| 【発明の名称】 |
発癌予防剤及びシクロアルタン型トリテルペン系化合物の製造方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】秋久 俊博
【氏名】徳田 春邦
【氏名】浮谷 基彦
【氏名】渡辺 健二
【氏名】米今 梨紗
|
| 【要約】 |
【課題】安全で有効な発癌予防剤を提供する。
【解決手段】本発明の発癌予防剤は、２４−メチルシクロアルタン−３β，２４，２４1−トリオール、２４1−メトキシ−２４−メチルシクロアルタン−３β，２４−ジオール、シクロアルタン−３，２４−ジオン、４，４，１４−トリメチル−９，１９−シクロプレグナン−３，２０−ジオン、２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタン−３−オン、２５−ヒドロキシシクロアルト−２３−エン−３−オン、２５−ヒドロキシ−２４−メトキシシクロアルタン−３−オンからなる群から選ばれた少なくとも１種のシクロアルタン型トリテルペン系化合物を含有する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロユーカレノール、２４−メチルシクロアルタン−３β，２４，２４1−トリオール、２４1−メトキシ−２４−メチルシクロアルタン−３β，２４−ジオール、シクロアルタン−３，２４−ジオン、４，４，１４−トリメチル−９，１９−シクロプレグナン−３，２０−ジオン、２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタン−３−オン、２５−ヒドロキシシクロアルト−２３−エン−３−オン、２５−ヒドロキシ−２４−メトキシシクロアルタン−３−オンからなる群から選ばれた少なくとも１種のシクロアルタン型トリテルペン系化合物を含有することを特徴とする発癌予防剤。
【請求項２】
前記シクロアルタン型トリテルペン系化合物は、米糠成分を処理して得た化合物を基質とした糸状菌による微生物変換反応から得られる反応生成物、あるいは米糠成分を処理して得た化合物の化学的変換反応によって得られる反応生成物であることを特徴とする請求項１に記載の発癌予防剤。
【請求項３】
米糠成分を処理して得られる化合物を基質として糸状菌による微生物変換を行うことでシクロアルタン型トリテルペン系化合物を得ることを特徴とするシクロアルタン型トリテルペン系化合物の製造方法。
|
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は発癌予防剤及びシクロアルタン型トリテルペン系化合物の製造方法に関し、特にシクロアルタン型トリテルペン系化合物を含有する発癌予防剤及びシクロアルタン型トリテルペン系化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、発癌予防剤としてトリテルペン系化合物は知られている（特許文献１参照）。この特許文献１では、米糠成分を処理して得られるγ−オリザノールを化学的に変換することで、発癌予防に有効な数種のトリテルペン系化合物を得る技術が示されている。
【特許文献１】特開２００３−２７７２６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、発癌予防の大きなニーズに鑑みて、さらに安全で有効な発癌予防剤が得られないものかとの期待は大きい。
本発明は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、安全で有効な発癌予防剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決することを目的として、従来から安全性及び優れた発癌予防効果が報告されているシクロアルタン型トリテルペン系化合物に着目し、さらに優れた発癌予防効果を有する化合物を探索すべく鋭意研究を行った。その結果、糸状菌を用いることで、優れた発癌予防効果を有するシクロアルタン型トリテルペン系化合物を得ることができるのを見出した。すなわち本発明の請求項１による発癌予防剤は、シクロユーカレノール、２４−メチルシクロアルタン−３β，２４，２４1−トリオール、２４1−メトキシ−２４−メチルシクロアルタン−３β，２４−ジオール、シクロアルタン−３，２４−ジオン、４，４，１４−トリメチル−９，１９−シクロプレグナン−３，２０−ジオン、２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタン−３−オン、２５−ヒドロキシシクロアルト−２３−エン−３−オン、２５−ヒドロキシ−２４−メトキシシクロアルタン−３−オンからなる群から選ばれた少なくとも１種のシクロアルタン型トリテルペン系化合物を含有することを特徴とする。
【０００５】
上述したシクロアルタン型トリテルペンであれば、発癌予防効果に優れ、かつ、案税も高い。
なお、上述した本発明の化合物には、医学的に使用され薬理学的に許容される各化合物の塩も含むものであるもの。このような塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩等を挙げることができる。
【０００６】
また、上述した請求項１に記載の本発明の化合物が溶剤和物（例えば水和物）を形成する場合は、これらもすべて本発明に含まれる。例えば、本発明の化合物が、大気中に放置されたり、または再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水が付着したり、水和物を形成する場合がある。本発明にはこのような溶剤和物も含まれる。
さらに、請求項１に記載の本発明の化合物は、それぞれいくつかの不斉炭素原子を有しており、このため、種々の光学異性体が存在する。本発明においては、特に記述しない限り、ラセミ化合物を含むこれらの異性体及びこれらの異性体の混合物をもすべて含むものである。
【０００７】
また、本発明の請求項２による発癌予防剤は、請求項１において、前記シクロアルタン型トリテルペン系化合物は、米糠成分を処理して得た化合物を基質とした糸状菌による微生物変換反応から得られる反応生成物、あるいは米糠成分を処理して得た化合物の化学的変換反応によって得られる反応生成物であることを特徴とする。
さらに、本発明は新規で優れた発癌予防効果を有するシクロアルタン型トリテルペン系化合物を提供するのみでなく、自律神経失調治療薬等としても有用なシクロアルタン型トリテルペン系化合物の新たな製造方法を提供するものである点において重要な意味を有する。すなわち、本発明の請求項３によるは、米糠成分を処理して得られる化合物を基質として糸状菌による微生物変換を行うことでシクロアルタン型トリテルペン系化合物を得ることを特徴とする。
【０００８】
米糠成分を処理して得られる化合物を基質として糸状菌による微生物変換を行うことでシクロアルタン型トリテルペン系化合物を得ることができる。これは、より安全なシクロアルタン型トリテルペン系化合物の製造の可能性、糸状菌の大量培養、変換反応の関連遺伝子を組み込んだ形質転換体の培養や糸状菌から抽出される変換反応の関連酵素の利用による大量製造の可能性を示唆するものである。
ここで、用いることができる糸状菌としては、例えばＧｌｏｍｅｒｅｌｌａ属、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などが挙げられる。Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ属の中でも、さらにＧｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｆｕｓａｒｉｏｉｄｅｓが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安全かつ発癌予防効果に優れた発癌予防剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
次に、実施例により本発明を具体的に説明する。すなわち、本発明に係る微生物変換反応による発癌予防効果を有する化合物の生成、単離、単離された化合物の同定及び構造解析、並びに、本発明に係る発癌予防剤の効果確認試験について説明する。
［基質の調製］
微生物変換反応の基質であるシクロアルテノール（以下、本明細書では「化合物１」と記すこともある。）、２４−メチレンシクロアルタノール（以下、本明細書では「化合物２」と記すこともある。）、及び、シクロアルテノン（以下、本明細書では「化合物３」と記すこともある。）の調製について説明する。
【００１１】
まず、γ−オリザノールから、文献記載（Ｌ． Ｊ． Ｇｏａｄ、Ｔ． Ａｋｉｈｉｓａ、“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｌｓ”、Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ＆ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、ロンドン、２９２項、１９９７年）の方法に基づき、分別再結晶法により、シクロアルテノールフェルラート及び２４−メチレンシクロアルタノールフェルラートを調製した。その後、シクロアルテノールフェルラート及び２４−メチレンシクロアルタノールフェルラートを、それぞれアルカリ加水分解（５％水酸化カリウム・メタノール溶液；加熱還流；３時間）することで、シクロアルテノール（化合物１）及び２４−メチレンシクロアルタノール（化合物２）を調製した。またシクロアルテノン（化合物３）は、化合物１のＣ3位の水酸基をＣｒＯ3／Ｃ5Ｈ5Ｎにて化学的に酸化して調製した。
【００１２】
［変換反応菌体の調製］
微生物変換反応に用いる糸状菌Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｆｕｓａｒｉｏｉｄｅｓの調製について説明する。まず、糸状菌Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｆｕｓａｒｉｏｉｄｅｓ、より具体的に本実施例ではＧｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｆｕｓａｒｉｏｉｄｅｓ ＩＦＯ８８３１（財団法人 発酵研究所）をポテトデキストロース液体培地（ＰＤＢ、日水製薬株式会社製）４００ｍＬにて、室温で５日間、撹拌培養を行った。さらに新たに調製したＰＤＢ３Ｌに植菌し、室温で３日間、大量培養を行った。培養終了後、菌体を水洗浄し、微生物変換反応に用いる変換反応菌体を調製した。
【００１３】
なお、本発明においては、変換反応菌体の調製工程における培養方法としては、通常微生物の大量培養に用いられる培養法であれば特に限定はないが、例えば、上記の撹拌培養法、振盪培養法、通気培養法等を挙げることができる。ここで挙げられたいずれの培養法も、好気的条件下で行うことが好ましい。工業的培養には、通気撹拌培養法が適している。
【００１４】
［微生物変換反応］
基質をジメチルスルホキシドに溶解させ、これを純水に加えて反応液を調製した。この反応溶液に変換反応菌体を加え、室温で１０日間、通気培養を行った。
［化合物の単離］
反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて抽出を行った。この抽出物について、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、オクタデシルシリカ（ＯＤＳ）カラム分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分画を行った。なお本実施例で用いた分取ＨＰＬＣのカラムは、Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（（株）センシュー科学製、充填剤：粒子径５μｍ、カラム：長さ２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）である。
【００１５】
［シクロアルテノールの微生物変換反応］
シクロアルテノール（５０７ｍｇ）を基質として上記の方法で微生物変換反応を行い、その反応溶液から酢酸エチル抽出物（５３６ｍｇ）を得た。以下に、この酢酸エチル抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画、及び分取ＨＰＬＣによる変換生成物の単離の詳細を示す。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりＦｒ．１（溶離液、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；１１ｍｇ）、Ｆｒ．２（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；４２ｍｇ）、Ｆｒ．３（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；３０４ｍｇ）、Ｆｒ．４（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；１９ｍｇ）、Ｆｒ．５（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝９：１；４０ｍｇ）、Ｆｒ．６（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル４＝１：１；２１ｍｇ）、Ｆｒ．７（酢酸エチル；９ｍｇ）、Ｆｒ．８（メタノール；５５ｍｇ）を得た。
【００１６】
分取ＨＰＬＣ［展開液：メタノール−水−酢酸（９５：５：１）、３．０ｍＬ／分］を行い、Ｆｒ．２から、シクロアルテノン（化合物３；２４．７ｍｇ；保持時間２８．８分）、Ｆｒ．４から、シクロアルタン−３β，２４，２５−トリオール（化合物４；４．８ｍｇ；保持時間２２．４分）、Ｆｒ．５から、シクロアルト−２５−エン−３β，２４−ジオール（化合物５；４．１ｍｇ；保持時間２３．２分）を単離した（図１参照）。なお、未反応の基質であるシクロアルテノール（化合物１）はＦｒ．３成分として回収された。
【００１７】
［２４−メチレンシクロアルタノールの微生物変換反応］
２４−メチレンシクロアルタノール（５００ｍｇ）を基質として用い、上記の方法で微生物変換反応を行い、その反応溶液から酢酸エチル抽出物（４４２ｍｇ）を得た。以下に、この酢酸エチル抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画、及び分取ＨＰＬＣによる変換生成物の単離の詳細を示す。
【００１８】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりＦｒ．１（溶離液、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；２５ｍｇ）、Ｆｒ．２（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；３５５ｍｇ）、Ｆｒ．３（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；２３ｍｇ）、Ｆｒ．４（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；５ｍｇ）、Ｆｒ．５（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１；１２ｍｇ）、Ｆｒ．６（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９：１；１９ｍｇ）、Ｆｒ．７（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝８：２；９ｍｇ）、Ｆｒ．８（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１；６ｍｇ）、Ｆｒ．９（酢酸エチル；８ｍｇ）、Ｆｒ．１０（メタノール；３１ｍｇ）を得た。
【００１９】
このうち分取ＨＰＬＣ［展開液：メタノール−酢酸（１００：１）、３．０ｍＬ／分］を行い、Ｆｒ．２からシクロユーカレノール（化合物６；４．８ｍｇ；保持時間２７．２分）、２４−メチルシクロアルタン−３β，２４，２４1−トリオール（化合物７；３．７ｍｇ；保持時間８．４分）、２４1−メトキシ−２４−メチルシクロアルタン−３β，２４−ジオール（化合物８；６．５ｍｇ；保持時間１８．４分）を単離した。Ｆｒ．３からシクロユーカレノール（化合物６；４．８ｍｇ；保持時間２７．２分）、２４1−メトキシ−２４−メチルシクロアルタン−３β，２４−ジオール（化合物８；６．５ｍｇ；保持時間１８．４分）を単離した。また分取ＨＰＬＣ［展開液：メタノール−水−酢酸（９５：５：１）、３．０ｍＬ／分取により、Ｆｒ．５からシクロアルト−２５−エン−３β，２４−ジオール（化合物５；３．６ｍｇ；保持時間２６．８分）を単離した（図２参照）。なお、Ｆｒ．２に未反応基質である２４−メチレンシクロアルタノール（化合物２）はＦｒ．２成分として回収された。
【００２０】
［シクロアルテノンの微生物変換反応］
シクロアルテノン（５６８ｍｇ）を基質として上記の方法で微生物変換反応を行い、その反応溶液から酢酸エチル抽出物（５４６ｍｇ）を得た。以下に、この酢酸エチル抽出物のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画、及び分取ＨＰＬＣによる変換生成物の単離の詳細を示す。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりＦｒ．１［溶離液、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５；３０９ｍｇ］、Ｆｒ．２［ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝８：２；３２ｍｇ］、Ｆｒ．３（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１；１３０ｍｇ）、Ｆｒ．４（酢酸エチル；３０ｍｇ）、Ｆｒ．５（メタノール；１０７ｍｇ）を得た。
【００２１】
分取ＨＰＬＣ［展開液：メタノール−水−酢酸（９５：５：１）、３．０ｍＬ／分］を行い、Ｆｒ．１から、シクロアルタン−３，２４−ジオン（化合物９；３．１ｍｇ；保持時間１６．２分）、２４−ヒドロキシシクロアルト−２５−エン−３−オン（化合物１１；５．２ｍｇ；保持時間１３．８分）、２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタン−３−オン（化合物１３；５．３ｍｇ；保持時間８．７分）、２５−ヒドロキシ−２４−メトキシシクロアルタン−３−オン（化合物１５；４２ｍｇ；保持時間１２．９分）を単離した。Ｆｒ．２から、４，４，１４−トリメチル−９，１９−シクロプレグナン−３，２０−ジオン（化合物１０；３．５ｍｇ；保持時間６．９分）、化合物１１（５．２ｍｇ；保持時間１３．８分）、シクロアルト−２５−エン−３，２４−ジオン（化合物１２；３．０ｍｇ；保持時間１９．５分）を単離した。Ｆｒ．３から、化合物１３（５．３ｍｇ；保持時間８．７分）、２５−ヒドロキシシクロアルト−２３−エン−３−オン（化合物１４；３．９ｍｇ；保持時間１６．５分）、を単離した（図３参照）。なお、反応基質であるシクロアルテノンはＦｒ．１成分として回収された。
【００２２】
［化合物４〜１５の構造解析及び同定について］
上記のようにして単離した１２種の化合物４〜１５について構造解析及び同定を行ったので説明する。化合物４〜１５の構造解析はＭＳ、ＩＲ、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、及び２次元ＮＭＲ法である相関分光法（1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ）、異種核多量子コヒーレンス法（ＨＭＱＣ）、異種核遠隔多量子相関法（ＨＭＢＣ）、及び、核オーバーハウザー交換分光法（ＮＯＥＳＹ）を用いて行った。構造解析を行った１２種の化合物４〜１５の化学構造式を図１〜図３に示す。
【００２３】
これらのうち、化合物７、８、１０、１５の４種はこれまで文献記載のない新規化合物である。新規化合物７、８、１０、１５の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲをＨＭＢＣデータとともに表１〜４に示した。また、図４には新規化合物７、８、１０、１５の炭素番号を示した構造式を、図５にはこれらの新規化合物のＮＯＥＳＹスペクトル法により得られた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）相関関係を立体構造式とともに両方向の矢印で示した。これらのＮＯＥ相関は化合物７、８、１０、１５について帰属した構造と矛盾はしない。
【００２４】
また既知の化合物４〜６、９、１１〜１４の構造は、これら各化合物の種々のスペクトル値を文献（以下に示す）値と比較することにより確認した。
化合物４：稲田らＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６巻、２号、３７９−３８１頁、１９９７年
化合物５、１１：ＣａｂｒｅｒａらＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ５９巻、３４３−３４７頁、１９９６年
化合物６：秋久らＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４７巻、６号、１１０７−１１１０頁、１９９８年
化合物９、１３：稲田らＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ５８巻、１１４３−１１４６頁、１９９５年
化合物１２、１４：ＤｅＰａｓｃｕａｌらＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６巻、１７６７−１７７６頁、１９８７年
但し、これらの化合物の発癌予防効果については知られていない。
【００２５】
新規化合物７、８、１０、１５の諸性質及びスペクトルデータを次に示す。
（１）２４−メチルシクロアルタン−３β，２４，２４1−トリオール（化合物７）
無色結晶．融点：１７５〜１７７℃．比旋光度 ［α］25D：＋２５．５０（濃度 ｃ＝０．１０（ｇ／１００ｍＬ）、溶媒クロロホルム）．ＩＲ νmax：３４０７、２９２８ｃｍ-1
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値、（相対イオン強度））：４７４（８）〔Ｍ〕+、４５６（３０）［Ｍ−Ｈ2Ｏ］+、４４１（２３）［ｍ／ｚ４５６−ＣＨ3］、４２３（３０）［ｍ／ｚ４４１−Ｈ2Ｏ］+、３３４（２３）、２０３（３２）、１７５（５７）、９５（１００）．高分解能ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値）：４７４．４０６４（理論値Ｃ31Ｈ54Ｏ3［Ｍ−Ｈ2Ｏ］+４７４．４０７３）．
1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータはＨＭＢＣデータとともに表１に示した。
化合物７の13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）、1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）及びＨＭＢＣスペクトルデータ（溶媒：ＣＤＣｌ3）
【００２６】
【表１】
【００２７】
（２）２４1−メトキシ−２４−メチルシクロアルタン−３β，２４−ジオール（化合物８）
無色結晶．融点：１６８〜１７１℃．比旋光度 ［α］25D：＋４．３°（濃度ｃ＝０．１０（ｇ／１００ｍＬ）、溶媒クロロホルム）．ＩＲ νmax：３４０９、２９３８ｃｍ-1．
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値、（相対イオン強度））：４８８（１３）〔Ｍ〕+、４７０（４５）［Ｍ−Ｈ2Ｏ］+、４５７（１００）、４３８（３７）［ｍ／ｚ４７０−ＨＯＣＨ3］、４２３（５２）［ｍ／ｚ４３８−ＣＨ3］、３１７（８３）、１７５（４４）、９５（６８）．
高分解能ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値）：４８８．４２２８（理論値Ｃ31Ｈ56Ｏ3［Ｍ］+４８８．４２２９）．
1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータはＨＭＢＣデータとともに表２に示した。
化合物８の13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）、1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）及びＨＭＢＣスペクトルデータ（溶媒：ＣＤＣｌ3）
【００２８】
【表２】
【００２９】
（３）４，４，１４−トリメチル−９，１９−シクロプレグナン−３，２０−ジオン（化合物１０）
無色結晶．融点：１６５〜１６８℃．比旋光度 ［α］25D：＋８．３０（濃度ｃ＝０．１６（ｇ／１００ｍＬ）、溶媒クロロホルム）．ＩＲ νmax：２９３１、１７１０ｃｍ-1．
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値、（相対イオン強度））：３５６（１００）〔Ｍ〕+、３４１（５２）［Ｍ−ＣＨ3］+、３１３（５２）［ｍ／ｚ３４１−ＣＯ］、２７１（２６）［ｍ／ｚ３１３−Ｃ3Ｈ6］、２１８（１００）［ｍ／ｚ２７１−Ｃ4Ｈ6］、１７５（７０）、１３７（５０）、１２１（４７）、１０７（６０）、９５（６８）．
高分解能ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値）：３５６．２７１４（理論値Ｃ24Ｈ36Ｏ2［Ｍ］+３５６．２７１５）．
1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータはＨＭＢＣデータとともに表３に示した。
化合物１０の13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）、1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）及びＨＭＢＣスペクトルデータ（溶媒：ＣＤＣｌ3）
【００３０】
【表３】
【００３１】
（４）２５−ヒドロキシ−２４−メトキシシクロアルタン−３−オン（化合物１５）
無色結晶．融点：１９８〜１９９℃．比旋光度 ［α］25D：＋１６．４０（濃度ｃ＝０．１８（ｇ／１００ｍＬ）、溶媒クロロホルム）．ＩＲ νmax：３４４５、２９３１、１７１０ｃｍ-1．
ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値、（相対イオン強度））：４７２（１５）〔Ｍ〕+、４４０（４５）［Ｍ−ＨＯＣＨ3］+、３１３（５０）［Ｍ−側鎖（Ｃ9Ｈ19Ｏ2）］+、２７１
（５）、７３（１００）．
高分解能ＥＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ値）：４７２．３９２４（理論値Ｃ31Ｈ52Ｏ3［Ｍ］+４７２．３９１６）
1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲデータはＨＭＢＣデータとともに表４に示した
化合物１５の13Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）、1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）及びＨＭＢＣスペクトルデータ（溶媒：ＣＤＣｌ3）
【００３２】
【表４】
【００３３】
以下に新規化合物７、８、１０、１５の構造決定について述べる（図４参照）。
化合物７は、高分解能ＥＩ−ＭＳ（〔Ｍ〕+ｍ／ｚ４７４．４０６４）及び13Ｃ−ＮＭＲより分子式Ｃ31Ｈ54Ｏ3を持つ事が示された。また本化合物はＩＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲからメチレン基〔δH ０．３３（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ）、０．５５（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）〕の存在が示され、シクロプロピル基の存在が示唆された。さらに４個の第３級メチル基〔δH ０．８１、０．８９、０．９７、０．９７（各ｓ）〕、１個の第２級メチル基〔δH ０．９０（ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）〕、インプロピル基〔δH ０．９３（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．９４（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）〕、そして１個のヒドロキシメチン基〔３４０７ｃｍ-1；δH ３．２８（ｍ）；δC ７８．８〕、１個のヒドロキシメチレン基〔δH ３．４７（ｄ、Ｊ＝１１．３Ｈｚ）、３．６２（ｄ、Ｊ＝１０．７Ｈｚ）；δC ６５．９〕の存在が示唆された。ＥＩ−ＭＳではｍ／ｚ４５６にＨ2Ｏの脱離によるイオン、ｍ／ｚ４４１に（ｍ／ｚ４５６−ＣＨ3）に対応するイオン、ｍ／ｚ４２３に（ｍ／ｚ４４１−Ｈ2Ｏ）に対応するイオンが観測された。これらの値とシクロアルタン系化合物の文献値（Ｄｅ Ｐａｓｃｕａｌら Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６巻、１７６７−１７７６頁、１９８７年）と比較し、化合物７は２４−メチルシクロアルタン−３β，２４，２４1−トリオール構造を持つ事が明らかとなった。本構造が正しい事は、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＮＯＥＳＹスペクトルの解析により確認した。
【００３４】
化合物８は、高分解能ＥＩ−ＭＳ（〔Ｍ〕+ｍ／ｚ４８８．４２２９）及び13Ｃ−ＮＭＲより分子式Ｃ32Ｈ56Ｏ3を持つ事が示された。また本化合物はＩＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲからメチレン基〔δH ０．３３（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ）、０．５５（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）〕の存在が示され、シクロプロピル基の存在が示唆された。さらに４個の第３級メチル基〔δH ０．８１、０．９０、０．９７、０．９７（各ｓ）〕、１個の第２級メチル基〔δH ０．９０（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）〕、インプロピル基〔δH ０．９２（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．９４（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）〕、そして１個のヒドロキシメチン基〔３４０９ｃｍ-1；δH ３．２９（ｍ）；δC ７８．９〕、１個のメトキシル基〔δH ３．２３（ｍ）；δC ４９．４］の存在が示唆された。ＥＩ−ＭＳではｍ／ｚ４７０にＨ2Ｏの脱離によるイオン、ｍ／ｚ４３８にＣ24−Ｃ241の開裂によりＨＯＣＨ3が脱離したイオンが観測された。これらを化合物７のスペクトル値と比較し、化合物８は２４1−メトキシ−２４−メチルシクロアルタン−３β，２４−ジオール構造を持つ事が明らかとなった。本構造が正しい事は、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＮＯＥＳＹスペクトルの解析により確認した。
【００３５】
化合物１０は高分解能ＥＩ−ＭＳ（〔Ｍ〕+ｍ／ｚ３５６．２７１４）及び13Ｃ−ＮＭＲより分子式Ｃ24Ｈ36Ｏ2を持つ事が示された。また本化合物はＩＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲからメチレン基〔δH ０．５７（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ）、０．８２（ｄ、Ｊ＝４．３Ｈｚ）〕の存在が示され、シクロプロピル基の存在が示唆された。さらに４個の第３級メチル基〔δH ０．９３、０．９８、１．０５、１．１０、２．１２（各ｓ）〕、そして２個のカルボニル基〔１７１０ｃｍ-1；δC ２１０．３、２１６．４〕の存在が示唆された。ＥＩ−ＭＳではｍ／ｚ３４１にＣ20‐Ｃ21の開裂によりＣ21メチル基が脱離した開裂イオン、ｍ／ｚ３１３にＣ17‐Ｃ20の開裂によりＣＨ3ＣＯが脱離したイオンが観測された。これらのスペクトル値、及びシクロアルタン系化合物の文献値（ＢａｒｉｋらＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５巻、１００１−１００４頁、１９９４年）と比較し、化合物１０は４，４，１４−トリメチル−９，１９−シクロプレグナン−３，２０−ジオン構造を持つ事が明らかとなった。本構造が正しい事は、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＮＯＥＳＹスペクトルの解析により確認した。
【００３６】
化合物１５は高分解能ＥＩ−ＭＳ（〔Ｍ〕+ｍ／ｚ４７２．３９２４）及び13Ｃ−ＮＭＲより分子式Ｃ31Ｈ52Ｏ3を持つ事が示された。また本化合物はＩＲスペクトル、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲからメチレン基〔δH ０．５７（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）、０．７９（ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ）〕の存在が示され、シクロプロピル基の存在が示唆された。さらに４個の第３級メチル基〔δH ０．９１、１．００、１．０５、１．１０、（各ｓ）〕、１個の第２級メチル基〔δH ０．８９（ｄ、Ｊ＝６．４Ｈｚ）〕、インプロピル基〔δH １．１０、１．１３（各ｓ）、そしてヒドロキシル基〔３４４５ｃｍ-1〕、カルボニル基〔１７１０ｃｍ-1；δC ２１３．０〕、メトキシル基（δH ３．２３（ｓ）；δC ４９．１）の存在が示唆された。ＥＩ−ＭＳではｍ／ｚ４４０にＣ24位のＣＨ3ＯＨ脱離によるイオン、ｍ／ｚ３１３にＣ17‐Ｃ20の開裂により側鎖（Ｃ9Ｈ19Ｏ2）が脱離した開裂イオン、更にｍ／ｚ２７１にＣ13‐Ｃ17とＣ14‐Ｃ15の結合開裂による、１Ｈを伴ったＤ環の開裂イオンが観測された。これらの値とシクロアルタン系化合物の文献値（稲田らＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６巻、３７９−３８１頁、１９９７年）、化合物１３のスペクトル値との比較により、化合物１５は２５−ヒドロキシ−２４−メトキシシクロアルタン−３−オン構造を持つ事が明らかとなった。本構造が正しい事は、1Ｈ−1ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＮＯＥＳＹスペクトルの解析により確認した。
【００３７】
なお、化合物７、８は、２４−メチレンシクロアルタノール（化合物２）の化学的変換反応によって得られるものであってもよい。化学的変換反応を用いた化合物７，８の合成方法を以下に示す（図５参照）。
［化合物７の化学的方法による調製］
（１）化合物２（１００ｍｇ）を塩化メチレンに溶解させ、炭酸水素ナトリウム（２５０ｍｇ）、ｍ−クロロ過安息香酸（５００ｍｇ）を加え、室温にて４８時間、撹拌した。
（２）反応終了後、反応溶液を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて洗浄し、続いて塩化メチレン層は水で洗浄した。
【００３８】
（３）分取ＨＰＬＣ［溶離液：メタノール；流速３．０ｍＬ／分］を行い、２４，２４1−エポキシシクロアルタン−３β−オール（化合物１６；３１．６ｍｇ；保持時間１６．８分）を得た。
（４）化合物１６（８．７ｍｇ）を１，２−ジメトキシエタンに溶解させ、過塩素酸水溶液（２ｍＬ）を加え、室温にて１６時間、撹拌した。
（５）反応終了後、ジエチルエーテルにて抽出し、エーテル層を１Ｍ炭酸ナトリウム、続いて水で洗浄した。エーテル抽出部は分取ＨＰＬＣ［溶離液：メタノール；流速３．０ｍＬ／分］を行い、化合物７（２．６ｍ；保持時間１２．９分）を得た。
【００３９】
上述した本発明のシクロアルタン型トリテルペン系化合物は、単独であるいは混合して用いることができる。
また、本発明のシクロアルタン型トリテルペン系化合物は、適当な医薬用の担体又は希釈剤と組み合わせて医薬とすることができ、通常の如何なる方法によっても製剤化でき、経口又は非経口投与するための固体、半固体又は液体の剤形に処方することができる。処方にあたっては、他の医薬活性成分との配合剤としてもよい。
【００４０】
例えば、日本薬局方に記載されている各種製剤、即ち、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、乾燥エキス剤、トローチ剤等の内用固形製剤、流エキス剤、エリキシル剤、酒精剤、シロップ剤、リモナーデ剤等の内容液剤、チンキ剤、リニメント剤、ローション剤等の外用液剤、硬膏剤、軟膏剤、パップ剤等の外用剤などに製剤化できる。また、投与可能であるならば、吸入剤、エアゾール剤、注射剤、点眼剤、座剤等にも用途に応じて製剤化してもよい。
【００４１】
経口投与においては、成人に対し体重１ｋｇ当り０．５〜５００ｍｇ／日の範囲で投与するのが好ましい。
また、本発明のシクロアルタン型トリテルペン系化合物は発癌予防の薬剤として使用するだけでなく、種々の飲食品に添加し、発癌予防に有効な機能性飲食品を製造するのにも有用なものである。このような機能性飲食品の形態の例としては、顆粒、錠菓、ゼリー、飴、飲料などが挙げられる。さらに、本発明のシクロアルタン型トリテルペン系化合物は、人間の食べる食品としてだけでなく、ペット、家畜、競技用動物などの人間以外の動物の飼料に添加して利用され得る。
【００４２】
［化合物８の化学的方法による調製］
（１）〜（３） 上記（１）〜（３）と同じようにして、化合物１６を得た。
（４）化合物１６（８．７ｍｇ）を１，２−ジメトキシエタンに溶解させ、過塩素酸／メタノール（２ｍＬ）を加え、室温にて１６時間、撹拌した。
（５）反応終了後、ジエチルエーテルにて抽出し、エーテル層を１Ｍ炭酸ナトリウム、続いて水で洗浄した。エーテル抽出部は分取ＨＰＬＣ［溶離液：メタノール；流速３．０ｍＬ／分］を行い、化合物８（１．７ｍｇ；保持時間１８．３分）を得た。
【００４３】
［発癌予防効果の確認試験について］
次に、本発明の効果を確認するために行った試験について説明する。
（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）活性化抑制試験）
本研究者らは、ＥＢＶのゲノムを内蔵するバーキット・リンパ腫由来の培養細胞であるＲａｊｉ（ラジ）株において、ＥＢＶ・ゲノムの発現を阻害する化合物の多くが、マウス皮膚発癌二段階実験において抗発癌プロモーターとして作用する点に注目した。そして米糠抽出物から得られるシクロアルタン系トリテルペノイドの糸状菌による微生物変換反応から得られた変換生成物からＥＢＶ・ゲノムの発現を阻害するウイルス・ゲノム不活性化物質を探索した。ＥＢＶ・ゲノムの発現阻害作用に着目したこの方法はＲａｊｉ（ラジ）株培養系に、発癌プロモーターであるＴＰＡ（テトラデカノイルホルボールアセタート）と、活性発現のために相乗作用として働くｎ−酪酸、それに被験物質を加えて培養し、ＴＰＡにより活性化された細胞由来の抗体を用いる間接蛍光抗体法で検出する方法である。この方法は、迅速、かつ定量性に優れ、加えて、微量活性成分の検出が可能な点で優れた方法である。
【００４４】
まず、試験の手順について図７のスキームを参照しながら説明する。なお、本手順は、徳田らの方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０巻、３０９頁、１９９８）に準拠している。
（１）１×１０6／ｍＬのラジ細胞に、発癌プロモーターとして、２０ｎｇ／ｍＬの濃度の１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセタート（ＴＰＡ）を３２ｐｍｏ１加え、さらにＴＰＡの活性発現のために相乗作用として働くｎ−酪酸を加えた。
（２）そこに、水、エタノール、又はジメチルスルホキシドに溶解した所定量の被験物質を添加して、３７℃で４８時間培養した。
（３）培養終了後、上咽頭癌患者の血清（ＴＰＡにより活性化された細胞由来の抗体を含む）を用いた間接蛍光抗体法によりＥＢＶ早期抗原の発現を検出した。
【００４５】
上記の手順に従って検定を行った後、ＴＰＡのみを加えた群（コントロール）のＥＢＶ早期抗原の発現率を１００％として、被験物質添加群のＥＢＶ早期抗原の発現率を求め、次式（１）により被験物質のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を算出した。
ＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）＝
１００−被験物質添加群のＥＢＶ早期抗原の発現率（％）・・・式（１）
検定は、前述のように糸状菌Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｆｕｓａｒｉｏｉｄｅｓによるシクロアルタン系トリテルペノイドの変換反応より得た化合物１〜１５を被験物質とし、各被験物質を種々の濃度（被験物質／ＴＰＡのモル比）に調製して行った。この検定の結果を表５に示す。
シクロアルタン型トリテルペン（化合物１〜１５）のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）
【００４６】
【表５】
【００４７】
なお、被検物質の濃度が１０００倍モル濃度の欄の括弧内の数値は、ラジ細胞の生存率（％）を示す。この数値が高い方が正常細胞に対する悪影響が小さい、すなわち安全性が高いと言える。表５に示されるように、これらの化合物の阻害率は、ＴＰＡに対し１００倍モル濃度の時２８〜３７％であり、高い活性を有している。特に２４−メチルシクロアノレタン−３β，２４，２４1−トリオール（化合物７）、２４1−メトキシ−２４−メチルシクロアルタン−３β，２４−ジオール（化合物８）は１０倍モル濃度の時１５％以上と非常に高い活性を有しており、抗発癌プロモーター活性に優れる事が確認された。また、この阻害率は、ビタミンＡ誘導体であり、その発がん予防効果が種々の動物実験でも確認されているβ−カロテン（村上ら、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６０巻、１頁、１９９６）よりも高い値を示した。さらに、これらは本検定において高いラジ細胞生存率を示したことから、高い安全性を持つ発癌予防剤として期待できる。
【００４８】
さらに、本発明の効果を試験するために化合物１〜１５をＮＯ（一酸化窒素）障害に対する抑制試験を行い、活性を示したので説明する。
（ＮＯＲ１処理による細胞形態変化抑制試験）
（±）−（Ｅ）−４−メチル−２−［（Ｅ）−ハイドロキシイミノ］−５−ニトロ−６ムメトキシ−３−ヘキセナミド（ＮＯＲ１）処理による細胞形態変化抑制試験は、発癌イニシエーターの一次スクリーニング法として知られた試験である。ＮＯはガス状のフリーラジカルであり、その過剰産生が慢性化すると、胃がんや大腸がんの危険性が高まるといわれている。このことから、ＮＯの過剰生産を抑制することが発癌予防に有効であるといえる。この試験は迅速、かつ微量活性成分の検出が可能な点で優れた試験である
【００４９】
試験方法について説明する。なお、本手順は、秋久らの方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０５巻、９−１３頁、２００４年）に準拠している。
（１）イーグルの最小必要培地より得た５×１０5／ｍＬのヒト正常肝由来細胞を３日間培養する。
（２）そこに被検物質を加え、その１分後にＮＯドナーであるＮＯＲ１を加えＣＯ2インキュベーターで培養する。
（３）細胞の形態変化を光学顕微鏡にて測定する。（２５０以上の形態変化を示した細胞数を測定する。）
【００５０】
上記の手順に従って試験を行なった後、被検物質を加えない群をコントロールとし、次式によりＮＯＲ１処理によるＮＯ産性抑制率を算出した。
ＮＯＲ１処理による細胞形態変化抑制率
＝ＮＯＲ１のみで形態変化した細胞（％）／ＮＯＲ１と被検物質を加えたときの形態変化した細胞（％）…式（２）
【００５１】
前述のように糸状菌Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｆｕｓａｒｉｏｉｄｅｓによるシクロアルタン系トリテルペノイドの変換反応より得た化合物（１〜１５）を被験物質として行った検定の結果を表６に示す。なお、参照化合物として、発癌予防効果が知られているクルクミン（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ１５９巻、１３５頁、２０００年）と、ＮＯスカベンジャーである２−（４−カルボキシフェニル）−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾリン−１−オキシル ３−オキシド ナトリウム塩（カルボキシ−ＰＴＩＯ）の値も示した。
シクロアルタン型トリテルペン（化合物１〜１５）のＮＯ障害に対する抑制率
【００５２】
【表６】
【００５３】
表６に示されるように、化合物７、８は参照化合物であるクルクミンと同程度の活性を示した。このことから、これらの化合物は抗発癌イニシエーター活性に優れることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】糸状菌によるシクロアルテノール（化合物１）の微生物変換反応生成物（化合物３〜５）の化学構造式を示す図である。
【図２】糸状菌による２４−メチレンシクロアルタノール（化合物２）の微生物変換反応生成物（化合物５〜８）の化学構造式を示す図である。
【図３】糸状菌によるシクロアルテノン（化合物３）の微生物変換反応生成物（化合物９〜１５）の化学構造式を示す図である。
【図４】新規化合物７、８、１０、１５の化学構造式を示す図である。
【図５】本発明に係る新規化合物７、８、１０、１５のＮＯＥＳＹスペクトル法により得られた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）相関関係を説明する図である。
【図６】化合物７、８を化学的に合成する方法を示す図である。
【図７】ＥＢＶ活性化抑制試験の手順を説明する図である。
|
| 【出願人】 |
【識別番号】８９９００００５７
【氏名又は名称】学校法人日本大学
|
| 【出願日】 |
平成１６年１１月９日（２００４．１１．９） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００６６９８０
【弁理士】
【氏名又は名称】森 哲也
【識別番号】１０００７５５７９
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 嘉昭
【識別番号】１００１０３８５０
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 秀▲てつ▼
|
| 【公開番号】 |
特開２００６−１３１５９５（Ｐ２００６−１３１５９５Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１８年５月２５日（２００６．５．２５） |
| 【出願番号】 |
特願２００４−３２５３７０（Ｐ２００４−３２５３７０） |
|