| 【発明の名称】 |
抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤、並びに皮膚化粧料 |
| 【発明者】 |
【氏名】三宅 康夫
【住所又は居所】広島県福山市新市町相方１０８９−８ 丸善製薬株式会社総合研究所内
【氏名】木曽 昭典
【住所又は居所】広島県福山市新市町相方１０８９−８ 丸善製薬株式会社総合研究所内
【氏名】周 艶陽
【住所又は居所】広島県福山市新市町相方１０８９−８ 丸善製薬株式会社総合研究所内
【氏名】大塚 百合
【住所又は居所】広島県福山市新市町相方１０８９−８ 丸善製薬株式会社総合研究所内
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| 【要約】 |
【課題】タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有する抗炎症剤、美白剤、又は抗老化剤、並びにこれらを配合してなる皮膚化粧料の提供。
【解決手段】タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤、タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする美白剤、又はタデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤である。タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を有効成分として含有する皮膚化粧料である。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項２】
ヒアルロニダーゼ活性阻害作用及びヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用の少なくともいずれかを有する請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする美白剤。
【請求項４】
チロシナーゼ活性阻害作用及びメラニン産生抑制作用の少なくともいずれかを有する請求項３に記載の美白剤。
【請求項５】
タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項６】
エラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する請求項５に記載の抗老化剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のミズヒキ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚化粧料。
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【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有する抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤、並びにこれらを配合した皮膚化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性の疾患、例えば、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、及びその他の肌荒れに伴う各種皮膚疾患等の原因や発症機構は多種多様であるが、その原因としてヒアルロニダーゼの活性化やヘキソサミニダーゼの活性化によるものが知られている。
例えば、体組織への親和性を保つヒアルロン酸塩は、含水系の中では紫外線や酵素などによって分解され、分子量の低下に伴って保水効果も減少する。また、ヒアルロン酸は細胞間組織として存在し、血管透過性とも関与している。更に、ヒアルロニダーゼは肥満細胞中にあって活性化により、肥満細胞からの脱顆粒に関与していると言われている。従ってヒアルロン酸の加水分解酵素であるヒアルロニダーゼの活性を阻害することにより、ヒアルロン酸の安定化をはかり、肥満細胞からの種々のケミカルメディエーターの放出を防止し、保湿の強化又は抗炎症が期待できる。
このようなヒアルロニダーゼ阻害活性作用を有する生薬としては、例えば、オスベッキア属植物の抽出物（特許文献１参照）、藤茶抽出物（特許文献２参照）、ローズマリー、タイム抽出物及びメリッサ抽出物（特許文献３参照）などが報告されている。
【０００３】
また、皮膚においてメラニンは紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、次いで、５,６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。従って、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）を予防・治療するためには、メラニン産生過程を阻害すること、あるいは既に産生したメラニンを淡色漂白することが考えられる。
このようなチロシナーゼ阻害作用を有する生薬としては、例えば、藤茶抽出物（特許文献４参照）、ヤナギタデ抽出物（特許文献５参照）などが報告されている。
【０００４】
一方、皮膚の真皮及び表皮は、表皮細胞、線維芽細胞、及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン等の細胞外マトリックスによって構成されている。若い皮膚においてはこれらの皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があって、みずみずしい状態に維持される。
【０００５】
ところが、紫外線、著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり加齢が進んだりすると、エラスチンは分解・変質を起こす。その結果、皮膚の弾力性や保湿機能は低下し、角質は異常剥離を引き起こし、肌は張りや艶を失い、荒れ、しわ、くすみ等の老化症状を呈するようになる。
【０００６】
また、加齢を伴う皮膚老化の一因は、女性ホルモンの一種であるエストロゲンの分泌が減退することにある。即ち、エストロゲンは成人女性の健康維持に深く関わっていて、その分泌不足は種々の内科的疾患を招くほか、肌の過敏症、弾力性低下、潤いの減少等、好ましくない肌の変化の原因となることが知られている。そこで、エストロゲンの分泌が衰える更年期以降の女性に対して、エストロゲンと同様の作用をする物質（エストロゲン様作用剤）を経皮的又は経口的に投与することが行われている。前記エストロゲン様作用剤としては、ステロイド系エストロゲン、非ステロイド系エストロゲン、フラボン系化合物等が使われている（特許文献６〜８等参照）。
【０００７】
しかしながら、安価であり、かつ安全性の高い天然物系のものであって、皮膚化粧料に使用可能な抗炎症剤、美白剤、又は抗老化剤として十分満足できるものは未だ提供されておらず、その速やかな提供が求められているのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−５５２４２号公報
【特許文献２】特開２００３−１２５３２号公報
【特許文献３】特開平８−３３３２６７号公報
【特許文献４】特開２００２−３７０９６２号公報
【特許文献５】特開２００４−０８３４８８号公報
【特許文献６】特開２００１−３１６２４０号公報
【特許文献７】特開２００２−２２６３２３号公報
【特許文献８】特開２００３−０５５２４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、第一に、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用及びヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用の少なくともいずれかを有し、炎症性疾患を予防及び改善の少なくともいずれかを行える抗炎症剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、優れたチロシナーゼ活性阻害作用及びメラニン産生抑制作用の少なくともいずれかを有し、色素沈着、シミ、ソバカス等の原因となるメラニン生成に関与するチロシナーゼ活性を阻害し得る美白剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第三に、優れたエラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、皮膚の老化を予防及び改善の少なくともいずれかを行える抗老化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第四に、抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤の少なくともいずれかを配合した皮膚化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため本発明者が鋭意検討を重ねた結果、タデ科タデ属のミズヒキの抽出物が、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、エラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、抗炎症剤、美白剤、又は抗炎症剤として有効であることを知見した。また、タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を有効成分として含有する皮膚化粧料が、優れた抗炎症作用、美白作用、及び皮膚の老化防止作用の少なくともいずれかを有することを知見した。
【００１１】
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤である。
＜２＞ ヒアルロニダーゼ活性阻害作用及びヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用の少なくともいずれかを有する前記＜１＞に記載の抗炎症剤である。
＜３＞ タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする美白剤である。
＜４＞ チロシナーゼ活性阻害作用及びメラニン産生抑制作用の少なくともいずれかを有する前記＜３＞に記載の美白剤である。
＜５＞ タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤である。
＜６＞ エラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する前記＜５＞に記載の抗老化剤である。
＜７＞ 前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のミズヒキ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする皮膚化粧料である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗炎症剤によると、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、及びヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用の少なくともいずれかを通して、これらの関与する炎症を効果的に予防及び改善することができる。また、本発明の美白剤によると、色素沈着、シミ、ソバカス等の原因となるメラニン生成に関与するチロシナーゼ活性を阻害することによって、色素沈着を防止することができる。また、本発明の抗老化剤によると、優れたエラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用作用の少なくともいずれかを通じて、皮膚のしわの形成や弾力性低下等の老化現象を効果的に予防及び治療することができる。
また、本発明の抗炎症剤、美白剤及び抗老化剤は、使用感と安全性に優れているので皮膚化粧料に配合するのに好適なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤）
本発明の抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤は、タデ科タデ属のミズヒキの抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１４】
前記ミズヒキ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｆｉｌｉｆｏｒｍｅ）は、赤い水引のような長い花穂をつける多年草であって、全草に伏毛がある。日本全土、中国、朝鮮、インドシナ半島などの地域に分布しており、これらの地域から容易に入手可能である。
前記ミズヒキは、秋の野草として生け花や鑑賞用に用いられたり、中国では打撲骨折、吐血、腹痛、下痢、月経不順などに用いられることはあるが、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、エラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、抗炎症剤、美白剤、又は抗老化剤として有用であることは、これまで全く知られておらず、これらのことは、本発明者らの新知見である。
【００１５】
前記ミズヒキの抽出物が有するヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、エラスターゼ活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する物質の詳細については不明であるが、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法により得ることができる。なお、抽出液、該抽出液の希釈液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１６】
前記ミズヒキの抽出原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葉部、枝部、樹皮部、茎部、果実部、根部などの構成部位を用いることができ、これらの中でも、葉部、枝部、樹皮部、茎部、果実部等の地上部が特に好ましい。
【００１７】
前記抽出原料であるミズヒキは、乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。なお、前記ミズヒキは、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。なお、脱脂等の前処理を行うことにより、ミズヒキの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１８】
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜４０質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２０】
本発明において、抽出原料であるミズヒキからヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、エラスターゼ活性阻害作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する物質を抽出するにあたって特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の装置を用いて抽出することができる。
【００２１】
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料としてのミズヒキの地上部を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃にて１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃にて３０分〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであればそのまま配合して本発明の抗炎症剤、美白剤、又は抗老化剤として用いることができる。
【００２２】
得られるミズヒキの抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２３】
なお、得られたミズヒキの抽出液はそのままでも抗炎症剤、美白剤、又は抗老化剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、前記ミズヒキは特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製は、具体的には、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２４】
本発明の抗炎症剤、美白剤、又は抗老化剤は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、エラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかの作用を有すると共に、高い安全性を有しており、以下の本発明の皮膚化粧料に好適に使用することができる。
【００２５】
（皮膚化粧料）
本発明の皮膚化粧料は、本発明の前記抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤の少なくともいずれかを含有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
【００２６】
ここで、前記皮膚化粧料の用途としては、特に制限はなく、各種用途から適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤、アストリンゼント、などが挙げられる。
【００２７】
前記抗炎症剤、美白剤、又は抗老化剤の前記皮膚化粧料全体に対する配合量は、皮膚化粧料の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、前記ミズヒキ抽出物に換算して０．００１〜１０質量％が好ましい。
【００２８】
前記抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤を配合する皮膚化粧料は、更に必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、その皮膚化粧料の製造に通常使用される各種主剤及び助剤、その他成分を使用することができる。本発明の抗炎症剤、美白剤及び抗老化剤を配合する皮膚化粧料は、炎症性疾患の予防及び治療、美白効果、及び皮膚の老化防止及び改善に関し、本発明の抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤のみが主剤となるものに限られるわけではない。
【００２９】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、抗炎症作用、美白作用、又は抗老化作用の妨げにならない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択した成分が挙げられ、例えば、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、抗酸化剤、活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、などが挙げられる。これらの成分は、前記ミズヒキ抽出物と共に併用した場合、相乗的に作用して、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００３０】
本発明の皮膚化粧料は、皮膚に使用した場合に高い安全性を有し、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、エラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを効果的に達成することができ、炎症性疾患の予防及び治療、美白効果、及び皮膚の老化防止及び改善を図ることができる。
【００３１】
なお、本発明の抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤、並びに皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り特に制限はなく、ヒト以外の動物に対しても適用することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３３】
（製造例１）
−ミズヒキの水抽出物の製造−
ミズヒキの地上部の乾燥物を細切りしたもの２００ｇに水２Ｌを加え、還流抽出器で８０℃にて２時間加熱抽出し、熱時濾過した。残渣について更に同様の抽出処理を行った。得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、更に乾燥して、ミズヒキの水抽出物を得た。抽出物の収率は表１に示すとおりであった。
【００３４】
（製造例２）
−ミズヒキの５０質量％エタノール抽出物の製造−
ミズヒキの地上部の乾燥物を細切りしたもの２００ｇに５０質量％エタノール２Ｌを加え、還流抽出器で８０℃にて２時間加熱抽出し、熱時濾過した。残渣について更に同様の抽出処理を行った。得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、更に乾燥して、ミズヒキの５０質量％エタノール抽出物を得た。抽出物の収率は表１に示すとおりであった。
【００３５】
（製造例３）
−ミズヒキの８０質量％エタノール抽出物の製造−
ミズヒキの地上部の乾燥物を細切りしたもの２００ｇに８０質量％エタノール２Ｌを加え、還流抽出器で８０℃にて２時間加熱抽出し、熱時濾過した。残渣について更に同様の抽出処理を行った。得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、更に乾燥して、ミズヒキの８０質量％エタノール抽出物を得た。抽出物の収率は表１に示すとおりであった。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（実施例１）
−ヒアルロニダーゼ阻害試験−
製造例１〜３で得られた各抽出物について、下記の試験法によりヒアルロニダーゼ阻害作用について試験した。
まず、被験試料を溶解した０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液(ｐＨ３．５)０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ溶液（Ｔｙｐｅ ＩＶ−Ｓ(ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｉｓ;ＳＩＧＭＡ ４００ ＮＦ ｕｎｉｔｓ／ｍＬ)０．１ｍＬを加え、３７℃で２０分間反応した。更に、活性化剤として２．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム０．２ｍＬを加え、３７℃にて２０分間反応した。これに０．４ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸カリウム溶液（ｆｒｏｍ ｒｏｂｓｔｅｒ ｃｏｍｂ）０．５ｍＬを加え、３７℃にて４０分間反応した。その後、０．４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム０．２ｍＬを加え、反応を止めて冷却した後、各反応溶液にホウ酸溶液０．２ｍＬを加え、３分間煮沸した。氷冷後、ｐ−ＤＡＢＡ試薬６ｍＬを加え、３７℃にて２０分間反応した。その後、波長５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。
これらの結果から、下記数式１によりヒアルロニダーゼ活性阻害率を算出した。
【００３８】
＜数式１＞
ヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）＝
［１−（Ｓｔ−Ｓｂ）／（Ｃｔ−Ｃｂ）］×１００
ただし、前記数式１中、Ｓｔは、被験試料溶液の波長５８５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｓｂは、被験試料溶液ブランクの波長５８５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃｔは、コントロール溶液の波長５８５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃｂは、コントロール溶液ブランクの波長５８５ｎｍにおける吸光度を表す。
【００３９】
次いで、試料濃度を段階的に減少させて上記抑制率の測定を行い、ヒアルロニダーゼ活性を５０％抑制する試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
表２の結果から、製造例１〜３の各ミズヒキ抽出物がヒアルロニダーゼ阻害作用を有することが確認できた。
【００４１】
（実施例２）
−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用試験−
製造例１〜３で得られた各抽出物について、下記の試験法によりヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を試験した。
まず、ラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）を１５質量％ＦＢＳ添加Ｓ−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に培地で希釈し、ＤＮＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ＩｇＥが終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるよう添加した後、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ緩衝液１００μＬにて洗浄を２回行った。次に、同緩衝液３０μＬ及び同緩衝液にて調製した被験試料１０μＬを加え、３７℃にて１０分静置下した。その後、１００ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ−ＢＳＡ溶液１０μＬを加え、３７℃にて１５分静置し、ヘキソサミニダーゼを遊離させた。その後、９６ｗｅｌｌプレートを氷上に静置することにより遊離を停止した。各ｗｅｌｌの細胞上清１０μＬ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ−ＮＡＧ（１）溶液１０μＬを、新たな９６ｗｅｌｌプレートに添加し、３７℃、１時間反応させた。反応終了後、各ｗｅｌｌに０．１ｍｏｌ／ＬＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３を２５０μＬ加え、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、空試験として、細胞上清１０μＬ、及び０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３ ２５０μＬの混合液の波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定し、補正した。
これらの結果から、下記数式２によりヘキソサミニダーゼ遊離抑制率を算出した。
なお、（１）ｐ−ＮＡＧは、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅを表す。
【００４２】
＜数式２＞
ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率（％）＝［１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ］×１００
ただし、前記数式２中、Ａは、被験試料無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｂは、被験試料添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃは、被験試料添加，ｐ−ＮＡＧ無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。
【００４３】
次いで、試料濃度を段階的に減少させて上記抑制率の測定を行い、ヘキソサミニダーゼの遊離を５０％阻害する試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
表３の結果から、製造例１〜３の各ミズヒキ抽出物が、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有することが確認できた。
【００４５】
（実施例３）
−チロシナーゼ活性阻害作用試験−
製造例１〜３で得られた各抽出物について、下記の試験法によりチロシナーゼ活性阻害作用を試験した。
まず、試験管に、１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．４５ｍＬ、チロシン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１．０ｍＬ、ミズヒキ抽出物４０ｍｇを５０ｖ／ｖ％エタノール溶液１ｍＬに溶解して得た試料溶液０．０５ｍＬを加え、更にチロシナーゼ溶液（シグマ社製 マッシュルーム由来 １２８．４ｕｎｉｔ／ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、３７℃にて１時間インキュベーションした。反応終了後、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の操作と吸光度測定を、酵素を添加せずに１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて行った。更に、試料溶液を添加せずに試料を溶かす溶媒についても同様の測定を行った。
これらの結果から、下記数式３によりチロシナーゼ活性の阻害率を算出した。
【００４６】
＜数式３＞
チロシナーゼ活性阻害率(％)＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
ただし、前記数式３中、Ａは、酵素溶液添加、試料溶液添加時の吸光度を表す。Ｂは、酵素溶液無添加、試料溶液添加時の吸光度を表す。Ｃは、酵素溶液添加、試料溶液無添加時の吸光度を表す。Ｄは、酵素溶液無添加、試料溶液無添加時の吸光度を表す。
【００４７】
次いで、試料濃度を段階的に減少させて上記抑制率の測定を行い、チロシナーゼ活性を５０％抑制する試料濃度(μｇ／ｍＬ)を内挿法により求めた。結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
表４の結果から、製造例１〜３の各ミズヒキ抽出物がチロシナーゼ活性阻害作用を有することが確認できた。また、チロシナーゼ活性阻害作用の程度は、抽出物の濃度によって調節できることが確認できた。
【００４９】
（実施例５）
−メラニン産生抑制作用試験−
製造例１〜３で得られた各抽出物について、下記の試験法によりメラニン産生抑制作用を試験した。
まず、Ｂ１６メラノーマ細胞を１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで８．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭを２ｍＬ加えた直径６０ｍｍシャーレに０．５ｍＬずつ播種し、８時間培養した。培養後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで終濃度の２倍に調製した被験試料を２．５ｍＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、トリプシン処理により細胞を回収し細胞数を数えた。その後、遠心（２５００×ｇ、６分、室温）して培地を取り除き、１０％ＤＭＳＯ含有１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液２ｍＬを添加して超音波破砕器により細胞を破壊した。これをろ過し、得られたろ液の波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。
これらの結果から、下記数式４によりメラニン産生抑制作用を算出した。結果を表５に示す。
【００５０】
＜数式４＞
メラニン産生抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×（Ｃ／Ｄ）×１００
ただし、前記数式４中、Ａは、被験試料無添加での４７５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｂは、被験試料添加での４７５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃは、被験試料添加での細胞数を表す。Ｄは、被験試料無添加での細胞数を表す。
【００５１】
【表５】
表５の結果から、製造例１〜３の各ミズヒキ抽出物がメラニン産生抑制作用を有することが確認できた。
【００５２】
（実施例６）
−エラスターゼ活性阻害作用試験−
製造例１〜３で得られた各抽出物について、下記の試験法によりエラスターゼ活性阻害作用を試験した。
まず、９６ｗｅｌｌプレートにて、０．２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８．０）で調製した被験試料５０μＬ及び２０μｇ／ｍＬエラスターゼ・タイプＩＩＩ溶液５０μＬを混合した。その後、上記緩衝液にて調製した０．４５１４ｍｇ／ｍＬ Ｎ−ＳＵＣＣＩＮＹＬ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ｐ−ＮＩＴＲＯＡＮＩＬＩＤＥ １００μＬを添加して、２５℃にて１５分反応させた。反応終了後、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。
これらの結果から、下記数式５によりエラスターゼ活性阻害率を算出した。
【００５３】
＜数式５＞
エラスターゼ活性阻害率（％）＝［１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）］×１００
ただし、前記数式５中、Ａは、被験試料無添加、酵素添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｂは、被験試料無添加、酵素無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃは、被験試料添加、酵素添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｄは、被験試料添加、酵素無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。
【００５４】
次いで、試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、エラスターゼの活性を５０％阻害する試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表６に示す。
【００５５】
【表６】
表６の結果から、製造例１〜３の各ミズヒキ抽出物がエラスターゼ阻害作用を有することが確認できた。また、エラスターゼ阻害作用の程度は、抽出物の濃度によって調節できることが確認できた。
【００５６】
（実施例７）
−エストロゲン様作用試験−
製造例１〜３で得られた各抽出物について、下記の試験法によりエストロゲン様作用を試験した。
ヒト乳癌由来細胞（ＭＣＦ−７）を１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ及び１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を活性炭処理した１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ及び１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムを含有するフェノールレッド不含ＭＥＭ（Ｔ−ＭＥＭ）を用いて３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり４５０μＬずつ播種し、細胞を定着させるため培養した。６時間後（０日目）にＴ−ＭＥＭで終濃度の１０倍に調製した被験試料を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加し、培養を続けた。３日目に培地を抜き、Ｔ−ＭＥＭで終濃度に調製した被験試料を各ｗｅｌｌに１ｍＬ添加し、更に培養を続けた。
エストロゲン様作用は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、１％ＮＥＡＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭに終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで溶解したＭＴＴを各ｗｅｌｌに２００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。ポジティブコントロールとして、１０−９Ｍ エストラジオールを使用した。
これらの結果から、エストロゲン様作用（エストロゲン依存性増殖作用）を下記数式６から算出した。試料溶液の濃度１２．５μｇ／ｍＬの時の結果を表７に示す。
【００５７】
＜数式６＞
エストロゲン様作用率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
ただし、前記数式６において、Ａは、試料添加の場合の吸光度を表す。Ｂは、試料無添加の場合の吸光度を表す。
【００５８】
【表７】
表７の結果から、製造例１〜３の各ミズヒキ抽出物がエストロゲン様作用を有することが確認できた。
【００５９】
（配合実施例１）−乳液−
下記組成の乳液を常法により製造した。
ホホバオイル ４．０ｇ
プラセンタエキス ０．１ｇ
オリーブオイル ２．０ｇ
スクワラン ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．０ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ） ２．０ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．０ｇ
加水分解コンキオリン ０．１ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
カミツレ抽出物 ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
ヒノキチオール ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
ミズヒキ５０質量％エタノール抽出物（製造例２） ０．０１ｇ
精製水 残部
合計 １００ｇ
【００６０】
（配合実施例２） −美容液−
下記組成の美容液を常法により製造した。
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１ｇ
アスコルビン酸リン酸エステル ０．１ｇ
アロエエキス ０．１ｇ
ウコンエキス ０．１ｇ
ソウハクヒエキス ０．１ｇ
ビワエキス ０．１ｇ
香料 適量
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
ミズヒキ８０質量％エタノール抽出物（製造例３） ０．０１ｇ
精製水 残部
合計 １００ｇ
【００６１】
（配合実施例３） −パック−
下記組成のパックを常法により製造した。
ポリビニルアルコール １５ｇ
ポリエチレングリコール ３ｇ
プロピレングリコール ７ｇ
エタノール １０ｇ
甘草エキス ０．１ｇ
ワレモコウエキス ０．１ｇ
ヨクイニンエキス ０．１ｇ
ローヤルゼリー抽出液 ０．１ｇ
パラオキシ安息香酸エチル ０．０５ｇ
香料 ０．０５ｇ
ミズヒキ水抽出物（製造例１） ０．０５ｇ
精製水 残部
合計 １００ｇ
【００６２】
（配合実施例４） −クリーム−
下記組成のクリームを常法により製造した。
【表８】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の抗炎症剤、美白剤、及び抗老化剤の少なくともいずれかを含有する皮膚化粧料は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、エラスターゼ活性阻害作用及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、安全性にも優れているので、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、入浴剤等の皮膚化粧料として幅広く用いられる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９１０８２４２１
【氏名又は名称】丸善製薬株式会社
【住所又は居所】広島県尾道市向東町１４７０３番地の１０
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| 【出願日】 |
平成１６年９月１７日（２００４．９．１７） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１００１０７５１５
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
【識別番号】１００１０７７３３
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
【識別番号】１００１１５３４７
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
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| 【公開番号】 |
特開２００６−８３１４４（Ｐ２００６−８３１４４Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１８年３月３０日（２００６．３．３０） |
| 【出願番号】 |
特願２００４−２７２５１４（Ｐ２００４−２７２５１４） |
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