徐放性抗腫瘍剤組成物

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【発明の名称】	徐放性抗腫瘍剤組成物
【発明者】	【氏名】大西啓【氏名】町田昌明【氏名】町田良治
【要約】	【課題】カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩の腫瘍部位への蓄積が可能な、あるいは腫瘍細胞の周囲の濃度を長時間にわたり有効域に保つことができる徐放性製剤を提供すること。【解決手段】カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩を、ポリ乳酸並びにポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体からなる担体に含有させた徐放性抗腫瘍剤組成物、その製造方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩を、ポリ乳酸並びにポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体からなる担体に含有させた徐放性抗腫瘍剤組成物。
【請求項２】
カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩が、7-エチル-10-[4-（1-ピペリジノ）-1-ピペリジノ]カルボニルオキシカンプトテシン又はその酸付加塩である請求項１記載の徐放性抗腫瘍剤組成物。
【請求項３】
担体の粒子径が80～300nmである請求項１又は２記載の徐放性抗腫瘍剤組成物。
【請求項４】
カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩、ポリ乳酸並びにポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体を１～２：５：３～５の重量比でアセトンに懸濁し、このアセトン懸濁液に水を添加した後、アセトンを蒸散させることを特徴とする、徐放性抗腫瘍剤組成物の製造方法。

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩を含有する徐放性抗腫瘍剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンプトテシンは中国産の木であるComptotheca acuminataより分離されたアルカロイドとして知られている（非特許文献１参照）。7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン（SN-38）は、カンプトテシンの半合成誘導体であり、塩酸イリノテカン（CPT-11）はSN-38のプロドラッグである（非特許文献２、３参照）。CPT-11は、SN-38と比べて各種の腫瘍に対してin vivoで極めて優れた作用を示すが（非特許文献４～６参照）、in vitro ではSN-38のほうが優れた作用を示す。この差異は、これら薬剤の薬物動態特性の違いに起因していると考えられている(非特許文献３参照)。カンプトテシンは時間依存的に効果を発現するため（非特許文献７参照）、薬剤の体内での残存時間を延長させることができれば、より高い効果が得られる。CPT-11がin vivoで優れた効果を示すのは、体液中での残存時間がSN-38よりも極めて長時間なためである（非特許文献２参照）。
【０００３】
一方、カンプトテシン誘導体の徐放性製剤としては、カンプトテシン誘導体をポリ乳酸又は乳酸－グリコール酸共重合体よりなるマトリックスに担持させた種々の剤形の徐放性製剤が知られている（特許文献１、２、非特許文献８～１０参照）。また、活性体SN-38をポリエチレングリコール修飾リポソームに直接高内封率で内封したナノスフェアリポソーム製剤が提案されている（特許文献３参照）。
【０００４】
しかしながら、ポリ乳酸又は乳酸－グリコール酸共重合体マトリックスに担持させた徐放性製剤を腹腔内投与した場合、腹水中のP388白血病細胞に対しては、マトリックスに担持させない製剤と同等又はそれ以上の抗腫瘍活性を示すが、皮下接種されたSarcoma180充実性腫瘍に対しては作用が低下する。すなわち、カンプトテシン誘導体の単純な徐放化は、腫瘍細胞に直接又は近接してカンプトテシン誘導体が放出された場合に限って良好な結果を示し、腫瘍細胞までの距離がある場合にはSN-38の濃度が不充分となり、ほとんど効果を示さない。従って、腫瘍部位に蓄積可能な、あるいは腫瘍細胞の周囲の濃度を長時間にわたり有効域に保つことができる新たな剤形の徐放性製剤、特に充実性腫瘍に対して優れた作用を示す徐放性製剤の開発が望まれている。
【特許文献１】特開平10-17472号公報
【特許文献２】特開2002-154963号公報
【特許文献３】特願2003-203064号明細書
【非特許文献１】Jpn.J.Cancer Chemother., 14, 850-857, 1987.
【非特許文献２】Cancer Res., 50, 1715-1720, 1990.
【非特許文献３】Cancer Res., 51, 4187-4191, 1991.
【非特許文献４】Cancer Chemother Pharmacol., 21, 71-74, 1988.
【非特許文献５】Jpn.J.Cancer Chemother., 15, 2757-2760, 1988.
【非特許文献６】Jpn.J.Cancer Chemother., 15, 2757-2760, 1990.
【非特許文献７】J.Aichi Me.Univ.Assoc., 15, 683-699, 1987.
【非特許文献８】Jpn. J. Hosp. Pharm., 24, 457-463, 1988.
【非特許文献９】S.T.P. Pharma. Sci., 8, 175-181, 1998.
【非特許文献１０】J. Control. Release, 66, 159-175, 2000.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩を高い内包率で内包し、かつ腫瘍部位への蓄積が可能な、あるいは腫瘍細胞の周囲の濃度を長時間にわたり有効域に保つことが可能な新たな剤形を有する徐放性製剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討したところ、カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩を、ポリ乳酸並びにポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体からなる担体に含有させることにより、内包率が高く、かつカンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩を腫瘍部位に蓄積でき、あるいは腫瘍細胞の周囲の濃度を長時間にわたり有効域に保つことができ、持続的な抗腫瘍効果を発現する徐放性抗腫瘍剤が得られることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩を、ポリ乳酸並びにポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体からなる担体に含有させた徐放性抗腫瘍剤組成物を提供するものである。
【０００７】
本発明はまた、カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩、ポリ乳酸並びにポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体を１～２：５：３～５の重量比でアセトンに懸濁し、このアセトン懸濁液に水を添加した後、アセトンを蒸散させることを特徴とする、徐放性抗腫瘍剤組成物の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の徐放性抗腫瘍剤組成物は、従来の徐放性抗腫瘍剤と比較してカンプトテシン誘導体を高内包率で内包するものであり、抗腫瘍効果が向上し、かつ効果の持続性が高い。また、投与部位より離れた部位に位置する腫瘍組織にも低用量で効果を発揮する。従って、本発明の徐放性抗腫瘍剤組成物は、従来の徐放性抗腫瘍剤ではほとんど効果の期待できなかった充実性腫瘍に対して有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明におけるカンプトテシン又はカンプトテシン誘導体としては、天然のカンプトテシン、天然由来のカンプトテシン誘導体（10-ヒドロキシカンプトテシン、11-ヒドロキシカンプトテシン、9-メトキシカンプトテシン、10-メトキシカンプトテシン、11-メトキシカンプトテシン等）、全合成法で得られたカンプトテシン及びカンプトテシン誘導体（特開平1-186892号公報、特開平1-279891号公報）などが挙げられる。また、天然のカンプトテシン等を原料に用いて化学修飾して得られる、半合成法によるカンプトテシン誘導体等も挙げられる。
【００１０】
半合成法によるカンプトシン誘導体としては、7-ヒドロキシメチル体及びその誘導体（特公昭62-42911号公報及び特公昭62-42913号公報）、7-アルデヒド体及びその誘導体（特公昭62-47191号公報、特公昭62-47192号公報及び特公昭62-47189号公報）、7-エチルカンプトテシン、7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン、7-エチル-10-［4-（1-ピペリジノ）-1-ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシンなどの7-アルキル体（特公昭62-42914号公報）、7-カルボン酸誘導体（特開昭58-154582号公報）、5-ヒドロキシ体及びその誘導体（特公昭62-42912号公報、特開昭56-12394号公報、特公昭63-6072号公報）、カンプトテシンのＡ環の９位、10位、11位及び12位にニトロ基、アミノ基、ハロゲン基などの種々の置換基を有する誘導体（特公昭62-47193号公報、特公昭63-6070号公報、特公平3-10630号公報、特公平3-12070号公報、特公平4-34999号公報）が挙げられる。更に、カンプトテシン誘導体を水溶性型のプロドラッグタイプのものとした誘導体群、例えば、Ａ環にアミノカルボニロキシ基を有するもの（特公平3-68007号公報）、Ａ環のヒドロキシル基をリン酸エステル、硫酸エステル、グリコシドとしたもの(特公平5-69112号公報、特開昭62-195384号公報、特開昭63-238098号公報)、また、20位水酸基に各種可溶化基を結合させたもの(特公平5-69111号公報、特開平1-249777号公報)、Ｅ環ラクトン環開環型の可溶化誘導体(特開平1-131179号公報)などが挙げられる。
【００１１】
また、カンプトテシン又はカンプトテシン誘導体の塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩類；酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩類；塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸類などが挙げられ、有機酸又は無機酸の付加塩が好ましい。カンプトテシン又はカンプトテシン誘導体の塩の具体例としては、カンプトテシンナトリウム塩、7-エチル-10-［4-（1-ピペリジノ）-1-ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン塩酸塩（塩酸イリノテカン）が挙げられる。
【００１２】
本発明に使用されるカンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩は、7-エチル-10-［4-（1-ピペリジノ）-1-ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン又はその酸付加塩が特に好ましい。
【００１３】
本発明に使用されるカンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩の量は、標的となる腫瘍に有効で且つ白血球減少などの重篤な副作用を招かない濃度であればよく、各々の活性又は目的に合わせて適宜決定すればよい。例えば、塩酸イリノテカンであれば１回の投与量は、体重あたり10～200mg/kgが好ましく、特に50～100mg/kgが好ましい。
【００１４】
本発明に使用される担体は、ポリ乳酸並びにポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体からなる。これらのうち、ポリ乳酸及びポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステルからなる担体、又はポリ乳酸及びエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体からなる担体が特に好ましい。
【００１５】
ここで乳酸としてはD-乳酸、L-乳酸、D，L-乳酸のいずれも使用できるが、D，L-乳酸が特に好ましい。ポリ乳酸の重量平均分子量は、徐放性の点から、5,000～30,000が好ましく、特に10,000～15,000が好ましい。
【００１６】
ポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステルにおける脂肪酸部分としては、炭素数６～24の脂肪酸、例えばラウリン酸、ステアリン酸等が挙げられ、ステアリン酸が特に好ましい。ポリエチレングリコール部分としては、重量平均分子量400～3,000のものが好ましく、特に重量平均分子量600～2,000のものが好ましい。ポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステルは、担体表面をコーティングして担体表面を親水性にする。担体表面を親水性にすることにより、細網内細胞による担体の捕獲が回避され、血液中での担体の残留が回避される。
【００１７】
エチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体は、担体中にカンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩を内包した微小粒子（いわゆるナノパーティクル）の懸濁安定剤として使用される。エチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体におけるエチレングリコール、プロピレングリコール、エチレングリコールの重合比は２～130：15～67：２～130が好ましく、特に70～80：25～35：70～80が好ましい。エチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体の重量平均分子量は、徐放性の点から、5,000～10,000が好ましく、特に8,000～9,000が好ましい。
【００１８】
本発明の徐放性抗腫瘍剤組成物中の、カンプトテシン、その誘導体又はそれらの塩；ポリ乳酸；ポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体の配合量は、重量比で１～２：５：３～５であることが好ましい。
【００１９】
本発明の徐放性抗腫瘍剤組成物は、以下の製造方法に示すように、上記担体中にカンプトテシン誘導体を内包したナノパーティクルの懸濁液として得られる。このナノパーティクルの粒子径は、製剤の剤形によっても異なるが、80～300nmが好ましい。具体的には、ポリ乳酸及びポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステルを担体とするカンプトテシン内包ナノパーティクル（「NP-A」とする）の粒子径は、110～270nmが特に好ましく、平均粒径は150nmが好ましい。ポリ乳酸及びエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体を担体とするカンプトテシン内包ナノパーティクル（「NP-B」とする）の粒子径は、80～210nmが特に好ましく、平均粒径は118nmが好ましい。担体の粒子径が80nm未満では、カンプトテシン誘導体が腫瘍部位から血中に戻り易く、300nmを超えると細網内細胞によって捕獲されるため、血中から腫瘍部位へ漏出しにくい。静脈内投与用としては100～200nmが好ましい。このような粒子径を有するナノパーティクルは、血管透過性が亢進している腫瘍組織などの局所に蓄積する性質がある。このような性質は、腫瘍新生血管の透過性の亢進と腫瘍組織における滞留性による効果（EPR）として知られている。
【００２０】
本発明の徐放性抗腫瘍剤組成物の製造方法としては、例えば、アセトン等の有機溶媒にカンプトテシン、その誘導体又はそれらの誘導体；ポリ乳酸；ポリエチレングリコールモノ脂肪酸エステル及び／又はエチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体の３成分を重量比１～２：５：３～５で配合し懸濁した後、水を添加し、有機溶媒を蒸散すればよい。水は有機溶媒とほぼ同量使用することが好ましい。有機溶媒の蒸散は、例えば32～38℃下で回転乾燥機等を使用して行うことができる。得られた懸濁液は共沈法、ゲルろ過法等により更に精製することにより、ナノパーティクルを整粒してもよい。整粒により、カンプトテシン誘導体の内包率が高くなる。得られたナノパーティクルはいずれも安定であり、特にNP-Bは高い安定性を示した。
【００２１】
このようにして製造されるナノパーティクル中のカンプトテシン誘導体の内包率は、後記実施例に示すように、NP-Aについては少なくとも20％（W/W）であり、従来法（Cancer Res., 127, 99-106, 1998.、特願2003-203064号明細書）に比較して高い。
【００２２】
本発明の徐放性抗腫瘍剤組成物には、更に必要に応じて、分散補助剤、賦形剤等の製薬的に不活性な添加剤を配合してもよく、ガス等の噴射剤、推進剤を配合することもできる。
このような添加剤としては、例えば、マンニトール、乳糖、デキストランなどの水溶性の単糖類、オリゴ糖類及び多糖類；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のゲル形成性又は水溶性のセルロース類；結晶性セルロース、α-セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム及びそれらの誘導体などの水吸収性でかつ水難溶性のセルロース類；ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペクチン及びそれらの誘導体などの水吸収性でかつ水難溶性の多糖類；アラビアガム、トラガントガム、グリコマンナン及びそれらの誘導体などの水吸収性でかつ水難溶性のガム類；ポリビニルピロリドン、架橋ポリアクリル酸及びその塩、架橋ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート及びそれらの誘導体などの架橋ビニル重合体類；リン脂質、コレステロール等のリポソーム等分子集合体を形成する脂質類等を挙げることができる。
【００２３】
噴射剤、推進剤としては、例えば、クロロフルオロカーボン類、ハイドロフルオロカーボン類、ハイドロカーボン類、ジメチルエーテル、窒素ガスなどを挙げることができる。
【００２４】
本発明の徐放性抗腫瘍剤組成物は、吸入粉剤、吸入液剤、エアゾール剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、リモナーデ剤等の内服、又は注射剤等の剤形で使用することができる。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
Ａ.実験材料及び方法
（１）材料
ポリ（DL-乳酸）（PLA、分子量10,000）は、和光純薬工業株式会社より購入した。ポリエチレングリコールモノステアレート（PEG-M、分子量2,000）は、東京化成工業株式会社より購入した。塩酸イリノテカン（CPT-11）及び7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン（SN-38）は、株式会社ヤクルト本社の製品を使用した。その他の化学品は試薬用であった。
【００２７】
（２）動物
体重190～200gの雄Wistarラット（６週齢）及び体重24～28gの雄ddYマウス（６週齢）は、東京実験動物株式会社より購入した。これらの動物は購入後直ちに動物実験に供した。全ての動物実験は、星薬科大学の動物実験のためのガイドラインに従って実施した。
【００２８】
（３）ナノパーティクル含有懸濁液（NP-S）の調製
CPT-11を水に溶解し、溶液のpHを重炭酸ナトリウムで8.5に調整した。得られた懸濁液を、クロロホルムを用いて数回抽出した。クロロホルム層を収集し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を蒸散させた。得られた黄白色の粉末をナノパーティクル調製用の薬剤として使用した。薬剤粉末（10mg）、PLA（50mg）及びPEG-M（50mg）を、３mLのアセトンに溶解した。この溶液に水（３mL）を添加し、回転乾燥機を用いて35℃下でアセトンを蒸散させた。得られた白色の水性懸濁液（2.8mL）をナノパーティクル含有懸濁液（NP-S）として使用した。
【００２９】
（４）NP-Sのin vitro特性
NP-S中のナノパーティクルの粒子径及び粒度分布をELS-800（大塚電子株式会社）を用いた動的光散乱で測定した。２種の方法を用いて、NP-S中のナノパーティクルと遊離しているイリノテカンと分離した。すなわち、NP-Sを35,000rpmで20分間超遠心、又は溶出溶媒として水を用いたSephadex-G50カラム（内径３cm×長さ14cm）によるゲル濾過を行った。分離したナノパーティクルから溶媒を蒸散させて乾燥し、得られた化合物の重量を測定した。乾燥させたナノパーティクルをクロロホルムに溶解し、ナノパーティクル中に含有する薬物量を365nmの分光光度計で測定した。
【００３０】
（５）Sarcoma180充実性腫瘍に対するin vivoでの抗腫瘍作用
雄のddYマウスに1匹あたり１×10⁷個のSarcoma180細胞を毎週、Hanks 緩衝塩類溶液（0.1mL）に懸濁して腹腔内に接種した。抗腫瘍試験では、上述の調製で得られた１×10⁷個のSarcoma180細胞をHanks 緩衝塩類溶液（0.1mL）に懸濁し、新たな各雄のddYマウスの腋窩部に接種した。NP-S又はCPT-11溶液（0.2mL）を、腫瘍接種後第７、８及び９日目に20mgイリノテカン当量/kgの用量、すなわち20×３mgイリノテカン当量/kgを尾静脈に反復静脈内投与した（n=５）。対照群には、同量の生理食塩水を同じスケジュールで投与した。
【００３１】
腫瘍容積V（cm³）、長径の長さL（cm）及び長径に直交する軸の長さ（幅）W（cm）を用いて、以下の式より計算した。
V＝L×W²/2 (1)
薬剤投与直前に測定した腫瘍容積を、初期腫瘍容積と定義した。腫瘍の成長率は、初期腫瘍容積に対するある時点の腫瘍容積の割合から計算した。同時に、各マウスの体重変動を測定し、毒性、副作用の指標とした。
【００３２】
（６）静脈内投与後の血漿中濃度
雄Wistarラットに、生理食塩水にウレタンを0.9g/４mL/kg添加した溶液を腹腔内投与して麻酔をかけ、ラットの背中を固定した。CPT-11水溶液又はNP-S（0.2mL）を、１匹あたり３mgイリノテカン当量/kgずつ頸静脈より静脈内投与した。へパリン入り注射器を使用して、規定した時間に血液サンプル（0.5mL）を採取し、血漿を得るために15,000rpmにて30秒間遠心分離をした。その直後に0.15Mのリン酸水溶液（0.2mL）を血漿（0.1mL）に添加し、よく混合した。その後、クロロホルム（0.3mL）を添加し、混合液をよく攪拌した。3,000rpmにて10分間遠心分離をした後、20μLのクロロホルム層を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に直接注入し、イリノテカンの濃度を測定した。この濃度はNP-Sでは総イリノテカン濃度（ナノパーティクル中に保持されたイリノテカン[内包型]及び遊離のイリノテカン[遊離型]）を示し、CPT-11水溶液では遊離型イリノテカンの濃度を示す。
【００３３】
HPLCでの分析は25℃で実施した。島津LC-6Aに励起波長及び発光波長をそれぞれ355及び515nmに設定した蛍光検出器、島津RF-10AXLを装着して使用した。分析カラムとして、Nova-Pack5C13カラム（内径4.6mm×長さ150mm）を使用した。移動相に、0.075Mの酢酸アンモニウム緩衝液、pH6.4及び５mMのリン酸二水素テトラブチルアンモニウムを含有したアセトニトリル（78：22、v/v）を混合し、また、流率を１mL/分に設定した。
【００３４】
（７）薬物動態の解析
薬物動態パラメータは、以下の式で計算した。
AUC＝∫₀∞Cp dt （2）
MRT＝∫₀∞（Cp×t） dt/AUC （3）
VRT＝∫₀∞[Cp×（t-MRT）²] dt/AUC （4）
ここで、Cpは時間tにおける血漿中濃度を意味する。t=０のCpは初期の３測定点を使用して外挿し、最終相の血漿中濃度はmono-exponential減衰に従うと仮定して、t=∞のCp曲線の外挿を行った。各パラメータは台形法を用いて計算した。
【００３５】
（８）統計解析
統計解析は対応のないt検定を用い、有意水準をp＜0.05とした。
【００３６】
Ｂ．結果
（１）NP-Sのin vitro特性
NP-S中のナノパーティクルの平均直径は150nmであり、粒子径は主に110～270nmに分布していた（図１）。PLA（50mg）、イリノテカン（10mg）及びPEG-M（50mg）からNP-Sを調製し、全てのナノパーティクルを超遠心分離及びゲル濾過によって分離すると、それぞれ35mg及び67mgとなった。超遠心分離及びゲル濾過による薬物の回収率は、それぞれ22%及び21%（w/w）であった。すなわち、添加した薬物の少なくとも20%（w/w）はナノパーティクル中に保持された。尚、図１中、直径が20～30nmの小粒子はPEG-Mである。
【００３７】
超遠心によって分離されたナノパーティクルを水に再懸濁させることは不可能であった。ゲル濾過によって分離されたナノパーティクルについては、その後のin vivo試験用に濃縮する必要があるが、濃縮によって薬物含量などの粒子特性がある程度変化することが判った。一方、分離前のNP-Sは、ある程度の遊離型イリノテカンを含有しているものの、全ての調製において同様の収率、粒径、及び薬物含量が再現された。従って、遊離型イリノテカンとナノパーティクル中のイリノテカンが混在してはいるが、NP-Sそれ自体を抗腫瘍作用試験及び薬物動態試験に使用した。
【００３８】
（２）Sarcoma180充実性腫瘍に対するin vivoでの抗腫瘍作用
NP-Sの抗腫瘍作用を、腋窩部にSarcoma180充実性腫瘍を皮下接種したマウスを用いて、腫瘍成長の抑制度によって評価した。その結果を図２に示す。図２から明らかなように、初期腫瘍容積からの増加度は、観察期間を通してNP-S群のほうがCPT-11溶液群より低かった。NP-Sは観察期間を通して、投与後の腫瘍成長を有意に抑制した。投与開始後19日目では、NP-S群、CPT-11溶液群及び対照群の腫瘍増加度はそれぞれ11、22及び70であった。
【００３９】
平均体重の変化を毒性、副作用の指標として使用し、その結果を図３に示す。図３から明らかなように、投与開始後数日において、NP-S群及びCPT-11溶液群ではわずかに体重が減少した。その後の数日間で体重は回復し、続いて増加した。対照群においては、体重の減少は認められなかった。さらに、イリノテカン投与により高頻度に発現する副作用として知られている下痢は、NP-S群においてもCPT-11溶液群においても認められなかった。
【００４０】
（３）静脈内投与後のイリノテカン血漿中濃度
ラットにNP-S及びCPT-11水溶液を静脈内投与したときの血漿中濃度を検討した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、CPT-11水溶液（３mgイリノテカン当量/kg）を静脈内投与すると、イリノテカンの血漿中濃度は注射後１時間で0.70μg/mLであった。また、注射後２時間、４時間及び８時間の血漿中濃度はmono-exponentialに減少し、それぞれ0.36、0.12及び0.02μg/mLであった。一方、NP-S（３mgイリノテカン当量/kg）を静脈内投与した際の投与後１、２、４、８及び24時間のイリノテカン血漿中濃度は、それぞれ0.62、0.37、0.37、及び0.04、0.04μg/mLであった。投与後４時間では、イリノテカン（内包型及び遊離型）の血漿中濃度はNP-S群のほうがCPT-11水溶液群より有意に高値であった。
【００４１】
（４）薬物動態
薬物動態パラメータを表１に示す。結果は平均±SE（n=５）で示した。
【００４２】
【表１】

【００４３】
表１から明らかなように、各パラメータはNP-Sのほうが高値であり、NP-SのMRT及びVRTはCPT-11水溶液より有意に高値を示した。このように、NP-SはCPT-11水溶液よりも長時間イリノテカンの血漿中濃度を維持した。
また、SN-38についてNP-Sと同様にHPLC法で測定すると、SN-38の血漿中濃度は投与後８及び24時間においてそれぞれ３及び２ng/mL以上となった。
【００４４】
実施例２
Ａ.実験材料及び方法
（１）材料
ポリ（DL-乳酸）（PLA、分子量10000）は、和光純薬工業株式会社より、エチレングリコール－プロピレングリコール－エチレングリコール共重合体（PEG-PPG-PEG、分子量8400, 80％（W/W）エチレングリコール）は、Aldrich Chemical Company, Inc.より購入した。CPT-11及びSN-38は、株式会社ヤクルト本社の製品を使用した。
【００４５】
（２）動物
体重190～210g（6週齢）の雄Wistarラット及び体重24～28 g（6週齢）の雄ddYマウスを東京実験動物株式会社から購入した。これらは購入後直ちに動物実験に供した。動物実験は全て星薬科大学の動物実験のためのガイドラインに準拠して実施した。
【００４６】
（３）ナノパーティクルの調製
実施例１と同等にして得たナノパーティクル（NP）調製用粉末（20mg）、PLA（50mg）及びｃPEG-PPG-PEG（30mg）を３mLのアセトンに溶解した。この溶液に水（３mL）を添加し、回転乾燥機により35℃で１時間処理し、アセトンを蒸散させ、NPを得た。次いで、Sephadex G-50カラム（内径３cm×長さ14cm）を用い、水を溶出液としてNPを遊離薬剤から分離した。得られたNP水性懸濁液を約２mLに濃縮し、以下の実験に供した。
【００４７】
（４）粒子特性
NPの粒径分布は、NP水性懸濁液を水で適当に希釈した後、dynamic light scatteringによりELS-800（大塚電子株式会社）を用いて測定した。NPの収率は、（添加PLA＋添加PEG-PPG-PEG＋添加イリノテカン）又は（添加PLA＋添加イリノテカン）の総量に対するNP回収量の比として算出した。NP水性懸濁液の特定量を窒素ガス下で40℃にて乾燥した後、残渣をクロロホルムに溶解し、NPに含まれるイリノテカン量を測定するために365nmで分光高度分析に供した。薬剤回収率は、イリノテカン添加量に対するイリノテカン回収量の比として算出した。
【００４８】
Sarcoma180充実性腫瘍に対するin vivoでの抗腫瘍作用試験、静脈内投与後の血漿中濃度試験、薬物動態の解析は実施例１と同様にして行った。
【００４９】
Ｂ．結果
（１）粒子特性
得られたNPの平均粒径は118nmであり、粒径分布は80～210nmであった（図５）。この大きさは、網内系による取り込みを阻止するのに十分であり、その結果、高度な血管透過性を示す疾患部位への受動的な送達が可能となる。（NP回収量）/（PLA、PEG-PPG-PEG及びイリノテカンの総添加量：100mg）並びに（NP回収量）/（PLA及びイリノテカンの総添加量：70mg）から算出した収率は、それぞれ50及び72%（W/W）であった。さらに、薬剤内包率及び薬剤回収率は、それぞれ4.5及び11％（W/W）であった。
【００５０】
（２）Sarcoma180充実性腫瘍に対するin vivoでの抗腫瘍作用
皮下接種したSarcoma180充実性腫瘍の成長率を、NP水性懸濁液、CPT-11水溶液及び対照（生理食塩水）とで比較した（図６）。NP水性懸濁液では腫瘍成長の有意な抑制が認められたが、CPT-11水溶液では対照と比べて顕著な差が認められなかった。平均体重変化は、毒性、副作用の指標として用いた（図７）。体重は、当初の体重から減少せず、観察期間中の平均体重は対照＞CPT-11水溶液＞NP水性懸濁液の順に重かった。下痢は毒性、副作用の一つとして知られているが、NP水性懸濁液、CPT-11水溶液のいずれにおいても観察されなかった。
【００５１】
（３）静脈内投与後の血漿中濃度－時間プロファイル
血漿中濃度－時間プロファイルをNP水性懸濁液及びCPT-11水溶液の静脈内投与後に調査した。NP水性懸濁液では、イリノテカンの（NP内包型及び遊離型）総濃度を示した。CPT-11水溶液の静脈内投与（３mgリノテカン当量/kg）の場合には、血漿中濃度は投与１時間後に0.70μg/mLとなり、投与８時間後にはmono-exponentialに0.02μg/mLまで減少した。NP水性懸濁液を静注した場合、投与１時間及び２時間後の血漿中濃度は、それぞれ0.46及び0.18μg/mLであり、CPT-11水溶液の場合よりも低かった。しかしながら、投与４時間後の血漿中濃度はNP水性懸濁液のほうがCPT-11水溶液よりも高い傾向にあった（図８）。
【００５２】
薬物動態評パラメータを表２に示す。結果は平均±S.E.（CPT-11水溶液はn=５、NP水性懸濁液はn=４）で示す。
【００５３】
【表２】

【００５４】
表２から明らかなように、各評価項目ともNP水性懸濁液のほうが高く、MRT及びVRTは顕著に高かった。また、同様のHPLC法により、SN-38の血漿中濃度は、NP水性懸濁液で投与８時間後に７ng/mL以上になることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】NP-S中のナノパーティクルの粒子径の分布を示す図である[横軸は粒子の直径（nm）を示し、縦軸は光度に比例したγ（ガンマ）の頻度（％）による粒子径の分布比率を示す。]。
【図２】Sarcoma180充実性腫瘍の成長に対する静脈内投与でのNP-S（黒丸）及びCPT-11水溶液（黒三角）の抑制作用を示す図である[対照群を白丸で示す。皮下接種後の第７～９日に毎日20mgイリノテカン当量/kg、すなわちマウス１匹あたり20×３mgイリノテカン当量/kgの用量を注射した。各ポイントは平均±SE（n=５）を示す。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001対対照群。]。
【図３】NP-S（黒丸）及びCPT-11水溶液（黒三角）を静脈内投与したときのSarcoma180接種マウスの体重変化を示す図である[対照群を白丸で示す。皮下接種後第7～9日に毎日20mgイリノテカン当量/kg、すなわちマウス１匹あたり20×３mgイリノテカン当量/kgの用量を注射した。各ポイントは平均±SE（n=５）を示す。]。
【図４】NP-S（黒丸）及びCPT-11水溶液（黒三角）を静脈内投与したときのイリノテカン血漿中濃度‐時間プロファイルを示す図である[いずれの剤型もラットに３mgイリノテカン当量/kgの用量を注射した。各ポイントは平均±SE（n=４～５）を示す。*p＜0.05対CPT-11水溶液。]。
【図５】NP-Bの粒子径の分布を示す図である[横軸は粒子の直径（nm）を示し、縦軸は光度に比例したγ（ガンマ）の頻度（％）による粒子径の分布比率を示す。]。
【図６】NP水性懸濁液（黒丸）及びCPT-11水溶液（黒三角）静脈内投与後のSarcoma180充実性腫瘍に対する成長阻害作用を示す図である[対照は白丸で示す。各日の静脈内投与は、皮下接種７～９日後に20m イリノテカン当量/kg（20×３イリノテカン当量/kg）を投与して実施。点はそれぞれ平均±S.E．（n=５）を表す。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001対対照。]。
【図７】Sarcoma180担癌マウスのNP水性懸濁液（黒丸）及びCPT-11水溶液（黒三角）静注後の体重変化を示す図である[データは図６に示すマウスで得られたもの。対照は白丸で示す。各日の静脈内投与は、皮下接種７～９日後に20mgイリノテカン当量/kg（20×３イリノテカン当量/kg）を投与して実施。点はそれぞれ平均±S.E.（n=５）を表す。]。
【図８】NP水性懸濁液（黒丸）及びCPT-11水溶液（黒三角）をラットに静注後のイリノテカン血漿中濃度－時間プロファイルを示す図である[各標本とも３mgイリノテカン当量/kgをラットに静注。点はそれぞれ平均±S.E.（n=４～５）を表す。*p＜0.05対CPT-11水溶液。]。

【出願人】	【識別番号】０００００６８８４【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社【識別番号】５００５２４９３６【氏名又は名称】医療法人財団中山会八王子消化器病院【識別番号】５００５２４９４７【氏名又は名称】町田良治
【出願日】	平成１６年１１月１日（２００４．１１．１）
【代理人】	【識別番号】１１０００００８４【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所【識別番号】１０００６８７００【弁理士】【氏名又は名称】有賀三幸【識別番号】１０００７７５６２【弁理士】【氏名又は名称】高野登志雄【識別番号】１０００９６７３６【弁理士】【氏名又は名称】中嶋俊夫【識別番号】１００１１７１５６【弁理士】【氏名又は名称】村田正樹【識別番号】１００１１１０２８【弁理士】【氏名又は名称】山本博人【識別番号】１０００８９０４８【弁理士】【氏名又は名称】浅野康隆【識別番号】１００１０１３１７【弁理士】【氏名又は名称】的場ひろみ
【公開番号】	特開２００６－１２４３５１（Ｐ２００６－１２４３５１Ａ）
【公開日】	平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願番号】	特願２００４－３１７５４９（Ｐ２００４－３１７５４９）