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【発明の名称】 免疫賦活剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗老化剤及び皮膚化粧料
【発明者】 【氏名】木曽 昭典
【住所又は居所】広島県福山市新市町相方１０８９−８ 丸善製薬株式会社総合研究所内

【氏名】村上 敏之
【住所又は居所】広島県福山市新市町相方１０８９−８ 丸善製薬株式会社総合研究所内

【氏名】伊藤 洋子
【住所又は居所】広島県福山市新市町相方１０８９−８ 丸善製薬株式会社総合研究所内
【要約】 【課題】安全性の高い天然物の中から、ＴＮＦ−α産生促進作用、血小板凝集抑制作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用及び表皮角化細胞増殖促進作用を有するものを見出し、それを有効成分として含有する免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤、抗老化剤及び皮膚化粧料を提供することを目的とする。

【解決手段】免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤、抗老化剤及び皮膚化粧料に土貝母（Bolbostemma paniculata (Maxim.)Franq.）からの抽出物を含有せしめる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項２】
土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項３】
土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生促進剤。
【請求項４】
土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項５】
前記抽出物が、血小板凝集抑制作用及び／又はヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有することを特徴とする請求項４に記載の抗炎症剤。
【請求項６】
土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項７】
前記抽出物が、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用及び表皮角化細胞増殖促進作用の群から選ばれた１種又は２種以上の作用を有することを特徴とする請求項６に記載の抗老化剤。
【請求項８】
土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物を配合したことを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項９】
土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）の鱗片からの抽出物を配合したことを特徴とする皮膚化粧料。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性の高い植物抽出物を有効成分として含有する免疫賦活剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗老化剤及び皮膚化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、消費者の健康に対する意識はますます高まりを見せている。一方で、現代社会には、不規則な生活習慣、食事の偏り、精神的ストレス等、免疫機構にダメージを与える要因が氾濫している。このようにして免疫力が低下することにより、癌、感染症、アレルギー症状等の各種疾患を誘発することが知られており、逆に免疫力が賦活されると、発癌抑制、制癌作用、抗感染症、抗アレルギー作用、さらには体調リズムの回復・恒常性維持などの様々な効果が期待できる。
【０００３】
免疫機構には、多くの種類の細胞が関与しているが、特に白血球の役割は大きく、なかでもマクロファージは全動物に普遍的に存在しており、免疫応答の特に初期段階での働きを含め、あらゆる段階に関与している重要な白血球の一種である。近年、白血球の働きが物質レベルで解明されてきており、白血球の機能や細胞間相互作用は、白血球が分泌する微量タンパク質（サイトカイン）によって担われていることがわかってきた。
【０００４】
サイトカインには多くの種類があり、なかでも腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やインターロイキン類が注目されている。それらのなかで、ＴＮＦ-αに代表される炎症性サイトカインは、主にマクロファージから放出され、最終的には抗腫瘍作用等を示すことが報告されている。したがって、ＴＮＦ−αの産生機能を亢進させることにより、免疫機能を賦活させ、悪性腫瘍の増殖を抑制できるものと考えられる。このような考えに基づき、ＴＮＦ−α産生促進剤として、ユキノシタ科スグリ属に属する植物からの抽出物（特許文献１参照）等が提案されている。
【０００５】
炎症性の疾患、例えば接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他肌荒れに伴う各種皮膚疾患等の原因や発症機構は多種多様であるが、その原因として、ホスホリパーゼＡ２の活性化、血小板凝集、ヒスタミン遊離によるものが知られている。
【０００６】
血小板は、凝集して活性化することにより、生理的には止血、病理的には血栓形成を生じる他、血小板の凝集は、動脈硬化症の進展、ガン転移、炎症等に関与していると考えられている。したがって、血小板の凝集を抑制することにより、上記疾患の予防、治療又は改善をすることができるものと考えられる。このような考えに基づき、血小板凝集抑制剤として、コウサンフウ抽出物（特許文献２参照）等が提案されている。
【０００７】
また、ヒスタミンは、マストセル内に存在し、脱顆粒反応により放出されたものが起炎物質として作用する。細胞内のヒスタミンが遊離されると同時にヘキソサミニダーゼも遊離されることから、ヘキソサミニダーゼの遊離を指標にヒスタミン遊離抑制作用を評価することができる。したがって、ヘキソサミニダーゼの遊離を抑制することにより、同時にヒスタミンの遊離も抑制でき、これにより炎症性疾患等の予防、治療又は改善に効果があるものと考えられる。このような考えに基づき、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤として、紅雪茶抽出物（特許文献３参照）等が提案されている。
【０００８】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞、及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては線維芽細胞の増殖は活発であり、線維芽細胞、コラーゲン等の皮膚組織の相互作用により水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、皮膚は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００９】
ところが、紫外線、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少すると共に架橋による弾力性低下を引き起こす。また、線維芽細胞の増殖が遅くなり皮膚の保湿機能や弾力性が低下する。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ等の老化現象を呈するようになる。そのため、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進することにより、また、線維芽細胞の増殖を促進することにより皮膚の老化を防止又は改善することができると考えられる。このような考えに基づき、コラーゲン産生促進剤として、五斂子からの抽出物（特許文献４参照）等が、線維芽細胞増殖促進剤として、クスノハガシワ抽出物（特許文献５参照）等が提案されている。
【００１０】
表皮は、最下層である基底層から始まって、有棘層、顆粒層、角質層へと連なる４層構造からなるが、各層に存在する大部分の細胞は、基底層から分化した角化細胞である。通常、角化細胞は基底層で産生され、徐々に上層に分化しながら移動して角質細胞となって角質層を構成し、最終的に垢として角質層から脱落していく。
【００１１】
上記角質層は皮膚の最外殻に存在しており、外界からの刺激に対する物理的なバリアーとしての役割を果たしている。皮膚ではこのバリアー機能を持たせるため、角化細胞が基底層で産生されてから垢となって剥がれ落ちるまでのサイクル（角化）を通常４週間の周期で繰り返し、表皮の新陳代謝を行っている。しかしながら、この角質層も加齢によって新陳代謝機能が衰え、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚トラブルを発生することになる。そのため、角化細胞の増殖を促進し、肌の新陳代謝機能を回復させることにより、こじわ、くすみ、色素沈着等の皮膚の老化を改善できるものと考えられる。このような考えに基づき、表皮角化細胞増殖促進剤として、ハス胚芽抽出物（特許文献６参照）等が提案されている。
【特許文献１】特開２００４−１０７６６０号公報
【特許文献２】特開２００２−５３４７７号公報
【特許文献３】特開２００３−２１２７８９号公報
【特許文献４】特開２００２−２２６３２３号公報
【特許文献５】特開２００３−１４６８３７号公報
【特許文献６】特開２００２−６８９９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、安全性の高い天然物の中から、ＴＮＦ−α産生促進作用、血小板凝集抑制作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用を有するものを見出し、当該天然物からの抽出物を有効成分として含有する免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤及び抗老化剤、並びに当該天然物からの抽出物を配合した皮膚化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤又は抗老化剤は、土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とし、本発明の皮膚化粧料は、土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物又は土貝母（Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）の鱗片からの抽出物を配合したことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の抗炎症剤においては、前記抽出物が、血小板凝集抑制作用及び／又はヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有することが好ましく、本発明の抗老化剤においては、前記抽出物が、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用及び表皮角化細胞増殖促進作用の群から選ばれた１種又は２種以上の作用を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、土貝母からの抽出物が有するＴＮＦ−α産生促進作用、血小板凝集抑制作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用に基づく免疫賦活効果、抗炎症効果又は抗老化効果に優れ、安全性の高い免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤、抗老化剤及び皮膚化粧料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について説明する。
〔免疫賦活剤，抗腫瘍剤，ＴＮＦ−α産生促進剤，抗炎症剤，抗老化剤〕
本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤又は抗老化剤は、土貝母（学名：Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物を有効成分として含有する。
【００１７】
ここで、本発明において、「土貝母からの抽出物」には、土貝母を抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１８】
本発明において、抽出原料として使用する植物は、土貝母（学名：Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）である。土貝母は、ウリ科の多年生のよじのぼり性草本であり、その鱗茎は数個から十数個の鱗片からなる。土貝母は、中国の遼寧省、河北省、河南省、山東省、山西省等に分布しており、これらの地域から容易に入手することができる。
【００１９】
抽出原料として使用し得る土貝母の構成部位としては、全草を用いることができ、例えば、葉部、花部、茎部、種子、鱗茎（鱗片）、根部又はこれらの混合物を用いることができる。これらのうち、鱗茎（鱗片）を抽出原料として用いるのが好ましい。
【００２０】
ＴＮＦ−α産生促進作用、血小板凝集抑制作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用を有する土貝母からの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。例えば、抽出原料を乾燥した後、そのまま、又は粉砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。この際、抽出原料の乾燥は天日で行ってもよいし、通常用いられる乾燥機を使用して行ってもよい。また、土貝母は、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、土貝母の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２１】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用することが好ましく、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが特に好ましい。
【００２２】
抽出溶媒として使用し得る水は、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、濾過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等の炭素数２〜５の多価アルコールが挙げられる。
【００２４】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましい。
【００２５】
抽出処理は、土貝母に含有される可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定されるものではなく、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
【００２６】
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、通常３０分〜４時間静止して可溶性成分を溶出した後、濾過又は遠心分離により固形物を除去し、抽出液を得る。抽出溶媒量は、通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度であり、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００２７】
得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。ただし、土貝母からの抽出物は、固形の抽出物にしたものである必要はなく、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても構わない。これら土貝母からの抽出物は、その生理活性の低下を招かない範囲で、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液−液向流分配等の方法により精製してから用いてもよい。
【００２８】
土貝母からの抽出物は、好ましくない臭いもなく、抽出物特有の色調も有してないため、そのままでも免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤又は抗老化剤として利用可能であるが、濃縮・乾燥した剤形にして使用することもできるし、必要ならば活性の向上や脱色・脱臭を目的とする精製を施したり、任意の助剤と混合して製剤化したりして使用することもできる。
【００２９】
以上のようにして得られる土貝母からの抽出物は、ＴＮＦ−α産生促進作用、血小板凝集抑制作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用を有しているため、それらの作用を利用して免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤又は抗老化剤の有効成分として用いることができるとともにと、血小板凝集抑制剤、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤、コラーゲン産生促進剤、線維芽細胞増殖促進剤又は表皮角化細胞増殖促進剤の有効成分としても用いることができる。
【００３０】
本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤又は抗老化剤は、上記土貝母からの抽出物のみからなるものでもよいし、上記土貝母からの抽出物を製剤化したものでもよい。
【００３１】
上記土貝母からの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化して提供することができ、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。
【００３２】
なお、本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤又は抗老化剤は、必要に応じて、ＴＮＦ−α産生促進作用、血小板凝集抑制作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として用いることができる。
【００３３】
本発明の免疫賦活剤は、有効成分である土貝母からの抽出物が有するＴＮＦ−α産生促進作用を通じて、免疫機能を賦活させ、免疫機能の低下等に伴う各種疾病を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明の免疫賦活剤は、これらの用途以外にも、ＴＮＦ−α産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３４】
本発明の抗腫瘍剤は、有効成分である土貝母からの抽出物が有するＴＮＦ−α産生促進作用を通じて、悪性腫瘍の増殖を抑制することができる。ただし、本発明の抗腫瘍剤は、これらの用途以外にも、ＴＮＦ−α産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３５】
本発明のＴＮＦ−α産生促進剤は、有効成分である土貝母からの抽出物が有するＴＮＦ−α産生促進作用を通じて、ＴＮＦ−αの産生を促進することができる。ただし、本発明のＴＮＦ−α産生促進剤は、これらの用途以外にも、ＴＮＦ−α産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３６】
本発明の抗炎症剤は、有効成分である土貝母からの抽出物が有する血小板凝集抑制作用及び／又はヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を通じて、炎症性疾患等を抑制することができる。ただし、本発明の抗炎症剤は、これらの用途以外にも、血小板凝集抑制作用及び／又はヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３７】
本発明の抗老化剤は、有効成分である土貝母からの抽出物が有するコラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用及び表皮角化細胞増殖促進作用の群から選ばれた１種又は２種以上の作用を通じて、皮膚の老化症状の予防、治療又は改善をすることができる。ただし、本発明の抗老化剤は、これらの用途以外にも、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用及び表皮角化細胞増殖促進作用の群から選ばれた１種又は２種以上の作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３８】
〔皮膚化粧料〕
上記土貝母からの抽出物は、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。この場合、土貝母からの抽出物又は土貝母の鱗片からの抽出物をそのまま配合してもよいし、土貝母からの抽出物から製剤化した免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤又は抗老化剤を配合してもよい。上記土貝母からの抽出物又は土貝母の鱗片からの抽出物を皮膚化粧料に配合することによって、皮膚化粧料にＴＮＦ−α産生促進作用、血小板凝集抑制作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用を付与することができる。
【００３９】
上記土貝母からの抽出物又は土貝母の鱗片からの抽出物を配合し得る皮膚化粧料としては、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、リップ、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディーシャンプー等が挙げられる。
【００４０】
上記土貝母からの抽出物又は土貝母の鱗片からの抽出物を皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．０００１〜１０質量％である。
【００４１】
本発明の皮膚化粧料は、土貝母からの抽出物又は土貝母の鱗片からの抽出物が有するＴＮＦ−α産生促進作用、血小板凝集抑制作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することにより、より一般性のある製品となり、また、それにより、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。
【００４２】
なお、本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗炎症剤、抗老化剤又は皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４４】
〔製造例１〕土貝母抽出物の製造
細切りにした土貝母の鱗片２００ｇに抽出溶媒２０００Ｌを加え、還流抽出器で８０℃の温度条件下にて２時間加熱抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理を行った。得られた抽出液を合わせて、減圧下に濃縮し、乾燥して土貝母抽出物を得た。抽出溶媒として、水、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比＝１：１）、８０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比＝１：４）を用いたときの各抽出物の収率を表１に示す。
【００４５】
［表１］
試 料 抽出溶媒 抽出物収率（％）
１ 水 ５２．３
２ ５０％エタノール ４９．５
３ ８０％エタノール ４０．１
【００４６】
〔試験例１〕ＴＮＦ−α産生促進作用試験
製造例１で得られた土貝母抽出物（試料１〜３）について、以下のようにしてＴＮＦ−α産生促進作用を試験した。
【００４７】
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、４時間培養した。
【００４８】
培養終了後、培地を抜き、終濃度１％のＤＭＳＯを含む１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで試料を溶解した試料溶液（試料濃度：５０μｇ／ｍＬ）を各ウェルに２００μＬずつ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルの培養上清中のＴＮＦ−α量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。同様に、試料溶液を添加せずに培養した培養上清中のＴＮＦ−α量についても測定した。得られた結果から、以下の式により、試料溶液添加時のＴＮＦ−α産生促進率を算出した。
【００４９】
ＴＮＦ−α産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、上記式において、Ａは「試料溶液添加時のＴＮＦ−α量」を、Ｂは「試料溶液無添加時のＴＮＦ−α量」を示す。
上記試験の結果を、表２に示す。
【００５０】
［表２］
試 料 抽出溶媒 ＴＮＦ−α産生促進率（％）
１ 水 １４２．１±５．５
２ ５０％エタノール １６３．５±８．９
３ ８０％エタノール １３２．２±９．４
【００５１】
表２に示すように、土貝母抽出物は、優れたＴＮＦ−α産生促進作用を有することが確認された。
【００５２】
〔試験例２〕血小板凝集抑制作用試験
製造例１で得られた土貝母抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして血小板凝集抑制作用を試験した。
【００５３】
（１）血小板浮遊液の調製
採血したウサギの血液に７７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を１／１０量加えて、遠心（１８０×ｇ，１０分，室温）して血小板浮遊液を得た。さらに遠心（８１０×ｇ，１０分，４℃）して、上清を除去して血小板を得た。これを血小板洗浄液（０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム，０．１５ｍｏｌ／Ｌのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）及び７７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．４）を９０：８：２で混合）に浮遊させ、上記と同様に遠心して、得られた血小板を１４５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウム及び５．５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に浮遊させて血小板数を調整（３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）し、洗浄血小板浮遊液とした。
【００５４】
（２）血小板凝集抑制作用試験
上記洗浄血小板浮遊液２２３μＬに２００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム溶液１μＬを加え、３７℃の温度条件下で１分間反応させた。この反応溶液に試料溶液１μＬを加え、さらに２分間反応させ、攪拌子を入れて１分間攪拌した後、コラーゲン溶液を２５μＬ添加して、３７℃の温度条件下で１０分間血小板凝集率を測定した。また、コントロールとして試料溶液を添加しない以外は同様にして血小板凝集率を測定した。得られた結果から、下記の式により血小板凝集抑制率（％）を算出した。
【００５５】
血小板凝集抑制率(％)＝(Ａ−Ｂ)／Ａ×１００
ただし、上記式において、Ａは「試料無添加時の凝集率」を、Ｂは「試料添加時の凝集率」を示す。
【００５６】
試料溶液の濃度を段階的に減少させて、上記血小板凝集抑制率を算出し、血小板凝集抑制率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ；ｐｐｍ）の値を内挿法により算出した。
上記試験の結果を表３に示す。
【００５７】
［表３］
試 料 抽出溶媒 ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）
１ 水 ３９５
２ ５０％エタノール ３８８
３ ８０％エタノール ４００
【００５８】
表３に示すように、土貝母抽出物は、優れた血小板凝集抑制作用を有することが確認された。
【００５９】
〔試験例３〕ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用試験
製造例１で得られた土貝母抽出物（試料１〜３）について、以下のようにしてヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を試験した。
【００６０】
ラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）を１５％ＦＢＳ含有Ｓ−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように希釈し、DNP-specific IgEの終濃度が０．５μｇ／ｍＬとなるようにDNP-specific IgEを添加した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、シラガニアン緩衝液５００μＬにて洗浄を２回行った。
【００６１】
次に、シラガニアン緩衝液３０μＬ及び同緩衝液に溶解した試料溶液１０μＬを加え、３７℃の温度条件下にて１０分間静置した。その後、１００ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ−ＢＳＡ溶液１０μＬを加え、３７℃の温度条件下にて１５分間静置し、ヘキソサミニダーゼを遊離させた。その後、９６ウェルプレートを氷上に静置することによりヘキソサミニダーゼの遊離を停止させた。各ウェルの細胞上清１０μＬ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド（ｐ−ＮＡＧ）溶液１０μＬを、新たな９６ウェルプレートに添加し、３７℃の温度条件下で１時間反応させた。反応終了後、各ウェルに０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３２５０μＬを加え、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様にして試料を添加せずに、細胞上清１０μＬと０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３２５０μＬとの混合液の吸光度を測定した。また、同様にして試料を添加しｐ−ＮＡＧを添加せずに吸光度を測定した。得られた結果から、下記の式によりヘキソサミニダーゼ遊離抑制率（％）を算出した。
【００６２】
ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率(％)＝{１−(Ｂ−Ｃ)／Ａ}×１００
ただし、上記式において、Ａは「試料無添加時の吸光度」を、Ｂは「試料添加時の吸光度」を、Ｃは「試料添加・ｐ−ＮＡＧ無添加時の吸光度」を示す。
【００６３】
試料溶液の濃度を段階的に減少させて、上記ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率を算出し、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ；ｐｐｍ）の値を内挿法により算出した。
上記試験の結果を表４に示す。
【００６４】
［表４］
試 料 抽出溶媒 ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）
１ 水 ２２５
２ ５０％エタノール １９８
３ ８０％エタノール ２１０
【００６５】
表４に示すように、土貝母抽出物は、優れたヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有することが確認された。
【００６６】
〔試験例４〕コラーゲン産生促進作用試験
製造例１で得られた土貝母抽出物（試料１〜３）について、以下のようにしてコラーゲン産生促進作用を試験した。
【００６７】
ヒト正常線維芽細胞（Detroit 551）を１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように上記ＭＥＭ培地で希釈した後、９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に試料を溶解した試料溶液（試料濃度：５０μｇ／ｍＬ）を各ウェルに１５０μＬずつ添加し、３日間培養した。培養終了後、各ウェルの培地中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。同様にして試料溶液を添加せずにコラーゲン量を測定した。得られた結果から、下記の式により、試料溶液添加時のコラーゲン産生促進率を算出した。
【００６８】
コラーゲン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、上記式において、Ａは「試料溶液添加時のコラーゲン量」を、Ｂは「試料溶液無添加時のコラーゲン量」を示す。
上記試験の結果を表５に示す。
【００６９】
［表５］
試 料 抽出溶媒 コラーゲン産生促進率（％）
１ 水 １２２．２±８．２
２ ５０％エタノール １５３．６±１０．５
３ ８０％エタノール １４５．９±４．６
【００７０】
表５に示すように、土貝母抽出物は、優れたコラーゲン産生促進作用を有することが確認された。
【００７１】
〔試験例５〕線維芽細胞増殖促進作用試験
製造例１で得られた土貝母抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして線維芽細胞増殖促進作用を試験した。
【００７２】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように、５％ＦＢＳ含有α―ＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで試料を溶解した試料溶液（試料濃度：１２．５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに１００μＬ添加し、３日間培養した。
【００７３】
線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、各ウェルから１００μＬずつ培地を抜き、終濃度５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに２０μＬずつ添加した。４．５時間培養した後に、１０％ＳＤＳを溶解した０．０１ｍｏｌ／ｍＬの塩酸溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、一晩培養した後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同様にして波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両吸光度の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。補正後の各吸光度から、下記の式により線維芽細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００７４】
線維芽細胞増殖促進率(％)＝(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)×１００
ただし、上記式において、Ｓｔは「試料溶液添加・細胞添加時の吸光度」を示し、Ｓｂは「試料溶液添加・細胞無添加時の吸光度」を示し、Ｃｔは「試料溶液無添加・細胞添加時の吸光度」を示し、Ｃｂは「試料溶液無添加・細胞無添加時の吸光度」を示す。
上記試験の結果を表６に示す。
【００７５】
［表６］
試 料 抽出溶媒 線維芽細胞増殖促進率（％）
１ 水 １０８．８±６．３
２ ５０％エタノール １１２．５±２．５
３ ８０％エタノール １０２．５±７．２
【００７６】
表６に示すように、土貝母抽出物は、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００７７】
〔試験例６〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
製造例１で得られた土貝母抽出物（試料１〜３）について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
【００７８】
正常ヒト皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭで試料を溶解した試料溶液（試料濃度：３．１２５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに２００μＬ添加し、３日間培養した。
【００７９】
表皮角化細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに２００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定された各吸光度から、下記の式により表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００８０】
表皮角化細胞増殖促進率(％)＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
ただし、上記式において、Ｓｔは「試料溶液添加時の吸光度」を、Ｃｔは「試料溶液無添加時の吸光度」を示す。
上記試験の結果を、表７に示す。
【００８１】
［表７］
試 料 抽出溶媒 表皮角化細胞増殖促進率（％）
１ 水 １１５．７±３．６
２ ５０％エタノール １２２．２±０．８
３ ８０％エタノール １１１．６±５．１
【００８２】
表７に示すように、土貝母からの抽出物は、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤及びＴＮＦ−α産生促進剤は、悪性腫瘍細胞の増殖の抑制に、本発明の抗炎症剤は、炎症性疾患等の予防、治療又は改善に、本発明の抗老化剤は、皮膚の老化症状等の予防、治療又は改善に有用である。
【出願人】 【識別番号】５９１０８２４２１
【氏名又は名称】丸善製薬株式会社
【住所又は居所】広島県尾道市向東町１４７０３番地の１０
【出願日】 平成１６年８月２３日（２００４．８．２３）
【代理人】 【識別番号】１００１０８８３３
【弁理士】
【氏名又は名称】早川 裕司

【識別番号】１００１１２８３０
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 啓靖
【公開番号】 特開２００６−５６８５４（Ｐ２００６−５６８５４Ａ）
【公開日】 平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願番号】 特願２００４−２４３００１（Ｐ２００４−２４３００１）