩＬ−１３の産生を抑制すること、またはＩＬ−２やＩＦＮ−γの産生を促すことが重要である。また、Ｉ型アレルギー反応にはＴＮＦ（腫瘍壊死因子）も関与しているので、ＴＮＦの産生を抑制することも炎症反応の抑制に有効である。
【０００３】
上述のようなＩ型アレルギー反応による疾患を改善するために、医薬品として、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤、ステロイド剤などが開発され使用されている。これらの薬品は、長期投与による症状悪化（リバウンド現象）、中枢神経に作用することによる眠気、経皮吸収による内分泌系への影響、などの副作用を伴う場合がある。
【０００４】
一方で、副作用がなく安全に上記疾患を改善することを目的として、従来食されている食品から、抗アレルギー作用を有するものが探索されている（特開昭６１−２９１５２４、特開平１−１２１２１７、特開平７−２１５８８４等参照）。また、すでに上市されており、広く認知されているものとしては、甜茶（Ｒｕｂｕｓｓｕａｖｉｓｓｉｍｕｓ）の茶葉から熱水抽出された甜茶エキス、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）の葉から熱水抽出された、シソ葉エキスなどがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、医薬品として使用されている化合物は、上述のように副作用を有する場合が多いという問題がある。また、甜茶エキス、シソ葉エキスのように食品由来の抗アレルギー素材もあるが、これらとは異なる作用機序、より有効な薬効、および／または経済的優位性といった観点から、これら以外の食品に由来する抗アレルギー素材が求められている。
本発明者らは、レンコンの破砕物または抽出物が抗アレルギー作用を有することを見出し、これに基づいて本発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー食品を提供する。
また、本発明は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、花粉症改善剤、花粉症改善用食品添加剤および花粉症改善用食品を提供する。
さらに、本発明は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、血清中ＩｇＥ濃度低下剤、血清中ＩｇＥ濃度低下用食品添加剤および血清中ＩｇＥ濃度低下用食品を提供する。
また、本発明は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むＩＬ−４産生抑制剤、ＩＬ−４産生抑制用食品添加剤およびＩＬ−４産生抑制用食品を提供する。
さらに、また、本発明は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むＴＮＦ産生抑制剤、ＴＮＦ産生抑制用食品添加剤およびＴＮＦ産生抑制用食品を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、「ハス」とは、スイレン科（Ｎｙｍｐｈａｅａｃｅａｅ）、ハス亜科（Ｎｅｌｕｍｂｏｉｄｅａｅ）に属するＮｅｌｕｍｂｏｉｄｅａ ｎｕｃｉｆｅｒａをいう。当該ハスの地下茎は、一般に「レンコン」と称され市販されている。
また、本発明において破砕物または抽出物とされるハスとしては、ハスの植物体の任意の部分を使用することができ、例えば、ハスの地下茎（レンコン）、茎、葉、根、実等またはこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、破砕物または抽出物として使用されるハスは、ハスの地下茎、茎、葉もしくは根、またはこれらの組み合わせであり、より好ましくはハスの地下茎、茎もしくは葉、またはこれらの組み合わせであり、さらにより好ましくはハスの地下茎である。
【０００８】
ハスの破砕物は、ニーダー、ミキサー、破砕機をはじめとする任意の装置を用いた任意の方法で、ハスを破砕処理することにより調製することができる。破砕処理は、水などの溶媒を添加して行っても良いし、ハスのみが破砕処理されるような態様であっても良い。本発明におけるハスの破砕物は、ハスを破砕処理して得られるそのものであっても良いし、その後に加熱および／または脱水処理されたものであっても良い。好ましくは、ハスの破砕物は、ハスを破砕処理した後に加熱処理し、さらに乾燥処理することにより得られるもの、ハスを乾燥処理した後に破砕処理して得られるもの、ハスを加熱処理した後に破砕処理して得られるもの、ハスを加熱および乾燥処理（この加熱と乾燥の順序は問わない）した後に破砕処理して得られるものなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、破砕物は、ペースト、固体、粒状物、粉体、液体状（溶液、懸濁液など任意の状態を含む）など任意の形状であることができ、これらの形状を有する破砕物は、任意の公知の方法を用いて製造することができる。
【０００９】
本発明においてハスの抽出物とは、ハス中の成分を溶媒に移行させて抽出物を得るといった、いわゆる溶媒を用いた抽出処理により得られる抽出物に限定されるものではなく、ハスを圧搾して得られた絞り汁をはじめとする、ハス中の任意の成分を溶媒等を使用することなく直接的に取出して得られたものも本発明にいう抽出物である。また、抽出物は室温で調製されても良いし、加熱下で調製されても良い。例えば、ハスの抽出物の例としては、ハスの細切物または破砕物を圧搾して得られた絞り汁、ハスの細切物または破砕物を加熱圧搾して得られた絞り汁、ハスの細切物または破砕物を加熱下または非加熱下で溶媒抽出して得られた抽出物等が挙げられる。溶媒抽出する場合に使用可能な溶媒としては水、エタノール、プロピレングリコール、n-ブタノール、酢酸エチルおよびクロロホルムなどの１種または２種以上の単独あるいは混合溶媒などが挙げられる。好ましくは、抽出に使用される溶媒は水である。また、抽出物は必要に応じて濃縮あるいは濃縮乾固することができる。抽出物は、ペースト、固体、粒状物、粉体、液体状（溶液、懸濁液など任意の状態を含む）など任意の形状であることができ、これらの形状を有する抽出物は、任意の公知の方法を用いて製造することができる。本発明における、薬剤、食品添加剤及び食品においては、ハスの破砕物と抽出物はそれぞれ単独で含まれていても良いし、これら両方が含まれていても良い。
【００１０】
本発明の１態様は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー剤であるが、ここでの抗アレルギー剤は、アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療することができる薬剤であり、好ましくは、Ｉ型アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療できる薬剤である。より好ましくは、本発明の抗アレルギー剤は、花粉症（本発明において、花粉症とは、花粉によるアレルギー反応による症状をいい、主たる症状としては、例えば、鼻水、鼻づまり、くしゃみ、目のかゆみ、咽のかゆみ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。）、アトピー性皮膚炎をはじめとする皮膚炎、もしくは気管支喘息、またはこれらの組み合わせを改善、治療できる薬剤、すなわち花粉症改善剤、皮膚炎改善剤、アトピー性皮膚炎改善剤または気管支喘息改善剤である。さらにより好ましくは、本発明の抗アレルギー剤は花粉症改善剤である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー剤は、血清中のＩｇＥ濃度を低下させることができる血清中ＩｇＥ濃度低下剤である。さらに、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー剤はＩＬ−４産生抑制剤である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー剤はＴＮＦ産生抑制剤である。
本発明における抗アレルギー剤は経口投与、または筋肉内、皮内、皮下、静脈内、下部体腔、皮膚、鼻腔内、経口もしくは経鼻吸引投与などの非経口投与により投与され得る。本発明の抗アレルギー剤を製剤化するためには、製剤の技術分野における任意の通常の方法で製剤化することが可能であり、例えば、経口投与の場合には、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤などの剤型が採用されうる。また、経皮投与の場合には、軟膏剤、貼付剤、ローション剤、エアゾール剤などが挙げられる。すなわち、経口用固型製剤を調製する場合は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせに賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、糖衣錠剤などとすることができる。
【００１１】
本発明の抗アレルギー剤に含まれるハスの破砕物および抽出物の量は、本発明の抗アレルギー剤が効果を奏する限りは特に限定されるものではない。
本発明の抗アレルギー剤のヒトに対する投与量は、ハスの破砕物および抽出物の乾燥重量として、経口投与で、成人、１日あたり、破砕物の場合には、好ましくは、１ｇ〜１００ｇ、より好ましくは、２ｇ〜４０ｇである。また、抽出物の場合には、好ましくは、０．５ｇ〜５０ｇ、より好ましくは、１ｇ〜２０ｇである。
【００１２】
本発明の他の態様は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー用食品添加剤である。本発明における食品添加剤とは、食品に添加されるものであれば良く、その目的は問わない。ここでの抗アレルギー用食品添加剤は、当該食品添加剤を含む食品を摂取した者に対して、アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療することができる食品添加剤であり、好ましくは、Ｉ型アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療することができる食品添加剤である。より好ましくは、本発明の抗アレルギー用食品添加剤は、花粉症、アトピー性皮膚炎をはじめとする皮膚炎、もしくは気管支喘息、またはこれらの組み合わせを改善、治療できる食品添加剤、すなわち花粉症改善用食品添加剤、皮膚炎改善様食品添加剤、アトピー性皮膚炎改善用食品添加剤または気管支喘息改善用食品添加剤である。さらにより好ましくは、本発明の抗アレルギー用食品添加剤は花粉症改善用食品添加剤である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品添加剤は、血清中のＩｇＥ濃度を低下させることができる血清中ＩｇＥ濃度低下用食品添加剤である。さらに、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品添加剤はＩＬ−４産生抑制用食品添加剤である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品添加剤はＴＮＦ産生抑制用食品添加剤である。
【００１３】
本発明の抗アレルギー用食品添加剤を製造するためには、食品添加剤の技術分野における通常の方法で固体、顆粒、粉体、カプセル、溶液、懸濁物等の形態に製造することが可能である。
本発明の抗アレルギー用食品添加剤に含まれるハスの破砕物および抽出物の量は、食品に添加される当該食品添加剤の量、食品の種類などに応じて変化するものであり、特に限定されるものではない。
【００１４】
本発明の他の態様は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー用食品であるが、ここでの抗アレルギー用食品は、アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療することができる食品であり、好ましくは、Ｉ型アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療できる食品である。より好ましくは、本発明の抗アレルギー用食品は、花粉症、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎、もしくは気管支喘息、またはこれらの組み合わせを改善、治療できる食品、すなわち花粉症改善用食品、皮膚炎改善用食品、アトピー性皮膚炎改善用食品または気管支喘息改善用食品である。さらにより好ましくは、本発明の抗アレルギー用食品は花粉症改善用食品である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品は、血清中のＩｇＥ濃度を低下させることができる血清中ＩｇＥ濃度低下用食品である。さらに、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品はＩＬ−４産生抑制用食品である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品はＴＮＦ産生抑制用食品である。
【００１５】
本発明の抗アレルギー用食品としては、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含んでいるのであれば特に限定されるものではない。また、食品の種類としては、通常食品として摂取されるものであれば特に限定されるものではなく、いわゆる健康食品、サプリメント、栄養補助食品と呼ばれるような、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの形状を有する食品だけでなく、うどん、そば、パスタ、ラーメン等をはじめとする麺類、小麦粉、そば粉、片栗粉、米の粉等の粉類、菓子パン、食パンなどのパン類、ケーキ、クッキー、せんべい、あんこ、ようかん、もち、団子、ゼリーなどの菓子類、ジュース、お茶などの飲料、即席麺、即席みそ汁、即席スープなどの即席食品などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、本発明の食品はハスの破砕物および／または抽出物を含む粉類、例えば、小麦粉、そば粉、片栗粉、米の粉等から製造されるパン、ケーキ、クッキー、せんべいなどの食品である。より好ましくは、本発明の食品は、粉体状にされたハスの破砕物および／または抽出物を含む粉類、例えば、小麦粉、そば粉、片栗粉、米の粉等から製造されるパン、ケーキ、クッキー、せんべいなどの食品である。また、他の好ましい態様としては、本発明の食品は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むヨーグルトである。当該ヨーグルトは、ハスの破砕物および／または抽出物による効果と、乳酸菌のプロバイオティクス効果の相乗効果という有利な効果を有する。なお、ここでのヨーグルトとは、半固形状の通常のヨーグルトだけでなく、ヨーグルト飲料などのような液体状のヨーグルトも含む。ここで、上述の本発明の食品の製造については、任意の公知の方法、材料を使用することが可能である。
【００１６】
本発明の抗アレルギー用食品に含まれるハスの破砕物および抽出物の量は、本発明の抗アレルギー用食品が効果を奏する限りは特に限定されるものではない。本発明の抗アレルギー用食品は、ヒト成人が１日あたり、ハスの破砕物および抽出物の乾燥重量として、破砕物の場合には、好ましくは、１ｇ〜１００ｇ、より好ましくは、２ｇ〜４０ｇを摂取することとなる食品形態のものであり、また、抽出物の場合には、好ましくは、０．５ｇ〜５０ｇ、より好ましくは、１ｇ〜２０ｇを摂取することとなる食品形態のものである。
【００１７】
本発明の抗アレルギー用食品は、当該食品を構成する原料に、ハスの破砕物および／または抽出物を添加して製造することができ、また当該食品を構成する原料に、本発明の抗アレルギー用食品添加剤を添加して製造することも可能である。また、食品の種類によっては、製造された食品に、本発明の抗アレルギー用食品添加剤を添加して、本発明の抗アレルギー用食品とするような態様も可能である。
【００１８】
理論に拘束されるのを望むものではないが、本発明におけるハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー剤をヒトを含む哺乳類に経口投与した場合の抗アレルギー作用のメカニズムの１つは、当該抗アレルギー剤の経口投与による、生体内におけるタイプ２のヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ２）によるインターロイキン４（ＩＬ−４）の産生抑制、およびこれによるＢ細胞でのＩｇＥの産生抑制に起因しているものと考えられる。また、他のメカニズムとしては、当該抗アレルギー剤の経口投与による、生体内でのＴＮＦ、好ましくは、ＴＮＦ−αの産生抑制による、炎症反応の抑制に起因しているものと考えられる。なお、作用メカニズムとして上述の例を挙げたが、これは、他の作用メカニズムを排除するものではない。
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１：スギ花粉投与マウスのレンコンエキス経口摂取の影響
１）レンコン抽出物の調製方法
市販のレンコン２０ｇを細切し、これに蒸留水５０ｍＬを加え、８分間煮沸した後、ろ過し、ろ液をレンコン抽出物とした。
２）レンコン抽出物の経口投与法とスギ花粉エキスの経鼻投与法
スギ花粉エキスを投与する７日前から、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ；メス、３週齢）にゾンデを用いて、１個体あたりレンコン抽出物を１日１回０．５ｍＬ経口投与した（前投与）。なお、マウスは飼料（一般市販の固形飼料）、水道水を自由に摂取できるようにして、１２時間点灯−１２時間消灯のサイクルで飼育を行った。
上記前投与を７日間行った後、さらに１４日間、１日１回レンコン抽出物を経口投与する（本投与）と共に、並行してスギ花粉エキス（鳥居薬品；スギ花粉スクラッチ用アレルゲン）をマイクロピペットでマウスの鼻腔内に２５μＬ滴下して、スギ花粉感作マウスを人為的に作出した（実施例１）。
なお、比較例１として、レンコン抽出物の代わりに蒸留水を同量投与したものをコントロール群とした。なお、実験には各群９匹のマウスを使用した。
３）血清の採取法
１４日間の本投与の最後の投与の４時間後に、エーテル麻酔し、肝動脈より１ｍＬシリンジを用いて採血し、３７℃、６０分放置後、血清を分離した。
４）ＳＲＩＤ法（平板内単純免疫拡散法）による血清ＩｇＧ測定
ＳＲＩＤ法で血清中のＩｇＧ濃度を測定した。測定は、後述の実施例２で記載される方法に準じて行った。
５）ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）による血清ＩｇＥ測定
ＥＬＩＳＡ法で血清中のＩｇＥ濃度を測定した。測定は、後述の実施例２で記載される方法に準じて行った。
６）腹腔マクロファージの培養とＴＮＦ−α産生の測定
腹腔マクロファージ採取２日前に、腹腔内にチオグリコレートを１ｍＬ注入した。実験当日採血前に、３〜５ｍＬの冷ＭＥＭを注入してよくもみ、マクロファージを採取した（３〜４回繰り返して行った）。
細胞濃度を２×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬに調整し、１０μｇ ＬＰＳ（大腸菌由来）を含むＭＥＭに浮遊させ、１ｍＬずつ１２穴プレートのウェルに入れて３７℃で２４時間培養した。この培養上清を採取して、測定まで−８０℃に保存した。
ＴＮＦ−αは和光純薬製のキットを用いて、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。
７）脾臓細胞の培養、並びにＩＬ−２およびＩＬ−４産生の測定
採血時に、脾臓を無菌的に取り出し、ＲＰＭＩ１６４０培養液を２ｍＬ入れた小型シャーレに細胞用２００メッシュの金属フィルターを置き、当該フィルター上に摘出した脾臓を置き、５ｍＬ用の注射器のピストンのプッシュ面を用いて脾臓から脾臓細胞を取り出した。
得られた脾臓細胞を最終的に１０％ ＦＢＳ、２０μｇ ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０に、１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように調整して浮遊させた。次いで、１２穴プレートに細胞浮遊液を１ｍＬずつ入れ、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。この培養上清を測定まで−８０℃に保存した。
ＩＬ−２とＩＬ−４の測定はＥＬＩＳＡ法で行った。測定は、後述の実施例２で記載される方法に準じて行った。
【００２０】
血清中のＩｇＧは、コントロール群である比較例１では４６９ｍｇ／ｄＬであったのに対し、レンコン抽出物投与群である実施例１では８７５ｍｇ／ｄＬと比較例の約１．８６倍増加していた。このことから、レンコン抽出物は血清中のＩｇＧ増加による感染防御能を上昇させることが示唆される。
これに対して、Ｉ型アレルギーと密接な関係を有するＩｇＥについては、比較例では８７．２ｎｇ／ｄＬであったのに対し、実施例１では３８．６ｎｇ／ｄＬと、比較例１の約０．４４倍に低下していた。
このことから、レンコン抽出物を経口投与することにより、血清中のＩｇＧを上昇させると共に、血清中のＩｇＥを低減できることが明らかとなった。
【００２１】
また、マクロファージのＴＮＦ−α産生については、比較例１では培養液中のＴＮＦ−α濃度は３７．２ｐｇ／ｍＬであったのに対し、実施例１では１５．５ｐｇ／ｍＬと、約０．４２倍に低下していた。
このことから、レンコン抽出物を経口投与することにより、ＴＮＦ−αの産生が抑制されることが明らかとなり、本発明における抗アレルギー作用の作用機序の１つがＴＮＦ産生抑制であり得ることが推察される。
【００２２】
また、脾臓細胞のＩＬ−２産生については、比較例１では培養液中のＩＬ−２濃度は６３．６ｐｇ／ｍＬであったのに対し、実施例１では９４．２ｐｇ／ｍＬと、約１．４８倍に増加していた。このことから、レンコン抽出物はＴｈ１による細胞性免疫を亢進させることが示唆される。
これに対して、生体内においてＢ細胞におけるＩｇＥ産生に関与するＩＬ−４については、比較例１においては１１６．４ｐｇ／ｍＬであったのに対し、実施例１では３６．８ｐｇ／ｍＬと、約０．３２倍に低下していた。
このことから、レンコン抽出物を経口投与することにより、ＩＬ−２の産生が亢進されると共に、ＩＬ−４の産生が抑制されることが明らかとなった。
実施例１及び比較例１から、レンコン抽出物を経口投与することにより、生体内でのＩＬ−２の産生が促進される一方、生体内でのＩＬ−４の産生が抑制され、これにより血清中のＩｇＥが低減され、これにより抗アレルギー作用が生じ得ることが推察される。
【００２３】
実施例２：レンコン抽出物の連続的摂取がヒト免疫系に及ぼす影響
１）レンコン抽出物の調製方法
市販のレンコン１００ｋｇの皮をむき、水洗後５〜１０ｍｍ厚さにスライスした。水２６０Ｌを加え、水およびレンコンをニーダーに投入し９８℃に昇温して撹拌した。９９℃に昇温後３０分間煮沸した。次いで、煮沸物をニーダーから取り出し、サラシでろ過して得られたろ液をフリーズドライ法により粉末にした。この操作により、５．０ｋｇのレンコン抽出物粉末を得た。この粉末５．０ｋｇに等量の乳糖を加え、直径８ｍｍの丸形の白色錠剤（約２５０ｍｇ／粒）１０．０ｋｇを作成し、これを抗アレルギー剤ＬＲＥとした。
２）レンコン抽出物の投与量および投与スケジュール
４名の女性（２１歳、花粉体質）を被験者とした。
被験者によるＬＲＥの摂取は、朝および夕の２回、食前に８粒を水または湯で飲用することとした。なお、朝摂取するのを忘れた場合には、倍量を夕食前に摂取することとした。ＬＲＥの摂取は９週間の間行われた。
３）被験者からの血清および末梢血中のリンパ球の採取
レンコン抽出物の連続摂取開始前と摂取後７日間ごとに、以下の方法で、血清とリンパ球を採取し、実験に用いた。なお、操作は全て無菌的に行い、器具も滅菌済みの器具を使用した。
ａ）静脈血を１０ｍＬ採血し、血清分離用採血管に２ｍＬ、残りを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム）の入った２本の採血管に４ｍＬずつ分注した。
ｂ）血清分離用採血管を３７℃、１時間放置後、３０００ｒｐｍ、１５分の遠心操作を行い、得られた血清をマイクロチューブに取り、使用するまで−８０℃下に冷凍保存した。
ｃ）末梢血中からリンパ球を得るために、抗凝固剤入りの採血管に採取された血液をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２倍希釈した。これを比重１．０７７のヒトリンパ球分離液（ＬＳＭ）に重層して１６００ｒｐｍ、２０分の冷却遠心を行い、界面の総リンパ球を得た。
ｄ）リンパ球を小試験管に集め、ＰＢＳにて１４００ｒｐｍ、１０分の冷却遠心操作を２回行い、洗浄した。なお、赤血球が混在した場合には、ろ過滅菌したトリス塩化アンモニウムを用いて３７℃、１０分間放置して、赤血球を溶血させた。
ｅ）上清を除去し、２０μｇ／ｍＬ濃度のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０培養液を１ｍＬ入れ、良く混和後、タタイ式血算板にて細胞数を求めた。細胞数は２×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬに調整された。その後、培養用８穴プレートを用いて、リンパ球浮遊液を３７℃、４８時間培養した。
ｆ）培養後、上清をマイクロチューブに取り、６０００ｒｐｍ、５分間遠心後、その上清を別のマイクロチューブに移して実験日まで−８０℃下に冷凍保存した。
【００２４】
４）血清ＩｇＥのＥＬＩＳＡによる測定
被験者の血清中に存在するＩｇＥ抗体の定量を以下のＥＬＩＳＡによって行った。
ａ）炭酸ナトリウム緩衝液で１００倍希釈した抗ＩｇＥ抗体をＥＬＩＳＡ用９６穴プレートのウェルに１００μＬ入れ、室温、６０分間固相化した。
ｂ）洗浄液で２回洗浄後、ｐｏｓｔ−ｃｏａｔ用緩衝液を２００μＬ入れ、３７℃、３０分間インキュベートした。
ｃ）洗浄液で２回洗浄後、被験者血清並びにＩｇＥ標準液（１．８７；３．７５；７．５；１５；３０ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ入れ、３７℃、６０分間反応させた。
ｄ）洗浄液で２回洗浄後、２０００倍希釈したペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標準抗体を１００μＬ入れ、３７℃、６０分間反応させた。
ｅ）洗浄液で３回洗浄後、発色液（ｏ−フェニレンジアミン液；ＯＰＤ液）を１００μＬ入れ、室温、３０分間反応させた。
ｆ）発色後、停止液（３Ｍ硫酸）を１００μＬ入れ、ＥＬＩＳＡリーダーにて４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
ｇ）標準曲線より、被験者の血清中のＩｇＥ濃度を算出した。
各被験者における、レンコン抽出物の摂取開始前（０週目）と摂取９週目での、血清中ＩｇＥ濃度のグラフが図１に示される。
【００２５】
５）血清ＩｇＧのＳＲＩＤ法による測定
被験者の血清中に存在するＩｇＧ抗体の定量を、以下のＳＲＩＤ法によって行った。
ａ）生理的食塩水で良く洗浄したマイクロシリンジを用いて、標準ＩｇＧ血清（５４３、１６０４、３０５３ｍｇ／ｄＬ）並びに被験者血清を正確に４μＬずつ、ＭＢＬヒトＩｇＧ定量用アガロースプレート（医学生物学研究所）の各ウェルに入れた。プレートカバーをして、室温、２４時間インキュベートした。
ｂ）反応後、生じた沈降リングの直径を測定し、標準曲線から被験者の血清中のＩｇＧ濃度を算出した。
各被験者における、レンコン抽出物の摂取開始前（０週目）と摂取９週目での、血清中ＩｇＧ濃度のグラフが図２に示される。
【００２６】
６）リンパ球培養上清中のＩＬ−２のＥＬＩＳＡによる測定
４８時間培養された末梢血中リンパ球から分泌されるＩＬ−２の定量は、以下のＥＬＩＳＡによって行った。
ａ）ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートのウェルに被験者血清並びにＩＬ−２標準液（３１、２５、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ入れた。
ｂ）ビオチン化抗体（抗ＩＬ−２）を５０μＬ入れ、室温、１時間インキュベートした。
ｃ）３回洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを１００μＬ入れ、室温、３０分間反応させた。
ｄ）３回洗浄後、発色液（ＴＭＢ）を１００μＬ入れ、遮光して室温、１０〜１５分間反応させた。
ｅ）停止液（硫酸）を１００μＬ入れ、ＥＬＩＳＡリーダーにて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
ｆ）標準曲線より被験者リンパ球培養上清中のＩＬ−２濃度を算出した。
各被験者における、レンコン抽出物の摂取開始前（０週目）と摂取８週目での、リンパ球培養上清中のＩＬ−２濃度のグラフが図３に示される。
【００２７】
７）リンパ球培養上清中のＩＬ−４のＥＬＩＳＡによる測定
４８時間培養された末梢血中リンパ球から分泌されるＩＬ−４の定量は、以下のＥＬＩＳＡによって行った。
ａ）ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートのウェルに被験者血清並びにＩＬ−４標準液（１．２１、４．４、８．７５、１７．５、３５ｐｇ／ｍＬ）を１００μＬ入れ、室温、２時間インキュベートした。
ｂ）３回洗浄後、ビオチン化抗体（抗ＩＬ−４）を５０μＬ入れ、室温、１時間インキュベートした。
ｃ）３回洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを１００μＬ入れ、室温、３０分間反応させた。
ｄ）３回洗浄後、発色液（ＴＭＢ）を１００μＬ入れ、遮光して室温、１５〜２０分間反応させた。
ｅ）停止液（硫酸）を１００μＬ入れ、ＥＬＩＳＡリーダーにて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
ｆ）標準曲線より被験者リンパ球培養上清中のＩＬ−４濃度を算出した。
各被験者における、レンコン抽出物の摂取開始前（０週目）と摂取６〜８週目での、リンパ球培養上清中のＩＬ−４濃度のグラフが図４に示される。
【００２８】
実施例２においては、レンコン抽出物を含む抗アレルギー剤であるＬＲＥを９週間摂取することにより、４名の被験者いずれにおいても、ＬＲＥ摂取前と比較して、血清中のＩｇＥ濃度の低下が認められた。これに対して、ＩｇＧについては、４名の被験者いずれにおいても血清中濃度の上昇が認められた。
また、レンコン抽出物であるＬＲＥを８週間摂取することにより、４名の被験者いずれにおいても、ＬＲＥ摂取前と比較して、末梢血中リンパ球におけるＩＬ−２の産生が促進されることが認められた。これに対して、ＩＬ−４の産生については、４名の被験者いずれにおいても、ＬＲＥを６〜８週間摂取することにより、末梢血中リンパ球におけるＩＬ−４の産生が抑制されることが認められた。
実施例２から、レンコン抽出物を経口摂取することにより、生体内でのＩＬ−２の産生が促進される一方、生体内でのＩＬ−４の産生が抑制され、これにより血清中のＩｇＥが低減され、これにより抗アレルギー作用が生じ得ることが推察される。
【００２９】
実施例３：レンコン抽出物の連続的摂取が花粉体質改善に及ぼす影響
１）レンコン抽出物の調製方法
実施例２において使用したレンコン抽出物を含む抗アレルギー剤ＬＲＥを使用した。
２）レンコン抽出物の投与量および投与スケジュール
１７名の花粉体質の被験者、男性２名（４０代１名、３０代１名）、女性１５名（５０代３名、４０代５名、３０代１名、２０代３名、１０代３名）、および花粉体質でない２名の被験者（男性５０代１名および女性４０代１名）の合計１９名を被験対象者とした。
被験対象者によるＬＲＥの摂取は、朝および夕の２回、食前に８粒を水または湯で飲用することとした。なお、朝摂取するのを忘れた場合には、倍量を夕食前に摂取することとした。ＬＲＥの摂取は３ヶ月（１２月上旬から３月上旬まで）の間行われた。
３）被験者からの血清の採取
レンコン抽出物の連続摂取開始前と摂取後約１月ごとに、病院において採血し、血清を分離して、血清中のＩｇＥ（非特異的ＩｇＥ）、スギ花粉特異的ＩｇＥおよびヒノキ花粉特異的ＩｇＥの濃度の測定を行った。なお、これらの測定は株式会社ビー・エム・エルが行った。
花粉特異的ＩｇＥについては、ＩｇＥ濃度を０〜６の７段階に分けて評価した。すなわち、クラス０：０．３４（ＵＡ／ｍＬ、以下同じ単位）以下、クラス１：０．３５〜０．６９、クラス２：０．７０〜３．４９、クラス３：３．５０〜１７．４９、クラス４：１７．５〜４９．９、クラス５：５０．０〜９９．９、クラス６：１００以上である。
４）花粉症症状の改善度
花粉症の症状の改善度は、本試験期間中のアレルギーの症状（くしゃみ、鼻水、鼻づまり、目のかゆみ、なみだ目、眼異物感、まぶた違和感、その他顔のほてり、頭痛、皮膚のかゆみ、咽頭のかゆみ、口のかゆみ、呼吸異常音など）について、本試験が行われる前年度の症状に対する改善度を、１〜４の４段階（無＝改善無し；軽＝軽度の改善；中＝中程度の改善；著＝著しい改善）で被験者が自己申告するものとした。
以下、実施例３の結果を示す。
【００３０】
花粉体質の被験者における血清ＩｇＥ（非特異的ＩｇＥ）に及ぼす影響
抗アレルギー剤ＬＲＥの摂取開始前のＩｇＥ濃度と比較して、投与３ヶ月後のＩｇＥ濃度が低下した被験者は全部で１４名（７３．７％）であった。そのうち、４割減は２名（１０．５％；男性３０代１名、女性４０代１名）、３割減は７名（３６．８％；男性４０代１名、女性５０代１名、４０代３名、２０代１名、１０代１名）、２割減が４名（２１．０％；女性５０代１名、２０代２名、１０代１名）、１割減が１名（５．３％；女性５０代）であった。全く変化がなかったのが１名（５．３％；女性４０代）、上昇したがほとんど変化がなかったのは２名（１０．５％；女性３０代１名、１０代１名）であった。上述のように、抗アレルギー剤ＬＲＥによる効果が認められたが、この効果については、年齢や性別によるかたよりは認められなかった。
代表例として、ＩｇＥ濃度が低下した被験者における、ＩｇＥ濃度の変動のグラフを図５（男性３０代）および図６（女性２０代）に示す。図５および図６は、縦軸にＩｇＥ濃度（非特異的ＩｇＥ濃度）、花粉特異的ＩｇＥをとり、横軸は採血日である。図５においては試験開始日は１２月４日であり、図６においては試験開始日は１２月５日である。
【００３１】
花粉体質の被験者における血清中花粉特異的ＩｇＥに及ぼす影響
花粉体質の被験者においては、非特異的ＩｇＥ濃度が上昇すると、花粉特異的ＩｇＥの濃度が上がり、非特異的ＩｇＥ濃度が低下すると、花粉特異的ＩｇＥの濃度も低下する傾向が認められた。図６においても、非特異的ＩｇＥの低下と共に、スギ特異的ＩｇＥおよびヒノキ特異的ＩｇＥが低減していることが認められる。
【００３２】
花粉体質ではない被験者に対する影響
花粉体質でない２名の被験者（男性５０代１名、女性４０代１名）のいずれも、非特異的ＩｇＥ濃度の低下が認められた。低下の程度は、試験開始前から３ヶ月後で、それぞれ、３９から３７ＩＵ／ｍＬ、８から５ＩＵ／ｍＬであった。
なお、花粉特異的ＩｇＥは試験期間中いずれの時点においてもクラス０であった。
【００３３】
花粉体質の被験者におけるアレルギー症状改善の評価
１７名の花粉体質の被験者のうち７名（４１．２％）に、前年度と比較してアレルギー症状の改善が認められた。
【００３４】
また、３ヶ月の試験期間中、当該抗アレルギー剤ＬＲＥを摂取することによる重大な身体的トラブルは認められず、危険な副作用は無いことが確認できた。
また、被験者５名において、３ヶ月の投与により、肌荒れ等を含む皮膚炎の症状の改善が認められた。
また、被験者７名において、３ヶ月の投与により、自覚症状による冷え性の改善が認められた。
【００３５】
【発明の効果】
以上、説明したように、本発明の抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー用食品は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患の改善、治療を可能にするという有利な効果を有する。
また、本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、血清中ＩｇＥ濃度を低下できるという有利な効果を有する。
さらに、本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、生体内でのＩＬ−４産生を抑制できるという有利な効果を有する。
また、本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、生体内でのＴＮＦ産生を抑制できるという有利な効果を有する。
また、本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、冷え性を改善、治療できるという有利な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は実施例２における、レンコン抽出物の摂取開始前（０週目）と摂取９週目での、被験者ごとの血清中ＩｇＥ濃度を示すグラフである。
【図２】 図２は実施例２における、レンコン抽出物の摂取開始前（０週目）と摂取９週目での、被験者ごとの血清中ＩｇＧ濃度を示すグラフである。
【図３】 図３は実施例２における、レンコン抽出物の摂取開始前（０週目）と摂取８週目での、被験者ごとのリンパ球培養上清中のＩＬ−２濃度を示すグラフである。
【図４】 図４は実施例２における、レンコン抽出物の摂取開始前（０週目）と摂取６〜８週目での、被験者ごとのリンパ球培養上清中のＩＬ−４濃度を示すグラフである。
【図５】 図５は実施例３における、花粉体質被験者におけるＩｇＥの変動を示すグラフである。
【図６】 図６は実施例３における、花粉体質被験者におけるＩｇＥの変動を示すグラフである。
【出願人】 【識別番号】５０３０３６３５７
【氏名又は名称】株式会社トーヨー技術研究所
【住所又は居所】埼玉県さいたま市見沼区小深作３４１
【識別番号】５０３０３６３６８
【氏名又は名称】株式会社日本アレルギー応用研究所
【住所又は居所】埼玉県狭山市北入曽１３６３番地
【出願日】 平成１５年１月２７日（２００３．１．２７）
【代理人】 【識別番号】１０００７３１３９
【弁理士】
【氏名又は名称】千田 稔

【識別番号】１００１１２５８６
【弁理士】
【氏名又は名称】橋本 幸治
【公開番号】 特開２００６−１５１８１１（Ｐ２００６−１５１８１１Ａ）
【公開日】 平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【出願番号】 特願２００３−１７５１４（Ｐ２００３−１７５１４）