| 【発明の名称】 |
免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有オリゴリボヌクレオチド |
| 【発明者】 |
【氏名】グレイソン ベー． リプフォルト
【氏名】シュテファン バウアー
【氏名】ハーマン ヴァーグナー
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| 【要約】 |
【課題】免疫賦活性リボ核酸、該免疫賦活性リボ核酸のホモログ、ならびに該免疫賦活性リボ核酸およびホモログの利用方法の提供。
【解決手段】少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマー、ならびに必要に応じて、 陽イオン性脂質を含む免疫賦活性組成物であって、１実施形態において、上記単離ＲＮＡオリゴマーがＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである組成物であり、別の実施形態において、上記塩基配列が５’−ＲＵＲＧＹ−３’を含み、Ｒがプリンを表すものとし、Ｕがウラシルを表すものとし、Ｇがグアニンを表すものとし、およびＹがピリミジンを表すものとする組成物。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマー、ならびに必要に応じて、
陽イオン性脂質
を含む免疫賦活性組成物。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、全体として、免疫学および免疫賦活の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫賦活性リボ核酸、該免疫賦活性リボ核酸のホモログ、ならびに該免疫賦活性リボ核酸およびホモログの利用方法に関する。本発明の組成物および方法は、トル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体７（ＴＬＲ−７）およびトル様受容体８（ＴＬＲ８）を介するシグナル伝達を誘起するのに有用であると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫反応は、概念的には、先天性免疫と適応免疫に分類される。先天性免疫は、感染性細菌により発現される特定の種類の分子もしくは外来性高分子が同様に共有している病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識を含むと考えられている。また、ＰＡＭＰは、特定の免疫細胞のパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識されると考えられている。
【０００３】
トル様受容体（ＴＬＲ）は、哺乳動物の先天性免疫において重要な役割を果たす高度に保存されたポリペプチドのファミリーである。現在、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と呼ばれる１０個のファミリー・メンバーが同定されている。種々のＴＬＲの細胞質ドメインは、トル−インターロイキン１（ＩＬ−１）受容体（ＴＩＲ）ドメインによって特徴付けられる。メドジトフ・Ｒほか（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ Ｒ．ｅｔ ａｌ．）（１９９８年）モレキュラー・セル（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ）２：ｐ２５３−８参照。ＴＬＲによって細菌の侵入が認識されると、ショウジョウバエおよび哺乳動物において進化的に保存されているシグナル伝達系が賦活化される。ＴＩＲドメイン含有アダプタ蛋白質ＭｙＤ８８は、ＴＬＲと一体となってＩＬ−１受容体関与キナーゼ（ＩＲＡＫ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関与ファクター６（ＴＲＡＦ６）をＴＬＲに動員すると報告されている。このＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路は、免疫賦活の重要な段階であるＮＦ−ｋＢ転写因子およびｃ−Ｊｕｎ ＮＨ２末端キナーゼ（Ｊｎｋ）マイトジェン賦活化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫｓ）の賦活化、ならびに炎症性サイトカインの産生をもたらすと考えられている。総説としては、アデレム・Ａほか（Ａｄｅｒｅｍ Ａ．ｅｔ ａｌ．）（２０００年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４０６：ｐ７８２−８７を参照されたい。
【０００４】
特定のＴＬＲリガンドがいくつか報告されているが、一部のＴＬＲのリガンドについてはまだ特定されていない。ＴＬＲ２のリガンドとしては、ペプチドグリカンおよびリポペプチドが挙げられる。ヨシムラ・Ａほか（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ａ．ｅｔ ａｌ．）（１９９９年）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６３：ｐ１−５；ヨシムラ・Ａほか（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ａ．ｅｔ ａｌ．）（１９９９年）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６３：ｐ１−５；アリプランティス・Ａ・Ｏほか（Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓ ＡＯｅｔ ａｌ．）（１９９９年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８５：ｐ７３６−９参照。ウイルス由来二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、およびｄｓＲＮＡの合成アナログであるポリＩ：Ｃは、ＴＬＲ３のリガンドであると報告されている。アレクソプロー・Ｌほか（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ Ｌ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４１３：ｐ７３２−８参照。リポ多糖体（ＬＰＳ）はＴＬＲ４のリガンドである。ポルトラク・Ａほか（Ｐｏｌｔｏｒａｋ Ａ．ｅｔ ａｌ．）（１９９８年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８２：ｐ２０８５−８；ホシノ・Ｋほか（Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．）（１９９９年）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６２：ｐ３７４９−５２参照。細菌性フラジェリンはＴＬＲ５のリガンドである。ハヤシ・Ｆほか（Ｈａｙａｓｈｉ Ｆ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４１０：ｐ１０９９−１１０３参照。ペプチドグリカンは、ＴＬＲ２のリガンドであるばかりでなく、ＴＬＲ６のリガンドでもある。オジンスキー・Ａほか（Ｏｚｉｎｓｋｙ Ａ．ｅｔ ａｌ．）（２０００年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ）ＵＳＡ９７：ｐ１３７６６−７１；タケウチ・Ｏほか（Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｏ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）インターナショナル・イムノロジー（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１３：ｐ９３３−４０参照。細菌性ＤＮＡ（ＣｐＧ ＤＮＡ）は、ＴＬＲ９リガンドであると報告されている。ヘンミ・Ｈほか（Ｈｅｍｍｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．）（２０００年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４０８：ｐ７４０−５；バウアー・Ｓほか（Ｂａｕｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ）ＵＳＡ９８：ｐ９２３７−４２参照。上記に挙げたＴＬＲリガンドは全て、天然のリガンド、即ち、感染性細菌によって発現される分子として自然界に存在するＴＬＲリガンドを含む。
【０００５】
ＴＬＲ１、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ１０の天然リガンドは知られていないが、最近、一部の低分子量合成化合物イミダゾキノロン類のイミキモッド（Ｒ−８３７）およびレシキモッド（Ｒ−８４８）がＴＬＲ７のリガンドであると報告された。ヘンミ・Ｈほか（Ｈｅｍｍｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．）（２００２年）ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）３：ｐ１９６−２００参照。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（項目１）
少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマー、ならびに必要に応じて、
陽イオン性脂質
を含む免疫賦活性組成物。
（項目２）
項目１に記載の組成物であって、前記単離ＲＮＡオリゴマーがＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである組成物。
（項目３）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＲＵＲＧＹ−３’を含み、Ｒがプリンを表すものとし、Ｕがウラシルを表すものとし、Ｇがグアニンを表すものとし、およびＹがピリミジンを表すものとする組成物。
（項目４）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＡＧＵ−３’を含み、Ａがアデニンを表すものとする組成物。
（項目５）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＡＧＵＧＵ−３’を含む組成物。
（項目６）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＵＧＢ−３’を含み、ＢがＵ、ＧもしくはＣを表すものとし、Ｃがシトシンを表すものとする組成物。
（項目７）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＧＵＧ−３’を含む組成物。
（項目８）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を含む組成物。
（項目９）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む組成物。
（項目１０）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＣＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む組成物。
（項目１１）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＣＵＣＧＧＣＡＣ−３’を含む組成物。
（項目１２）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが５〜１２ヌクレオチド長である組成物。
（項目１３）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列にＣｐＧジヌクレオチドがない組成物。
（項目１４）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が少なくとも５０パーセント自己相補性である組成物。
（項目１５）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが複数のオリゴマーである組成物。
（項目１６）
項目１５に記載の組成物であって、前記複数のオリゴマーが第１の塩基配列を有するオリゴマーおよび第２の塩基配列を有するオリゴマーを含み、該第１の塩基配列および該第
２の塩基配列が少なくとも５０パーセント相補性であるものとする組成物。
（項目１７）
項目１５に記載の組成物であって、前記複数のオリゴマーが５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を含む塩基配列を有するオリゴマーおよび５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む塩基配列を有するオリゴマーを含む組成物。
（項目１８）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが非天然型主鎖結合を含む組成物。
（項目１９）
項目１８に記載の組成物であって、前記非天然型主鎖結合がホスホロチエート結合である組成物。
（項目２０）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが７−デアザグアノシン、８−アザグアノシン、５−メチルウラシルおよびシュードウラシルからなる群から選ばれる修飾塩基を含む組成物。
（項目２１）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが修飾糖を含む組成物。
（項目２２）
項目１に記載の組成物であって、前記陽イオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−サルフェート（ＤＯＴＡＰ）である組成物。
（項目２３）
項目１に記載の組成物であって、さらに抗原を含む組成物。
（項目２４）
項目２３に記載の組成物であって、前記抗原がアレルゲンである組成物。
（項目２５）
項目２３に記載の組成物であって、前記抗原が癌抗原である組成物。
（項目２６）
項目２３に記載の組成物であって、前記抗原が微生物抗原である組成物。
（項目２７）
項目１に記載の組成物であって、さらに医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
（項目２８）
有効量の項目１〜２７のうちの任意の１項に記載の組成物を免疫細胞と接触させて該免疫細胞の賦活化を誘起する工程
を含む免疫細胞を賦活化する方法。
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、前記免疫細胞の賦活化が該免疫細胞によるサイトカインもしくはケモカインの分泌を含む方法。
（項目３０）
項目２９に記載の方法であって、前記サイトカインがインターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン（ＩＦＮ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）からなる群から選ばれる方法。
（項目３１）
項目２９に記載の方法であって、前記ケモカインがインターフェロン−ガンマ誘導蛋白質１０（ＩＰ−１０）である方法。
（項目３２）
項目２８に記載の方法であって、前記免疫細胞の賦活化がＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路の賦活化を含む方法。
（項目３３）
項目３２に記載の方法であって、前記ＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路がトル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体（ＴＬＲ）と関連している方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法であって、前記ＴＬＲがＴＬＲ８である方法。
（項目３５）
項目３３に記載の方法であって、前記ＴＬＲがＴＬＲ７である方法。
（項目３６）
有効量の項目１〜２７のうちの任意の１項に記載の組成物を被験体に投与して該被験体の免疫反応を誘起する工程
を含む、被験体の免疫反応を誘起する方法。
（項目３７）
項目３６に記載の方法であって、前記被験体が癌に罹患しているか、罹患するリスクを有する方法。
（項目３８）
項目３６に記載の方法であって、前記被験体がウイルス、細菌、真菌および寄生生物からなる群から選ばれる外的病原因子による感染症に罹患しているか、罹患するリスクを有する方法。
（項目３９）
項目３６に記載の方法であって、前記被験体がウイルス感染症に罹患しているか、罹患するリスクを有する方法。
（項目４０）
抗原を被験体に投与する工程、および
有効量の項目１〜２２のうちの任意の１項もしくは項目２７に記載の組成物を該被験体に投与して該抗原に対する免疫反応を誘起すること
を含む、被験体の免疫反応を誘起する方法。
（項目４１）
項目４０に記載の方法であって、前記抗原がアレルゲンである方法。
（項目４２）
項目４０に記載の方法であって、前記抗原が癌抗原である方法。
（項目４３）
項目４０に記載の方法であって、前記抗原が微生物抗原である方法。
（項目４４）
被験体の樹状細胞を単離し、
項目１〜２２のうちの任意の１項もしくは項目２７に記載の組成物と該樹状細胞を生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で接触させる工程、
抗原と該樹状細胞を生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で接触させる工程、および
該接触させた樹状細胞を該被験体に投与する工程
を含む、被験体の免疫反応を誘起する方法。
（項目４５）
項目４４に記載の方法であって、前記抗原がアレルゲンである方法。
（項目４６）
項目４４に記載の方法であって、前記抗原が癌抗原である方法。
（項目４７）
項目４４に記載の方法であって、前記抗原が微生物抗原である方法。
（項目４８）
ＴＬＲ８シグナル伝達を誘起するのに有効な量の、トル様受容体８（ＴＬＲ８）のリガンド、および
別のＴＬＲによるシグナル伝達を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０からなる群から選ばれる該別のＴＬＲのリガンド
を含む組成物。
（項目４９）
項目４８に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ３である組成物。
（項目５０）
項目４８に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ７である組成物。
（項目５１）
項目４８に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ９である組成物。
（項目５２）
項目４８に記載の組成物であって、ＴＬＲ８の前記リガンドおよび前記別のＴＬＲのリガンドが結合されている組成物。
（項目５３）
項目４８に記載の組成物であって、さらに医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
（項目５４）
ＴＬＲ７シグナル伝達を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ７のリガンド、および
別のＴＬＲによるシグナル伝達を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０からなる群から選ばれる該別のＴＬＲのリガンド
を含む組成物。
（項目５５）
項目５４に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ３である組成物。
（項目５６）
項目５４に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ８である組成物。
（項目５７）
項目５４に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ９である組成物。
（項目５８）
項目５４に記載の組成物であって、ＴＬＲ７の前記リガンドおよび前記別のＴＬＲのリガンドが結合されている組成物。
（項目５９）
項目５４に記載の組成物であって、さらに医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
（項目６０）
ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体であって、該結合体のＤＮＡが、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効なＣｐＧモチーフを含み、該結合体のＲＮＡが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８もしくはこれらの任意の組合せによるシグナル伝達を賦活化するのに有効なＲＮＡを含む結合体
を含む組成物。
（項目６１）
項目６０に記載の組成物であって、前記結合体がキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む組成物。
（項目６２）
項目６１に記載の組成物であって、前記キメラ主鎖が前記ＤＮＡと前記ＲＮＡとの間に切断部位を含む組成物。
（項目６３）
項目６０に記載の組成物であって、前記結合体が二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖を含む組成物。
（項目６４）
項目６０に記載の組成物であって、さらに医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
（項目６５）
ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離ＲＮＡとＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目６６）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである方法。
（項目６７）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡがリボソームＲＮＡである方法。
（項目６８）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡが転移ＲＮＡである方法。
（項目６９）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである方法。
（項目７０）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡがウイルスＲＮＡである方法。
（項目７１）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡがＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである方法。
（項目７２）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡが本質的にＧおよびＵからなる方法。
（項目７３）
ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の、１Ｇ：５０Ｕ〜１０Ｇ：１Ｕの割合で本質的にＧおよびＵからなるヌクレオシドの混合物とＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目７４）
項目７３に記載の方法であって、前記ヌクレオシドがリボヌクレオシドである方法。
（項目７５）
項目７３に記載の方法であって、前記ヌクレオシドがリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの混合物を含む方法。
（項目７６）
項目７３に記載の方法であって、前記Ｇが８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン、グアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体、イノシンおよびネブラリンからなる群から選ばれるグアノシン誘導体である方法。
（項目７７）
リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物とＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目７８）
項目７７に記載の方法であって、前記混合物がグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体を含む方法。
（項目７９）
ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の、ＵＵＧＵＧＧ、ＵＧＧＵＵＧ、ＧＵＧＵＧＵおよびＧＧＧＵＵＵからなる群から選ばれる配列を含む単離Ｇ、Ｕ−リッチ・オリゴヌクレオチドとＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目８０）
項目７９に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがオリゴリボヌクレオチドである方法。
（項目８１）
項目７９に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが７〜５０塩基長である方法。
（項目８２）
項目７９に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが１２〜２４塩基長である方法。
（項目８３）
項目７９に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが配列５’−ＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧ−３’（配列番号１）を有する方法。
（項目８４）
ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の、少なくとも１つのＧ−Ｕ塩基対を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子とＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目８５）
ＴＬＲ８媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８リガンドとＴＬＲ８を接触させる工程、および
ＴＬＲ８以外のＴＬＲによって媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ８以外のＴＬＲのリガンドと、ＴＬＲ８以外のＴＬＲを接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８媒介性免疫反応を補強する方法。
（項目８６）
免疫反応が低下している被験体に有効量のＴＬＲ８リガンドを投与してＴＬＲ８媒介性免疫反応を誘起する工程、および
該被験体に有効量の、ＴＬＲ８以外のＴＬＲのリガンドを投与して該ＴＬＲ８以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起する工程
を含む、被験体のＴＬＲ８媒介性免疫反応を補強する方法。
（項目８７）
項目８６に記載の方法であって、前記ＴＬＲ８以外のＴＬＲがＴＬＲ９である方法。
（項目８８）
項目８７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ９のリガンドがＣｐＧ核酸である方法。
（項目８９）
項目８８に記載の方法であって、前記ＣｐＧ核酸の主鎖が安定化されている方法。
（項目９０）
項目８７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ８のリガンドおよび前記ＴＬＲ９のリガンドが１つの結合体である方法。
（項目９１）
項目９０に記載の方法であって、前記結合体が二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖を含む方法。
（項目９２）
項目９０に記載の方法であって、前記結合体がキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む方法。
（項目９３）
項目９２に記載の方法であって、前記キメラ主鎖が前記ＤＮＡと前記ＲＮＡとの間に切断部位を含む方法。
（項目９４）
ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離グアノシンリボヌクレオシドとＴＬＲ７を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目９５）
項目９４に記載の方法であって、前記グアノシンリボヌクレオシドが８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン、グアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体、イノシンおよびネブラリンからなる群から選ばれるグアノシンリボヌクレオシド誘導体である方法。
（項目９６）
項目９５に記載の方法であって、前記グアノシンリボヌクレオシド誘導体が８−オキソグアノシンである方法。
（項目９７）
項目９４に記載の方法であって、前記グアノシンヌクレオシドがリボヌクレオシドである方法。
（項目９８）
項目９７に記載の方法であって、前記グアノシンヌクレオシドがリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの混合物を含む方法。
（項目９９）
ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の、末端酸化もしくはハロゲン化グアノシンを含む単離核酸とＴＬＲ７を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目１００）
項目９９に記載の方法であって、前記酸化もしくはハロゲン化グアノシンが８−オキソグアノシンである方法。
（項目１０１）
ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離ＲＮＡとＴＬＲ７を接触させること
を含む、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目１０２）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである方法。
（項目１０３）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡがリボソームＲＮＡである方法。
（項目１０４）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡが転移ＲＮＡである方法。
（項目１０５）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである方法。
（項目１０６）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡがウイルスＲＮＡである方法。
（項目１０７）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡがＧ−リッチＲＮＡである方法。
（項目１０８）
項目１０７に記載の方法であって、さらに前記ＲＮＡがＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の一部である方法。
（項目１０９）
項目１０７に記載の方法であって、前記ＲＮＡが本質的にグアノシンリボヌクレオシドからなる方法。
（項目１１０）
リボヌクレオシドバナシル錯体の混合物とＴＬＲ７を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目１１１）
項目１１０に記載の方法であって、前記混合物がグアノシンリボヌクレオシドバナシル錯体を含む方法。
（項目１１２）
ＴＬＲ７媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７リガンドとＴＬＲ７を接触させる工程、および
ＴＬＲ７以外のＴＬＲによって媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ７以外のＴＬＲのリガンドと、ＴＬＲ７以外のＴＬＲを接触させる工程
を含む、ＴＬＲ７媒介性免疫反応を補強する方法。
（項目１１３）
免疫反応が低下している被験体に有効量のＴＬＲ７リガンドを投与してＴＬＲ７媒介性免疫反応を誘起する工程、および
該被験体に有効量の、ＴＬＲ７以外のＴＬＲのリガンドを投与して該ＴＬＲ７以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起する工程
を含む、被験体のＴＬＲ７媒介性免疫反応を補強する方法。
（項目１１４）
項目１１３に記載の方法であって、前記ＴＬＲ７以外のＴＬＲがＴＬＲ９である方法。
（項目１１５）
項目１１４に記載の方法であって、前記ＴＬＲ９のリガンドがＣｐＧ核酸である方法。
（項目１１６）
項目１１５に記載の方法であって、前記ＣｐＧ核酸の主鎖が安定化されている方法。
（項目１１７）
項目１１４に記載の方法であって、前記ＴＬＲ７のリガンドおよび前記ＴＬＲ９のリガンドが１つの結合体である方法。
（項目１１８）
項目１１７に記載の方法であって、前記結合体が二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖を含む方法。
（項目１１９）
項目１１７に記載の方法であって、前記結合体がキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む方法。
（項目１２０）
項目１１９に記載の方法であって、前記キメラ主鎖が前記ＤＮＡと前記ＲＮＡとの間に切断部位を含む方法。
（項目１２１）
対照ＲＮＡに反応するＴＬＲ８媒介性対照シグナルを測定する工程、
免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ８媒介性試験シグナルを測定する工程、および
該ＴＬＲ８媒介性試験シグナルを該ＴＬＲ８媒介性対照シグナルと比較する工程
を含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法。
（項目１２２）
対照のイミダゾキノリンに反応するＴＬＲ８媒介性対照シグナルを測定する工程、
免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ８媒介性試験シグナルを測定する工程、および
該ＴＬＲ８媒介性試験シグナルを該ＴＬＲ８媒介性対照シグナルと比較する工程
を含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法。
（項目１２３）
項目１２２に記載の方法であって、前記イミダゾキノリンがレシキモッド（Ｒ−８４８）である方法。
（項目１２４）
項目１２２に記載の方法であって、前記イミダゾキノリンがイミキモッド（Ｒ−８３７）である方法。
（項目１２５）
対照の７−アリル−８−オキソグアノシンに反応するＴＬＲ７媒介性対照シグナルを測定する工程、
免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ７媒介性試験シグナルを測定する工程、および
該ＴＬＲ７媒介性試験シグナルを該ＴＬＲ７媒介性対照シグナルと比較する工程
を含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法。
（項目１２６）
対照のイミダゾキノリンに反応するＴＬＲ７媒介性対照シグナルを測定する工程、
免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ７媒介性試験シグナルを測定する工程、および
該ＴＬＲ７媒介性試験シグナルを該ＴＬＲ７媒介性対照シグナルと比較する工程
を含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法。
（項目１２７）
項目１２６に記載の方法であって、前記イミダゾキノリンがレシキモッド（Ｒ−８４８）である方法。
（項目１２８）
項目１２６に記載の方法であって、前記イミダゾキノリンがイミキモッド（Ｒ−８３７）である方法。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の一部は、本発明者による特定の免疫賦活性ＲＮＡおよびＲＮＡ様（以下、単に「ＲＮＡ」という）分子の新規な発見に基づくものである。本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基配列であって、必要に応じて、その少なくとも１つのＧをＧの変異体もしくはホモログとし、および／またはその少なくとも１つのＵを独立にＵの変異体もしくはホモログとすることができる塩基配列を必要とすると、本発明者は考えている。意外なことに、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、一本鎖または少なくとも部分的に二本鎖とすることができる。しかも意外なことに、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、その免疫賦活効果を発揮するのにＣｐＧモチーフを必要としない。特定の理論もしくはメカニズムに捕らわれているということではなく、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が、ＭｙＤ８８依存性経路、恐らくＴＬＲを介してシグナルを伝達するというのは、本発明者の見解である。また、特定の理論もしくはメカニズムに捕らわれているということではなく、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７もしくはまだ確認されていない他のなんらかのＴＬＡを介してシグナルを伝達するということも、本発明者の見解である。
【０００８】
また、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、免疫を誘起することができる天然のＲＮＡ分子の１クラスを表すものとも、本発明者は考えている。特定の理論もしくはメカニズムに捕らわれているということではなく、これに相当する天然ＲＮＡ分子のクラスが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）として存在するというのは、本発明者の見解である。このことに関連して、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が５〜４０ヌクレオチド長程度の小さなものであることに留意されたい。このような短いＲＮＡ分子は、癌抗原に対する免疫反応を誘起することを目的として樹状細胞を形質転換するのに有用と報告されている完全長のメッセンジャーＲＮＡの範囲から外れている。例えば、ボクツコウスキー・Ｄほか（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ Ｄ．ｅｔ ａｌ．）（１９９６年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）１８４：ｐ４６５−７２；ミッチェル・Ｄ・Ａほか（Ｍｉｔｃｈｅｌ Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）（２０００年）カレント・オピニョン・イン・モレキュラー・セラピューティクス（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）２：ｐ１７６−８１を参照されたい。
【０００９】
また、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの安定化、ＲＮＡ分子の局所への集合および／または細胞のエンドソームコンパートメントへのＲＮＡ分子の輸送に対して促進する特定の物質と有利に併用することができることも、本発明によって発見した。特に、この点において特定の脂質および／またはリポソームが有用であることを本発明により発見した。例えば、特定の陽イオン性脂質、例えば、特にＮ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）は、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子と併用すると、特に有利である。別の例として、このＲＮＡに、例えばこのＲＮＡの３’末端に、コレステリル部分を共有結合させると、陽イオン性脂質が存在しなくても、このＲＮＡの免疫賦活効果が増強される。
【００１０】
本発明は、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子に関連した組成物および方法を提供する。この組成物および方法は、とりわけ、イン・ビボ（生体内）、イン・ビトロ（試験管内）およびエクス・ビボ（生体外）での免疫細胞の賦活化、感染の治療、癌の治療、医薬組成物の調製、本発明の免疫賦活性ＲＮＡの標的受容体の特定、ならびに別の免疫賦活性化合物のスクリーニングおよび特徴付けに有用である。さらに、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子に関連した組成物および方法は、他の免疫賦活性の組成物、およびこのような他の免疫賦活性の組成物に関連した方法とも有利に併用することができる。
【００１１】
一態様として、本発明は、免疫賦活性組成物を提供する。本発明のこの態様による免疫賦活性組成物は、少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマー、ならびに、必要に応じて陽イオン性脂質を含む。このＲＮＡオノゴマーは、天然由来のものでも非天然由来のものでもよい。一実施態様として、天然由来のＲＮＡオノゴマーは、原核生物ＲＮＡ由来のものとすることができ、別の実施態様として、真核生物ＲＮＡ由来のものとすることができる。さらに、天然由来のＲＮＡオノゴマーは、リボソームＲＮＡの一部を含むことができる。非天然由来のＲＮＡオノゴマーは、細胞外で、例えば、当業者に既知の化学的方法を用いて合成したＲＮＡ分子を含むことができる。一実施態様として、ＲＮＡオノゴマーは、天然由来ＲＮＡオノゴマーの誘導体を含むことができる。
【００１２】
一実施態様として、上記単離ＲＮＡオリゴマーは、以下に定義するようなＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである。
【００１３】
一実施態様として、上記Ｇ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＲＵＲＧＹ−３’によって示されるような塩基配列を含み、Ｒがプリン、Ｕがウラシル、Ｇがグアニン、Ｙがピリミジンを表すものとする少なくとも５ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子である。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＧＵＡＧＵ−３’によって示されるような塩基配列を含み、Ａがアデニンを表すものとする少なくとも５ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子である。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＧＵＡＧＵＧＵ−３’によって示されるような塩基配列を含む単離ＲＮＡ分子である。
【００１４】
一実施態様として、上記Ｇ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＧＵＵＧＢ−３’によって示されるような塩基配列を含み、ＢがＵ、ＧまたはＣを表すものとする少なくとも５ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子である。
【００１５】
一実施態様として、上記Ｇ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＧＵＧＵＧ−３’によって示されるような塩基配列を含む少なくとも５ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子である
。
【００１６】
その他の実施態様として、この単離ＲＮＡ分子は、前述の配列のうちの任意のものの倍数単位、前述の配列のうちの任意のものの組合せ、または前述の配列のうちの任意のものの倍数単位を含む前述の配列のうちの任意のものの組合せを含有することができる。これらの倍数単位および組合せについては、直接結合させることができるが、間接的に、即ち、ヌクレオシドもしくは配列を介在させることによっても結合させることができる。一実施態様として、この結合に介在させるヌクレオシドはＧであり、一実施態様として、この結合介在性ヌクレオシドはＵである。
【００１７】
一実施態様として、上記塩基配列は５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を含む。一実施態様として、この塩基配列は５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’である。
【００１８】
別の実施態様として、この塩基配列は５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む。一実施態様として、この塩基配列は５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’である。
【００１９】
さらに別の実施態様として、この塩基配列は５’−ＣＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む。一実施態様として、この塩基配列は５’−ＣＵＡＧＧＣＡＣ−３’である。
【００２０】
またさらに別の実施態様として、この塩基配列は５’−ＣＵＣＧＧＣＡＣ−３’を含む。一実施態様として、この塩基配列は５’−ＣＵＣＧＧＣＡＣ−３’である。
【００２１】
一実施態様として、前記オリゴマーは５〜１２ヌクレオチド長である。一実施態様として、このオリゴマーは８〜１２ヌクレオチド長である。
【００２２】
また、本発明のこの態様によれば、一実施態様として、上記塩基配列はＣｐＧジヌクレオチドを欠く。従って、この実施態様では前記免疫賦活性ＲＮＡはＣｐＧ核酸ではない。
【００２３】
本発明のこの態様による一部の実施態様として、上記ＲＮＡオリゴマーの塩基配列は少なくとも部分的に自己相補的である。一実施態様として、この自己相補性の程度は少なくとも５０パーセントである。この自己相補性の程度は１００パーセントにまで及び、１００パーセントを含むことができる。従って、例えば、種々の実施態様として、この少なくとも部分的に自己相補性のＲＮＡオリゴマーの塩基配列は、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または１００パーセント自己相補的である。相補性塩基対としては、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）、アデニン−ウラシル（Ａ−Ｕ）、アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）、およびグアニン−ウラシル（Ｇ−Ｕ）が挙げられる。Ｇ−Ｕ「ゆらぎ」塩基対合は、リボソームＲＮＡおよびＲＮＡレトロウイルスでかなりよく見られるが、通常の、Ｇ−Ｃ、Ａ−ＴもしくはＡ−Ｕ間のワトソン−クリック塩基対合より幾分弱いものである。部分的自己相補性配列は、自己相補性配列の部分を１つ以上含むことができる。部分的自己相補性配列を必要とする実施態様では、前記ＲＮＡオリゴマーは、このオリゴマーの各末端に位置し、この各末端を含む自己相補性部分を包含することができる。
【００２４】
本発明のこの態様による一実施態様として、このオリゴマーは、複数のオリゴマー、即ち、少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基対を有するそれぞれ６〜４０ヌクレオチド長の複数のＲＮＡオリゴマーである。この複数のオリゴマーは、少なくとも部分的に互いに相補性である配列を含むことができるが、これを必要とするものではない。一実施態様として、この複数のオリゴマーには、第１の塩基配列を有するオリゴマーおよび第２の塩基配列を有するオリゴマーが含まれ、この第１の塩基配列と第２の塩基配列とは少なくとも５０パーセントの相補性を有する。従って、
例えば、種々の実施態様として、前記少なくとも部分的に相補性の塩基配列は、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または１００パーセント相補的である。上述の場合のように、相補性塩基対としては、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）、アデニン−ウラシル（Ａ−Ｕ）、アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）、およびグアニン−ウラシル（Ｇ−Ｕ）が挙げられる。部分的相補性配列は、相補性配列の部分を１つ以上含むことができる。部分的相補性配列を必要とする実施態様では、前記ＲＮＡオリゴマーは、このオリゴマーの少なくとも一端に位置し、この末端を含む相補性部分を含有することができる。
【００２５】
一実施態様として、このオリゴマーは、５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を含む配列を有するオリゴマーおよび５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む配列を有するオリゴマーをそれぞれ含有する複数のオリゴマーである。一実施態様として、このオリゴマーは、塩基配列５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を有するオリゴマーおよび塩基配列５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を有するオリゴマーを含む複数のオリゴマーである。
【００２６】
さらに、本発明のこの態様によれば、種々の実施態様として、このオリゴマーは、非天然型主鎖結合、修飾塩基、修飾糖、またはこれらの任意の組合せを含む。この非天然型主鎖結合は、安定化された結合、即ち、ホスホジエステル結合に比し、ＲＮＡ分解酵素もしくは核酸分解酵素による分解に対して比較的抵抗性の結合とすることができる。一実施態様として、この非天然型主鎖結合は、ホスホロチオエート結合である。このオリゴマーは、１つの非天然型主鎖結合、またはそれぞれその他とは独立に選ばれる複数の非天然型主鎖結合を含むことができる。上記修飾塩基は、本発明のこの態様による塩基配列の少なくとも１つのＧおよび少なくとも１つのＵを含む、Ｇ、Ｕ、ＡもしくはＣの修飾体とすることができる。一部の実施態様として、この修飾塩基は、７−デアザグアノシン、８−アザグアノシン、５−メチルウラシル、およびシュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）から選ぶことができる。このオリゴマーは、１つの修飾塩基、またはそれぞれその他とは独立に選ばれる複数の修飾塩基を含むことができる。上記修飾糖は、メチル化糖のアラビノースとすることができる。このオリゴマーは、１つの修飾糖、またはそれぞれその他とは独立に選ばれる複数の修飾糖を含むことができる。
【００２７】
一実施態様として、前記陽イオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）である。ＤＯＴＡＰは、ＲＮＡオリゴマーを細胞中へ輸送し、エンドソーム・コンパートメントへ特異的に出入りして、このコンパートメントでｐＨ依存性にこのＲＮＡオリゴマーを遊離させることができる。このＲＮＡは、一旦エンドソーム・コンパートメントに入れば、特定の細胞内トル様受容体分子（ＴＬＲ）と相互作用して、免疫反応の形成に関与するＴＬＲ媒介性シグナル変換経路を作動させることができる。エンドソーム・コンパートメントへの輸送などの同様な性質を有するその他の物質も、ＤＯＴＡＰの代わりに、あるいはこれに加えて用いることができる。
【００２８】
一実施態様として、前記免疫賦活性組成物は、さらに抗原を含む。一実施態様として、この抗原はアレルゲンである。一実施態様として、この抗原は癌抗原である。一実施態様として、この抗原は微生物抗原である。
【００２９】
また、本発明のこの態様によれば、別の実施態様として、本発明は医薬用組成物である。この医薬用組成物は、本発明の免疫賦活性組成物、および医薬用として許容可能な担体を含む。また、この医薬用組成物を調製する方法も提供する。この方法は、免疫賦活性組成物を医薬用として許容可能な担体と接触させて配置するものである。この医薬用組成物は、便宜のため、単位投与量として配合することができる。
【００３０】
別の態様として、本発明は、免疫細胞を賦活化する方法を提供する。この方法は、免疫細胞の賦活化を誘起するのに有効な量の上記本発明の免疫賦活性組成物を免疫細胞に接触させるものである。一実施態様として、免疫細胞の賦活化は、この免疫細胞によるサイトカインの分泌を伴うものである。一実施態様として、このサイトカインは、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン（ＩＦＮ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）からなる群から選ばれる。一実施態様として、免疫細胞の賦活化は、ケモカインの分泌を含む。一実施態様として、この分泌ケモカインは、インターフェロン・ガンマにより誘導される蛋白１０（ＩＰ−１０）である。一実施態様として、免疫細胞の賦活化は、免疫細胞による共起刺激／アクセサリー分子の発現を含む。一実施態様として、この共起刺激／アクセサリー分子は、細胞内粘着分子（ＩＣＡＭ、例えば、ＣＤ５４）、白血球機能関連抗原（ＬＦＡ、例えば、ＣＤ５８）、Ｂ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）、およびＣＤ４０からなる群から選ばれる。
【００３１】
また、本発明のこの態様によれば、一実施態様として、免疫細胞の賦活化は、ＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路を賦活化するものである。ＭｙＤ８８は、種々のトル様受容体（ＴＬＲ）分子のトル／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインと相互作用し、シグナル変換経路に関与して最終的に核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の賦活化をもたらすアダプター分子であると考えられている。従って、一実施態様として、ＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路はＴＬＲと関連づけられる。より詳細には、一実施態様として、このＴＬＲはＴＬＲ８である。別の実施態様として、このＴＬＲはＴＬＲ７である。
【００３２】
また、本発明のこの態様によれば、一実施態様として、免疫細胞はヒト免疫細胞である。一実施態様として、この免疫細胞は骨髄樹状細胞である。
【００３３】
本発明のこの態様の一実施態様として、前記接触はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行う。別の実施態様として、この接触は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で行う。
【００３４】
別の態様として、本発明は、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体に対し、被験体の免疫反応を誘起するのに有効な量で、本発明の免疫賦活性組成物を投与するものである。本発明のこの態様による方法は、被験体に対し抗原を投与するものではないことに留意されたい。一実施態様として、この被験体はヒトである。一実施態様として、この被験体は癌に罹患しているか、罹患するリスクを有する者である。一実施態様として、この被験体は、ウイルス、細菌、および寄生生物からなる群から選ばれる外的病原因子（ａｇｅｎｔ）に感染しているか、感染するリスクのある者である。特定の実施態様として、この被験体は、ウイルスに感染しているか、感染するリスクのある者である。また、本発明のこの態様による方法は、有効な、もしくは所望の免疫反応を生じる能力が抑制されている被験体を治療するために用いることができることにも留意されたい。例えば、この被験体は、感染、癌、腎もしくは肝不全などの急性または慢性疾患、手術、および化学療法、放射線療法、特定の薬剤などの免疫抑制因子への暴露により免疫系が抑制されている者とすることができる。一実施態様として、この被験体は、アレルギーもしくは喘息に罹患しているか、罹患するリスクのある者とすることができる。このような被験体は、被験体のアレルギー反応もしくは喘息と関連があるアレルゲンに接触しているか、接触するリスクのある者とすることができる。
【００３５】
さらに別の態様として、本発明は、被験体の免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体に抗原を投与した後、この抗原に対する免疫反応を誘起するのに有効な量で、本発明の免疫賦活性組成物をこの被験体に投与するものである。この抗原の投与は、本発明の免疫賦活性組成物投与の前でも後でも、あるいは同時にでも行うことができることに留意されたい。さらに、この抗原および免疫賦活性組成物は、被験体に対し、２回以上投与することができる。
【００３６】
本発明のこの態様による一実施態様として、この抗原はアレルゲンである。本発明のこの態様による一実施態様として、この抗原は癌抗原である。一実施態様として、この癌抗原は、その被験体から単離された癌抗原とすることができる。前記微生物抗原は、ウイルス、細菌、真菌もしくは寄生生物の抗原とすることができる。
【００３７】
さらに、本発明は、さらに別の態様として、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体の樹状細胞を単離し、この樹状細胞を生体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）本発明の免疫賦活性組成物と接触させた後、この樹状細胞を生体外で抗原と接触させ、こうして接触させた後の樹状細胞をこの被験体に投与するものである。
【００３８】
本発明のこの態様による一実施態様として、この抗原はアレルゲンである。本発明のこの態様による一実施態様として、この抗原は癌抗原である。一実施態様として、この癌抗原は、その被験体から単離された癌抗原とすることができる。別の実施態様として、この抗原は微生物抗原である。この微生物抗原は、ウイルス、細菌、真菌もしくは寄生生物の抗原とすることができる。
【００３９】
１つのＴＬＲを賦活化することにより生じる免疫反応は、別のＴＬＲを賦活化することによって修飾、増強もしくは増幅することができ、この免疫賦活効果の連係は相乗的なものとすることができる。例えば、ＴＬＲ９は、細菌性ＤＮＡ、より一般的には、ＣｐＧ ＤＮＡに反応すると報告されている。ＴＬＲ９がその天然のリガンド（もしくは任意のＴＬＲ９リガンド）と接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ７をＴＬＲ７リガンドと選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ８をＴＬＲ８リガンドと選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても修飾、増強もしくは増幅することができる。同様に、ＴＬＲ７がＴＬＲ７リガンドと接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ８をＴＬＲ８リガンドと選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ９をＣｐＧ ＤＮＡ（もしくは任意の適当なＴＬＲ９リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても修飾、増強もしくは増幅することができる。さらに別の例として、ＴＬＲ８がＴＬＲ８リガンドと接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ７をＴＬＲ７リガンドと選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ９をＣｐＧ ＤＮＡ（もしくは任意の適当なＴＬＲ９リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても修飾、増強もしくは増幅することができる。
【００４０】
本発明の一部は、本発明者が、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する天然のリガンドと考えられるものを新規に発見したことに基づいている。微生物由来の天然リガンドは一部のＴＬＲに関して報告されているが、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する天然のリガンドは、これまで報告されていなかった。一部の合成低分子、イミダゾキノリン系化合物がＴＬＲ７のリガンドとして報告されているが、このような化合物は本発明の天然リガンドとは区別されるべきである。ヘンミ・Ｈほか（Ｈｅｍｍｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．）（２００２年） ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）３：ｐ１９６−２００参照。
【００４１】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の単離した天然リガンド類は、免疫反応を誘起、増強および補強することができる組成物として有用である。また、このＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然リガンド類は、免疫反応を誘起、増強および補強することができる新規な組成物を調製するのに有用である。さらに、このＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然リガンド類は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が媒介するシグナル伝達を選択的に誘起し、また、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が媒介する免疫反応を選択的に誘起するのに有用である。さらに、このＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然リガンド類は、免疫賦活性化合物を特定および選択するためのスクリーニ
ング法をデザインし、実施するのに有用である。
【００４２】
また、本発明の一部は、ヒト好中球がＴＬＲ８を強く発現するという本発明による新規発見に基づいている。この知見は、好中球が感染性病原体を結合し、それによって反応を誘発する最初の細胞となる場合が非常に多いので、重要である。賦活化された好中球は、ケモカインおよびサイトカインを分泌し、それによりこれらが樹状細胞を動員するのに貢献していると考えられる。この賦活化好中球のサイトに引き寄せられたＴＬＲ発現性樹状細胞は、そこで賦活化されることによって免疫反応を増幅する。
【００４３】
また、本発明の一部は、免疫系のさまざまな細胞におけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９などの種々のＴＬＲの識別的発現についての理解に基づいている。この識別は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９に関し、ヒトで特に重要である。これらのＴＬＲのうちの任意の１種を賦活化することにより生じる免疫反応は、別のＴＬＲを賦活化することによって増強もしくは増幅することができ、この免疫賦活化効果の連係は相乗的である。例えば、ＴＬＲ９は細菌性ＤＮＡ、より一般的には、ＣｐＧ ＤＮＡに反応すると報告されている。ＴＬＲ９がその天然のリガンド（もしくは任意のＴＬＲ９リガンド）と接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ７をその天然リガンド（もしくは任意の適当なＴＬＲ７リガンド）と選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ８をその天然リガンド（もしくは任意の適当なＴＬＲ８リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても増強もしくは増幅させることができる。同様に、ＴＬＲ７がその天然リガンド（もしくは任意のＴＬＲ７リガンド）と接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ８をその天然リガンド（もしくは任意の適当なＴＬＲ８リガンド）と選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ９をＣｐＧ ＤＮＡ（もしくは任意の適当なＴＬＲ９リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても増強もしくは増幅させることができる。さらに別の例として、ＴＬＲ８がその天然リガンド（もしくは任意のＴＬＲ８リガンド）と接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ７をその天然リガンド（もしくは任意の適当なＴＬＲ７リガンド）と選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ９をＣｐＧ ＤＮＡ（もしくは任意の適当なＴＬＲ９リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても増強もしくは増幅させることができる。
【００４４】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８のリガンドを、ＴＬＲ８シグナル伝達を誘起するのに有効な量で含むと共に、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０からなる群から選ばれる別のＴＬＲのリガンドを、この別のリガンドによりシグナル伝達を誘起するのに有効な量で含む組成物を提供する。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ３である。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ７である。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ９である。一実施態様として、ＴＬＲ８のリガンドと別のＴＬＲのリガンドとは結合されている。さらに別の実施態様として、この組成物は、さらに医薬用として許容可能な担体を含む。
【００４５】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７のリガンドを、ＴＬＲ７シグナル伝達を誘起するのに有効な量で含むと共に、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０からなる群から選ばれる別のＴＬＲのリガンドを、この別のリガンドによりシグナル伝達を誘起するのに有効な量で含む組成物を提供する。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ３である。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ８である。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ９である。一実施態様として、ＴＬＲ７のリガンドと別のＴＬＲのリガンドとは結合されている。さらに別の実施態様として、この組成物は、さらに医薬用として許容可能な担体を含む。
【００４６】
別の態様として、本発明は、ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体を含む組成物であって、この結合体
のＤＮＡが、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効な免疫賦活性モチーフを含み、かつこの結合体のＲＮＡが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８もしくはこれらの任意の組合せによるシグナル伝達を賦活化するのに有効なＲＮＡを含む組成物を提供する。一実施態様として、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効なこの免疫賦活性モチーフはＣｐＧモチーフである。別の実施態様として、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効なこの免疫賦活性モチーフはポリ−ｄＴである。さらに別の実施態様として、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効なこの免疫賦活性モチーフはポリ−ｄＧである。一実施態様として、上記結合体は、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む。一実施態様として、この結合体は、そのＤＮＡとＲＮＡとの間に切断部位を有する。一実施態様として、この結合体は、二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡのヘテロ二重鎖を含む。さらに別の実施態様として、上記組成物は、さらに医薬用として許容可能な担体を含む。
【００４７】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離ＲＮＡをＴＬＲ８と接触させるものである。一実施態様として、このＲＮＡは二本鎖ＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはリボソームＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡは転移ＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはウイルスＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡは本質的にＧおよびＵからなるものである。
【００４８】
さらに別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、１Ｇ：５０Ｕ〜１０Ｇ：１Ｕの割合で本質的にＧおよびＵからなるヌクレオシドの混合物を、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ８と接触させるものである。一実施態様として、このヌクレオシドはリボヌクレオシドである。一実施態様として、このヌクレオシドはリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの混合物を含む。一実施態様として、このＧは、８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン、グアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体、イノシンおよびネブラリンからなる群から選ばれるグアノシン誘導体である。
【００４９】
さらに別の態様の本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物をＴＬＲ８と接触させるものである。一実施態様として、この混合物はグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体を含む。
【００５０】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、ＵＵＧＵＧＧ、ＵＧＧＵＵＧ、ＧＵＧＵＧＵおよびＧＧＧＵＵＵからなる群から選ばれる配列を含むＧ、Ｕ−リッチ単離オリゴヌクレオチドを、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ８と接触させるものである。一実施態様として、このオリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチドである。一実施態様として、このオリゴヌクレオチドは７〜５０塩基長である。一実施態様として、このオリゴヌクレオチドは１２〜２４塩基長である。一実施態様として、このオリゴヌクレオチドは５’−ＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧ−３’（配列番号１）の配列を有する。
【００５１】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、少なくとも１つのＧ−Ｕ塩基対を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子を、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ８と接触させるものである。
【００５２】
さらに別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８媒介性免疫反応を補強する方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ８媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８リガンドをＴＬＲ８と接触させた後、ＴＬＲ８以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８以外のＴＬＲのリガンドをＴＬＲ８以外のＴＬＲと接触させるものである。
【００５３】
別の態様として、本発明は、被験体のＴＬＲ８媒介性免疫反応を補強する方法を提供する。この態様による方法は、免疫反応が低下している被験体に対し、ＴＬＲ８媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８リガンドを投与した後、この被験体に、ＴＬＲ８以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８以外のＴＬＲのリガンドを投与するものである。一実施態様として、このＴＬＲ８以外のＴＬＲは、ＴＬＲ９である。一実施態様として、ＴＬＲ９のリガンドはＣｐＧ核酸である。一実施態様として、このＣｐＧ核酸は安定化した主鎖を有する。一実施態様として、ＴＬＲ８のリガンドおよびＴＬＲ９のリガンドは１つの結合体である。一実施態様として、この結合体は二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡのヘテロ二重鎖を含む。一実施態様として、この結合体はキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む。一実施態様として、このキメラ主鎖はそのＤＮＡとＲＮＡとの間に切断部位を有する。
【００５４】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離グアノシンリボヌクレオシドをＴＬＲ７と接触させるものである。一実施態様として、このグアノシンリボヌクレオシドは、８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン、グアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体、イノシンおよびネブラリンからなる群から選ばれるグアノシンリボヌクレオシド誘導体である。一実施態様として、このグアノシンリボヌクレオシド誘導体は８−オキソグアノシンである。一実施態様として、このグアノシンヌクレオシドは、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの混合物を含む。
【００５５】
別の態様として、本発明はさらに、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、末端酸化またはハロゲン化グアノシンを含む単離核酸を、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ７と接触させるものである。一実施態様として、この末端酸化またはハロゲン化グアノシンは８−オキソグアノシンである。
【００５６】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離ＲＮＡをＴＬＲ７と接触させるものである。一実施態様として、このＲＮＡは二本鎖ＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはリボソームＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡは転移ＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはウイルスＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはＧ−リッチＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡは、ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の一部である。一実施態様として、このＲＮＡは、本質的にグアノシンリボヌクレオシドからなる。
【００５７】
さらに別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、１Ｇ：５０Ｕ〜１０Ｇ：１Ｕの割合で本質的にＧおよびＵからなるヌクレオシドの混合物を、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ７と接触させるものである。
【００５８】
さらに別の態様の本発明は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この
態様による方法は、リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物をＴＬＲ７と接触させるものである。一実施態様として、この混合物はグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体を含む。
【００５９】
さらに別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７媒介性免疫反応を補強する方法を提供する。この態様による方法は、ＴＬＲ７媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７リガンドをＴＬＲ７と接触させた後、ＴＬＲ７以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７以外のＴＬＲのリガンドをＴＬＲ７以外のＴＬＲと接触させるものである。
【００６０】
さらに別の態様として、本発明は、被験体のＴＬＲ７媒介性免疫反応を補強する方法を提供する。この方法は、免疫反応が低下している被験体に対し、ＴＬＲ７媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７リガンドを投与した後、この被験体に、ＴＬＲ７以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７以外のＴＬＲのリガンドを投与するものである。一実施態様として、このＴＬＲ７以外のＴＬＲは、ＴＬＲ９である。一実施態様として、ＴＬＲ９のリガンドはＣｐＧ核酸である。一実施態様として、このＣｐＧ核酸は安定化した主鎖を有する。一実施態様として、ＴＬＲ７のリガンドおよびＴＬＲ９のリガンドは１つの結合体である。一実施態様として、この結合体は二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡのヘテロ二重鎖を含む。一実施態様として、この結合体はキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む。一実施態様として、このキメラ主鎖はそのＤＮＡとＲＮＡとの間に切断部位を有する。
【００６１】
別の態様として、本発明は、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この態様による方法は、対照ＲＮＡに反応するＴＬＲ８媒介性対照シグナルを測定し、免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ８媒介性試験シグナルを測定して、このＴＬＲ８媒介性試験シグナルをＴＬＲ８媒介性対照シグナルと比較するものである。
【００６２】
さらに別の態様として、本発明は、対照のイミダゾキノリンに反応するＴＬＲ８媒介性対照シグナルを測定し、免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ８媒介性試験シグナルを測定して、このＴＬＲ８媒介性試験シグナルをＴＬＲ８媒介性対照シグナルと比較することを含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６３】
また、本発明のさらに別の態様によって、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、対照のイミダゾキノリンに反応するＴＬＲ７媒介性対照シグナルを測定し、免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ７媒介性試験シグナルを測定して、このＴＬＲ７媒介試験シグナルをＴＬＲ７媒介対照シグナルと比較するものである。
【００６４】
一部の実施態様として、このイミダゾキノリンはレシキモッド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８）である。
【００６５】
一部の実施態様として、このイミダゾキノリンはイミキモッド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８３７）である。
【００６６】
また、別の態様として、本発明は、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この態様による方法は、対照の７−アリル−８−オキソグアノシンに反応するＴＬＲ媒介性対照シグナルを測定し、免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ７媒介性試験シグナルを測定して、このＴＬＲ７媒介試験シグナルをＴＬＲ７媒介対照シグナルと比較するものである。
【００６７】
本発明の諸限定はそれぞれ、本発明の種々の実施態様を含むことができる。従って、任
意の１つの構成要素もしくは構成要素の組合せを含む本発明の諸限定は、それぞれ本発明の各態様に含めることができると想定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
（発明の詳細な説明）
本発明の一部は、免疫賦活性化合物として有効ないくつかのＲＮＡおよびＲＮＡ関連分子についての本発明者による発見に関する。これらの免疫賦活性化合物の同定は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然リガンドを同定することを目的とした系統的な努力の結果、達成されたものである。こうした努力により、ごく最近、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）を含有する特定の配列を含むＧおよびＵを含有するＲＮＡならびにＲＮＡ様分子は、免疫賦活性であり、ＭｙＤ８８依存性経路を介して作用するように思われ、このことはＴＬＲの関与を示すものであることを発見した。注目に値すべきなのは、これらのＲＮＡ配列の一部が、ウイルスの複製に重要な５’非翻訳領域の高度に保存された構造的特徴として存在することである。また、この同定した免疫賦活性ＲＮＡの配列は、細菌および酵母由来のｔＲＮＡ、ならびに細菌そして恐らく真核生物に由来するｒＲＮＡを含む他のＲＮＡにも符合、もしくは殆ど符合している。重要なことは、本発明の免疫賦活性ＲＮＡが、部分的もしくは完全に二本鎖のＲＮＡの他に、一本鎖ＲＮＡも含み、その作用をＲＮＡ分解酵素によって消失させることができることである。このＲＮＡが少なくとも部分的に二本鎖である場合、一実施態様として、これはステムループ構造を含むことができる。以下にさらに詳細を説明するが、５ヌクレオチド長程度の短い一本鎖Ｇ、Ｕ−リッチＲＮＡが免疫細胞を賦活化して、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、タイプ１インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）、ＩＰ−１０などのいくつかのサイトカインおよびケモカインを大量に産生させることができることを本発明によって発見した。
【００６９】
本発明者は、ごく最近、意外なことに、特定のＧ、Ｕ含有ＲＮＡ分子およびそのアナログは免疫賦活性であるが、これに対応するＤＮＡはそうではないことを発見した。注目に値すべきなのは、本発明のＧ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドは、以前に樹状細胞ワクチンを調製するのに有用と報告されたメッセンジャーＲＮＡよりずっと小さいものとすることができることである。例えば、ボクツコウスキー・Ｄほか（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ Ｄ．ｅｔ ａｌ．）（１９９６年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）１８４：ｐ４６５−７２；ミッチェル・Ｄ・Ａほか（Ｍｉｔｃｈｅｌ
Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）（２０００年）カレント・オピニョン・イン・モレキュラー・セラピューティクス（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）２：ｐ１７６−８１を参照されたい。本発明のＧ、Ｕ含有ＲＮＡ分子は、天然に存在するリボソームＲＮＡおよび／またはウイルスＲＮＡの代用になることができるが、そのサイズについては５〜４０ヌクレオチド長程度の小さなものとすることができる。さらに本明細書で説明するように、本発明のＧ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＧおよび少なくとも１つのＵを含む。驚くべきことに、本発明のＧ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドからＧまたはＵを除去すると、その免疫賦活化効果が実質的に消失する。これらの少なくとも１つのＧおよび少なくとも１つのＵは、互いに隣接したものとすることができ、あるいは、ヌクレオシドもしくは配列を介在させることにより離隔することもできる。また、注目に値すべきなのは、本発明のＧ、Ｕ含有ＲＮＡ分子がＣｐＧジヌクレオチドを必要としないことである。
【００７０】
一態様として、本発明は、免疫賦活性組成物を提供する。本発明のこの態様による免疫賦活性組成物は、少なくとも１つのグアノシン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含有する塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマーを含む。さらに以下でより詳細に説明するが、この少なくとも１つのグアノシン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含有する塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の免疫賦活性ＲＮＡオリゴマーは、このＲＮＡオリゴマーを分解に対して安定化し、リポソームなどの粒子中もしくは粒子上に濃縮し、および／または細胞のエンドソーム・コンパー
トメントへの送達の対象とすることができるように、有利に配合することができる。以下の実施例で説明する１つの配合例では、このＲＮＡオリゴマーは、エンドソーム・コンパートメントへこのＧ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドを輸送するのに役立つと考えられる陽イオン性脂質ＤＯＴＡＰと有利に併用することができる。従って、一態様として、本発明は、少なくとも１つのＧおよび少なくとも１つのＵを含有する塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長のＲＮＡオリゴマーならびに、必要に応じて陽イオン性脂質を含む免疫賦活性組成物である。
【００７１】
本発明のこのＲＮＡオリゴマーは、天然もしくは非天然由来のものとすることができる。天然に存在する状態のＲＮＡは、一般に、特定のリボヌクレオシド単位の線状ポリマーであって、各リボヌクレオシド単位がプリンもしくはピリミジン塩基およびリボース糖で構成され、ヌクレオシド間がホスホジエステル結合によって連結されているものを意味する一種の核酸である。その際、「線状」とは、ＲＮＡの一次構造を表して言っている。一般に、ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であるが、部分的に二本鎖のものも含むことができる。
【００７２】
本明細書に用いている「ヌクレオシド」とは、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））である交換可能な有機塩基に、単一の糖部分（例えば、リボースもしくはデオキシリボース）が結合したものを意味する。本明細書で述べたように、このヌクレオシドは天然のヌクレオシド、修飾したヌクレオシド、または合成（人工的）ヌクレオシドとすることができる。
【００７３】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義で用いられており、複数のヌクレオチド（即ち、リン酸基、および置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））である交換可能な有機塩基に、糖（例えば、リボースもしくはデオキシリボース）が結合したものを含む分子）を意味する。本明細書に用いているこれらの用語は、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドを意味する。また、これらの用語は、ポリヌクレオシド（即ち、ポリヌクレオチドからリン酸を除いたもの）および他の任意の有機塩基含有ポリマーを含むものとする。核酸分子は、既存の核酸供給源（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）からも得ることはできるが、好ましくは合成（例えば、核酸合成法により作製）したものである。
【００７４】
また、核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は、塩基および／または糖部分などにおいて置換もしくは修飾した核酸またはオリゴヌクレオチドを含む。例えば、これらは、３’位および５’位においてそれぞれヒドロキシル基およびリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している主鎖糖を有する核酸を含む。このように修飾された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含むことができる。さらに、修飾核酸は、リボースの代わりにアラビノースなどの糖を含むことができる。従って、これらの核酸は、主鎖構成を異成分からなるものとすることができるため、（核酸塩基群を含むアミノ酸主鎖を有する）ペプチド核酸などの、互いに結合したポリマー単位の任意の可能な組合せを含むことができる。一部の実施態様として、これらの核酸は、主鎖構成が異成分からなるものである。また、核酸は、Ｃ−５プロピン修飾塩基などの置換されたプリンおよびピリミジンをも含む。ワーグナー・Ｒ・Ｗほか（Ｗａｇｎｅｒ Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．）（１９９６年）ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１４：ｐ８４０−４参照。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに置換および非置換芳香族部分のその他の天然および非天然核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他のこのような修飾については、当業者によく知られている。
【００７５】
天然ヌクレオシド塩基は、例えば、ヒポキサンチン；ジヒドロウラシル；シュードウラシル；２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−アミノウラシル；５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル；５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル；５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル；５−（ヒドロキシメチル）ウラシル；５−クロロウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−ヒドロキシシトシン；５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン；５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン；５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン；５−クロロシトシン；５−フルオロシトシン；５−ブロモシトシンＮ２−ジメチルグアニン；２，４−ジアミノ−プリン；８−アザプリン（特に、８−アザグアニンなど）；７−デアザ−７−置換および／または７−デアザ−８−置換プリンなどの置換７−デアザプリン（特に、７−デアザグアニンなど）；または天然ヌクレオシド塩基のその他の修飾体から選ばれる修飾ヌクレオシド塩基によって置換することができる。以上に挙げたものは例示的なものであり、限定的なものと解釈されるべきではない。
【００７６】
特に、免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有オリゴリボヌクレオチドの前記少なくとも１つのグアニン塩基は、７−デアザグアニンなどの置換もしくは修飾グアニン；８−アザグアニン；７−デアザ−７−置換グアニン（７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニンなど）；７−デアザ−８−置換グアニン；ヒポキサンチン；２，６−ジアミノプリン；２−アミノプリン；プリン；８−ヒドロキシグアニンなどの８−置換グアニン；および６−チオグアニンとすることができる。以上に挙げたものは例示的なものであり、限定的なものと解釈されるべきではない。
【００７７】
また、特に、免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有オリゴリボヌクレオチドの前記少なくとも１つのウラシル塩基は、シュードウラシルおよび５−メチルウラシルなどの置換もしくは修飾ウラシルとすることができる。
【００７８】
本発明に用いるための本発明の核酸は、当該分野で既知のいくつかの方法のどれを用いてもデノボに合成することができる。例えば、β−シアノエチルホスホラミダイト法（ボーケイジ・Ｓ・Ｌほか（Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）（１９８１年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）２２：ｐ１８５９）；Ｈ−ホスホン酸ヌクレオシド法（ガレッグほか（Ｇａｒｅｇｇｅｔ ａｌ．）（１９８６年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）２７：ｐ４０５１−４；フローラーほか（Ｆｒｏｅｈｌｅｒｅｔ ａｌ．）（１９８６年）ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１４：ｐ５３９９−４０７；ガレッグほか（Ｇａｒｅｇｇｅｔ ａｌ．）（１９８６年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）２７：ｐ４０５５−８；ガフニほか（Ｇａｆｆｎｅｙｅｔ ａｌ．）（１９８８年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）２９：ｐ２６１９−２２）が挙げられる。これらの化学反応は、市販の種々の自動核酸合成機を用いて行うことができる。こうした核酸は、合成核酸と呼ばれている。一方、Ｔ−リッチおよび／またはＴＧジヌクレオチドは、プラスミドを用いて大規模に製造することができ（サンブルック・Ｔほか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８９年参照）、また、より小さな断片に分けるか、そのまま投与することができる。核酸は、制限酵素、エキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼを使用するなど、既知の技術を利用して既存の核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）から作製することができる。このような方法により作製した核酸は、単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）核酸と呼ばれている。一般に、単離核酸とは、通常自然界で関連がある成分から分離した核酸を意味する。単離核酸の例としては、細胞、核、ミトコンドリアもしくはクロマチンから分離したものが挙げることができる。「核酸」という用語は、合成および単離核酸の両方を意味することができる。
【００７９】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で使用するためのこれらの核酸は、必要に応じて、分解に対して比較的抵抗性とすることができる（例えば、安定化する）。一部の実施態様として、必要に応じて、これらの核酸の特定の部分のみを安定化することができる。「安定化核酸分子」とは、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での（例えば、エキソ−もしくはエンド−ヌクレアーゼによる）分解に対して比較的抵抗性の核酸分子を意味するものとする。安定化は長さもしくは一次構造の関数とすることができる。数十〜数百ｋｂ長の核酸は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での分解に比較的抵抗性である。これらより短い核酸では、二次構造によりその作用を安定化および増強することができる。例えば、核酸の３’末端が上流領域に対する自己相補性を有するため、これが折り返し、一種のステムループ構造を形成する場合、核酸は安定となり、従って活性が増強する。
【００８０】
本発明のこの態様による一部の実施態様として、前記ＲＮＡオリゴマーの塩基配列は少なくとも部分的に自己相補性である。本明細書に用いている自己相補性配列とは、適当に配置すると、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕおよび／またはゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）Ｇ−Ｕ対間で分子内、より一般的には分子間の塩基対合を形成することができる塩基配列のことを意味する。一実施態様として、自己相補性の程度は少なくとも５０パーセントである。例えば、少なくとも５０パーセント自己相補性である８−マーは、４個、５個、６個、７個もしくは８個のＧ−Ｃ、Ａ−Ｕおよび／またはゆらぎＧ−Ｕ塩基対を形成し得る配列を有することができる。このような塩基対は、この自己相補性ＲＮＡオリゴマーの両端に位置する塩基を含むことができるが、必ずしもこれらを必要とするものではない。核酸の安定化がこのＲＮＡオリゴマーにとって重要とすることができる場合、塩基対合またはその他の任意の適当な手段によって二本鎖核酸の一端もしくは両端を「固定（ｃｌａｍｐ）」することは有利とすることができる。自己相補性の程度は、オリゴマー間の配置構造に依拠することができるが、この配置構造は単一もしくは複数のヌクレオシド・オーバーハングを含んでもよいし、含まなくてもよい。他の実施態様として、自己相補性の程度は、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、もしくは１００パーセントである。上記にもかかわらず、二本鎖であることが本発明のＲＮＡオリゴマーの要件ではないことに留意されたい。
【００８１】
考慮すべき事して、同様な事柄が異なる塩基配列を有するＲＮＡオリゴマー間の分子間塩基対合にも当てはまる。従って、複数のＲＮＡオリゴマーが同時に用いられる場合、これらの複数のオリゴマーは、互いに少なくとも部分的に相補性の配列を含むことができるが、これを必要とするものではない。一実施態様として、これらの複数のオリゴマーは、第１の塩基配列を有するオリゴマーおよび第２の塩基配列を有するオリゴマーを含み、この第１の塩基配列と第２の塩基配列は少なくとも５０パーセント相補性である。例えば、少なくとも５０パーセント相補性の２つの８−マー間の場合のように、これらは、４個、５個、６個、７個もしくは８個のＧ−Ｃ、Ａ−Ｕおよび／またはゆらぎＧ−Ｕ塩基対を形成することができる。このような塩基対はこの相補性ＲＮＡオリゴマーの両端に位置する塩基を含むことができるが、必ずしも含む必要はない。この場合、相補性の程度は、オリゴマー間の配置構造に依拠することができるが、この配置構造は単一もしくは複数のヌクレオシド・オーバーハングを含んでもよいし、含まなくてもよい。他の実施態様として、自己相補性の程度は、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、もしくは１００パーセントである。
【００８２】
一方、核酸の安定化は、リン酸主鎖の修飾によって達成することができる。本発明の核酸の好ましい安定化では主鎖を修飾する。核酸の主鎖を修飾すると、生体内（ｉｎ ｖｉ
ｖｏ）投与した場合の核酸の活性が増強する。主鎖修飾の１つのタイプは、リン酸主鎖の修飾である。免疫賦活性核酸において、このオリゴヌクレオチドの５’末端に少なくとも２つのホスホロチオエート結合および３’末端に複数（好ましくは５つ）のホスホロチオエート結合を含ませると、ある状況の下では、活性が最大となり、細胞内エキソ−およびエンドヌクレアーゼによる分解からこの核酸が保護される。その他の修飾核酸としては、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート核酸の組合せ、アルキルホスホネートおよびアリールホスホネート核酸の組合せ、アルキルホスホロチオエートおよびアリールホスホロチオエート核酸の組合せ、メチルホスホネート核酸、メチルホスホロチオエート核酸、ホスホロジチオエート核酸、ｐ−エトキシ核酸、モルホリノ核酸、ならびにこれらの組合せが挙げられる。ホスホロチオエート結合を有する核酸では、活性が最大となり、細胞内エキソ−およびエンドヌクレアーゼならびにこれらの組合せによる分解からこの核酸が保護される。これらの各組合せおよびその免疫細胞に対する特定の作用については、付与された米国特許第６，２０７，６４６号および第６，２３９，１１６号においてＣｐＧ核酸の場合に関し、より詳細に開示されており、これらの特許の内容全体が引用により本明細書に組み込まれている。これらの修飾核酸では、ヌクレアーゼに対する抵抗性の向上、細胞への取り込みの増加、蛋白結合の増強および／または細胞内局在の変化により賦活化作用を増強させることができると考えられる。
【００８３】
ホスホロチオエートなどの修飾主鎖は、ホスホルアミデートもしくはＨ−ホスホネート・ケミストリーを利用する自動化技術を用いて合成することができる。アリール−およびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に開示されている方法で合成することができ、また、アルキルホスホトリエステル（この荷電酸素部分が米国特許第５，０２３，２４３号およびヨーロッパ特許第０９２，５７４号に開示されている方法でアルキル化されている）は、市販の試薬を用いて自動化固相合成法により作製することができる。その他のＤＮＡ主鎖の修飾および置換方法についても報告がある。ウールマン・Ｅほか（Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ．）（１９９０年）ケミカル・レビューズ（Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．）９０：ｐ５４４；グッドチャイルド・Ｊ（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ．）（１９９０年）バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）１：ｐ１６５参照。
【００８４】
その他の安定化核酸としては、アルキル−およびアリール−ホスフェート（この場合、ホスホネートの荷電酸素がアルキルもしくはアリール基によって置換されている）、ホスホジエステル、ならびに荷電酸素部分がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルなどの非イオン性ＤＮＡアナログが挙げられる。また、一端もしくは両端にテトラエチレングリコールもしくはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含む核酸も、ヌクレアーゼによる分解に対してかなり抵抗性であることが明らかにされている。
【００８５】
別の種類の主鎖修飾体としては、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（２’−ＯＭｅ）が挙げられる。このタイプの置換については、従来広く報告されており、特にその免疫賦活化特性に関してはザオほか（Ｚｈａｏｅｔ ａｌ．）（１９９９年）バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ）９：２４：ｐ３４５３−８に報告がある。ザオほか（Ｚｈａｏｅｔ ａｌ．）は、核酸の２’ＯＭｅ修飾体を作製する方法を記載している。
【００８６】
本発明の免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、通常、約５〜約４０ヌクレオチド長である。従って、一部の別の実施態様として、このＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０ヌクレオチド長とすることができる。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０ヌクレオチド長とすることができる。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヌクレオチド長とすることができる。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、８、９、１０、１１もしくは１２ヌクレオチド長とすることができる。
【００８７】
例えば、次の塩基配列を有するＲＮＡオリゴマーが、本発明の組成物および本発明の実施に有用であることを発見した：５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’；５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’；５’−ＣＵＡＧＧＣＡＣ−３’；５’−ＣＵＣＧＧＣＡＣ−３’；および５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’と５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’との併用。
【００８８】
本発明のＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーの免疫賦活作用がＭｙＤ８８依存性であることを発見したので、本発明の免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーはその免疫賦活作用を発揮する際の１ステップとして少なくとも１種のＴＬＲと相互作用することができるというのが、本発明者の見解である。従って、本発明の免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、この少なくとも１種のＴＬＲに対する天然のリガンドの少なくとも一部に相当もしくは類似したものであるとすることができる。このような天然リガンドとしては、原核または真核生物のリボソームＲＮＡおよび特定のウイルスＲＮＡを挙げることができる。上記ＴＬＲは、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７もしくは何らかのまだ明らかにされていないＴＬＲとすることができる。ＴＬＲ１、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ１０の天然リガンドは、これまでのところ、報告されていない。
【００８９】
本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が、通常、高度に保存された配列もしくは重要な構造的特徴に関連している天然のあらゆるタイプのＲＮＡの中に存在することを発見した。１例として、免疫賦活性ＲＮＡは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と関連して存在することを見出した。
【００９０】
ＩＲＥＳは、キャップ非依存性にウイルスゲノムの翻訳開始を調節する、ウイルスＲＮＡおよび他のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内の複雑な構造的特徴の中に含まれる最小のシス作用性ＲＮＡエレメントである。ヘレン・Ｃ・Ｕほか（Ｈｅｌｌｅｎ Ｃ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．）１５：ｐ１５９３−１６１２参照。ウイルスＲＮＡ翻訳がｃａｐ非依存性に開始されることについては、ピコルナウイルスで最初に観察された。ジャクソン・Ｒ・Ｊほか（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（１９９０年）トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．）１５：ｐ４７７−８３；ジャクソン・Ｒ・Ｊほか（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）（１９９５年）アール・エヌ・エー（ＲＮＡ）１：ｐ９８５−１０００参照。
【００９１】
多くの真核細胞では、ｍＲＮＡの翻訳開始は、ｅＩＦ４Ｅ（キャップ結合蛋白質）、ｅＬＩＦ４ＡおよびｅＩＦ４Ｇからなるキャップ結合複合体の真核細胞翻訳開始因子（ｅＩＦ）４をｍＲＮＡの５’キャップ（ｃａｐｐｅｄ）末端に動員することで始まる。次いで、ｅＩＦ３を含有する４０Ｓリボソームサブユニットおよび三重開始複合体ｔＲＮＡ−ｅＩＦ２−ＧＴＰが、ｅＩＦ３とｅＩＦ４Ｇとの間の相互作用によりｍＲＮＡの５’末端へ動員される。次に、この４０Ｓサブユニットが、適当な開始コドンに出会うまでそのｍＲＮＡを５’から３’への方向に読み取って行き、その後すぐに、開始メチオニンｔＲＮＡのアンチコドンが嵌め込まれ、これに６０Ｓが加わって８０Ｓリボソームが形成され、翻訳が開始される。
【００９２】
従って、少なくともウイルスとの関連で見たＩＲＥＳの重要性は、ＩＲＥＳが、細胞内の通常のキャップ依存性翻訳に対して、ウイルスに選択的な利点を与えることができるこ
とにあると考えられている。
【００９３】
以下のウイルスはそのゲノム内にＩＲＥＳエレメントを有すると報告されている：全てのピコルナウイルス；ウシウイルス下痢症ウイルス；豚コレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃ
ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）；コオロギ麻痺病ウイルス；脳心筋炎ウイルス；蹄疫ウイルス；フレンドマウス白血病ウイルスｇａｇ ｍＲＮＡ；ＨＣＶ；ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ ｍＲＮＡ；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス；モロニーマウス白血病ウイルスｇａｇ ｍＲＮＡ；チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸ウイルス；ポオウイルス；ライノウイルス；ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）ウイルス；およびラウス肉腫ウイルス。ヘレン・Ｃ・Ｕほか（Ｈｅｌｌｅｎ Ｃ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．）１５：ｐ１５９３−１６１２参照。以上掲載したものは限定的なものではない。
【００９４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルス蛋白質は、５’および３’ＵＴＲによって隣接されている９．５ｋｂの一本鎖プラス・センス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡから翻訳される。この高度に保存された５’ＵＴＲはｎｔ４０〜３７０に存在するＩＲＥＳを含む。レイノルズ・Ｊ・Ｅほか（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．）（１９９６年）アール・エヌ・エー（ＲＮＡ）２：ｐ８６７−７８参照。このＨＣＶ５’ＵＴＲは、４つの主要構造ドメイン（Ｉ〜ＩＶ）を有し、このうちドメインＩＩおよびＩＩＩはサブドメインを有すると考えられている。サブドメインＩＩＩｄは、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）突然変異に関する研究に基づき、ＨＣＶ ＩＲＥＳ媒介性翻訳において重要と報告されている２７ ｎｔステム−ループ（ｎｔ２５３−２７９）を含む。キーフト・ジェイ・エスほか（Ｋｉｅｆｔ Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．）（１９９９年）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２９２：ｐ５１３−２９；クリンク・Ｒほか（Ｋｌｉｎｃｋ Ｒ．ｅｔ ａｌ．）（２０００年）アール・エヌ・エー（ＲＮＡ）６：ｐ１４２３−３１参照。ＩＩＩｄ２７−マーの配列は、５’−ＧＣＣＧＡＧＵＡＧＵＧＵＵＧＧＧＵＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣ−３’（配列番号４）で示され、この場合、ＵＵＧＧＧＵは末端ループを形成している。このステム−ループ構造は、ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）Ｕ・Ｇ、Ｕ・Ａ、Ｇ・ＡおよびＡ・Ａ塩基対を含む、他のＲＮＡに典型的ないくつかの非ワトソン−クリック塩基対を有すると報告されている。
【００９５】
別の例では、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ配列が、効率的なウイルスＲＮＡ詰め込み（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に極めて重要なヒト免疫不全ウイルス・タイプ１（ＨＩＶ−１）のウイルスＲＮＡの５’末端近傍のＧ、Ｕ−リッチ配列内に存在することを発見した。ラッセル・Ｒ・Ｓほか（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．）（２００２年）バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）３０３：ｐ１５２−６３参照。具体的には、Ｕ５内の２つの重要なＧ、Ｕ−リッチ配列、即ち、それぞれＢＨ１０株のｎｔ９９〜１０８および１１２〜１２３に相当する５’−ＧＵＡＧＵＧＵＧＵＧ−３’（配列番号２）および５’−ＧＵＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧ−３’（配列番号３）が高度に免疫賦活性であることを本発明によって発見した（以下の実施例１１参照）。配列番号２がＧＵＡＧＵおよびＧＵＧＵＧを含み、配列番号３がＧＵＧＵＧを含むことが注目されよう。
【００９６】
さらに別の例では、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ配列が、多数の種の細菌の５ＳリボソームＲＮＡループＥ内に存在することを見出した。
【００９７】
ＴＬＲ８およびＴＬＲ７は、ＴＬＲ９に高度な配列相同性を示す（図８）。ＴＬＲ９は、ＣｐＧ−ＤＮＡ受容体であり、免疫賦活性シグナルを変換する。ＴＬＲ内には２つのＤＮＡ結合モチーフが存在することが開示されており（米国特許出願第０９／９５４，９８７号）、これらは一部修飾されてＴＬＲ８およびＴＬＲ７にも存在する（図９）。しかし
ながら、このような類似性にもかかわらず、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８はＣｐＧ−ＤＮＡに結合しない。
【００９８】
グアノシン、特にウラシルと結合させたグアノシン、および一部のグアノシン含有核酸とその誘導体がＴＬＲ８の天然リガンドであることを本発明により発見した。また、ＲＮＡ、酸化ＲＮＡ、Ｇ、Ｕ−リッチ核酸、および少なくとも１つのＧ−Ｕ塩基対を有する少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子がＴＬＲ８リガンドであることも本発明により発見した。グアノシン、グアノシン誘導体およびＧ、Ｕ−リッチ核酸にかかわる一部の好ましい実施態様として、グアノシンはそのリボヌクレオシドである。ＧＵＵ、ＧＵＧ、ＧＧＵ、ＧＧＧ、ＵＧＧ、ＵＧＵ、ＵＵＧ、ＵＵＵ、これらの倍数体およびこれらの任意の組合せを含む核酸分子は、ＴＬＲ８リガンドであると考えられる。一部の実施態様として、このＴＬＲ８リガンドは、ヘキサマー配列（ＵＵＧＵＧＧ）ｎ、（ＵＧＧＵＵＧ）ｎ、（ＧＵＧＵＧＵ）ｎもしくは（ＧＧＧＵＵＵ）ｎを含み、ｎが１〜８の整数であるものとし、好ましくはｎが少なくとも３であるものとするＧ、Ｕ−リッチオリゴヌクレオチドである。さらに、リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物（即ち、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルリボヌクレオシドバナジル錯体の混合物）ならびにグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体単独がＴＬＲ８リガンドであることも、本発明により発見した。さらに、レシキモッドおよびイミキモッドを含む一部のイミダゾキノリン類がＴＬＲ８リガンドであることを本発明により発見した。
【００９９】
また、グアノシンおよび一部のグアノシン含有核酸とその誘導体がＴＬＲ７の天然リガンドであることも本発明により発見した。さらに、ＲＮＡ、酸化ＲＮＡ、Ｇ−リッチ核酸、およびＧ含量が高い少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子がＴＬＲ８リガンドであることも本発明により発見した。グアノシン、グアノシン誘導体およびＧ−リッチ核酸にかかわる一部の好ましい実施態様として、グアノシンはそのリボヌクレオシドである。さらに、リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物（即ち、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルリボヌクレオシドバナジル錯体の混合物）ならびにグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体単独がＴＬＲ７リガンドであることも、本発明により発見した。さらに、７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ））がＴＬＲ７リガンドであることを本発明により発見した。
【０１００】
これらの種々のＴＬＲは、さまざまなリガンドを有することの他に、種々の組織およびさまざまなタイプの免疫細胞において識別的に発現されると考えられている。例えば、ヒトＴＬＲ７は、胎盤、肺、脾臓、リンパ節、扁桃腺、および形質球様前駆樹状細胞（ｐＤＣ）において発現されることが報告されている。チュアン・Ｔ−Ｈほか（Ｃｈｕａｎｇ Ｔ−Ｈ ｅｔ ａｌ．）（２０００年）ヨーロピアン・サイトカイン・ネットワーク（Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．）１１：ｐ３７２−８；カドワキ・Ｎほか（Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）１９４：ｐ８６３−９参照。ヒトＴＬＲ８は、肺、末梢血白血球（ＰＢＬ）、胎盤、脾臓、リンパ節、および単球において発現されることが報告されている。カドワキ・Ｎほか（Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）１９４：ｐ８６３−９；チュアン・Ｔ−Ｈほか（Ｃｈｕａｎｇ Ｔ−Ｈｅｔ ａｌ．）（２０００年）ヨーロピアン・サイトカイン・ネットワーク（Ｅｕｒ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．）１１：ｐ３７２−８参照。ヒトＴＬＲ９は、脾臓、リンパ節、骨髄、ＰＢＬ、ならびにｐＤＣ、Ｂ細胞およびＣＤ１２３＋ＤＣにおいて発現されると報告されている。カドワキ・エヌほか（Ｋａｄｏｗａｋｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）１９４：ｐ８６３−９；バウアー・Ｓほか（Ｂａｕｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．）（２００１年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ）ＵＳＡ９８：ｐ９２３７−４２；チュアン・Ｔ−Ｈほか（Ｃｈｕａｎｇ Ｔ−Ｈｅｔ ａｌ．）（２０００年）ヨーロピアン・サイトカイン・ネットワーク（Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．）１１：ｐ３７２−８参照。
【０１０１】
これまで、グアノシン誘導体は、Ｂ細胞およびＮＫ細胞のアクチベータとして説明されてきたが、これらの受容体および作用メカニズムについては知られていなかった。グッドマン・Ｍ・Ｇほか（Ｇｏｏｄｍａｎ Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．）（１９９４年）ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）２７４：ｐ１５５２−５７；ライツ・Ａ・Ｂほか（Ｒｅｉｔｚ Ａ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．）（１９９４年）ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）３７：ｐ３５６１−７８参照。このようなグアノシン誘導体としては、８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、および７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
イミダゾキノリン類は、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）ならびに一部のインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−１２）を含む数種のサイトカインの発現を誘起すると考えられる合成低分子免疫反応修飾物質である。イミダゾキノリン類は、これらがＩｇＧ２ａレベルの増加を誘起することができることから部分的に明らかなように、Ｔｈ１免疫反応を賦活化することができる。また、イミダゾキノリン剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−３などのＴｈ２サイトカインの産生を抑制することができることも報告されている。イミダゾキノリン類によって誘導されるサイトカインの一部は、マクロファージおよび樹状細胞によって産生される。イミダゾキノリン類うちの一部の化学種は、ＮＫ細胞溶解作用を増強し、Ｂ細胞の増殖および分化を促進することにより抗体の産生および分泌を誘起すると報告されている。
【０１０３】
本明細書に用いているイミダゾキノリン剤としては、イミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミンおよび１，２−架橋イミダゾキノリンアミンが挙げられる。これらの化合物は、米国特許第４６８９３３８号、第４９２９６２４号、第５２３８９４４号、第５２６６５７５号、第５２６８３７６号、第５３４６９０５号、第５３５２７８４号、第５３８９６４０号、第５３９５９３７号、第５４９４９１６号、第５４８２９３６号、第５５２５６１２号、第６０３９９６９号および第６１１０９２９号に開示されている。イミダゾキノリン剤の具体的な化学種としては、４−アミノ−α，α−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール（レシキモッドもしくはＲ−８４８もしくはＳ−２８４６３；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８７６４号、国際特許第ＷＯ ０２／２２１２５号）；および１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（イミキモッドもしくはＲ−８３７もしくはＳ−２６３０８）が挙げられる。現在、イミキモッドは、性器および肛門のいぼ等のいぼの局所治療に用いられており、また、基底細胞癌の局所治療においても試験されている。
【０１０４】
ヒトおよびマウスＴＬＲ３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は既知である。例えば、ジェンバンク登録（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号Ｕ８８８７９、ＮＭ＿００３２６５、ＮＭ＿１２６１６６、ＡＦ３５５１５２；およびＡＡＣ３４１３４、ＮＰ＿００３２５６、ＮＰ＿５６９０５４、ＡＡＫ２６１１７参照。ヒトＴＬＲ３は、９０４アミノ酸長であり、配列番号２１で示される配列を有することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は配列番号２１として示される。マウスＴＬＲ３は、９０５アミノ酸長であり、配列番号２２で示される配列を有することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は配列番号２３として示される。ＴＬＲ３ポリペプチドは、ロイシン−リッチ反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含有する細胞内ドメインを含んでいる。
【０１０５】
本明細書に用いている「ＴＬＲ３ポリペプチド」とは、上記配列の１つによる完全長のＴＬＲ３、相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、対立遺伝子多型、ＳＮＰ、保存的アミノ酸置換を有する変異体、ＴＬＲ３融合蛋白質、およびこれらの任意のものの機能性断片を含むポリペプチドのことを意味する。好ましい実施態様は、配列番号２０のヒトＴＬＲ３アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるヒトＴＬＲ３ポリペプチドを含む。また、好ましい実施態様は、配列番号２２のマウスＴＬＲ３アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるマウスＴＬＲ３ポリペプチドを含む。
【０１０６】
本明細書に用いている「ＴＬＲ３シグナル伝達」とは、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路をＴＬＲ３ポリペプチドが賦活化することができることを意味する。ＴＬＲ３活性の変化については、κＢ−感受性のプロモータおよびエンハンサーの制御下に遺伝子を発現させるなど、本明細書に開示したようなアッセイ法を用いて測定することができる。このような天然の遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ ｐ４０）ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより（下記参照）、ＴＬＲ３シグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。配列番号２１もしくは配列番号２３に対して、好ましくは、配列番号２１のオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に大して別のヌクレオチド配列を加えることによって、検出可能な部分、即ちレポータ部分、例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、および当業者に知られているその他のものを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１０７】
【化１】
【０１０８】
【化２】
【０１０９】
【化３】
ヒトおよびマウスＴＬＲ７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については既知である。例えば、ジェンバンク登録番号ＡＦ２４０４６７、ＡＦ２４５７０２、ＮＭ＿０１６５６２、ＡＦ３３４９４２、ＮＭ＿１３３２１１；およびＡＡＦ６０１８８、ＡＡＦ７８０３５、ＮＰ＿０５７６４６、ＡＡＬ７３１９１、ＡＡＬ７３１９２参照。ヒトＴＬＲ７は、１，０４９アミノ酸長であり、配列番号２４で示される配列を有することが報告されてい
る。これに対応するヌクレオチド配列は、配列番号２５として示される。マウスＴＬＲ７は、１，０５０アミノ酸長であり、配列番号２６で示される配列を有することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は、配列番号２７として示される。ＴＬＲ７ポリペプチドは、ロイシン−リッチ反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含有する細胞内ドメインを含んでいる。
【０１１０】
本明細書に用いている「ＴＬＲ７ポリペプチド」とは、上記配列の１つによる完全長のＴＬＲ７、相同分子種、対立遺伝子多型、ＳＮＰ、保存的アミノ酸置換を有する変異体、ＴＬＲ７融合蛋白質、およびこれらの任意のものの機能性断片を含むポリペプチドのことを意味する。好ましい実施態様は、配列番号２４のヒトＴＬＲ７アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるヒトＴＬＲ７ポリペプチドを含む。また、好ましい実施態様は、配列番号２６のマウスＴＬＲ７アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるマウスＴＬＲ７ポリペプチドを含む。
【０１１１】
本明細書に用いている「ＴＬＲ７シグナル伝達」とは、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路をＴＬＲ７ポリペプチドが賦活化することができることを意味する。ＴＬＲ７活性の変化については、κＢ−感受性のプロモータおよびエンハンサーの制御下に遺伝子を発現させるなど、本明細書に開示したようなアッセイ法を用いて測定することができる。このような天然の遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ ｐ４０）ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより（下記参照）、ＴＬＲ７シグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。配列番号２５もしくは配列番号２７に対して、好ましくは、配列番号２５のオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に対して別のヌクレオチド配列を加えることによって、検出可能な部分、即ちレポータ部分、例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、および当業者に知られているその他のものを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１１２】
【化４】
【０１１３】
【化５】
【０１１４】
【化６】
【０１１５】
【化７】
ヒトおよびマウスＴＬＲ８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については既知である。例えば、ジェンバンク登録番号ＡＦ２４６９７１、ＡＦ２４５７０３、ＮＭ＿０１６６１０、ＸＭ＿０４５７０６、ＡＹ０３５８９０、ＮＭ＿１３３２１２；およびＡＡＦ６４０６１、ＡＡＦ７８０３６、ＮＰ＿０５７６９４、ＸＰ＿０４５７０６、ＡＡＫ６２６７７、ＮＰ＿５７３４７５参照。ヒトＴＬＲ８は、少なくとも２つのイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）、１つは配列番号２８の配列を有する１，０４１アミノ酸長のもの、他は配列番号３０の配列を有する１，０５９アミノ酸長のものとして存在することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号２９および配列番号３１として示される。これらの２つのイソ型のうち、短鎖のものの方がより重要と考えられている。マウスＴＬＲ８は、１，０３２アミノ酸長であり、配列番号３２で示される配列を有する。これに対応するヌクレオチド配列は、配列番号３３として示される。ＴＬＲ８ポリペプチドは、ロイシン−リッチ反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含有する細胞内ドメインを含んでいる。
【０１１６】
本明細書に用いている「ＴＬＲ８ポリペプチド」とは、上記配列の１つによる完全長のＴＬＲ８、相同分子種、対立遺伝子多型、ＳＮＰ、保存的アミノ酸置換を有する変異体、ＴＬＲ８融合蛋白質、およびこれらの任意のものの機能性断片を含むポリペプチドのことを意味する。好ましい実施態様は、配列番号２８のヒトＴＬＲ８アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるヒトＴＬＲ８ポリペプチドを含む。また、好ましい実施態様は、配列番号３２のマウスＴＬＲ８アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるマウスＴＬＲ８ポリペプチドを含む。
【０１１７】
本明細書に用いている「ＴＬＲ８シグナル伝達」とは、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路をＴＬＲ８ポリペプチドが賦活化することができることを意味する。ＴＬＲ８活性の変化については、κＢ−感受性のプロモータおよびエンハンサーの制御下に遺伝子を発現させるなど、本明細書に開示したようなアッセイ法を用いて測定することができる。このような天然の遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ ｐ４０）ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより（下記参照）、ＴＬＲ８シグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。配列番号２９もしくは配列番号３３に対して、好ましくは、配列番号２９のオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に対して別のヌクレオチド配列を加えることによって、検出可能な部分、即ちレポータ部分、例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色
蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、および当業者に知られているその他のものを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１１８】
【化８】
【０１１９】
【化９】
【０１２０】
【化１０】
【０１２１】
【化１１】
【０１２２】
【化１２】
ヒトおよびマウスＴＬＲ９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については既知である。例えば、ジェンバンク登録番号ＮＭ＿０１７４４２、ＡＦ２５９２６２、ＡＢ０４５１８０、ＡＦ２４５７０４、ＡＢ０４５１８１、ＡＦ３４８１４０、ＡＦ３１４２２４、ＮＭ＿０３１１７８、；およびＮＰ＿０５９１３８、ＡＡＦ７２１８９、ＢＡＢ１９２５９、ＡＡＦ７８０３７、ＢＡＢ１９２６０、ＡＡＫ２９６２５、ＡＡＫ２８４８８、ＮＰ＿１１２４５５参照。ヒトＴＬＲ９は、少なくとも２つのイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）、１つは配列番号３４の配列を有する１，０３２アミノ酸長のもの、他は配列番号３６の配列を有する１，０５５アミノ酸長のものとして存在することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３５および配列番号３７として示される。これらの２つのイソ型のうち、短鎖のものの方がより重要と考えられている。マウスＴＬＲ９は、１，０３２アミノ酸長であり、配列番号３８で示される配列を有する。これに対応するヌクレオチド配列は、配列番号３９として示される。ＴＬＲ９ポリペプチドは、ロイシン−リッチ反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含有する細胞内ドメインを含んでいる。
【０１２３】
本明細書に用いている「ＴＬＲ９ポリペプチド」とは、上記配列の１つによる完全長のＴＬＲ９、相同分子種、対立遺伝子多型、ＳＮＰ、保存的アミノ酸置換を有する変異体、ＴＬＲ８融合蛋白質、およびこれらの任意のものの機能性断片を含むポリペプチドのことを意味する。好ましい実施態様は、配列番号３４のヒトＴＬＲ９アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるヒトＴＬＲ９ポリペプチドを含む。また、好ましい実施態様は、配列番号３８のマウスＴＬＲ９アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるマウスＴＬＲ９ポリペプチドを含む。
【０１２４】
本明細書に用いている「ＴＬＲ９シグナル伝達」とは、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路をＴＬＲ９ポリペプチドが賦活化することができることを意味する。特定の理論などによるという意味ではなく、このＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路は、骨髄分化マーカー（ＭｙＤ８８）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）という分子を介するシグナル伝達を伴い、ＩκＢキナーゼ複合体のキナーゼおよびｃ−ｊｕｎ ＮＨ２−末端キナーゼ（例えば、Ｊｎｋ１／２）の賦活化をもたらすと考えている。ヘッカー・エイチほか（Ｈａｅｃｋｅｒ Ｈ．ｅｔ ａｌ．）（２０００年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）１９２：ｐ５９５−６００参照。ＴＬＲ９活性の変化については、κＢ−感受性のプロモータおよびエンハンサーの制御下に遺伝子を発現させるなど、本明細書に開示したようなアッセイ法を用いて測定することができる。このような天然の遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ ｐ４０）ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより（下記参照）、ＴＬＲ９シグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。配列番号３５もしくは配列番号３９に対して、好ましくは、配列番号３５のオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に対して別のヌクレオチド配列を加えることによって、検出可能な部分、即ちレポータ部分、例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、および当業者に知られているその他のものを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１２５】
【化１３】
【０１２６】
【化１４】
【０１２７】
【化１５】
【０１２８】
【化１６】
【０１２９】
【化１７】
リボヌクレオシドバナジル錯体（即ち、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルリボヌクレオシドバナジル錯体の混合物）は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤として当業者にはよく知られてる。バーガー・Ｓ・Ｌほか（Ｂｅｒｇｅｒ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．）（１９７９年）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１８：ｐ５１４３；プスカシュ・Ｒ・Ｓほか（Ｐｕｓｋａｓ Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．）（１９８２年）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２１：ｐ４６０２参照。リボヌクレオシドバナジル錯体は、シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ．）などの供給元から市販されている。
【０１３０】
一実施態様として、本発明の免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、ＣｐＧジヌクレオチドを含まず、ＣｐＧ免疫賦活性核酸ではない。一部の実施態様として、ＣｐＧ免疫賦活性核酸は、本発明の方法において用いている。
【０１３１】
ＣｐＧ免疫賦活性核酸はＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸であり、そのＣ残基はメチル化されていない。ＣｐＧ免疫賦活性核酸はＴｈ１型免疫反応を賦活化することが知られている。ＣｐＧ配列は、ヒトＤＮＡ中に存在するのは比較的まれであるが、細菌などの感染性微生物のＤＮＡ中にはよく見られる。ヒトの免疫系は、感染初期の危険徴候としてＣｐＧを認識し、他の免疫賦活剤でよく見られるような有害反応を生じることなく侵入病原体に対して直ちに強力な免疫反応を開始するよう進化したものと思われる。従って、この先天性免疫防御機構に依存するＣｐＧ含有核酸は、免疫療法のために独自で自然な経路を利用することができる。ＣｐＧ核酸の免疫調節に対する作用については、広く、米国特許第６，１９４，３８８Ｂ１号、第６，２０７，６４６Ｂ１号、第６，２３９，１１６Ｂ１号、第６，２１８，３７１号などの米国特許、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３６７８号、第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０４０８号、第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４７０３号、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９８６３号などの公開特許出願に開示されている。これらの特許のそれぞれの内容全体は、引用により本明細書に組み込まれている。
【０１３２】
ＣｐＧ核酸は、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸である。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸は、シトシン−グアニンジヌクレオチド配列中に非メチル化シトシンを含む核酸分子（すなわち、「ＣｐＧ ＤＮＡ」、もしくは５’シトシンの次にグアノシンが続き、これらがリン酸結合によって連結されているＤＮＡ）であり、免役系を賦活化する。このＣｐＧ核酸は、二本鎖もしくは一本鎖とすることができる。概して、二本鎖分子は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でより安定ではあるが、一本鎖分子の方が免疫活性は高い。従って、本発明の一部の態様として、この核酸は一本鎖であることが好ましいが、その他の態様としては、この核酸は二本鎖であることが好ましい。一部の実施態様として、この核酸は一本鎖であるが、（例えば、それ自体で折り返すことによって、または全体にわたって、もしくは長さに沿って選ばれたセグメントでそれ自体とハイブリッドを形成することによって）二次および三次構造を形成することができる。従って、このような核酸の一次構造は一本鎖とすることができるが、そのより高次の構造は二本鎖または三本鎖とすることができる。本明細書で用いているＣｐＧ核酸もしくはＣｐＧオリゴヌクレオチドという用語は、特に別の記載がない限り、免疫賦活性ＣｐＧ核酸のことを意味する。免疫賦活性核酸全体を非メチル化することができ、あるいは部分を非メチル化してもよいが、少なくとも５’ＣＧ３’のＣは非メチル化する必要がある。
【０１３３】
一態様として、本発明は、免疫細胞を賦活化する方法を提供する。この方法は、免疫細胞に対し、前述した本発明の免疫賦活性組成物を、この免疫細胞の賦活化を誘起する有効な量で接触させるものである。本明細書で用いている「免疫細胞」とは、免役系に属する細胞である。免疫細胞は、炎症および免疫反応の調節ならびに遂行に関与している。これらのものとしては、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、他の組織特異的抗原提示細胞（例えば、ランゲルハンス細胞）、マクロファージ、単球、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、および肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。脾細胞、胸腺細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は免疫細胞を含んでいる。免疫細胞は、当業者によく知られている方法を用いて、血液、脾臓、骨髄、リンパ節、胸腺その他の組織から単離することができる。また、免疫細胞は、一部の細胞株、およびイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）もしくは生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で維持されている一次培養細胞を含むことができる。
【０１３４】
一実施態様として、上記免疫細胞の賦活化はこの免疫細胞によるサイトカインの分泌を必要とする。一実施態様として、上記免疫細胞の賦活化はこの免疫細胞によるケモカインの分泌を必要とする。一実施態様として、上記免疫細胞の賦活化はこの免疫細胞による共起刺激／アクセサリー分子の発現を必要とする。一実施態様として、この共起刺激／アク
セサリー分子は、細胞内粘着分子（ＩＣＡＭ、例えばＣＤ５４）、白血球機能関連抗原（ＬＦＡ、例えば、ＣＤ５８）、Ｂ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）およびＣＤ４０からなる群から選ばれる。
【０１３５】
「免疫細胞の賦活化」とは、免疫細胞が、休止もしくは静止状態から免疫細胞機能と関連した代謝活性および表現型の増強された状態へ移行することを意味するものとする。このような免疫細胞機能としては、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、ケモカインなどの可溶性産物の分泌；共起刺激／アクセサリー分子およびＭＨＣ抗原の細胞表面における発現；免疫細胞移動；標的細胞に対する食作用および細胞傷害作用；ならびに細胞成熟を挙げることができる。ある場合には、免疫の賦活化はＴｈ１免疫賦活化のことを意味することができ、他の場合には、免疫の賦活化はＴｈ２免疫賦活化のことを意味することができる。
【０１３６】
本明細書で用いている「Ｔｈ１免疫賦活化」とは、特定のサイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリンのサブクラスなどのＴｈ１様分泌産物を発現する免疫細胞を賦活化すること；および特定の免疫細胞を賦活化させることを意味する。Ｔｈ１様分泌産物としては、例えば、サイトカインのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、およびケモカインのＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）が挙げられる。マウスでは、Ｔｈ１免疫賦活化はＩｇＧ２ａの分泌を促進する。又、Ｔｈ１免疫賦活化は、ＮＫ細胞および樹状細胞、即ち、細胞性免疫に関与する細胞の賦活化を含むこともできる。Ｔｈ１免疫賦活化は、Ｔｈ２免疫賦活化を逆調節していると考えられる。
【０１３７】
本明細書で用いている「Ｔｈ２免疫賦活化」とは、特定のサイトカインおよび免疫グロブリンのサブクラスなどのＴｈ２様分泌産物を発現する免疫細胞を賦活化することを意味する。Ｔｈ２様分泌産物としては、例えば、サイトカインのＩＬ−４およびＩＬ−１０が挙げられる。マウスでは、Ｔｈ２免疫賦活化はＩｇＧ１およびＩｇＥの分泌を促進する。Ｔｈ２免疫賦活化は、Ｔｈ１免疫賦活化を逆調節していると考えられる。
【０１３８】
別の態様として、本発明は、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。この方法は、被験体に対し、被験体の免疫反応を誘起するのに有効な量で、本発明の組成物を投与するものである。従って、本発明の組成物は、免疫の賦活化を必要としている被験体の治療に用いることができる。免疫の賦活化を必要としている被験体としては、ＴＨ１様免疫の賦活化を必要としている被験体を挙げることができる。
【０１３９】
本発明の組成物および方法は、単独もしくは他剤との併用で用いることによりＴＨ１様免疫の賦活化を必要としている被験体を治療することができる。「ＴＨ１様免疫の賦活化を必要としている被験体」とは、疾病、疾患、もしくは免疫反応をＴｈ１に向けて偏らせることが有効な症状に罹患しているか、罹患するリスクのある被験体である。このような被験体は、Ｔｈ１媒介性の相互調節（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）もしくは抑制を受けやすいＴｈ２媒介性疾患に罹患しているか、罹患するリスクのある者とすることができる。このような疾患としては、例えば、特定器官に特異的な自己免疫疾患が挙げられる。あるいは、このような被験体は、Ｔｈ１欠損症状を有するか、これを発症するリスクのある者とすることができる。このような疾患としては、例えば、腫瘍、細胞内病原体による感染、およびＡＩＤＳが挙げられる。
【０１４０】
本明細書で用いている「Ｇ、Ｕ−リッチＲＮＡ」とは、塩基組成でグアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）が少なくとも６０パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセントである少なくとも５ヌクレオチド長のＲＮＡを意味するものとする。このような塩基組成については、このＲＮＡが１０塩基長以下であれば、その完全長について測定し、１１塩基長以上であれば、少なくとも１０個の連
続する塩基の一伸びについて測定する。
【０１４１】
本明細書で用いている「Ｇ−リッチＲＮＡ」とは、塩基組成でグアニン（Ｇ）が少なくとも７０パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセントであるＲＮＡを意味するものとする。このような塩基組成については、このＲＮＡが１０塩基長以下であれば、その完全長について測定し、１１塩基長以上であれば、少なくとも１０個の連続する塩基の一伸びについて測定する。
【０１４２】
一部の実施態様として、本発明の組成物は、ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体を含む。ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体とは、少なくとも１つのリボヌクレオシドに結合した少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシドを含む分子もしくは結合体を意味するものとする。このデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシド成分は、塩基対の相互作用によって結合させることができる。あるいは、このデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシド成分は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシドおよび少なくとも１つのリボヌクレオシドの糖部分間の共有結合によって結合させることができる。この糖部分間の共有結合は、直接的、または、例えば、リンカーを介する間接的なものとすることができる。塩基対相互作用としては、通常、非共有結合性のワトソン−クリック型塩基対相互作用が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明では、非共有結合性（例えば、ホーグスタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）塩基対合）および共有結合性相互作用を含むその他の塩基対相互作用も企図している。また、通常、塩基対相互作用は２本のストランドを必要とする二本鎖形成を意味するが、本発明ではより高次の相互作用も企図している。
【０１４３】
上記の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシドおよび少なくとも１つのリボヌクレオシドの糖部分間の共有結合を伴うＤＮＡ：ＲＮＡ結合体は、本明細書では、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を有するものとする。キメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を有するこのＤＮＡ：ＲＮＡ結合体は、その塩基配列により規定される一次構造を有するが、さらに、これは二次以上の高次の構造を有することができる。二次以上の高次の構造には、少なくとも１つの分子内塩基対相互作用、例えば、ステム−ループ構造、または分子間塩基対相互作用が含まれよう。
【０１４４】
ヘテロ二重鎖塩基対合とは、ＤＮＡとＲＮＡ間の分子内もしくは分子間塩基対相互作用を意味するものとする。例えば、ヘテロ二重鎖塩基対合は、個々の相補性の一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ分子間で行わせることができる。あるいは、適当なＤＮＡ：ＲＮＡキメラ主鎖核酸分子では、同じ分子内の相補性ＤＮＡおよびＲＮＡ領域間でヘテロ二重鎖塩基対合を行わせることができる。
【０１４５】
一部の実施態様として、本発明の組成物は、ＤＮＡとＲＮＡ間に切断部位を有するキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む。切断部位とは、任意の適当な手段により切断されやすいキメラ主鎖に沿った構造要素のことを意味する。この切断部位は、エンドヌクレアーゼにより比較的切断されやすいホスホジエステル結合とすることができる。この場合、ＤＮＡおよびＲＮＡがそれぞれ、安定化されたヌクレオチド間結合を含むことによって、そのキメラ主鎖がこの安定化ＤＮＡと安定化ＲＮＡとの間のホスホジエステル接合部でエンドヌクレアーゼによる切断を最も受けやすいようにすることができる。この切断部位は、特定のｐＨ条件下、例えば、低いｐＨよりも高いｐＨで、またはその逆で比較的より安定な条件下で切断されやすいようにデザインすることができる。このようなｐＨ感受性は、例えば、このキメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物をリポソームを用いて調製することにより得ることができる。上記切断部位は、ジスルフィド結合を含むことができる。このようなジスルフィド結合は、例えばエンドソーム内に存在する還元的な条件下よりも酸化的な条件下で比較的より安定なものとすることができる。また、この切断部位は、酵素、ｐＨ、酸化還元条件などにより切断されやすいリンカーを含むことができる。
【０１４６】
本発明の結合体では、結合体の成分について一定のモル比を選択することができる。ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体の場合、ＤＮＡとＲＮＡとの比を１：１とすることが有利もしくは好都合とすることができる。ヘテロ二重鎖ＤＮＡ：ＲＮＡである結合体では、ＤＮＡとＲＮＡとの比は１：１とするのが通例であろう。また、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を有する結合体でも、ＤＮＡとＲＮＡとの比は、通例１：１とすることができる。他のＤＮＡ：ＲＮＡ比を有する結合体についても本発明は企図しており、例えば、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、４：１などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。この結合体は、１種以上の成分に対し、同じ成分単独の安定性と比較して、より安定なものとすることができる。また、結合体とすることにより、その成分を選択した比率で細胞内に送達することが容易になる。
【０１４７】
切断部位は、本発明において有用ないくつかの目的のどれにも役立てることができる。この切断部位を介して結合した成分は、対象の細胞に送達されるとすぐに遊離して、細胞内もしくは細胞近傍で、独立に、または最適に活性となることができる。一部の実施態様として、この切断部位は、その結合体成分の少なくとも１種についての薬動力学に重要なものとなることができる。例えば、この切断部位は、成分のうちの１種の持続放出を延長させるように、デザインし、選択することができる。
【０１４８】
本発明は、概して、免疫賦活性化合物を同定する効率的な方法、ならびにこれにより同定された化合物および物質を提供する。概して、このスクリーニング方法は、特定のＴＬＲを介するシグナル伝達を抑制または増強する化合物についてアッセイを行うものである。この方法では、ＴＬＲ、このＴＬＲに対する適当な対照リガンド、および免疫賦活性候補化合物を用いる。選択したＴＬＲを適当な対照化合物（ＴＬＲリガンド）と接触させ、ＴＬＲ媒介性対照シグナルを測定する。また、この選択したＴＬＲを免疫賦活性候補化合物と接触させ、ＴＬＲ媒介性対照シグナルを測定する。次に、こうして得られた試験シグナルと対照シグナルを比較する。その後、好ましい免疫賦活性候補化合物は、このアッセイの対照化合物として用いることができる。この方法は、候補化合物の、自動化されたハイスループット・スクリーニングに対応可能である。このようなハイスループット・スクリーニング法の例については、米国特許第６，１０３，４７９号、第６，０５１，３８０号、第６，０５１，３７３号、第５，９９８，１５２号、第５，８７６，９４６号、第５，７０８，１５８号、第５，４４３，７９１号、第５，４２９，９２１号、および第５，１４３，８５４号に開示されている。
【０１４９】
アッセイ混合物は、免疫賦活性候補化合物を含む。通常、複数のアッセイ混合物について種々の濃度を同時に用いアッセイすることにより、種々の濃度に対する異なる反応が得られる。通常、これらの濃度の１つを陰性対照、即ち、物質のゼロ濃度もしくはアッセイ検出限界未満の物質濃度とする。免疫賦活性候補化合物には、多くの化学物質のクラスが含まれが、通常は、有機化合物である。好ましくは、免疫賦活性候補化合物は、低分子、即ち、分子量が５０超、約２，５００未満の有機化合物である。高分子免疫賦活性候補化合物というのは、これらより分子量が大きく、例えば、約２，５００〜約１２，５００の範囲のオリゴヌクレオチドとすることができる。免疫賦活性候補化合物は、ポリペプチドとの構造上の相互作用に必要な官能化学基を含み、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能化学基のうちの少なくとも２種、より好ましくはこれらの官能化学基のうちの少なくとも３種をふくむことができる。これらの免疫賦活性候補化合物は、上記で特定した官能基のうちの１種以上で置換した環状炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。また、免疫賦活性候補化合物は、核酸、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジンなどの生体分子、これらの誘導体もしくは構造アナログ、または、これらの組合せなどとすることができる。免疫賦活性候補化合物が核酸の場
合、この免疫賦活性候補化合物は、通常、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であるが、非天然結合もしくはサブユニットを有する修飾された核酸も企図している。
【０１５０】
免疫賦活性候補化合物は、天然、合成、もしくは半合成化合物のライブラリ、またはこれらの任意の組合せを含むさまざまな供給源から入手することができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド、合成有機コンビナトリー・ライブラリ、ファージ提示系ランダムペプチド・ライブラリなどを含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムならびに制御（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成のための多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物からの抽出物の形の天然化合物のライブラリが利用可能であるか、容易に作製できる。さらに、天然および合成的に作製したライブラリならびに化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾することができる。さらに、既知の薬物に対して、アシル化、アルキル化、エステル化、アミディフィケーション（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの制御的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）もしくはランダム的化学修飾を行い、免疫賦活性候補化合物の構造アナログを作製することができる。
【０１５１】
従って、免疫賦活性候補化合物の供給源は、ＴＬＲ９と相互作用することが分かっているＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの既知のＴＬＲリガンドをベースとし、このリガンドの構造が、化学的部分をより多く、もしくは少なく含み、または異なる化学的部分を含むように、分子の１箇所以上の位置が変更されている分子のライブラリである。アナログ阻害剤のライブラリを作製する際にこれらの分子に加えられる構造の変更は、制御（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）もしくはランダム置換および／または付加、あるいはこれらの置換および／または付加の組合せとすることができる。コンビナトリー・ライブラリの作製に際し、当業者は、既存のＴＬＲ９リガンドを用いて、このようなライブラリを容易に作製することができる。
【０１５２】
また、種々の他の試薬をこの混合物に加えることができる。これらのものとしては、蛋白質−蛋白質および／または蛋白質−核酸結合の最適化を容易にするために用いることができる塩、緩衝剤、中性蛋白質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が挙げられる。また、このような試薬により、反応成分間の非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を低減させることもできる。また、蛋白分解酵素阻害剤、核酸分解酵素阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させるその他の試薬も使用することができる。
【０１５３】
成分の添加順序、インキュベーション温度、インキュベーション時間その他のアッセイ・パラメータは容易に決定することができる。こうした実験は、単にこれらのアッセイパラメータを最適化するものであり、このアッセイの根本的な構成に係わるものではない。インキュベーション温度は、通常４℃〜４０℃である。インキュベーション時間は、迅速ハイスループット・スクリーニングを容易にするため、できるだけ短くすることが好ましく、通常は１分〜１０時間である。
【０１５４】
インキュベーション後、ユーザーに利用可能な任意の便利な方法により、ＴＬＲシグナル伝達のレベルを検出する。セル・フリー結合型アッセイの場合、未結合成分から結合成分を分離する分離工程を用いることが多い。この分離工程は、種々の方法で遂行することができる。例えば、溶液中で分離を遂行することができ、あるいは、未結合成分を容易に分離することができる固体担体上に成分の少なくとも１つを固定すると都合がよい。この固体担体は、多種多様な材料で、マイクロタイター・プレート、マイクロビーズ、ディップ・スティック、樹脂粒子などの多種多様な形状に作製することができる。この担体は、シグナル対ノイズの最大化、主としてバックグラウンド結合の最少化をもたらすように、また、分離の容易さおよびコストを考慮して選択することが望ましい。
【０１５５】
分離は、例えば、リザーバからビーズもしくはディップスティックを除去し、マイクロタイター・プレートウェルのようなリザーバを空にするか希釈し、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムもしくはフィルターを洗浄液もしくは溶媒ですすぐことによって行うことができる。この分離工程は、多数回のすすぎもしくは洗浄処理を含むことが望ましい。例えば、固体担体がマイクロタイター・プレートである場合、塩、緩衝剤、界面活性剤、非特異的蛋白質などのような、特異的結合に関与しないインキュベーション混合液の成分を含むのが通常である洗浄液を用いて、ウェルを数回洗浄することができる。固体担体が磁性ビーズである場合、このビーズは、洗浄液で１回以上洗浄した後、磁石を用いて分離することができる。
【０１５６】
検出は、細胞内もしくは細胞表面に存在する、または細胞により分泌された誘導ポリペプチドの測定など、細胞を利用するアッセイ用のどんな簡便な方法によっても行うことができる。細胞利用のアッセイに有用な検出法の例としては、蛍光細胞分離（ＦＡＣＳ）分析法、生体発光法（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などが挙げられる。無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）アッセイに有用な検出法としては、生体発光法、蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などが挙げられる。
【０１５７】
被験体とは、ヒト、または動物を意味するものとする。動物としては、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、齧歯動物、例えば、ラットおよびマウス、霊長類、例えば、サルおよび魚もしくはひれ魚（ｆｉｎ ｆｉｓｈ）（例えば、サーモン）などの水産養殖類、ならびに甲殻類（例えば、エビおよびホタテ貝）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。治療もしくは予防方法に好適な被験体としては、脊椎動物種および無脊椎動物種が挙げられる。被験体は、家で飼うペット（例えば、イヌ、ネコ、魚など）、農業用家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリなど）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）、動物園の動物（例えば、ライオン、キリンなど）とすることができるが、これらに限定されるものではない。本明細書で説明する実施態様の多くは、ヒトの疾患に関するものであるが、本発明は、その他の非ヒト脊椎動物の治療にも有用である。
【０１５８】
本明細書に用いている「治療する」という用語は、本明細書に記載した諸疾患の１種に関して用いる場合、被験体がその疾患を発症する可能性を少なくする予防的治療、および確立された疾患の治療、例えば、その疾患もしくはそれによる症状を緩和もしくは根治させること、またはその疾患もしくは症状の悪化を防止することを意味する。
【０１５９】
疾患に罹患している被験体とは、その疾患の症状が客観的に測定可能である被験体のことを意味する。従って、例えば、癌に罹患している被験体とは、検出可能な癌細胞を有する被験体のことである。感染症に罹患している被験体とは、感染性生物に接触したことがあり、体内に検出可能なレベルでその生物を急性もしくは慢性的に有する被験体のことである。この感染症は、不顕性（潜伏性）もしくは活動性のものとすることができる。
【０１６０】
疾患に罹患するリスクのある被験体とは、その疾患を発症するリスクが通常より高い被験体と定義する。概して、この通常のリスクとは、その疾患に罹患していない正常者の集団、および、その疾患を発症する特定可能な（例えば、遺伝的もしくは環境的）素因を有していない正常者の集団のリスクのことである。従って、疾患に罹患するリスクのある被験体としては、その疾患を発症する遺伝的な素因を有する被験体、およびその疾患を引き起こすことが知られているか考えられている環境因子に接触しているか接触することになる被験体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的な環境因子としては、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他の環境因子としては、例えば、タバコの煙、一部の有機化学物質、アスベストなどが挙げられる。
【０１６１】
核酸その他の治療剤の「有効量」という用語は、目的とする生物効果を達成するのに必要もしくは十分な量のことを意味する。概して、有効量とは、免疫系を賦活化させることにより、抗原特異的な免疫反応の形成が可能となるのに必要な量のことである。一部の実施態様として、この核酸その他の治療剤は、Ｔｈ１免疫反応もしくは一般的な免疫反応を賦活もしくは誘起するのに有効な量で投与する。Ｔｈ１免疫反応を賦活するのに有効な量とは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γなどのＴｈ１型サイトカインの１種以上の産生、および／またはＴｈ１型抗体の１種以上の産生を促進する量と定義することができる。
【０１６２】
さらに別の態様として、本発明は、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体に抗原を投与した後、この抗原に対する免疫反応を誘起するのに有効な量の本発明の免疫賦活性組成物をこの被験体に投与するものである。この抗原の投与は、本発明の免疫賦活性組成物投与の前、もしくは後、または同時に行うことができることに留意されたい。さらに、被験体への抗原および免疫賦活性組成物の投与は２度以上行うことができる。
【０１６３】
また、さらに別の態様として、本発明は、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体の樹状細胞を単離し、この樹状細胞を生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で本発明の免疫賦活性組成物と接触させ、次いでこの樹状細胞を生体外で抗原と接触させ、接触させた樹状細胞をこの被験体に投与するものである。
【０１６４】
「抗原」という用語は、免疫反応を誘発することができる分子のことを意味する。概して、この抗原という用語は、宿主系が異物と認識するあらゆるタイプの分子を含む。抗原としては、微生物抗原、癌抗原およびアレルゲンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、抗原としては、細胞、細胞抽出物、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、糖質複合体、多糖類その他の分子のペプチド性および非ペプチド性模倣体、低分子、脂質、糖脂質ならびに炭水化物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。蛋白質およびポリペプチドは、一般に炭水化物もしくは脂肪よりも抗原性が強いので、多くの抗原は事実上蛋白質もしくはポリペプチドである。
【０１６５】
この抗原は、核酸ベクターによりコードされている抗原とすることができるが、核酸ベクター内にコードされていなくてもよい。前者の場合、この核酸ベクターを被験体に投与すると、その抗原が生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で発現される。本明細書で用いている、核酸ベクター内にコードされていない抗原とは、核酸ではないあらゆるタイプの抗原を意味する。例えば、本発明の一部の態様として、この核酸ベクター内にコードされていない抗原は、ペプチドもしくはポリペプチドである。また、ペプチドもしくはポリペプチドの一次アミノ酸配列を軽微に修飾しても、対応する非修飾ポリペプチドに比し、ほぼ同等の抗原作用を有するポリペプチドを得ることができる。このような修飾は、部位特異的突然変異によるような意図的なものとすることができ、あるいは自然発生的なものとすることもできる。こうした修飾により産生されるポリペプチドは全て、抗原性が存続している限り、本明細書に含まれる。例えば、このペプチドもしくはポリペプチドは、ウイルス由来のものとすることができる。本発明に有用な抗原は、完全長の蛋白質もしくはポリペプチドの小ペプチド断片から完全長型までの範囲の任意の長さとすることができる。例えば、この抗原は、これが特異的免疫反応を賦活化するという条件で、アミノ酸残基数としての長さを５未満、８未満、１０未満、１５未満、２０未満、３０未満、５０７０未満、１００未満、またはそれ以上とすることができる。
【０１６６】
この抗原をコードする核酸は、真核細胞内で抗原核酸の発現を誘起する遺伝子発現配列へ動作可能なように結合させる。この遺伝子発現配列とは、プロモータ配列もしくはプロモータ−エンハンサ結合体などの任意の調節性ヌクレオチド配列のことであり、これにより、これに動作可能なように結合している抗原核酸の効率的な転写および翻訳が容易になる。この遺伝子発現配列は、例えば、構成性もしくは誘導性プロモータなどの哺乳動物もしくはウイルス・プロモータとすることができる。構成性哺乳動物プロモータとしては、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシン・デアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモータ、β−アクチン・プロモータその他の構成性プロモータが挙げられるが、これらに限定されるものではない。真核細胞内で構成的に機能するウイルス・プロモータの例としては、例えば、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）、シミアン・ウイルス（例えば、ＳＶ４０）、乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルスからのプロモータ、モロニー白血病ウイルスその他のレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、および単純ヘルペス・ウイルスのチミジンキナーゼ・プロモータが挙げられる。その他の構成性プロモータについても当業者に知られている。また、本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモータとして誘導性プロモータがある。誘導性プロモータは、誘導剤の存在下に発現される。例えば、メタロチオネイン・プロモータは、特定の金属イオンの存在下に転写および翻訳を促進するよう誘導される。その他の誘導性プロモータについても当業者に知られている。
【０１６７】
概して、この遺伝子発現配列は、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などのような、それぞれ転写および翻訳の開始に関連している５’非転写および５’非翻訳配列を含むものとする。特に、この５’非転写配列は、動作可能なように結合した抗原核酸の転写を制� | |