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【発明の名称】 皮膚または粘膜の損傷を治療するかまたは予防するための、および創傷の治療プロセスおよび組織再生プロセス用の製薬学的組成物
【発明者】 【氏名】ゲルトルート ヘッテン

【氏名】ヘルゲ ナイトハルト

【氏名】ミヒャエル パウリスタ
【要約】 【課題】ＤＮＡ配列にコードされた、分裂促進因子のポテンシャルおよび／または分化誘発性を有するＭＰ−５２蛋白質を含有する、皮膚または粘膜の損傷を治療するかまたは予防するための、および創傷の治療プロセスおよび組織再生プロセス用の製薬学的組成物を提供する。

【解決手段】（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されるヌクレオチド６４０〜２１４２または１７８３〜２１４２、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示されるアミノ酸１〜５０１または３８２〜５０１をコードするヌクレオチド配列または（ｄ）（ａ）または（ｂ）からの配列の１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるヌクレオチド配列を含むＭＰ５２蛋白質を作用物質として含有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されるヌクレオチド６４０〜２１４２または１７８３〜２１４２、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示されるアミノ酸１〜５０１または３８２〜５０１をコードするヌクレオチド配列または
（ｄ）（ａ）または（ｂ）からの配列の１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるヌクレオチド配列を含み、この場合（ｄ）に記載のＤＮＡ配列は少なくとも成熟蛋白質
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をコードする部分を有するという前提条件下にあるＤＮＡ配列にコードされたＭＰ５２蛋白質を作用物質として、場合によっては製薬学的に常用の担持剤、助剤、希釈剤または充填剤と一緒に含有することを特徴とする、皮膚または粘膜の損傷を治療するかまたは予防するための、および創傷の治療プロセスおよび組織再生プロセス用の製薬学的組成物。
【請求項２】
血管形成に関連して、殊に血管形成の誘発のために使用される、請求項１記載の製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚または粘膜の損傷を治療するかまたは予防するための、および創傷の治療プロセスおよび組織再生プロセス用の製薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＭＰ、ＴＧＦおよびインヒビンと血縁の蛋白質に属する（Roberts および Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 419〜472）、成長因子のＴＧＦ−β−系統群は、特に医学的処置方法および使用の他の範囲にとって重要である。この因子は、創傷治癒および組織の回復に関連する方法において適当である。更に、ＴＧＦ−β−系統群の数多くのメンバは、組織成長、殊に骨の成長を誘発し、したがって軟骨および骨の形成の誘発の際に中心的な役割を演じる。
【０００３】
ウォズニイ（Wozney）（Progress in Growth Factor Research 1 (1989), 267 - 280）およびベイル（Vale）他（Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 211 - 248）は、種々の成長因子、例えばＢＭＰ−（骨形態形成蛋白質）およびインヒビン群と血縁関係にあるようなものを記載している。前記群のメンバーは、重要な構造的類似性を有している。蛋白質の前駆物質は、約１１０個のアミノ酸のアミノ末端信号配列、プロペプチド配列およびカルボキシル末端配列からなり、前記アミノ酸は、前駆物質から分離され、かつ成熟蛋白質を表わす。更に、前記アミノ酸のメンバーは、アミノ酸配列の相同性によって定義されている。成熟蛋白質は、最大で保存された配列、殊に系統群のメンバーの下で保存されている７個のシステイン基を含有する。ＴＧＦ−β−種の蛋白質は、多官能性のホルモン活性成長因子である。また、該蛋白質は、血族の生物学的活性、例えば細胞の走化的誘引、細胞分化の促進および組織により誘発される能力、例えば軟骨および骨により誘発される能力をも示す。米国特許第５０１３６４９号明細書には、ＢＭＰ−２と呼ばれる骨誘発性蛋白質をコードするＤＮＡ配列が開示されており、米国特許第１７９１０１号明細書および米国特許第１７０１９７号明細書には、ＢＭＰ−蛋白質のＢＭＰ−１およびＢＭＰ−３が開示されている。更に、数多くの細胞タイプは、ＴＧＦ−β−種の蛋白質を合成する状態にあり、実際に全ての細胞は、ＴＧＦ−β−受容体を有している。
【０００４】
全体的に前記蛋白質は、構造の点で相違を示し、このことは、記載された生物学的機能の点で著しい変形を示す。更に、前記蛋白質は、異なる組織の種類および形成段階の広い範囲内で見い出される。従って、前記蛋白質は、記載された機能、例えば必要とされる細胞の生物学的環境、寿命、目的地、補助因子のための必要性および分解に抗する安定性に関連する相違を有することができる。従って、組織誘発性、殊に骨誘発性のポテンシャルを示す数多くの蛋白質は、有機体における天然の課題およびなお意義深い医学的重要性を詳細になおも研究されなければならない。骨形成または別の組織種の分化／誘発にとって重要であるＴＧＦ−β−系統群のなお未知のメンバーの存在の確率は、大きいものと思われる。しかし、この新規のＴＧＦ−β−種の蛋白質を分離する際の著しい困難は、該蛋白質の機能をなお十分に正確に識別力のあるバイオアッセイの展開について記載することができないことにある。他面、スクリーニングを古典的な核酸ハイブリダイゼーション技術によって可能にするためには、系統群の公知のメンバーに対して期待されるヌクレオチド配列の相同性は、僅かすぎる。それにも拘わらず、全ての望ましい医学的要求を満たす他の誘発蛋白質および分化蛋白質を調製するために、さらに新規のＴＧＦ−β−種の蛋白質の分離および特性決定が是非とも必要とされる。この因子は、創傷の治癒および骨および／または別の組織種、例えば腎臓または肝臓の退化性疾病の治療の際に使用することができる。
【０００５】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０には、ＴＧＦ−β−蛋白質ＭＰ−５２のヌクレオチド配列およびアミン酸配列が記載されており、この場合成熟ペプチドに相当する配列およびＭＰ−５２のペプチドに相当する配列の大部分が記載されている。プロペプチドＭＰ−５２の完全な配列は、開示されていない。
【特許文献１】米国特許第５０１３６４９号明細書
【特許文献２】米国特許第１７９１０１号明細書
【特許文献３】米国特許第１７０１９７号明細書
【特許文献４】国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０
【非特許文献１】Roberts および Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 419〜472
【非特許文献２】ウォズニイ（Wozney）（Progress in Growth Factor Research 1 (1989), 267 - 280）
【非特許文献３】ベイル（Vale）他（Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 211 - 248）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の基礎となる課題は、ＤＮＡ配列にコードされた、分裂促進因子のポテンシャルおよび／または分化誘発性、例えば骨誘発性のポテンシャルを有するＭＰ−５２蛋白質を含有する製薬学的組成物を提供することにある。殊に、本発明の課題は、完全なＤＮＡ配列およびアミノ酸配列にコードされた、ＭＰ−５２蛋白質を含有する製薬学的組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されるヌクレオチド６４０〜２１４２または１７８３〜２１４２、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示されるアミノ酸１〜５０１または３８２〜５０１をコードするヌクレオチド配列または
（ｄ）（ａ）または（ｂ）からの配列の１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるヌクレオチド配列を含み、この場合（ｄ）に記載のＤＮＡ分子は少なくとも成熟蛋白質
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をコードする部分を有するという前提条件下にあるＤＮＡ配列にコードされたＭＰ５２蛋白質を作用物質として、場合によっては製薬学的に常用の担持剤、助剤、希釈剤または充填剤と一緒に含有することを特徴とする、皮膚または粘膜の損傷を治療するかまたは予防するための、および創傷の治療プロセスおよび組織再生プロセス用の製薬学的組成物によって解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
更に、本発明の実施態様は、請求項２に記載の対象に関連する。本発明の別の特徴および利点は、有利な実施態様の記載および図面から明らかである。配列記録および図面は、今や短く記載される。
【０００９】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１は、ＴＧＦ−β−蛋白質ＭＰ−５２をコードするＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を示す。ＡＴＧ−出発遺伝暗号は、ヌクレオチド６４０で開始する。成熟蛋白質の出発は、ヌクレオチド１７８２の後方で開始する。
【００１０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されるヌクレオチド配列から導出されたＴＧＦ−β−蛋白質ＭＰ−５２の完全なアミノ酸配列を示す。
【００１１】
図１は、ＭＰ−５２のアミノ酸配列と７個の保存されたシステイン基の第１のシステイン基で開始するＢＭＰ−蛋白質系統群のメンバーとの比較を示す。＊は、アミノ酸が全ての比較蛋白質において等しいことを意味し；＋は、アミノ酸が蛋白質の少なくとも１つにおいてＭＰ−５２と比較した場合に一致していることを意味する。
【００１２】
図２は、本発明で使用されたオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列および該配列とＭＰ５２公知のメンバーとの比較を示す。ＭはＡまたはＣを意味し、ＳはＣまたはＧを意味し、ＲはＡまたはＧを意味し、かつＫはＧまたはＴを意味する。２ａは、プライマーＯＤの配列を示し、２ｂは、プライマーＯＩＤの配列を示す。
【００１３】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されるヌクレオチド６４０〜２１４２または１７８３〜２１４２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示されるアミノ酸１〜５０１または３８２〜５０１をコードするヌクレオチド配列およびこのような配列の対立遺伝子誘導体に相当するヌクレオチド配列を包含する。更に、本発明は、このようなＤＮＡ分子が少なくとも成熟蛋白質
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をコードする部分を有するという前提条件下でこの種の配列でストリンジェントな条件下でハイブリダイズされるヌクレオチド配列をも包含している。
【００１４】
本発明の範囲内で“官能性部分”の概念は、例えば信号ペプチド部分、プロペプチド部分もしくは成熟蛋白質部分として作用する、即ちＭＰ−５２の天然の蛋白質部分の生物学的機能の少なくとも１つを満たすような状態にある蛋白質部分を意味する。
【００１５】
蛋白質の成熟部分をコードする範囲は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示された配列のヌクレオチド１７８３〜２１４２によって達成される。場合によっては、ＤＮＡ分子は、なおさらにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示された配列の機能的部分、即ち信号部分または／およびペプチド部分をコードするヌクレオチド配列を包含することができる。特に有利には、ＤＮＡ分子は、信号部分およびプロペプチド部分ならびに成熟蛋白質の部分のための配列、即ちＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示された配列のヌクレオチド６４０〜２１４２を包含する。他面、ＤＮＡ分子は、成熟蛋白質をコードする部分とともに別の蛋白質、殊にＭＰ５２別の蛋白質、例えば上記のＢＭＰ蛋白質の機能的信号部分または／およびプロペプチド部分を包含することもできる。相応するヌクレオチド配列は、本明細書中で参考のために開示された上記の参考文献から認めることができる。
【００１６】
更に、本発明は、上記に定義されたようなＤＮＡ分子をも包含し、この分子は、付加的にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示された配列のヌクレオチド１２７０と１２７１との間にコードされていないイントロン配列を含んでいる。このイントロン配列は、ＤＳＭに寄託されたプラスミドＳＫＬ５２（Ｈ３）ＭＰ１２中に含まれており、これは、ＭＰ−５２のゲノム核酸配列を有している。
【００１７】
また、本発明には、ＭＰ−５２蛋白質のファージλ１５．１によってコードされたｃＤＮＡ配列が包含されている。この配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のヌクレオチドで開始される。
【００１８】
本発明によって包括される、対立遺伝子の退化したハイブリダイズ配列がヌクレオチド配列または／およびアミノ酸配列において僅かな変化に基づく構造的な相違を有するとしても、このような配列によってコードされた蛋白質は、なお本質的に同じ有用な性質を有し、この性質により原則的に同じ医学的使用を可能にする。
【００１９】
本発明によれば、“ハイブリダイズ”の用語は、通常のハイブリダイズ条件、特に０．６×ＳＳＣ、６２℃〜６６℃でＳＤＳ０．１％での１時間の洗浄とともに６２〜６６℃で６×ＳＳＣの塩濃度を用いるという条件を意味する。特に有利には、“ハイブリダイズ”の用語は、０．１×ＳＳＣ、６２℃〜６６℃でＳＤＳ０．１％での１時間の洗浄とともに６２〜６６℃で４×ＳＳＣの塩濃度を用いるという厳しいハイブリダイズ条件に関連する。
【００２０】
本発明の有利な実施態様は、脊椎動物、特に哺乳類、例えばブタ、ウシおよび齧歯類、例えばラットまたはマウス、および殊に霊長類、例えばヒトから得ることができる上記に定義されたようなＤＮＡ配列である。
【００２１】
本発明の１つの特に好ましい実施態様は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されかつＭＰ−５２と呼ばれる配列である。ＭＰ−５２の転写酵素は、胎児性組織から得られたものであり、ＢＭＰ種の蛋白質の成熟部分に対して重要なアミノ酸相同性を示す１つの蛋白質をコードする（図１参照）。ＢＭＰ２（＝ＢＭＰ２Ａ）およびＢＭＰ４（＝ＢＭＰ２Ｂ）の蛋白質配列は、ウォズニイ（Wozney）他、Science 242 (1988), 1528 - 1534 に記載されている。ＢＭＰ５、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７の相応する配列は、セレステ（Celeste）他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 9843 - 9847 に記載されている。ＭＰ−５２の前駆物質部分の別の部分は、ＢＭＰ前駆物質との著しい相違を示すが、公知のＢＭＰ配列にとって特異的である若干の典型的な配列相同性は、ＭＰ−５２のプロペプチド部分においても見い出された。
【００２２】
本発明のもう１つの対象は、本発明によるＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを有するベクターである。このようなベクターの場合、本発明によるＤＮＡ配列は、特に操作的に発現対象配列と結合されている。このようなベクターは、安定細胞または過渡的に形質転換された細胞中のＭＰ５２蛋白質の製造に適している。種々の動物系、植物系、真菌類系および細菌類系は、形質転換および引き続く培養に使用することができる。特に本発明によるベクターは、ホスト細胞の場合の複製に必要とされる配列を有し、かつ自己複製可能である。更に、選択可能な標識遺伝子を有するベクターの使用は、有利であり、それによってホスト細胞の形質転換は、検出可能になる。
【００２３】
更に、本発明の対象は、本発明によるＤＮＡまたは本発明によるベクターで形質転換されている１つのホスト細胞である。適当なホスト細胞の例は、種々の真核細胞および原核細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞および真菌類、例えば酵母菌を包含する。
【００２４】
更に、本発明の対象は、請求項１に記載のＤＮＡ配列によってコードされるＭＰ５２１つの蛋白質である。特に、本発明による蛋白質は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で示されるアミノ酸配列３８２〜５０１または場合により該アミノ酸配列の機能的部分を有し、かつ恐らく治療的使用にとって重要である生物学的性質、例えば組織誘発能力、殊に骨誘発能力または／および分裂促進因子能力を有する。蛋白質の上記特徴は、ホモ二量体またはヘテロ二量体の形成に依存して変化することができる。このような構造は、同様に臨床的使用に適していることが判明しうる。
【００２５】
本発明による蛋白質の生物学的性質、殊に分裂促進因子誘発ポテンシャルおよび骨誘発ポテンシャルは、例えばセイジン（Seyedin）他、PNAS 82 (1985), 2267 - 2271 またはサムパス（Sampath）およびレッディ（Reddi）、PNAS 78 (1981), 7599 - 7603 に記載の検定法で測定することができる。
【００２６】
更に、本発明の対象は、ＭＰ５２蛋白質を製造する方法であり、この方法は、本発明によるＤＮＡまたは本発明によるベクターで形質転換されたホスト細胞を培養し、ＭＰ５２蛋白質を細胞または／および培養上澄み液から取得することによって特徴付けられる。このような方法は、適当な培地中での形質転換されたホスト細胞の培養および製造されたＭＰ５２蛋白質の精製を包含する。こうして、この方法は、医学的治療の際の使用または成長因子が必要とされるような細胞培養技術を使用しながらの用途の際に十分な量の望ましい蛋白質の製造を可能にする。ホスト細胞は、細菌類、例えば桿菌または大腸菌。真菌類、例えば酵母菌、植物細胞、例えばタバコ、ジャガイモもしくはアラビドプシス（Arabidopsis）または動物性細胞、殊に脊椎動物細胞系列、例えばＭｏ−、ＣＯＳ−もしくはＣＨＯ−細胞系列または昆虫細胞系列であることができる。
【００２７】
なおさらに、本発明の対象は、作用物質としての本発明によるＭＰ５２蛋白質の製薬学的有効量を含有する製薬学的組成物の提供である。場合によっては、このような組成物は、製薬学的に認容性の担持剤、助剤、希釈剤または充填剤を含む。このような製薬学的組成物は、創傷の治癒および組織の再生の場合ならびに骨、軟骨、結合組織、皮膚、粘膜、上皮または歯の損傷の治癒の場合および歯のインプラントの場合に単独でかまたは別の作用物質、例えばＭＰ５２の別の蛋白質または増殖因子、例えばＥＧＦ（表皮増殖因子）またはＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）との組合せ物で使用することができる。更に、このような製薬学的組成物は、疾病の予防の際に、例えば骨多孔症および関節症の予防のために使用することができる。
【００２８】
本発明によるＭＰ５２蛋白質の別の可能な臨床的使用は、移植器官の剥脱を回避するための免疫反応のサプレッサーとしての使用または血管形成と関連した使用にある。また、本発明による製薬学的組成物は、予防に使用することもできるし、美容整形外科において使用することもできる。更に、この組成物の使用は、ヒトに限定されるのではなく、動物、殊に家畜を含めることもできる。
【００２９】
最後に、本発明のもう１つの対象は、特異的な本発明による蛋白質の抗体または抗体断片（例えば、FabまたはFab'）である。このような特異的抗体または抗体断片の製造法は、平均的な当業者の一般的な知識に属する。特に、このような抗体は、モノクロナール抗体である。このような抗体または抗体断片は、診断学的方法にも適している。
【００３０】
更に、本発明は、次の実施例によって明示されているはずである。
【実施例】
【００３１】
例１
ＭＰ−５２の分離
１．１ 全ＲＮＡをヒトの胎児性組織（８〜９週間の年齢）をキルグウィン（Chirgwin）他、Biochemistry 18 (1979), 5294 - 5299 に記載の方法により分離した。ポリ（Ａ＋）−ＲＮＡを全ＲＮＡから製造者の規定によりオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィー（Strata遺伝子ポリ（Ａ）クイックカラム）によって分離した。
【００３２】
１．２ 逆転写反応のために、ポリ（Ａ＋）−ＲＮＡ２．５μｇを５分間６５℃に加熱し、かつ急速に氷上で冷却した。反応混合物は、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ １μｇ当たりＲＮＡガード（Guard）（Pharmacial社）２７Ｕ、オリゴ（ｄＴ）１２−１８（Pharmacial社）２．５μｇ、５×緩衝液（トリス／ＨＣｌ ２５０ミリモル／ｌ ｐＨ８．５、ＭｇＣｌ２ ５０ミリモル／ｌ、ＤＴＴ ５０ミリモル／ｌ、全てのｄＮＴＰ ５ミリモル／ｌ、ＫＣｌ ６００ミリモル／ｌ）およびＡＭＶ逆転写酵素（Boehringer Mannheim）２０Ｕを含有していた。反応混合物（２５μｌ）を４２℃で２時間恒温保持した。
【００３３】
１．３ 図２に示したデオキシヌクレオチドプライマーＯＤおよびＯＩＤを自動ＤＮＡ合成装置（Biosearch社）上で製造した。精製を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等速電気泳動によるゲルからの主帯域の分離によって行なった。オリゴヌクレオチドをＭＰ５２の公知のメンバーの核酸配列の比較および最高の性質を持ち続けている領域の選択によって設計した。これらの領域の比較は、図２に示されている。クローン化を簡易化するために、２つのヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ制限位置を有し、ＯＤは、付加的に５´末端にＮｃｏＩ制限個所を有していた。
【００３４】
１．４ ＰＣＲ反応の場合には、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡに相当する出発物質からのｃＤＮＡ ２０ｎｇを使用した。反応を５０μｌの容量で実施し、この容量には、１×ＰＣＲ緩衝液（（ＮＨ４）２ＳＯ４ １６．６ミリモル／ｌ、トリス／ＨＣｌ ６７ミリモル／ｌ ｐＨ８．８、ＭｇＣｌ２ ２ミリモル／ｌ、ＥＤＴＡ ６．７μモル／ｌ、β−メルカプトエタノール１０ミリモル／ｌ、牛血清アルブミン（Gibco社）１７０μｇ／ｍｌ、全てのｄＮＴＰ（Pharmacia社）２００μモル／ｌ、全てのオリゴヌクレオチド（ＯＤおよびＯＩＤ）３０ピコモル）およびＴａｑポリメラーゼ（AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus）１．５Ｕが含有されていた。この反応混合物をパラフィンで覆い、４０回のＰＣＲ作業周期を実施した。ＰＣＲ反応の生成物をフェノール／クロロホルム抽出によって精製し、かつエタノールによる沈殿によって濃縮した。
【００３５】
１．５ ＰＣＲ反応生成物を制限酵素ＳｐｈＩ（Pharmacia社）およびＡｌｗＮＩ（Biolabs）を用いて製造者の規定に相応して分解した。
【００３６】
１．６ 制限分解による生成物をアガロースゲル電気泳動によって分画した。臭化エチジウムでの着色後、分解されていない増幅生成物をゲルから切断し、かつフェノール抽出によって分離した。引続き、得られたＤＮＡを２回フェノール／クロロホルム抽出によって精製した。
【００３７】
１．７ エタノールによる沈殿後、分離されたＤＮＡの四分の一または五分の一を再増幅させ、この場合には、作業周期の回数を１３回に減らすこと以外は、一次増幅と同じ条件を使用した。再増幅生成物を精製し、上記と同じ酵素を用いて切断し、切断されていない生成物を増幅生成物の上記説明と同様にアガロースゲルから分離した。再増幅過程を２回繰り返した。
【００３８】
１．８ ゲルからの最後の分離後、増幅生成物をＥｃｏＲＩ（Pharmacia社）４Ｕによって製造者によって推奨された条件下で分解した。制限混合物の四分の一をＥｃｏＲＩで分解されたベクターｐブルースクリプトＩＩ ＳＫ＋（Strata遺伝子）中に結合させた。結合後、２４個のクローンを配列決定によってさらに分析した。ＡｌｗＮＩおよびＳｐｈＩで分解された試料により、ＭＰ−５２と呼称される新規の配列が得られた。別のクローンは、主にＢＭＰ６−配列を有し、１つのクローンは、ＢＭＰ７−配列を有していた。
【００３９】
クローンを、ｃＤＮＡの３´末端でフローマン（Frohmann）（Perkin-Elmer Corp. によって刊行された Amplifications, 第５号（1990）、第１１〜１５頁）によって詳細に記載された方法により完成させた。ＭＰ−５２の第１断片を分離するために使用された同じ胎児性ｍＲＮＡを、上記の記載と同様に逆転写した。増幅を、ＭＰ−５２配列のアダプタープライマー（AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG）および内部プライマー（CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG）を使用しながら行なった。増幅生産物を、ＭＰ−５２配列の重なり合うアダプタープライマー（ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG）および重なり合う内部プライマー（GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA）を使用しながら再増幅した。再増幅生産物を、ＮｃｏＩでの制限分解後に同様に分解されたベクター（１個のＮｃｏＩ制限位置を含む変化された多重クローン化位置を有するｐＵＣ１９（Pharmacia No.27-495101））中にクローン化し、かつ配列決定した。このクローンを、公知のＭＰ−５２配列の３´末端での配列の重なり合いによって特性決定した。その１つを、オースベル（Ausubel）等（Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience社刊（1989））によって詳細に記載された方法によりヒトのゲノム遺伝子バンク（Strata遺伝子No.946203）をスクリーニングするためのゾンデとして使用した。ファージ８×１０5 λから、約２０ｋｂの挿入断片を含有するファージ（λ２．７．４）を分離し、かつ寄託番号７３８７でＤＳＭに寄託した。このクローンは、ｍＲＮＡから記載された方法によって分離された配列とともに他の配列情報を５´末端に有している。
【００４０】
配列分析するために、約７．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、同様に切断されたベクター（ブルースクリプトＳＫ、Strata遺伝子No.212206）中に二次クローン化した。ＳＫＬ５２（Ｈ３）ＭＰ１２と呼ばれる前記プラスミドを、同様に寄託番号７３５３でＤＳＭに寄託した。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示される配列情報は、ファージλ２．７．４に由来する。位置６４０でのＡＴＧは、読み枠内での第１のＡＴＧである（位置４０３で終止コドンは生じる）。これは、配列データに基づいて翻訳のための開始コドンであると推測される。
【００４１】
ゲノムＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の塩基対１２７０と１２７１との間に約２ｋｂのイントロンを有している。イントロンの配列は示されていない。スプライシング位置の適切さは、この領域を有するｃＤＮＡに由来する増幅生産物の配列決定によって証明された。この配列情報は、フローマン（Frohmann）（Perkin-Elmer Corp. によって刊行された Amplifications, 第５号（1990）、第１１〜１５頁）によって詳細に記載された容易に変えられる方法により得られた。また、ＭＰ−５２の３´末端の分離のために使用された同様の胎児性ＲＮＡを、ＭＰ−５２配列（ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT）の５´方向に配向された内部プライマーを使用しながら逆転写した。ポリＡの尾を、末端転移酵素を使用しながら第１のｃＤＮＡ鎖の５´末端に結合した。２工程の増幅を、第１にオリゴｄＴおよびアダプター配列からなるプライマー（AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC(T16)）を使用することによって実施し、第２にＭＰ−５２配列のアダプタープライマー（AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG）および内部プライマー（CCAGCAGCCCATCCTTCTCC）を使用することによって実施した。増幅生産物は、同じアダプタープライマーおよびＭＰ−５２配列の重なり合う内部プライマー（TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG）を使用しながら再増幅された。引続き、再増幅生産物を、ＭＰ−５２配列の重なり合うアダプタープライマー（ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG）および重なり合う内部プライマー（ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG）を使用しながら再増幅した。再増幅生産物を、同じ末端でＥｃｏＲＶが分解されている１つのベクター（ブルースクリプトＳＫ、Strata遺伝子No.212206）中にクローン化した。このクローンを、λ２．７．４のＤＮＡを用いての配列の重なり合いによって特性決定した。
【００４２】
更に、ヒトの繊維芽細胞のＲＮＡから製造されかつλｇｔ１０中でクローン化されたｃＤＮＡバンクを、スクリーニングした。この場合には、ファージ２×１０６が試験され、この場合放射性ゾンデとしてゲノムＭＰ−５２−ＤＮＡの約１ｋｂの大きさの断片（３´−未翻訳領域内のＨｉｎｄＩＩＩ制限位置までの２．エキソン）が使用された。１７個の混合プラークを採用し、これは、ＭＰ−５２配列の５´領域および３´領域からのプライマーを使用しながらＰＣＲを用いて試験された。その上、８個のファージプラークを選択し、かつ個別化した。ｃＤＮＡを、ファージからのＥｃｏＲＩ部分分解により分離し、かつ同様にＥｃｏＲＩで分解されたブルースクリプトベクター中にクローン化した。
【００４３】
生じるプラスミドＳＫ５２Ｌ１５．１ＭＰ２５の配列決定は、最長のファージ（１５．１）がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のヌクレオチドＮｏ．３２１で開始されることを示した。更に、配列決定によってスプライシング位置（ヌクレオチド１２７０）は証明された。
【００４４】
プラスミドＳＫＬ５２（Ｈ３）ＭＰ１２を、寄託番号７３５３で１９９２年１２月１０日にＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig）に寄託した。
【００４５】
ファージλ２．７．４を、寄託番号７３８７で１９９３年１月１３日にＤＳＭに寄託した。
【００４６】
プラスミドＳＫ５２Ｌ１５．１ＭＰ２５を、寄託番号８４２１で１９９３年７月１６日にＤＳＭに寄託した。
【００４７】
例２
ＭＰ５２の発現
ＭＰ−５２の発現のために、種々の系を試験した。発現系としてのワクシニアウィルスの使用は、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel他, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience社刊, Wiley & Sons）に詳細に記載されており、当業者にとって修正可能なものであり、なお、これは以下、ＣＰ第１６章ユニット１６．１５〜１６．１８と略記されている。この系は、異質ＤＮＡを一定のベクターを使用しながら相同的な組換えによってワクシニアウィルスのゲノム中に組み込むことができることに基づいている。この目的のために、使用されるベクターは、ワクシニアウィルスのゲノムからのＴＫ（チミジンキナーゼ）遺伝子を有している。更に、組換えウィルスに対する選択を可能にするために、ベクターは、大腸菌−キサンチン−グアニン−ホスホリボリボシル−転移酵素−遺伝子（ｇｐｔ）（Falkner他、J. Virol. 62 (1988), 1849 - 1854）を有している。このベクター中でＭＰ５２のための全コード領域を有するｃＤＮＡをクローン化した。ｃＤＮＡはプラスミドＳＫ５２Ｌ１５．１ＭＰ２５（ＤＳＭ、寄託番号８４２１）に由来するが、しかし、このプラスミドは、５´−未翻訳領域の大部分を除去するためにまず欠失されかつ中間クローン化された。そのために、プラスミドＳＫ５２Ｌ１５．１ＭＰ２５をＳａｌＩで系統化し、段階的に５´末端をＥｘｏＩＩＩ／ムンビーンキット（Mung Bean Kit）（Strata遺伝子No.200330）で製造者の規定により欠失させた。ＢａｍＨＩでの制限後、種々の広範に欠失されたＭＰ５２ｃＤＮＡｓをアガロースゲル上で残存ベクターと分離し、単離し、かつ標準法（Sambrook他、Molecular Cloning, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989）によりＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで制限されたｐブルースクリプトＩＩ ＳＫ−ベクター（Strata遺伝子No.212206）中で中間クローン化した（ｐＳＫ５２ｓ）。全体の制限を製造者の規定により行なった。配列決定酵素（Sequenase）（USB/Amersham No.70770）を用いての配列決定により、特にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１（開始コドンの６４個の塩基対を除去した）中のヌクレオチド５７６で開始される１つのクローンを生じた。このクローンからＳａｌＩおよびＳａｃＩの制限によりｃＤＮＡ挿入断片を分離し、かつ同様に分解されたベクター中でワクシニアウィルス中での組換えのためにクローン化した。生じるプラスミド（ｐＢＰ１ＭＰ５２ｓ）を１９９４年５月２４日にＤＳＭ（寄託番号９２１７）に寄託し、かつ組換えワクシニアウィルスの製造に使用した。このために、８０％の集密的な１４３Ｂ細胞（HuTK-, ATCC CRL 8303）にＰＢＳ２ｍｌ中のワクシニア野生型ウィルスを３５ｍｍの培養皿中で室温で３０分間ときどき振盪させながら感染させた（１０個の細胞に対して１つのウィルス）。上澄み液を吸引濾過しかつ培養液（MEM, Gibco BRL No.041-01095）２ｍｌを添加した後、３７℃で２時間恒温保持した。引続き、この培養液を除去し、これらの細胞の形質転換をＭＥＭ １ｍｌ中のｐＢＰ１ＭＰ５２ｓ １００ｎｇ、担体ＤＮＡ（牛の胸腺、Boehringer Mannheim No.104175）２μｇおよびリポフェクチン（Lipofektin）（Gibco BRL No.18292 - 011）を用いて３７℃で１５時間で達成させた。ＦＣＳ（Gibco BRL No.011 - 06290）２０％を有するＭＥＭ１ｍｌの添加後、３７℃でさらに２４時間恒温保持し、引続き溶解された細胞を凍結乾燥させた。
【００４８】
キサンチン−グアニン−ホスホリボシル転移酵素に対するｇｐｔ選択および分離および個々の組換えウィルスの増幅は、本質的にＣＰのユニット１６．１７の記載と同様に行なわれたが、しかし、ＲＫ１３細胞（ATCC CCL 37）を使用した。
【００４９】
ウィルス−ゲノム中へのＭＰ５２ ｃＤＮＡの組込みをドットブロット（dot blot）分析およびサザンブロット分析（CP ユニット16.18）によって証明した。組換えウィルスを細胞系列１４３Ｂ（HuTK-, ATCC CRL 8303, ヒト）中での発現分析のために使用した。集密的細胞を細胞数に相当する数のウィルスで３７℃で４５分間感染させ、引続き相応する培養液（MEM, Gibco BRL No.041 - 01095）にＦＣＳ１０％およびペニシリン／ストレプトマイシン（1:500, Gibco BRL No.043-05140H）を添加した。３７℃で６時間後、この培養液を除去し、細胞を２回、例えばＨＢＳＳ（GibcoBRL No.042 - 04180M）で洗浄し、生産媒体（例えば、MEM）をＦＣＳなしに添加した。２０〜２２時間の生産後、細胞の上澄み液を捕集した。発現の分析を標準法（CP ユニット10.8）によるウェスタンブロットによって行なった。そのために、細胞培養上澄み液１００〜５００μｌからの蛋白質を等量のアセトンの添加および氷上での少なくとも１時間の恒温保持によって沈殿させ、かつ遠心分離した。ペレットを適切な緩衝液（尿素７モル、ＳＤＳ １％、燐酸二水素ナトリウム７ミリモル、ブロムフェノールブルー０．０１％および場合によってはβ−メルカプトエタノール１％）中に再懸濁させた後、１５％のポリアクリルアミドゲル中での分離を行なった。標識蛋白質として、予め着色された蛋白質−分子量標準（Gibco BRL No.26041 - 020）を使用した。ＰＶＤＦ膜（Immobilon No.IPVH00010）上での転移および膜の遮断は、標準法により行なわれた。
【００５０】
膜上のＭＰ５２を検出するために、ＭＰ５２に抗するポリクロナール抗体をニワトリ中ならびにカイウサギ中に産出させた。このために、例えばホチュリ（Hochuli）他（BIO/Technology, 第６巻、1321 - 1325 (1988)）の記載と同様に、ＭＰ５２の成熟部分を大腸菌の場合のＮ−末端に接する６個のヒスチジンで発現させ、かつ精製した。２つの抗体を用いた場合には、ＭＰ５２の特異的発現を検出することができ、この場合二量体ＭＰ５２は、単量体よりも殆ど効果的でないことが認められる。図３に示したウェスタンブロットのためには、ＰＥＧ沈殿（Thalley他, BIO/Technology 第８巻, 934 - 938 (1990)）および膜に結合した抗原（６個のヒスチジンを有する成熟ＭＰ５２）（Sambrook他、Molecular Cloning, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 中の18.17）により特異的に精製されているニワトリ抗体を使用した。第２の抗体として結合されたアルカリホスファターゼ（シグマＡ９１７１）を有する抗ニワトリＩｇＧを使用した。検出をトロピックスウエスタンライト蛋白質検出キット（Tropix Western-Light Protein Detection Kit）（Serva社 No.WL10RC）を用いて製造者の記載により行なった。
【００５１】
図３の場合のウェスタンブロットは、組換えウィルスの場合にのみＭＰ５２の特異的帯域を生じるが、しかし、野生型のウィルス（組み込まれた異質ＤＮＡのない）の場合にはＭＰ５２の特異的帯域は生じないことを示している。ＭＰ５２の発現は、非還元の条件下で出現する分子量約２５ｋＤａを有する分泌された蛋白質を導く。還元条件下で蛋白質は、ゲル中１４〜１５ｋＤａで展開する。この結果は、ＭＰ５２が二量体の成熟蛋白質として発現されていることを示す。ウェスタンブロットで生じる、６０ｋＤａを上廻る範囲内の弱い帯域は、恐らく切断されていない前駆物質蛋白質の残基である。その上、展開挙動は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２から導出すべき理論的分子量を証明し、それによれば、成熟の単量体ＭＰ５２は、１３．６ｋＤａの大きさを有している。
【００５２】
ＭＰ５２の発現および成熟ＭＰ５２への前駆物質蛋白質の分解は、種々の細胞系列において検出可能である。Ｃ１２７（ATCC CRL 1616, マウス）、ＢＨＫ２１（ATCC CCL 10, ハムスター）、ＭＲＣ−５（ATCC CCL 171, ヒト）および３Ｔ６−スイスアルビノ（Swiss albino）（ATCC CCL 96, マウス）の細胞を試験した。
【００５３】
また、成熟ＭＰ５２に対する発現および分解は、他の真核発現系においても示された。そのために、ＭＰ５２のｃＤＮＡ（ヌクレオチド５７６で開始する）を発現プラスミドｐＳＧ５（Strata遺伝子No.216201）中にクローン化した。プラスミドｐＳＫ５２ｓをＣｌａＩおよびＸｂａｌで制限し、かつＴ４−ポリメラーゼ処理によってＭＰ５２−挿入断片の上に懸吊されている末端を切り取った。ＥｃｏＲＩで制限されかつＴ４−ポリメラーゼ処理によって同様に末端を切り取られたベクターｐＳＧ５のクローン化を標準法により行なった。全ての酵素反応は、製造者の記載により行なわれた。ＭＰ５２−挿入断片の正しい配向を制限分析およびＴ７−プライマー（Strata遺伝子No.300302）での配列決定によって確実なものにした。生じるプラスミドｐＳＧ５２ｓ（寄託番号ＤＳＭ９２０４でＤＳＭに１９９４年５月１７日に寄託した）は、安定な細胞系列を得るために、選択可能な標識、例えばＧ４１８−耐性のための遺伝子をコードするベクターで共形質転換することができる。この目的のために、ｐＳＧ５２ｓをプラスミドｐ３６１６（寄託番号ＤＳＭ９２０３でＤＳＭに１９９４年５月１７日に寄託した）を用いてＬ９２９細胞（ATCC CCL1, マウス）中でリポフェクチン（Gibco BRL No.18292 - 011）と一緒に製造者の記載により共形質転換した。Ｇ４１８を用いての選択は、当業者に公知の方法（CP, ユニット９．５）により行なわれ、かつウェスタンブロットで検出可能な成熟ＭＰ５２中で生産される細胞系列を導く。
【００５４】
ＭＰ５２のためのもう１つの発現ベクターをドクターミヤザキ（Dr.Miyazaki）によって提供されたプラスミドｐＡＢＷＮ（Niwa 他, Gene 108 (1991), 193 - 200 および図４）を使用しながら製造した。
【００５５】
そのために、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のヌクレオチド５７６で開始するプラスミドｐＳＫ５２ｓからのＨｉｎｄＩＩＩ断片を分離し、上に懸吊されている末端をクレノウ断片を用いての処理によって切り取った。アダプターの連結反応によって２つの断片末端でＮｏｔＩの制限切断位置を導入した。
アダプター： ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ
ＴＣＧＣＣＧＧＣＧＡ
ベクターｐＡＢＷＮをＸｈｏＩで制限し、同様にクレノウ断片で処理し、かつ牛の直腸のアルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim）で脱リン酸した。同じ脱リン酸したアダプターを結合させ、したがって今やベクターの産生されたＮｏｔＩの切断位置中へのＮｏｔＩでの制限後のＭＰ５２−断片の挿入は可能になった。生じる発現ベクターを以下ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＰ５２／ｐＡＢＷＮと呼称する。クローン化のために実施される全ての反応を標準法（例えば、ＣＰユニット３．１６）により行なった。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＰ５２／ｐＡＢＷＮ発現ベクターの構造を配列決定および制限地図の作成によって証明した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＰ５２／ｐＡＢＷＮは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１のヌクレオチド５７６で開始されかつヌクレオチド２２７で終結するＭＰ５２配列を有する。
【００５６】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＰ５２／ｐＡＢＷＮをＬ細胞（マウスの繊維芽細胞）中に移入させ、それから安定な形質転換細胞を確定させた。そのために、プラスミドそれぞれ４μｇ（HindIII-MP52/pABWN または pABWN）を５×１０５ Ｌ−細胞中に６ｃｍの培養皿上でＬｏｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Gibco BRL No.18324 - 012）２０μｌを使用しながら移入した。そのために、溶液Ａ（OPTI-MEM I（Gibco BRL No.31985）２００μｌ中のそれぞれのプラスミドＤＮＡ４μｇ）を溶液Ｂ（OPTI-MEM I ２００μｌ中の LipofectAMINE 試薬２０μｌ）と注意深く混合し、かつ室温で４５分間ＤＮＡリポソーム複合体の形成のために恒温保持した。その間に、細胞を１回ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ ２ｍｌで洗浄した。それぞれの移入のために、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ １．６ｍｌをＤＮＡリポソーム複合体を有する容器に入れた。この溶液を注意深く混合し、それによって洗浄された細胞を上に成層させた。細胞を希釈された複合体と一緒に３７℃で５時間ＣＯ2 恒温保持器中で恒温保持した。恒温保持後、ＤＭＥＭ（Gibco BRL, Dulbecco's Modifiziertes Eagle Medium）２ｍｌ／ＦＣＳ２０％を添加した。移入してから２４時間後、この媒体に新しいＤＭＥＭ／ＦＣＳ１０％を添加した。移入を開始してから４８時間後、細胞を１０ｃｍの培養皿中に移した。移入を開始してから７２時間後、８００μｇ／ｍｌの濃度を有するＧ４１８の選択を開始した。安定なクローンは、１〜２週間後に現われた。
【００５７】
ＦＣＳを有するかまたはＦＣＳを有しない状態調節されたＤＭＥＭ５ｍｌを集密的な形質転換細胞から得、これを３日間１０ｃｍの培養皿中で洗浄した。形質転換された細胞の２つの異なる細胞培養上澄み液（HindIII-MP52/pABWN およびpABWN）ならびに細胞溶解物（Zellysate）をウェスタンブロットで検査した。この場合、成熟ＭＰ５２は、状態調節された媒体中ならびにＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＰ５２／ｐＡＢＷＮを移入した細胞の細胞溶解物中に見い出された。クローンをさらにクローン化し、ＭＰ５２を生産する細胞をそれぞれウェスタンブロット分析により選択した。ウェスタンブロット分析からの評価により１ｍｇ／ｌまでのＭＰ５２生産が生じた。
【００５８】
例３：
ＭＰ５２の生物学的活性
ＭＰ５２の生物学的活性を検出しかつ骨の疾病の回避および／または治療の医学的使用のための本発明の有用性を証明するために、数多くの実験を試験管内および生体内で実施した。
【００５９】
１．試験管内での検定法
１．１
ＴＧＦ−β刺激後に軟骨細胞中でグリコアミノグリカン（ＧＡＧ）合成が増大することは記載されている（Hiraki他、Biochimica et Biophysica Acta 969 (1988), 91 - 99）ので、ＭＰ５２が同様にこの影響を発揮するのか否かを試験した。ＭＰ５２を生産するＬ−細胞の形質転換細胞（HindIII-MP52/pABWN と一緒に移入された）の細胞培養上澄み液（ＦＣＳ１０％を有するＤＭＥＭ）を使用しながら、胎児性ラットの四肢からの一次培養の場合のＭＰ５２の軟骨遺伝子活性を試験した。
【００６０】
そのために、年齢１６日のラットの胎児の四肢を使用した。トリプシン処理後、Ｆ−１２媒体（栄養混合物 Ham's F-12, Gibco BRL No.21700）中の取得された細胞をＦＣＳ１０％と一緒にコラーゲンの型Ｉで被覆された２４個のウェルを備えた、細胞３×１０5 を有する板上に平らに入れ、かつ集密的になるまで約２日間培養した。培養液（FCS10% を有する F-12 媒体）５００μｌにＨｉｎｄＩＩＩ−ＭＰ５２／ｐＡＢＷＮ−Ｌ−細胞トランスフェクタント、ｐＡＢＷＮ−Ｌ−細胞トランスフェクタントまたは媒体（FCS10% を有する DMEM）だけの状態調節された媒体（KM）それぞれ５６μｌを添加した。０、３、６および９日間の時間の亘って、ＦＣＳ１０％を有するＦ−１２媒体ならびに相応する添加剤を使用した。３日間全体で、相応する添加剤を有する媒体の交換を行なった。その後に、この培養液をさらに２日間ＦＣＳなしのＦ−１２媒体中で相応する添加剤（状態調節された媒体もしくは対象媒体）の存在下に培養し、次いで35Ｓ−硫酸塩を６時間添加した。多糖類中に配合された35Ｓを、ヒラキ（Hiraki）他（Biochimica et Biophysica Acta 969 (1988), 91 - 99）の記載と同様にプロナーゼＥの消化および沈殿の後に測定した。
【００６１】
第１表：
放射能（cpm/ウェル）
恒温保持 対象-L-細胞の pABWN-L-細胞トランス HindIII-MP52/pABWN-L-細胞
段階の数 DMEM（FCS10%） フェクタントのKM トランスフェクタントのKM
2 3720±114 3865±120 4879±422
5 4188±135 4154±29 8223±275＊
8 3546±160 3310±115 9890±1260＊
11 3679±218 3633±167 7520±160＊
値は、３または４つの培養配合物に対する±Ｓ．Ｅ．Ｍ．に関するものである。
＊：ｐ＜０．０１は、ｐＡＢＷＮ−Ｌ−細胞トランスフェクタントのＤＭＥＭおよびＫＭに対するものである（Scheffe の多重ｔ−試験）。
【００６２】
第１表に示されているように、ＭＰ５２を生産するトランスフェクタントの細胞培養上澄み液は、重要なことに純粋な培養液（FCS10% を有する DMEM）またはｐＡＢＷＮ−移入されたＬ−細胞の細胞培養上澄み液と比較してＧＡＧ合成を刺激する。このことは、ＭＰ５２が軟骨細胞の分化を刺激しうることを示す。
【００６３】
１．２
ＢＭＰ系統群の若干のメンバーについて記載された効果は、骨芽細胞中のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が上昇することにある。クローンラット細胞系列ＲＯＢ−Ｃ２６（Ｃ−２６）は、相対的に早期の成熟段階の骨芽細胞に数えられる（Yamaguchi 他, Calcif. Tissue Int. 49 (1991), 221 - 225）。例えば、ＢＭＰ−２のような骨誘発性蛋白質について、ＡＬＰ−活性を上昇させる能力をヤマグチ（Yamaguchi）他（J. Cell Biol. 113 (1991), 681 - 687）は記載している。
【００６４】
Ｃ２６−細胞に対するＭＰ５２の影響を次のように試験した：Ｃ２６−細胞をウェル１個当たり３×１０4 の細胞を用いて２４個のウェルを備えた板中に播種し、かつα−ＭＥＭ（Gibco BRL）／ＦＣＳ１０％中で集密になるまで培養した。ウェル１個当たりＭＰ５２を生産するＬ−細胞トランスフェクタント（HindIII-MP52/pABWN）の細胞培養の上澄み液もしくはｐＡＢＷＮ−Ｌ−細胞トランスフェクタントの細胞培養上澄み液またはＬ−細胞の細胞培養上澄み液（FCS10% を有する DMEM）だけ５６μｌをＣ−２６細胞培養媒体５００μｌに添加した。相応する添加物を有する媒体の交換は、全部で３日間で行なった。細胞抽出液中のＡＬＰ−活性を０、３、６、９および１２日後に、例えばタクワ（Takuwa）他（Am. J. Physiol. 257 (1989), E797 - E803）が記載したように基質としてのｐ−ニトロフェニル−ホスフェートを基礎とする標準技術を用いて測定した。
【００６５】
第２表：
ウェル１個当たりのＡＬＰ−活性（ナノモル／分）
恒温保持 対象-L-細胞の pABWN-L-細胞トランス HindIII-MP52/pABWN-L-細胞
段階の数 DMEM（FCS10%） フェクタントのKM トランスフェクタントのKM
0 41.8±2.8 41.8±2.8 41.8±2.8
3 136.3±3.7 125.8±2.3 181.3±14.2＊
6 129.0±7.8 119.3±6.4 258.0±8.3＊
9 118.4±3.7 110.1±2.8 258.4±10.6＊
12 121.2±3.2 125.3±6.0 237.8±11.0＊
値は、４つの培養配合物に対する±Ｓ．Ｄ．に関するものである。
＊：ｐ＜０．０１は、ｐＡＢＷＮ−Ｌ−細胞トランスフェクタントのＤＭＥＭおよびＫＭに対するものである（Scheffe の多重ｔ−試験）。
【００６６】
第２表に示されているように、ＡＬＰ活性は、ＭＰ５２の添加によって重要なことに純粋なＤＭＥＭ／ＦＣＳ１０％媒体およびｐＡＢＷＮにより感染したＪ−細胞の媒体と比較して上昇する。この結果は、ＭＰ５２が軟骨細胞の分化を生じうるだけでなく、骨芽細胞の分化および成熟を生じうることを示す。
【００６７】
更に、タクワ（Takuwa）他（Biochem. Biophys. Res. Com. 174 (1991), 96 - 101）が記載したようにＢＭＰ−２の処理によってＡＬＰ活性を示す骨芽細胞細胞系列（MC3T3-E1, マウス）は、ＭＰ５２を生産するＬ−細胞トランスフェクタント（HindIII-MP52/pABWN）の状態調節された媒体またはＭＰ５２の生産後の媒体と一緒の恒温保持後に組換えワクシニアウィルスを用いての感染によってＡＬＰ−活性の変化を全く生じない。このことは、ＭＰ５２が目下、ＢＭＰ−２とは偏倚した細胞特異性を有していることに関連する。個々のＴＧＦ−β系統群メンバーのための種々の目的場所に応じて異なる機能は、大きな医学的重要性を有することができる。
【００６８】
２．生体内実験
２．１
骨の形成について最も力強く述べることができる可能性を試すことは、生体内での異所性骨形成に基づくものである。このことは、例えば鉱物投与されてない骨基質の移植によって誘発されうる（Urist, Science 150 (1965), 893 - 899）。不活性の基質と骨を誘発する蛋白質との組合せによって、例えばサムパス（Sampath）他（PNAS（Proc. Natl. Acad. Sci. USA） 78 (1981), 7599 - 7603）が記載したのと同様のプロセスを誘発させることができる。この骨形成のプロセスは、胎児性の軟骨の骨形成および成人の骨の治癒のプロセスと等しいものである。従って、この方法は、生体内での骨誘発に対する蛋白質の能力を試みる可能性を提供する。
【００６９】
このような試験のために、ワクシニアウィルス系（例２参照）中での発現によって得られたＭＰ５２蛋白質を部分的に浄化し、かつ移植した。
【００７０】
そのために、１４３Ｂ細胞（HuTk-, ATCC CRL 8303）をを培養皿中および細頚瓶中で集密になるまで培養し、発現分析のための例２の記載と同様に組換えウィルスを感染させ、洗浄し、かつ約２０時間ＭＰ５２をＭＥＭ（Gibco BRL, 細胞１０6 当たり約１ｍｌ）中に蓄積させた。対照として、野生型のウィルスで感染させた同じ配合物を生じさせた。全ての配合物の細胞培養上澄み液（状態調節された媒体）を捕集し、かつ遠心分離した（４℃で３０分間４００００×ｇ）。ウィルスを除去するために、上澄み液を無機フィルター（孔径０．１μｍ、Whatman, Anotop 25）を介して濾過した。ＭＰ５２の特性決定の経過中に、この蛋白質は、ヘパリンセファロースに結合することが示された。この挙動は、部分的浄化に利用された。そのために、濾過されかつ遠心分離され、状態調節された媒体をトリス５０ミリモル ｐＨ７．０、ＮａＣｌ １００ミリモルおよび尿素６モルの最終濃度にもたらし、かつヘパリンカラムＡ（トリス５０ミリモル ｐＨ７．０、ＮａＣｌ １００ミリモルおよび尿素６モル）中で平衡にされているヘパリンカラム（HiTrapTM, Pharmacia No.17-0407-01）上に負荷した。負荷されたカラムを緩衝液Ａで洗浄し、かつ０．５ｍｌ／ｍｉｎの通過流速度の際に緩衝液Ｂ（トリス５０ミリモル ｐＨ７．０、ＮａＣｌ ６００ミリモルおよび尿素６モル）１００％による線状勾配で５０分間で溶離した（分画１回当たり２．５ｍｌ）。尿素の使用は強制的なものではない。ウェスタンブロット分析（例２参照）により、ＭＰ５２は再生可能であるように主に２回の分画でＮａＣｌ約２５０〜４００ミリモルを溶離することを検査することができた。この画分のアリコートを同様に製造者の記載により銀で着色された１５％のポリアクリルアミドゲル（Silver Stain-II, Daiichi No.SE140000）を用いて試験し、かつ画分をプールした。野生型のウィルスでの感染後に状態調節された媒体の精製後に比較可能な画分を分析後に銀で着色されたゲル中に同様にプールした。
【００７１】
更に、ＭＰ５２に対する試験から、ＭＰ５２もヒドロキシアパタイトに結合していることが判明した。従って、ヒドロキシアパタイトによって付加的な精製を達成すること、もしくはヘパリンカラムをヒドロキシアパタイトカラム（例えば：BIO-RAD, Econo-pac HTP）によって代替することは、原理的に可能である。また、後精製のために当業者に知られた別の公知方法、例えばゲル篩カラム法、イオン交換カラム法、アフィニテートカラム法、金属キレートカラム法または疎水性交換作用に基づくカラム法が考えられる。
【００７２】
ヘパリンセファロースクロマトグラフィーにより前精製されたＭＰ５２蛋白質もしくは野生型の感染された細胞培養上澄み液中にも存在する相応するなお汚染されていない蛋白質をさらに逆相ＨＰＬＣにより精製した。そのために、Ｃ８−カラム（Aquapore RP300, Applied Biosystems, 粒径：７μｍ、孔径：３００オングストローム）を緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ：トリフルオロ酢酸０．１％；緩衝液Ｂ：アセトニトリル９０％、トリフルオロ酢酸０．１％）１０％で平衡にした。カラムをヘパリンカラムのＭＰ５２を含有するプールした画分で負荷した後、緩衝液Ｂ １０％で十分に洗浄した。結合された蛋白質を次の勾配を用いて溶離した：２０分間に亘って緩衝液Ｂ １０〜５０％および５０分間に亘って緩衝液Ｂ ５０〜１００％ 。画分を５００μｌ捕集し、かつウェスタンブロットならびに銀で着色されたゲル中で分析した。ＭＰ５２蛋白質は、選択された条件下でほぼアセトニトリル５５〜６５％の範囲内で溶離された。ＭＰ５２を有する画分をプールした。同様のことを野生型のウィルスで感染された細胞の細胞培養液の上澄み液を対照精製することによる相応する画分を用いて行なった。
【００７３】
また、部分精製されたＭＰ５２−蛋白質は、５０ナノグラム／ｍｌのウェスタンブロット分析により評価される濃度で３回の恒温保持段階後にＲＯＢ−Ｃ２６−細胞に対してＡＬＰ活性の明らかな上昇を示した。 軟骨形成および骨形成の能力を証明するために、部分的に精製されたＭＰ５２−蛋白質もしくは野生型のウィルスの感染後の相応する部分的に精製された細胞培養上澄み液からの対照蛋白質を基質で再構成させ、かつラット中に移植した。
【００７４】
原理的には、当業者に知られた基質材料、即ち天然の基質（また、変性された）および合成により得られた基質を使用することができるが、しかし、有利には、生物認容性の、生体内で生物学的に分解可能な多孔質材料を使用することができる。この実験において、本質的にサムパス（Sampath）他（PNAS 80 (1983), 6591 - 6595）が記載したのと同様に調製された、ラットの骨基質を使用した。ラットの骨（Femur および Tibia）をＨＣｌ ０．６モル中で２４時間脱塩し、引続きなお存在する骨標識を除去した。水での洗浄およびクロロホルム／メタノール（１／１）混合物中での３時間の脱脂の後、骨を空気乾燥し、低温凍結させ、ミル中で粉砕し、かつ４００〜１０００μｍの粒径を篩別した。引続き、基質を室温で７日間グアジニウム−ＨＣｌ ４モル中でプロテアーゼ阻害剤の存在下に抽出した。水での広範囲の洗浄の後、基質を凍結乾燥させ、かつ４℃で貯蔵した。こうして処理された基質は、単独で骨誘発性の活性をもはや示さない。
【００７５】
蛋白質は、当業者に知られた種々の方法で抽出された骨基質と組み合わせることができる。
【００７６】
ヘパリンセファロースによっても逆相ＨＰＬＣによっても精製されているＭＰ５２−蛋白質もしくは対照蛋白質をアセトニトリル／トリフルオロ酢酸溶液中で溶離後に移植組織１個当たりそれぞれ基質２５ｍｇと合わせ、十分に混合し、低温凍結させ、かつ凍結乾燥した。基質に結合したＭＰ５２の移植のために、体重１００ｇ当たり０．１４ｍｌを有する麻酔剤（Ketanest 50 (Parke Davis) 0.5ml で混合した Rompun (Bayer社) 0.2ml）の筋肉内注射によって意識を失っている年齢約３ヶ月の２匹のラット（Whister）を使用した。移植組織のために、腹筋系（胸部の下方、最も下の胸骨弓の下方約０．５ｃｍから開始）中の両側の袋を調製した。基質に結合したＭＰ５２（ウェスタンブロットでの評価後約２〜４μｇ）ならびに相応するマトリックスに結合した対照蛋白質を０．９％の食塩溶液（Delta Pharma 社）で湿らせ、かつ筋肉の袋中に移した。引続き、筋肉の袋ならびに必要とされる皮膚の切断片を縫い合わせた。ラットをシクロスポリンＡ（Sandimmun社）で免疫抑制した。１８日後もしくは２６日後に、挿入断片をラットから取り出し、かつ組織学的試験のために固定した。ＭＰ５２を有する移植組織により２６日後に既に巨視的に骨の形成が推測されたので、これを薄い切片の完成のためにメチルメタクリレート中に埋設させ、別の移植組織をパラフィン中に埋設させた。鉱物投与された軟骨組織および骨組織をコッサ（Kossa）による着色技術（Romeis, B; Mikroskopische Technik, Boeck, P 編； Urban und Schwarzenberg; Muenchen, Baltimore, Wien (1989)）によって黒色で際立たせる。マッソン−ゴルトナー（Masson-Goldner）（Romeis, B; Mikroskopische Technik, Boeck, P 編； Urban und Schwarzenberg; Muenchen, Baltimore, Wien (1989)）によるトリクロム着色法の場合には、鉱物投与された骨組織およびコラーゲンを光り輝くように緑に着色し、類骨は赤であり、かつ細胞質は帯赤褐色である。双方の着色技術を２つのラットからの移植組織上に使用した。双方の着色技術を用いた場合には、２つの試験動物において、ＭＰ５２を含有する移植組織内で明らかに軟骨形成および骨形成を検出することができた。対照蛋白質を有する相応する移植組織は、軟骨形成または骨形成を示さなかった。同心円内で細胞外基質の形成が開始されかつ細胞外基質の鉱物投与が開始される軟骨細胞および軟骨面積を有する軟骨前駆物質の含量は、２６日後の場合によりも多い１８日後のＭＰ５２移植組織にある。しかし、１８日後の移植組織の場合にも、既に方向性をもった類骨形成有する成熟骨組織ならびに骨内での個々の骨細胞を検出することができる。更に、骨標識形成の開始とともに閉鎖された小骨を認めることができる。また、２６日後の移植組織の場合には、基質の形成および石灰化の開始とともに軟骨面積を検出することができるが、しかし、骨細胞および類骨縁部を有する緑に着色された鉱物投与された骨組織の含量は、明らかに増大していた。また、この移植組織の場合には、個別化された脂肪細胞の存在を有する骨標識の形成を検出することができる。明示するために、図５には、２６日後の全移植組織の骨物質の着色検出法（Kossa による）が示されている。図６には、マッソン−ゴルトナー着色法によるおよびなし移植組織の小さい割れ目が示されている。個々の壁面中に固着された骨芽細胞中のクビオダール（kubiodale）の骨芽細胞および類骨からの縁部を有する活性の骨が示されている。更に、鉱物投与された骨組織（元来の調製物中で緑に着色されている）中の個々の骨細胞を目視することができる。骨標識形成も同様に検出可能である。
【００７７】
この試験は、組換え体を製造したＭＰ５２が単独で基質との組合せ物で軟骨の骨形成を誘発する状態にあることを示す。
【００７８】
２．２
結果を証明するために、他の逸所症の骨形成試験をＭＰ５２ Ｌ−細胞形質転換細胞を使用しながら実施した。ＭＰ５２を生産する（HindIII-MP52/pABWN 転移された）Ｌ−細胞（１×１０６ 細胞）およびＭＰ５２を生産しない（pABWN 転移された）Ｌ−細胞（１×１０６ 細胞）をそれぞれ３匹の雄の毛の生えていないマウスの両側の大腿筋中に注射した。３週間後、全ての動物を死亡させ、大腿筋を分離し、この大腿筋を低エネルギーのＸ線照射により検査し、ならびに組織病理学的に検査した。
【００７９】
第３表に示されているように、Ｘ線照射の分析により、全てのＭＰ５２を生産するＬ−細胞の筋肉組織中での注射位置で緊密な物質が示されている。組織学的検査によれば、筋肉内で簡単な軟骨形成および石灰化された軟骨形成を確認することができた。また、この結果は、ＭＰ５２が軟骨の骨形成を誘発することができることを証明している。
【００８０】
第３表：
ＭＰ５２を生産する細胞 対照細胞
（HindIII-MP52/pABWN） （pABWN）
Ｘ線分析の際の緊密な物質 ３／３ ０／３
組織学の際の軟骨細胞 ３／３ ０／３
組織学の際の石灰化軟骨形成 ３／３ ０／３
実施された実験は、Ｐ５２蛋白質が分化されていない間葉板細胞からの軟骨の形成、ならびに骨芽細胞の分化および成熟を刺激することを証明している。このことは、胎児性骨形成の場合の誘発カスケードおよび骨折の際の骨の治癒に匹敵する軟骨の骨形成を導く。
【００８１】
試験において記載された条件は、ＭＰ５２活性の説明のためのものであり、これに限定されるものではない。また、本発明は、別の形で試験することもでき、かつ特性決定することもできる。
【００８２】
本発明に記載された細胞系列およびプラスミドについては、添付した寄託証明書の記載から明らかである。
【００８３】
【表１】


【００８４】
【表２】


【００８５】
【表３】


【００８６】
【表４】


【００８７】
【表５】


【００８８】
【表６】


【００８９】
【表７】


【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ＭＰ−５２のアミノ酸配列と７個の保存されたシステイン基の第１のシステイン基で開始するＢＭＰ−蛋白質系統群のメンバーとの比較を示す略図。
【図２ａ】本発明で使用されたオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列および該配列とＭＰ５２公知のメンバーとの比較を示すプライマーＯＤの配列。この場合、ＭはＡまたはＣを意味し、かつＫはＧまたはＴを意味する。
【図２ｂ】本発明で使用されたオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列および該配列とＭＰ５２公知のメンバーとの比較を示すプライマーＯＩＤの配列。この場合、ＳはＣまたはＧを意味し、かつＲはＡまたはＧを意味する。
【図３】特異的に精製されているニワトリ抗体を使用したウェスタンブロットを示す略図。
【図４】ＭＰ５２のためのもう１つの発現ベクターを製造するためのプラスミドｐＡＢＷＮの制限地図を示す略図。
【図５】２６日後の全移植組織の骨物質の着色検出法（Kossa による）による、個別化された脂肪細胞の存在を有する骨標識の形成を示す略図。
【図６】マッソン−ゴルトナー着色法によるおよびなし移植組織の小さい割れ目が示されている。
【出願人】 【識別番号】５９６１５７１０４
【氏名又は名称】ビオファルム ゲゼルシャフト ツア ビオテヒノロギッシェン エントヴィックルング フォン ファルマカ ミット ベシュレンクテル ハフツング
【住所又は居所原語表記】Ｃｚｅｒｎｙｒｉｎｇ ２２、Ｄ−６９１１５ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ
【出願日】 平成１７年９月３０日（２００５．９．３０）
【代理人】 【識別番号】１０００６１８１５
【弁理士】
【氏名又は名称】矢野 敏雄

【識別番号】１０００９４７９８
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 利臣

【識別番号】１０００９９４８３
【弁理士】
【氏名又は名称】久野 琢也

【識別番号】２３０１０００４４
【弁護士】
【氏名又は名称】ラインハルト・アインゼル
【公開番号】 特開２００６−８３１７８（Ｐ２００６−８３１７８Ａ）
【公開日】 平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願番号】 特願２００５−２８８４５６（Ｐ２００５−２８８４５６）