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【発明の名称】 遺伝子治療用キャリアとしてのポリエチレングリコール／オリゴ核酸共担持金属微粒子
【発明者】 【氏名】長崎 幸夫

【氏名】大石 基

【氏名】石井 武彦

【氏名】中尾上 純平

【氏名】片岡 一則
【要約】 【課題】

【解決手段】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子表面に水溶性ポリマーを有し、水中での分散安定性を確保した表面に、オリゴ核酸を直接的または間接的に担持させた、オリゴ核酸輸送を行う遺伝子治療用キャリア。
【請求項２】
微粒子が金属である請求項１の微粒子
【請求項３】
親水性ポリマーが、数平均分子量２００〜３０，０００のポリエチレングリコールからなるポリエチレングリコール／ポリカチオンブロック共重合体である請求項１または２に記載のオリゴ核酸担持微粒子。
【請求項４】
親水性ポリマーが、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有するブロックポリマーの第１のブロックを構成するセグメントがポリエチレングリコールであり、かつ、第２のブロックを構成するポリマーセグメントの、微粒子表面の支持体に配位能を有する官能基を介して、下記のブロックポリマーが微粒子表面に固定されている、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴ核酸担持金属微粒子。
（ａ）上記親水性ポリマーのセグメントを第１のブロック成分とする。
（ｂ）金属微粒子表面の支持体に配位能を有する官能基を有するモノマーをモノマー単位とする、重合度が１〜３００のポリマーセグメントを第２のブロックとする。
【請求項５】
ブロックポリマーの第１のブロック：−ポリエチレングリコールが式（Ｉ）
式中、Ｌ１は単結合または連結基であり、


Ｘは水素原子もしくは、アルキル基、アラルキル基、ヒドロキシル基、ホルミル基、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンドを表し、ｎが５〜５００の整数である請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴ核酸担持金属微粒子。
【請求項６】
微粒子表面の支持体に配位能を有する官能基が、メルカプト基、ジチオール基、スルフィド基、またはアミノ基である、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴ核酸担持金属微粒子。
【請求項７】
ブロックポリマーの第２のブロックが式（ＩＩ）
【化１】


［式中、ｍは１〜１０の整数、ｎは１〜３００の整数を表し、Ｒ１、Ｒ２は互いに独立して、炭素原子数が１〜５のアルキル基、アミノ基、メルカプト基、または、スルフィド基を表す］で表される、メタクリル酸ポリマーのセグメント、またはペンタエチレンヘキサミン基である、請求項１〜６のいずれかに記載の金属微粒子。
【請求項８】
オリゴ核酸が、メルカプト基、およびジスルフィド基を介して、ポリアミンセグメントまたは微粒子表面の一部に化学的に修飾され、金属微粒子表面に担持されている、請求項４〜７のいずれかに記載の核酸担持金属微粒子。
【請求項９】
微粒子が金、銀、銅、白金、パラジウム、アルミニウムの群の少なくとも一種の金属から選ばれる素材で形成されている、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴ核酸担持金属微粒子。
【請求項１０】
金属微粒子の粒径が１ｎｍ以上であり、１００ｎｍ未満のサイズを有する請求項１〜９に記載のオリゴ核酸担持金属微粒子。
【請求項１１】
オリゴ核酸が１０〜２００の核酸塩基を含む１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡの２本鎖、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡの群から選ばれる、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴ核酸担持金属微粒子。
【請求項１２】
金属微粒子表面に直接的または間接的に担持されているオリゴ核酸が、生体環境中で放出される、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴ核酸輸送用金属微粒子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸輸送用金属微粒子の使用方法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、薬剤学の分野で有用なオリゴ核酸を生体環境下で安定に存在することができ、しかもある特定の遺伝子発現を制御するポリエチレングリコール／オリゴ核酸共担持金属微粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を生体内の標的部位へ送達するためのキャリアとして。改変レトロウイルス、改変アデノウイルス等に加えて、安全性の観点から、合成キャリア、例えば、カチオニックリポソーム、膜融合リポソーム、ポリカチオン（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリ−Ｌ−リジン、キトサン）、ポリカチオン含有ブロックコポリマー等の使用が検討されてきた。就中、片岡を初めとする本発明者の一部により提案されたポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルを利用するＤＮＡの送達系は、一般的に、薬物内包ミセルの安定性、標的細胞もしくは組織内への移行性、組織内での薬物の安定性が良く、最も期待されうる送達系である（非特許文献１参照。）。しかし、ある特定の標的遺伝子の発現を制御するために該遺伝子に対するオリゴ核酸を使用する系では、上記のＰＩＣミセル系を利用してもオリゴ核酸をＰＩＣミセル内に安定に保持することが困難な場合があった（非特許文献２参照。）。
【０００３】
他方、オリゴ核酸をキャリアに安定に保持する手段として、オリゴ核酸の一方の末端にチオール基およびジスルフィド基を導入した後、金などの金属微粒子と混合させることにより金属微粒子キャリアにオリゴ核酸を結合させ、安定に保持できることが見出されている（非特許文献３参照。）。しかし、金属微粒子キャリアに保持されたオリゴ核酸は、血清中のたんぱく質との非特異的な相互作用やＤＮＡ分解酵素による攻撃により、標的組織・細胞に到達しない場合が多く、さらに、金属微粒子自体生体適合性が低い。
【０００４】
発明者の一部は、金などの金属微粒子であっても、ポリエチレングリコールをブロックとして有し、かつ、特定のメタクリル酸ポリマーを他のブロックとして有するブロックポリマー誘導体を混合することにより、金属微粒子表面にポリエチレングリコールが担持され、生体適合性が向上することも提案されている（特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００２−８０９０３号公報
【非特許文献１】Ｋａｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２９（１９９６）８５５６−８５５７
【非特許文献２】Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１３（２００１）３５−４２
【非特許文献３】Ｊｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０（２００４）１３６９−１３７４
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上に述べた金属微粒子およびポリエチレングリコール担持金属微粒子はオリゴ核酸の保持率を高めるか、あるいは生体適合性を高めることに成功している。しかしながら、オリゴ核酸の保持率を高め、かつ、生体適合性を高め、標的組織・細胞に特異的にオリゴ核酸を送達しうる手段は依然として必要である。本発明は、かようなニーズに応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ポリエチレングリコール／ポリカチオン共重合体により表面保護した金属微粒子に、オリゴ核酸が、メルカプト基およびジスルフィド基を介して、ポリカチオンセグメントの一部に化学的に修飾され、もしくは金属微粒子表面に直接担持されているポリエチレングリコール／オリゴ核酸共担持金属微粒子として安定に得、さらに通常の生体内環境の下においては、担持したオリゴ核酸が金属微粒子表面からはがれることなく、さらに金属微粒子が一定の大きさを有しているため、腎臓などにおける体外排出を免れ、生体適合性の向上をはかることが可能であることを見出した。そのうえ、細胞内に取り込まれたポリエチレングリコール／オリゴ核酸共担持金属微粒子は、細胞質に大量に存在しているグルタチオンに代表される低分子チオール化合物などにより、金属微粒子表面に担持していたオリゴ核酸の末端チオールが競争的に交換されることにより細胞質内に放出することが可能である。しかも動物細胞内へ安定かつ効率的にオリゴ核酸を送達でき、標的遺伝子の発現を制御しうることも見出した。また、このような遺伝子治療用キャリアは本発明者らの知る限り、文献未載のものである。
【０００７】
したがって、本発明によれば、ある特定の遺伝子の発現を抑制する系で有用なオリゴ核酸の遺伝子治療用キャリアが供給される。具体的には、本発明における微粒子としては特に限定されるものではないが、ポリスチレンやポリブタジエンからなる群より選ばれるラテックス、シリカやクレイからなる群より選ばれる無機粒子、および金、銀、銅、アルミニウム、あるいはこれらの合金、あるいはこれらからなる群より選ばれる金属を微粒子の構造中の一部に含むものが好ましく、特に金、銀、銅はチオール基、ジスルフィド基およびアミノ基と極めて安定に結合するため最も好適な金属である。
【０００８】
また、本発明によれば、一般式（Ｉ）


式中、Ｒ１はポリカチオン（たとえばポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒシチジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサン、ポリエチレンイミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ポリアリルアミン、ポリビニルヒスチジン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルスチレン）、ポリ（メタクリル酸２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル））を表し、
Ｌ１は単結合または連結基を表し、
Ｘは水素原子もしくは、アルキル基、アラルキル基、ヒドロキシル基、ホルミル基、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンドを表し、そして
ｎが５〜５００の整数であるポリエチレングリコール／ポリカチオンブロック共重合体を表す。
一般式（Ｉ）が固定されている微粒子表面に、一方の末端をチオール修飾したオリゴ核酸を直接的または間接的に担持させ、効率的なオリゴ核酸輸送を行う遺伝子治療用キャリアが供給される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に従う、ポリエチレングリコール／オリゴ核酸共担持金属微粒子は、ある特定の遺伝子の発現を抑制することを主たる目的とするものである。したがって、オリゴ核酸は特定の遺伝子（または標的遺伝子）の発現に関与するｍＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対して相補的配列であるか、または相補的配列とアンチセン配列からなるニ本鎖を含むものである。
【００１０】
本発明にいうオリゴ核酸は、「オリゴ」が意味する数個から１０数個の核酸塩基からなるものに限定されず、最大、２００個までの核酸塩基からなるものを内包する。また、限定されるものでないが、本発明で用いることを意図しているオリゴ核酸の例としては、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖、ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００１１】
本発明のオリゴ核酸が標的とする遺伝子は、本発明の目的に沿う限り、如何なる遺伝子であってもよいが、好ましくは、動物の病原遺伝子およびそれらの発現に関与するＤＮＡまたはＲＮＡ部分であることができる。限定されるものでないが、標的遺伝子には、非小細胞肺癌などに関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫などに関係のあるＢＣＬ−２、クーロン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リウマチ、乾鮮に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡ１受容体、卵巣癌などに関係のあるｃ−ｒａｆ ｋｉｎａｓｅ、冠動脈疾病癌に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ ＲＩα、膵臓癌に関係のあるＨ−ｒａｓ、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチル−トランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌などに関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ＧＬＵＴ−１、およびａｕｔｏｔａｘｉｎの遺伝子を挙げることができる。そしてこれらの遺伝子の発現を効果的に抑制することのできる配列も、それ自体公知の配列のものを利用できる。
【００１２】
ポリエチレングリコール／ポリカチオンブロック共重合体はポリエチレングリコール末端に連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリエチレングリコール基を表す。具体的には、ポリエチレングリコール／ポリカチオンブロック共重合体は、式（Ｉ）
式中、Ｒ１はポリカチオン（たとえばポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒシチジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサン、ポリエチレンイミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ポリアリルアミン、ポリビニルヒスチジン、ポリ（Ｎ，Ｎ−


ジメチルアミノメチルスチレン）、ポリ（メタクリル酸２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル））であり、共重合体中一分子あたりのカチオン数は１〜３００の整数である。
【００１３】
Ｌ１は単結合または連結基を表し、本発明の目的に沿う限り、Ｘ部とポリエチレングリコール部とを連結しうる如何なる基、例えば、総原子数３〜３０のアルキレン基、アリレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−、−ＳＯ−から選ばれる１種類以上からなるものであってよい、
Ｘは水素原子もしくは、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル等）、アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル等）、ヒドロキシル基、アルデヒド（もしくはホルミル基：−ＣＨＯ）、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基（なお「保護された」と称する場合の保護基は、限定されるものでないが、ペプチド合成で慣用されるアミノ基およびカルボキシル基に対する保護基を意味する。）からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンド（例、ビオチン、ハプテン、ホルモン、抗体、糖、葉酸、ペプチド、酵素の基質等）の残基であり、
ｎは５〜５００の整数であるポリエチレングリコール基である。
【００１４】
本発明における微粒子としては特に限定されるものではないが、ポリスチレンやポリブタジエンからなる群より選ばれるラテックス、シリカやクレイからなる群より選ばれる無機粒子、および金、銀、銅、アルミニウム、あるいはこれらの合金、あるいはこれらからなる群より選ばれる金属を微粒子の構造中の一部に含むものが好ましく、特に金、銀、銅はチオール基、ジスルフィド基およびアミノ基と極めて安定に結合するため最も好適な金属である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明で得られたポリエチレングリコール／オリゴ核酸共担金属持微粒子分散液は高濃度、および生理条件下でも凝集せずに安定である。また、当該金属微粒子はオリゴ核酸のみで表面修飾した金属微粒子と比較すると、ＤＮＡ分解酵素耐性面を向上させることが可能である。また、本微粒子は粒子表面に固定されたオリゴ核酸が、周囲の環境に影響されて放出され、オリゴ核酸がある特定の遺伝子（標的遺伝子）の発現を効率的に制御することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。
【００１７】
実施例１：ポリエチレングリコール／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子の製造
【００１８】
市販の金コロイド溶液（ブリティッシュバイオセル社より購入、平均粒径１０ｎｍ、４．６ｎＭ）１０ｍＬにポリエチレングリコール／ポリ（メタクリル酸、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）ブロックポリマー溶液（ポリエチレングリコール分子量５０００、ポリ（メタクリル酸、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）分子量７５００、６ｍｇ／ｍＬ）１ ｍＬを添加して一晩激しく攪拌した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んでいる１０ｍＭトリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を用いて遠心精製（１５００００×ｇ、１５分間、３回）及び濃縮することによりポリエチレングリコー化金ナノ粒子溶液を得た。その後、吸光度および原子吸光度測定により金ナノ粒子濃度を２６．８ｎＭと決定した。次に、調製した２６．８ｎＭポリエチレングリコール化金ナノ粒子溶液５００μＬに、５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸ニ水素ニナトリウムニ水和物を含んでいる１０ｍＭトリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を１７０μＬ加え、金粒子濃度を２０ｎＭに調整しストック溶液とした。このポリエチレングリコール化金ナノ粒子ストック溶液５０μＬに、センス鎖ＲＮＡの５’末端をチオール基で修飾したｓｉＲＮＡ溶液（ダーマコン社より購入、２μＭ）を５０μＬ（金粒子の１００倍量）添加し、２時間ボルテックスで攪拌した後一晩静置することで平衡化し、１μＭのポリエチレングリコール／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子を得た。
【００１９】
実施例２：ポリエチレングリコール／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子のＲＮＡｉ効果
【００２０】
２４穴ポリスチレン製細胞培養プレート（ファルコン社製）に、人肝癌細胞（ＨｕＨ−７ｃｅｌｌ）を５Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した後、市販の遺伝子導入試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（１．２２μＬ／ｗｅｌｌ，インビィトロジェン社製）を用い、ホタルルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３，０．０８４μｇ／ｗｅｌｌ，プロメガ社製）とウミシイタケルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＲＬ−ＴＫ，０．７５μｇ／ｗｅｌｌ，プロメガ社製）のレポーター遺伝子をＯｐｔｉＭＥＭ（インビィトロジェン社製）中で細胞にトランスフェクションした。次に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する配列を有するポリエチレングリコール／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子（実施例１で調製した）の溶液を所定量加え（培地濃度換算［ｓｉＲＮＡ］＝１００ｍＭ）、２４時間１０％血清存在下で細胞と接触させた。培地交換後、さらに２４時間培養した後、細胞を回収し両レポーター遺伝子の発現量をＤｕａｌ ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）により測定しＲＮＡｉ効果を評価した（ｎ＝３）。
【００２１】
比較のために、実施例２と同様の条件で、センス鎖ＲＮＡの５’末端をチオール基で修飾したｓｉＲＮＡ担持金ナノ粒子、チオール基未修飾のポリエチレングリコール／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子（配列同じ）、ｓｉＲＮＡ担持金ナノ粒子、およびｓｉＲＮＡ単独のＲＮＡｉ効果も評価した。
【００２２】
以上の結果を図１に示した。ｓｉＲＮＡ単独では、ほとんどＲＮＡｉ効果を示さないことが確認された。一方、ポリエチレングリコール／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子（実施例１で調製した）では、チオール基未修飾のポリエチレングリコール／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子および、ｓｉＲＮＡ担持金ナノ粒子と比べ、高いＲＮＡｉ効果が確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は１００ｎＭにおけるポリエチレングリコー／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子、チオール基未修飾のポリエチレングリコー／ｓｉＲＮＡ共担持金ナノ粒子、ｓｉＲＮＡ担持金ナノ粒子（チオール基有／無）およびｓｉＲＮＡ単独のＲＮＡｉ効果の結果である。
【出願人】 【識別番号】５９７０５９０８５
【氏名又は名称】長崎 幸夫
【出願日】 平成１６年８月１７日（２００４．８．１７）
【代理人】
【公開番号】 特開２００６−５６８６３（Ｐ２００６−５６８６３Ａ）
【公開日】 平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願番号】 特願２００４−２６６０８３（Ｐ２００４−２６６０８３）