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【発明の名称】 ＤＮＡ合成酵素阻害組成物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物、テロメラーゼ阻害組成物、癌細胞増殖抑制組成物および抗炎症組成物
【発明者】 【氏名】水品 善之

【氏名】吉田 弘美

【氏名】長谷川 義和
【要約】 【課題】製造が容易なＤＮＡ合成酵素阻害組成物を提供する。

【解決手段】ＤＮＡ合成酵素阻害組成物は、いわしの頭部および内臓から抽出したブタノール層画分を有効成分として含有している。ＤＮＡ合成酵素阻害組成物は、α型およびβ型ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用、およびＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有している。ＤＮＡ合成酵素阻害組成物は、テロメラーゼに対する阻害活性作用、ヒト癌細胞増殖抑制作用、および抗炎症作用を有している。ＤＮＡ合成酵素阻害組成物は、癌治療剤、エイズ治療剤あるいは免疫抑制剤となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類から抽出した有効成分を含有し、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用を有する
ことを特徴としたＤＮＡ合成酵素阻害組成物。
【請求項２】
有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分である
ことを特徴とした請求項１記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物。
【請求項３】
魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項１または２記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物。
【請求項４】
魚類から抽出した有効成分を含有し、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する
ことを特徴としたＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物。
【請求項５】
有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して分けた脂溶性のブタノール層画分および水溶性の水層画分の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項４記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物。
【請求項６】
魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項４または５記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物。
【請求項７】
魚類から抽出した有効成分を含有し、テロメラーゼに対する阻害作用を有する
ことを特徴としたテロメラーゼ阻害組成物。
【請求項８】
有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分である
ことを特徴とした請求項７記載のテロメラーゼ阻害組成物。
【請求項９】
魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項７または８記載のテロメラーゼ阻害組成物。
【請求項１０】
魚類から抽出した有効成分を含有し、癌細胞増殖抑制作用を有する
ことを特徴とした癌細胞増殖抑制組成物。
【請求項１１】
有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分である
ことを特徴とした請求項１０記載の癌細胞増殖抑制組成物。
【請求項１２】
魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項１０または１１記載の癌細胞増殖抑制組成物。
【請求項１３】
魚類から抽出した有効成分を含有し、抗炎症作用を有する
ことを特徴とした抗炎症組成物。
【請求項１４】
有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分と、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の水層画分と脂溶性のヘキサン層画分との少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項１３記載の抗炎症組成物。
【請求項１５】
魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかである
ことを特徴とした請求項１３または１４記載の抗炎症組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類から抽出した有効成分を含有するＤＮＡ合成酵素阻害組成物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物、テロメラーゼ阻害組成物、癌細胞増殖抑制組成物および抗炎症組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ＤＮＡ合成酵素群およびＤＮＡトポイソメラーゼ群が細胞の増殖、分裂および分化などに関与していることが知られている。そして、ＤＮＡ合成酵素阻害剤、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤およびテロメラーゼ阻害剤は、癌の場合に癌細胞の増殖抑制作用を有し、エイズの場合にＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害作用を有し、さらに免疫抑制作用の場合に抗原に対する特異的抗体産生を抑制する作用を有すると考えられている。そこで、これらＤＮＡ合成酵素阻害剤、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤およびテロメラーゼ阻害剤は、癌、エイズおよび免疫疾患治療薬あるいは予防効果のある医薬品として開発が期待されている。
【０００３】
そして、ＤＮＡ合成酵素阻害群としては、癌あるいはエイズなどの疾病や、免疫担当細胞による抗体生産などにおいて重要な要因の一つであることが知られている(例えば、特許文献１参照。)。また現在、ＤＮＡ合成酵素阻害剤としては、ジデオキシＴＴＰ(ｄｄＴＴＰ)、Ｎ・メチルマイレミド、ブチルフェニル・ｄＧＴＰなどが知られている(例えば、非特許文献１参照。)。さらに、植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにも、ＤＮＡ合成酵素阻害作用が見出されている(例えば、特許文献２参照。)。
【０００４】
なお、ＤＮＡトポイソメラーゼは、ＤＮＡの複製、転写および組換えなどあらゆるＤＮＡ代謝に関わる重要な酵素であり、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤は、ヒト癌の治療においてイリノテカンやエトポシドなど多くの重要な抗癌剤として使用されている。
【０００５】
一方、従来の抗癌剤は、その多くが発生した癌細胞を殺すこと並びに癌細胞の増殖抑制作用を有するものであったが、近年発癌防止を目的とした抗発癌剤の開発も進められている。この点については、正常細胞の癌化のステップにおいて「イニシエータ」と「プロモータ」とが関係しており、正常細胞の癌化は「(1)正常細胞の染色体がイニシエータによりＤＮＡレベルでの障害を受けて潜在的腫癌細胞に変化する。(2)潜在的腫癌細胞にプロモータが作用して腫癌細胞に変化させる。」の２段階を経て起こるという発癌２段階説が知られている(例えば、特許文献３参照。)。
【０００６】
また、発癌プロモータとしての作用を持つ化合物の代表としては、ＴＰＡ(12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate)などが知られている。そして、癌研究の場でこのような発癌プロモータを用いた発癌実験が行われるとともに、発癌予防および抗発癌剤の探索においてこのような発癌プロモータの作用を阻害する抗発癌プロモータの探索が進められている。
【特許文献１】特開平１１−１０６３９５号公報
【特許文献２】特開２０００−１４３５１６号公報
【特許文献３】特開平９−１７６１８４号公報
【非特許文献１】アニュアル レビュー オブ バイオケミストリー誌(Annual Review of Biochemistry)、１９９１年，第６０巻，ｐ．５１３−５５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そして、上記ＤＮＡ合成酵素阻害剤やＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤などとしては、ジデオキシＴＴＰ(ｄｄＴＴＰ)、Ｎ・メチルマイレミド、ブチルフェニル・ｄＧＴＰやスルホキノボシルアシルグリセリドなどが有効成分として用いられているが、これら有効成分の製造が容易ではないから、これら有効成分を用いたＤＮＡ合成酵素阻害剤やＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤などの製造が容易ではないという問題を有している。
【０００８】
本発明は、このような点に鑑みなされたもので、製造が容易なＤＮＡ合成酵素阻害組成物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物、テロメラーゼ阻害組成物、癌細胞増殖抑制組成物および抗炎症組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用を有するものである。
【００１０】
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用を有する組成物の製造が容易になる。
【００１１】
請求項２記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物は、請求項１記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分であるものである。
【００１２】
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用がより確実となる。
【００１３】
請求項３記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物は、請求項１または２記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
【００１４】
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【００１５】
請求項４記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有するものである。
【００１６】
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する組成物の製造が容易になる。
【００１７】
請求項５記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物は、請求項４記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して分けた脂溶性のブタノール層画分および水溶性の水層画分の少なくともいずれかであるものである。
【００１８】
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して分けた脂溶性のブタノール層画分および水溶性の水層画分の少なくともいずれかを有効成分とすることにより、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用がより確実となる。
【００１９】
請求項６記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物は、請求項４または５記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
【００２０】
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【００２１】
請求項７記載のテロメラーゼ阻害組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、テロメラーゼに対する阻害作用を有するものである。
【００２２】
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、テロメラーゼに対する阻害作用を有する組成物の製造が容易になる。
【００２３】
請求項８記載のテロメラーゼ阻害組成物は、請求項７記載のテロメラーゼ阻害組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分であるものである。
【００２４】
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、テロメラーゼに対する阻害作用がより確実となる。
【００２５】
請求項９記載のテロメラーゼ阻害組成物は、請求項７または８記載のテロメラーゼ阻害組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
【００２６】
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、テロメラーゼに対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【００２７】
請求項１０記載の癌細胞増殖抑制組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、癌細胞増殖抑制作用を有するものである。
【００２８】
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、癌細胞増殖抑制作用を有する組成物の製造が容易になる。
【００２９】
請求項１１記載の癌細胞増殖抑制組成物は、請求項１０記載の癌細胞増殖抑制組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分であるものである。
【００３０】
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、癌細胞増殖抑制作用がより確実となる。
【００３１】
請求項１２記載の癌細胞増殖抑制組成物は、請求項１０または１１記載の癌細胞増殖抑制組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
【００３２】
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、癌細胞増殖抑制作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【００３３】
請求項１３記載の抗炎症組成物は、魚類から抽出した有効成分を含有し、抗炎症作用を有するものである。
【００３４】
そして、魚類から抽出した有効成分を含有させることにより、抗炎症作用を有する組成物の製造が容易になる。
【００３５】
請求項１４記載の抗炎症組成物は、請求項１３記載の抗炎症組成物において、有効成分は、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分と、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の水層画分と脂溶性のヘキサン層画分との少なくともいずれかであるものである。
【００３６】
そして、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分と、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の水層画分と脂溶性のヘキサン層画分との少なくともいずれかを有効成分とすることにより、抗炎症作用がより確実となる。
【００３７】
請求項１５記載の抗炎症組成物は、請求項１３または１４記載の抗炎症組成物において、魚類は、いわしの頭部および内臓の少なくともいずれかであるものである。
【００３８】
そして、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いることにより、抗炎症作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【発明の効果】
【００３９】
請求項１記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用を有する組成物の製造を容易にできる。
【００４０】
請求項２記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物によれば、請求項１記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用をより確実にできる。
【００４１】
請求項３記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物によれば、請求項１または２記載のＤＮＡ合成酵素阻害組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【００４２】
請求項４記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する組成物の製造を容易にできる。
【００４３】
請求項５記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物によれば、請求項４記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して分けた脂溶性のブタノール層画分および水溶性の水層画分の少なくともいずれかを有効成分とすることにより、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用をより確実にできる。
【００４４】
請求項６記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物によれば、請求項４または５記載のＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【００４５】
請求項７記載のテロメラーゼ阻害組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、テロメラーゼに対する阻害作用を有する組成物の製造を容易にできる。
【００４６】
請求項８記載のテロメラーゼ阻害組成物によれば、請求項７記載のテロメラーゼ阻害組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、テロメラーゼに対する阻害作用をより確実にできる。
【００４７】
請求項９記載のテロメラーゼ阻害組成物によれば、請求項７または８記載のテロメラーゼ阻害組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、テロメラーゼに対する阻害作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【００４８】
請求項１０記載の癌細胞増殖抑制組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、癌細胞増殖抑制作用を有する組成物の製造を容易にできる。
【００４９】
請求項１１記載の癌細胞増殖抑制組成物によれば、請求項１０記載の癌細胞増殖抑制組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分を有効成分とすることにより、癌細胞増殖抑制作用をより確実にできる。
【００５０】
請求項１２記載の癌細胞増殖抑制組成物によれば、請求項１０または１１記載の癌細胞増殖抑制組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、癌細胞増殖抑制作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【００５１】
請求項１３記載の抗炎症組成物によれば、魚類から抽出した有効成分を含有しているので、抗炎症作用を有する組成物の製造を容易にできる。
【００５２】
請求項１４記載の抗炎症組成物によれば、請求項１３記載の抗炎症組成物の効果に加え、魚類から抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分と、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の水層画分と脂溶性のヘキサン層画分との少なくともいずれかを有効成分とすることにより、抗炎症作用をより確実にできる。
【００５３】
請求項１５記載の抗炎症組成物によれば、請求項１３または１４記載の抗炎症組成物の効果に加え、廃棄物とされるいわしの頭部および内臓を用いるので、抗炎症作用を有する組成物を製造性良く安価に製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
以下、本発明の一実施の形態のＤＮＡ合成酵素阻害組成物について説明する。
【００５５】
まず、ＤＮＡ合成酵素阻害組成物は、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用を有するＤＮＡ合成酵素阻害剤である。そして、このＤＮＡ合成酵素阻害剤は、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する阻害作用を有しているので、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物であるＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤としても用いることができる。したがって、このＤＮＡ合成酵素阻害剤は、換言するとα型およびβ型ＤＮＡ合成酵素や、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害作用を有しているので、癌治療剤、エイズ治療剤あるいは免疫抑制剤となり得る。
【００５６】
また、このＤＮＡ合成酵素阻害剤は、テロメラーゼに対する阻害活性作用を有しているので、テロメラーゼ阻害組成物であるテロメラーゼ阻害剤としても用いることができる。さらに、このＤＮＡ合成酵素阻害剤は、ヒト癌細胞増殖抑制作用を有しているので、ヒト癌細胞増殖抑制組成物である癌細胞増殖抑制剤としても用いることができる。また、このＤＮＡ合成酵素阻害剤は、抗炎症作用を有しているので、抗炎症組成物である抗炎症剤として用いることができる。
【００５７】
具体的に、このＤＮＡ合成酵素阻害剤は、魚類であるいわしの頭部および内臓の少なくともいずれかから、アセトンやブタノールなどの溶媒を用いて効率よく抽出させた有効成分を含有している。そして、この有効成分としては、いわしの頭部あるいは内臓から溶媒を用いて抽出した抽出物を、ブタノールと水とで分配して水溶性の第１の水層画分から分けた脂溶性のブタノール層画分や、このブタノール層画分をヘキサンと水とで分配して分けた水溶性の第２の水層画分、および脂溶性のヘキサン層画分などである。
【００５８】
この結果、いわしの頭部または内臓から抽出される成分は、ＤＮＡ合成酵素阻害剤およびＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤として有効であり、抗癌剤、抗炎症剤および健康食品として期待できる。具体的には、いわし由来の脂溶性画分であるブタノール層画分やヘキサン層画分などを含有させることにより、ＤＮＡ合成酵素阻害剤、生化学試薬、さらには抗癌剤および抗炎症剤として医薬品などへ利用できるとともに、種々の有用性を有する組成物とすることができる。
【００５９】
なお、上記一実施の形態では、いわしの頭部や内臓から抽出した有効成分を含むＤＮＡ合成酵素阻害組成物について説明したが、上記一実施の形態と同様の作用効果を有する有効成分を含有していれば、いわし以外の魚類のいずれの部位であってもよい。
【実施例】
【００６０】
次に、上記ＤＮＡ合成酵素阻害組成物の一実施例について説明する。
【００６１】
まず、いわしの画分の調製について説明する。
【００６２】
図１に示すように、冷凍いわしの頭部と内臓とをミキサで粉砕しながらアセトンで成分を抽出してからアセトンを除去して、ｎ−ブタノールと水とで分配した。そして、脂溶性のブタノール層と水溶性の水層とのそれぞれの各溶媒を除去して、脂溶性のブタノール層画分と、水溶性の第１の水層画分とに分けた。
【００６３】
さらに、このブタノール層画分をｎ−へキサンと水とで分配した。そして、脂溶性のへキサン層と水溶性の水層とのそれぞれの各溶媒を除去して、脂溶性のへキサン層画分と、水溶性の第２の水層画分とに分けた。
【００６４】
また、冷凍いわしの頭部と内臓に５０質量％メタノールを加えてからミキサで粉砕したものから残渣を除いて抽出した溶液を乾固させて５０％メタノール画分とした。
【００６５】
次に、いわし画分の構成成分について説明する。
【００６６】
上記へキサン層画分と第２の水層画分について、シリカゲルカラムクロマトグラフィおよび高速液体クロマトグラフィを用いて、主成分の単離および精製をしてから、これらの化学構造を核磁気共鳴装置(Nuclear Magnetic Resonance:ＮＭＲ)およびガスクロマトグラフィで分析した。この結果、ヘキサン層画分には、トリグリセロール、長鎖不飽和脂肪酸およびコレステロールが主として含まれていることがわかった。また、第２の水層画分には、ウラシルなどの核酸系化合物が含まれていることがわかった。
【００６７】
次に、ＤＮＡ合成酵素阻害活性の検証について説明する。
【００６８】
上記いわしの画分の調製で得た有効成分のＤＮＡ合成酵素群に対する活性を測定した。
【００６９】
まず、ＤＮＡ合成酵素として哺乳類由来のＤＮＡポリメラーゼとしてのＤＮＡ合成酵素αおよびＤＮＡ合成酵素βについて試験した。このとき、ＤＮＡ合成酵素αとしては牛胸腺から常法にて抽出精製した標品を、ＤＮＡ合成酵素βとしてはラット由来の該当遺伝子を用いた。
【００７０】
そして、これらＤＮＡ合成酵素に対する阻害作用の測定には、一般的なＤＮＡ合成酵素反応系(日本生化学会編、新生化学実験講座２、核酸IV、東京化学同人、ｐ．６３−６６)を用いた。すなわち、このＤＮＡ合成酵素反応系では、放射性同位元素で標識した[３Ｈ]−ＴＴＰを含む系においてＤＮＡ合成反応をし、放射比活性を生成物(合成ＤＮＡ鎖)量の指標とするものである。
【００７１】
また、阻害率は、コントロールでの合成ＤＮＡ量(ａ)と、被検物質存在下での合成ＤＮＡ量(ｂ)とについて、(ａ−ｂ)／ａ×１００＝阻害率(％)の計算式に代入して評価した。なお、この阻害率＝１００％−活性(％)である。そして、これらＤＮＡ合成酵素α(複製型)およびＤＮＡ合成酵素β(修復型)に対する阻害結果を図２および図３に示す。このとき、これら図２および図３は、いわし画分非存在下におけるＤＮＡ合成酵素αおよびβの残存活性を示している。
【００７２】
そして、これら図２および図３に示すように、ブタノール層画分は、ＤＮＡ合成酵素αおよびβを１００μｇ／ｍｌで完全に阻害した。また、第１の水層画分および５０％メタノール画分のそれぞれは、ＤＮＡ合成酵素βを阻害しなかったが、１０００μｇ／ｍｌではＤＮＡ合成酵素αを阻害した。
【００７３】
次に、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害活性の検証について説明する。
【００７４】
まず、ＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する活性を測定した。
【００７５】
Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼおよびII型ＤＮＡトポイソメラーゼのそれぞれは、組換えヒト由来の市販標品(トポゲン社(TopoGEN Inc.,)製，米国)を用いた。文献(ミズシナ(Mizushina)他，バイオケミストリー ジャーナル誌(Biochemistry Journal)、２００２年，第３５０巻，ｐ．７５７−７６３)に記載の方法に従って、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼ活性はカンプトテンシン(camptothecin，ＣＰＴ)を、II型ＤＮＡトポイソメラーゼはエトポシド(etoposide，ＶＰ−１６)を陽性対照として、スーパーコイル(超ラセン，フォームＩ)を持った環状プラスミドＤＮＡの弛緩(relaxation，フォームII)反応で酵素活性を測定した。この反応後、反応液を平板アガロースゲル電気泳動させて、ゲルを臭化エチジウム染色した後に反応生成物のＤＮＡ量を解析した。
【００７６】
この結果、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼに対する結果が図４に示すようになった。このＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼによって基質である環状二本鎖ＤＮＡにニック(欠け)が入るとフォームＩ型からフォームII型へ移行する。図４に示すように、レーン１は酵素非存在下のネガティブ・コントロールであり、レーン２は酵素存在下のポジティブ・コントロールである。そして、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼは、第１の水層画分およびブタノール層画分によって１０μｇ／ｍｌ以上の濃度で阻害が見られた。一方、５０％メタノール画分では全く阻害が見られなかった。
【００７７】
次に、テロメラーゼ阻害活性の検証について説明する。
【００７８】
ヒト子宮癌細胞(HeLa cell)抽出液を用いて、ストレッチポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction:ＰＣＲ)法によってテロメラーゼを測定した。この結果、図５に示すポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真のように、テロメラーゼによる６塩基の繰り返し配列(テロメア配列)の生成が検出された。このとき、レーン１は、酵素非存在下のネガティブ・コントロールである。したがって、この図５に示すように、ブタノール層画分の７５μｇ／ｍｌにおいてテロメラーゼ阻害活性が見られ、第１の水層画分および５０％メタノール画分ではテロメラーゼ阻害活性が見られなかった。
【００７９】
次に、細胞増殖阻害活性の検証について説明する。
【００８０】
まず、細胞としてヒト胃癌由来ＮＵＧＣ−３細胞を用い、培地としてＲＰＭＩ１６４０培地(日水製薬株式会社製)を用い、この培地に牛胎児血清１０質量％を添加したものを用いた。このとき、この培地の培養としては、５質量％ＣＯ２インキュベータで３７℃とした。
【００８１】
そして、この培地に、最終濃度が１００μＭになるように第１の水層画分、ブタノール層画分および５０％メタノール画分のそれぞれを溶解させた。ただし、これら画分は水に難溶であるため、一度ＤＭＳＯ(ジメチルスルフォキシド)に溶解してから培地に溶解させた。なお、培地内に存在するＤＭＳＯの最終濃度は、すべての試験区で１％以下になっており、この検証で用いたＮＵＧＣ−３細胞の増殖抑制にＤＭＳＯが関わる可能性が否定できる状態となっている。
【００８２】
さらに、この検証での培養は、９６穴マイクロプレートを用いた。そして、各ウエルに３．０×１０５個の細胞を植え込んでから、１つの試験濃度に対して３ウエルずつ与えた。また、ポジティブコントロールとして培地に１％のＤＭＳＯを含むものを用いた。
【００８３】
そして、各培地に化合物を添加後は、５％ＣＯ２インキュベータで３７℃２４時間培養してから、各試験区の細胞生存率を判定した。このとき、この細胞生存率の判定としては、文献(「細胞の成長および生存の迅速な比色分析：細胞増殖および細胞傷害分析の適用(Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival:Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays)」、ティム モスマン(Tim Mosmann)、ジャーナル オブ イムノロジー メソッド(Journal of Immunological Methods)，１９８３年、第６５巻、ｐ．５５−６３)に記載の細胞毒性試験であるＭＴＴアッセイ法を用いた。このＭＴＴアッセイ法は、２４時間後にテトラゾリウム塩(ＭＴＴ)を添加してから、さらに４時間培養するものである。そして、生細胞による還元を経て生産するホルマザン量が生細胞に比例するとみなして、５７０ｎｍの光学密度(Optical Density:Ｏ．Ｄ．)で定量した。
【００８４】
このとき、細胞生存率は、細胞生存率(％)＝試験区の光学密度(Ｏ．Ｄ．)［５７０ｎｍ］／対照区の光学密度(Ｏ．Ｄ．)［５７０ｎｍ］の式にて算出した。そして、この式にて得られた結果を、化合物のヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ−３に対する細胞増殖阻害効果として図６に示した。なお、この図６に示されているデータは、３ウエルの平均値である。この結果、図６に示すように、ブタノール層画分が癌細胞の増殖を濃度依存的に阻害した。また、このブタノール層画分の５０％増殖阻害濃度(ＬＤ５０)が７２μｇ／ｍｌであった。一方、第１の水層画分および５０％メタノール画分では、癌細胞への影響が見られなかった。
【００８５】
次に、抗炎症活性の検証について説明する。
【００８６】
まず、ＴＰＡ(12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate)は、慢性炎症を誘発するのみならず、発癌プロモータとして哺乳類の細胞増殖を促進する。そこで、ＤＮＡ合成酵素阻害作用、抗炎症作用および抗発癌プロモータ活性の間には互いに関連性があるのではないかとの推測から、ＤＮＡ合成酵素を阻害するいわし画分が抗炎症活性を有するかを調べた。
【００８７】
具体的には、マウスの耳に予め所定量のいわし画分としての各画分を塗布した後、ＴＰＡによって誘発されるマウス耳の炎症性浮腫の質量を測定することで各阻害効果を算出した。このとき、試験は、基本的に(キャンサー レター(Cancer Letters)．１９８４年，第２５巻，ｐ．１７７−１８５)記載の方法に従って、マウスの一方の耳にいわし画分を５００μｇ塗布してから３０分経過した後に、これら各画分を塗布した箇所と反対側の耳にＴＰＡを０．５μｇ塗布する。この後、７時間経過した後に、ＴＰＡによって誘発される炎症性浮腫の質量を測定して反対側の耳(コントロール)と比較し、これら炎症生浮腫の質量減少を抗炎症活性として各阻害効果を算出した。
【００８８】
この結果、図７に示すように、ブタノール層画分、ヘキサン層画分および第２の水層画分のそれぞれにおいて有意に炎症を抑制した。一方、５０％メタノール画分および第１の水層画分のそれぞれにおいては抗炎症活性が見られなかった。この結果、脂溶性画分であるブタノール層画分、へキサン層画分および第２の水層画分のそれぞれは、抗炎症作用を有すると認められ、発癌プロモータＴＰＡの働きを抑制する抗発癌プロモータ活性、換言すれば抗発癌作用を有するものと認められた。
【００８９】
上述したように、上記一実施例では、一般的に安価で廃棄物となるいわしの頭部や内臓からの抽出物のうち脂溶性成分であるブタノール層画分は、ＤＮＡ合成酵素選択的阻害剤としての利用に止まらず、抗癌剤および抗炎症剤として医薬品などへの応用が可能であり、その薬理上許容される塩についても同様に医薬品などへの応用が可能である。したがって、このブタノール層画分を有効成分として含有したＤＮＡ合成酵素選択的阻害剤は、製造が容易で安価に製造できる。
【００９０】
さらに、上述したいわしの脂溶性画分であるブタノール層画分は、上述のようにＴＰＡによって誘発される炎症を抑制する作用を有しており、発癌プロモータＴＰＡの働きを抑制する作用を有するものと認められる。したがって、このブタノール層画分は、発癌プロモータ抑制剤および抗発癌剤、換言すれば発癌防止剤および発癌抑制剤として有用である。このとき、「抗癌剤」は、発癌プロモータ抑制作用を有する抗発癌剤を含む意味として用いている。
【００９１】
なお、上記いわしの各画分を体内投与する際は、経口投与よりも非経口投与が好ましく、またリボソームなどの運搬体に封入して投与することが好ましい。このとき、癌細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位、すなわち病変部位に有効成分を効率よく運ぶことができるので効果的である。また、上記いわしの各画分は、飲食品へ添加や配合することによって、抗癌効果、抗発癌効果、あるいは抗炎症効果をもった健康食品として利用することもできる。
【００９２】
次に、上記有効成分を配合した医薬用組成物および食用組成物について説明する。
【００９３】
まず、上記いわしの脂溶性画分であるブタノール層画分を有効成分とする抗癌剤および抗炎症剤としては、この有効成分をそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物とすることによって、動物やヒトに投与できる。このとき、医薬用組成物の剤形としては、特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択できる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤など経口剤や、注射剤、坐剤などの非経口剤などが挙げられ、好適には非経口剤が挙げられる。
【００９４】
そして、これら錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤あるいは散剤などの経口剤としては、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などを用いて常法に従って製造される。また、これら製剤中の成分の配合量は、特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には、上述の有効成分の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを適宜使用できる。
【００９５】
さらに、結合剤としては、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなどが例として挙げられる。また、崩壊剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどが例として挙げられる。
【００９６】
そして、界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどが例として挙げられる。また、滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、蔗糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールなどが例として挙げられる。さらに、流動性促進剤としては、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどが例として挙げられる。そして、上記有効成分を、懸濁液、エマルション剤、シロップ剤あるいはエリキシル剤などとして投与してもよく、これら各種剤形には、矯味矯臭剤や着色剤などを含有させてもよい。
【００９７】
一方、非経口剤として有効成分の効果を発現させるためには、患者の年齢や、体重、疾患の程度によって用いる量が異なるが、通常、成人であれば１日あたり１ｍｇ以上６０ｍｇ以下を静注、点滴静注、皮下注射あるいは筋肉注射によって投与するのが適当である。この非経口剤である非経口投与剤としては、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコールなどが用いられる。さらに必要に応じて、これら非経口剤に、殺菌剤、防腐剤、安定剤などを加えてもよい。また、この非経口剤は、安定性の点から、バイアルなどに充填した後に冷凍し、通常の凍結乾燥処理によって水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製するとよい。さらに必要に応じて、これら非経口剤に、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤などを加えてもよい。
【００９８】
これら製剤中の有効成分の配合量は、特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例としては、外用液剤、軟膏などの塗布剤や、直腸内投与のための坐剤などが挙げられ、これら塗布剤および坐剤なども常法に従って製造される。
【００９９】
さらに、有効成分の好適な態様としては食用組成物が挙げられる。すなわち、この有効成分は、そのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどに添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉などの賦形剤や香料、色素などとともにペレット、錠剤、類粒などに加工したり、ゼラチンなどで被覆してカプセルに成形加工したりして健康食品や栄養補助食品などとして利用できる。
【０１００】
なお、ヒトと他の哺乳類のＤＮＡ合成酵素の構造はほとんど同じであるため、上述したＤＮＡ合成酵素阻害剤としては、ヒト以外の哺乳類由来のＤＮＡ合成酵素阻害剤としても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明の一実施の形態のＤＮＡ合成酵素阻害組成物の有効成分の抽出方法を示す説明図である。
【図２】同上有効成分のＤＮＡ合成酵素α活性を示すグラフである。
【図３】同上有効成分のＤＮＡ合成酵素β活性を示すグラフである。
【図４】同上有効成分のＤＮＡトポイソメラーゼに対する効果を示す写真である。
【図５】同上有効成分のテロメラーゼ阻害を示す写真である。
【図６】同上有効成分のヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ−３に対する細胞増殖阻害効果を示すグラフである。
【図７】同上有効成分のマウス耳に対する抗炎症作用を示すグラフである。
【出願人】 【識別番号】５００２３８４１３
【氏名又は名称】株式会社帝和エンジニアリング
【出願日】 平成１６年８月２４日（２００４．８．２４）
【代理人】 【識別番号】１０００６２７６４
【弁理士】
【氏名又は名称】樺澤 襄

【識別番号】１０００９２５６５
【弁理士】
【氏名又は名称】樺澤 聡

【識別番号】１００１１２４４９
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 哲也

【識別番号】１００１２８３９２
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 秀一
【公開番号】 特開２００６−６２９６６（Ｐ２００６−６２９６６Ａ）
【公開日】 平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願番号】 特願２００４−２４３６１８（Ｐ２００４−２４３６１８）