リパーゼ阻害剤

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【発明の名称】	リパーゼ阻害剤
【発明者】	【氏名】中井正晃【氏名】福井祐子【氏名】浅見純生
【要約】	【課題】茶またはTellima grandifloraより分取したガロタンニン、エラジタンニン成分を含むリパーゼ阻害剤および該阻害剤を添加した飲食料、医薬品を提供する。【解決手段】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉ：
【化１】

（式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃はそれぞれ独立してＨまたは没食子酸残基であり、Ｒ₄およびＲ₅はＨまたは没食子酸残基であるか、またはＲ₄とＲ₅は一緒になって次式：
【化２】

で表されるHHDP基を形成するが、
但し、Ｒ₁ないしＲ₅の少なくとも二つは没食子酸残基であるか、あるいはＲ₁、Ｒ₂およびＲ₃が全てＨであるときはＲ₄とＲ₅は一緒になってHHDP基を形成するものとする）
で表される化合物の少なくとも一種を含むリパーゼ阻害剤。
【請求項２】
式Ｉにおいて、Ｒ₁ないしＲ₅のうち少なくとも三つはＨでない化合物を含む請求項1記載のリパーゼ阻害剤。
【請求項３】
式Ｉにおいて、Ｒ₁ないしＲ₅のうち少なくとも四つはＨでない化合物を含む請求項1記載のリパーゼ阻害剤。
【請求項４】
式Ｉにおいて、Ｒ₁ないしＲ₅の全てがＨでない化合物を含む請求項1記載のリパーゼ阻害剤。
【請求項５】
式Ｉにおいて、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃の全てが没食子酸残基であり、Ｒ₄とＲ₅は一緒になってHHDP基を形成する化合物を含む請求項1記載のリパーゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項記載のリパーゼ阻害剤を添加した飲食料。
【請求項７】
飲食料が、茶飲料、清涼飲料および健康食品からなる群から選択される、請求項６記載の飲食料。
【請求項８】
請求項１ないし５のいずれか１項記載のリパーゼ阻害剤を含有する医薬組成物。
【請求項９】
食事由来の脂肪の吸収を抑制するための、請求項８記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】【発明の分野】
【０００１】
本発明は、茶葉およびTellima grandifloraより分取したガロタンニン、エラジタンニン成分からなるリパーゼ活性阻害剤を提供する。
【従来の技術】
【０００２】
近年、日本人の生活様式の欧米化に伴い、高脂肪食の摂取が増加の一途をたどっている。平成11年国民栄養調査によると、エネルギー摂取量は年々減少しているにもかかわらず、その脂質エネルギー比は適正比率である25%を超え、中性脂肪値やコレステロール値が高い人の割合は60歳以上で5～6割に認められたとの報告がある（厚生労働省平成11年国民栄養調査結果の概要臨床栄養 2001; 98(5): 577-588）。
【０００３】
肥満は現代社会における最も重大な疾患の1つであるが、その主たる要因は脂肪の過剰摂取である。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等を発症させることが知られている。この肥満に対する治療薬として、国内では、食欲抑制剤のマジンドール(登録商標)が唯一承認されているが、口渇、便秘、胃部不快感、悪心・嘔吐等の副作用が報告されている（臨床評価 1985; 13(2): 419-459、臨床評価 1985; 13(2): 461-515）。また、海外においては、リパーゼ阻害活性により腸管からの脂肪吸収の抑制作用を持つゼニカル(登録商標)が肥満改善薬として市販されているが、やはり脂肪便、排便数の増加、軟便、下痢、腹痛等の副作用が報告され、必ずしも安全とは言いがたい（Lancet 1998; 352: 67-172）。
【０００４】
肥満を予防するためには、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効な手段ではあるものの、しっかりとした栄養指導を受けなければならず、日常生活においての実行は困難である場合が多い。そこで、食事由来の脂肪が体内に吸収されることを安全かつ健康的に抑制することは、肥満及びそれに関連する疾患の治療あるいは健康増進の目的で、現実的で有用な方策であると考えられる。
【０００５】
このような背景のもと、安全でかつヒトに対する有効性が証明されている特定保健用食品の開発が注目されている。今までに食後の血清中性脂肪値の上昇を抑える食品素材としては、膵リパーゼ阻害により脂肪吸収を抑制するグロビン蛋白分解物（J. Nutr. 1988; 128: 56-60、日本臨床・食糧学会誌 1999; 52(2): 71-77、健康・栄養食品研究 2002; 5(3): 131-144）、トリアシルグリセロールとは異なる消化吸収特性を持つジアシルグリセロール（J. Am. Coll. Nutr. 2000; 19(6): 789-796、Clin. Chim. Acta. 2001; 11(2): 109-117）、魚油より精製されたエイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）などが特定保健用食品として発売されている。
【０００６】
植物由来のリパーゼ阻害活性物質も最近注目されつつあり、特に、リパーゼ阻害活性を有するポリフェノール類に関しては、植物樹皮由来のタンニン（特公昭60-11912）、マメ科植物カワラケツメイに含まれるタンニン類やフラボノイド類およびその配糖体(特開平8-259557)、緑茶中の主要な成分エピガロカテキンガレートおよびエピカテキンガレートを配合した脂質吸収抑制食品（特開平3-228664）、ピーマン、シメジ、かぼちゃ、まいたけ、ひじき、緑茶、ウーロン茶、などの水抽出物からなるリパーゼ阻害剤（特開平3-219872）、フラボンおよびフラボノール類（特開平7-61927）ヒドロキシ安息香酸類（没食子酸）（特開平1-102022）、トリテルペン類化合物およびその誘導体（特開平9-40689）、タマリンドのプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤（特開平9-291039）などが報告されており、またブドウ種子抽出物のリパーゼ阻害作用(Nutrition 2003; 19(10): 876-879)、サラシア由来ポリフェノールによるリパーゼ阻害作用とラットの抗肥満作用(J. Nutr. 2002; 132: 1819-1824)、ウーロン茶抽出物によるマウスの抗肥満作用(Int. J. Obes. 1999; 23: 98-105)などが知られている。
【０００７】
しかしながら、上に示した既報の植物由来のリパーゼ阻害剤は、効果が十分なものとはいえない。例えば、ある植物の抽出物で効果があったとしても、その中に含まれる活性成分量を明確にしない限り、天然物が起源であるので、安定的にリパーゼ阻害活性を維持させることは困難である。また、嗜好性の低い植物由来の阻害剤の場合、飲食物として利用するには、香味に影響を及ぼすという問題がある。例えば、ウーロン茶の脂質改善効果を示した報告には、市販ウーロン茶を1日1330mlずつ6週間飲用させ、血中中性脂肪値の有意な低下が認められたとの報告（日本栄養・食糧学会誌 1991; 44(4): 251-259）や、単純性肥満症の男女102名を対照に、ウーロン茶（2g×4/日）を6週間連続経口摂取させた結果、67％の被験者に1kg以上の体重減少が認められ、さらに、血中中性脂肪値が高値を示した被験者においてウーロン茶摂取後に有意な改善効果が認められたとの報告（日本臨床栄養学会雑誌 1998; 20(1): 83-90）がある。このようにウーロン茶の大量飲用では効果が認められているものの、日常生活のなかで続けていくことは難しい。また、単純に濃縮したウーロン茶を提供したとしても、苦味・渋味が強く、カフェイン量も増えることより、現実的な方策として適当ではない。
【０００８】
一方、茶由来タンニンはその抗酸化活性が報告されており（Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003; 67(2): 396-401）、植物由来のタンニンとくにtellimagrandinは抗酸化活性(Phytochemistry 1993; 33(3): 557-561)のみでなく、抗菌性（Microbiol. Immunol. 2004,; 48(1): 67-73）抗がん性（Toxicology Letters 2004; 147(2): 109-119）、サイトカイン放出調節剤（特表2004-510688）などの機能が報告されている。
【特許文献１】特公昭60-11912
【特許文献２】特開平8-259557
【特許文献３】特開平3-228664
【特許文献４】特開平3-219872
【特許文献５】特開平7-61927
【特許文献６】特開平1-102022
【特許文献７】特開平9-40689
【特許文献８】特開平9-291039
【特許文献９】特表2004-510688
【非特許文献１】厚生労働省平成11年国民栄養調査結果の概要
【非特許文献２】臨床栄養 2001; 98(5): 577-588
【非特許文献３】臨床評価 1985; 13(2): 419-459
【非特許文献４】臨床評価 1985; 13(2): 461-515
【非特許文献５】Lancet 1998; 352: 67-172
【非特許文献６】J. Nutr. 1988; 128: 56-60
【非特許文献７】日本臨床・食糧学会誌 1999; 52(2): 71-77
【非特許文献８】健康・栄養食品研究 2002; 5(3): 131-144
【非特許文献９】J. Am. Coll. Nutr. 2000; 19(6): 789-796
【非特許文献１０】Clin. Chim. Acta. 2001; 11(2): 109-117
【非特許文献１１】Nutrition 2003; 19(10): 876-879
【非特許文献１２】J. Nutr. 2002; 132: 1819-1824
【非特許文献１３】Int. J. Obes. 1999; 23: 98-105
【非特許文献１４】日本栄養・食糧学会誌 1991; 44(4): 251-259
【非特許文献１５】日本臨床栄養学会雑誌 1998; 20(1): 83-90
【非特許文献１６】Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003; 67(2): 396-401
【非特許文献１７】Phytochemistry 1993; 33(3): 557-561
【非特許文献１８】Microbiol. Immunol. 2004; 48(1): 67-73
【非特許文献１９】Toxicology Letters 2004; 147(2): 109-119
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、植物に含まれる種々のポリフェノール成分に着目し、茶葉およびTellima grandiflorより分取したガロタンニン、エラジタンニン成分の少なくとも一種を含むリパーゼ阻害剤を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、上記リパーゼ阻害剤が添加され、香味を損なうことなく、嗜好性が高くて、かつ血中の中性脂肪低減、健康増進を目的とした飲食料を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、上記リパーゼ阻害剤を含み、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の上昇を抑える医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決する手段として、茶およびTellima grandifloraより脂肪吸収に必須な膵リパーゼを阻害する成分を見出し、そこに存在する種々のポリフェノールのリパーゼ阻害活性を評価し、没食子酸を分子内に複数持つ化合物に強いリパーゼ阻害活性があることを突き止めた。
【００１３】
より具体的には、本発明のリパーゼ阻害剤は、次式Ｉ：
【００１４】
【化３】

【００１５】
（式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃はそれぞれ独立してＨまたは没食子酸残基であり、Ｒ₄およびＲ₅はＨまたは没食子酸残基であるか、またはＲ₄とＲ₅は一緒になって次式：
【００１６】
【化４】

【００１７】
で表されるHHDP基を形成するが、
但し、Ｒ₁ないしＲ₅の少なくとも二つは没食子酸残基であるか、あるいはＲ₁、Ｒ₂およびＲ₃が全てＨであるときはＲ₄とＲ₅は一緒になってHHDP基を形成するものとする）
で表される化合物の少なくとも一種を有効成分とする。なお、本明細書中で、没食子酸残基とはカルボキシル基からＯＨがとれた没食子酸の残基を意味する。
【００１８】
好ましい有効成分は、式Ｉにおいて、Ｒ₁ないしＲ₅のうち少なくとも三つはＨでない化合物である。
【００１９】
より好ましい有効成分は、式Ｉにおいて、Ｒ₁ないしＲ₅のうち少なくとも四つはＨでない化合物である。
【００２０】
より一層好ましい有効成分は、式Ｉにおいて、Ｒ₁ないしＲ₅の全てがＨでない化合物、例えばＲ₁、Ｒ₂およびＲ₃の全てが没食子酸残基であり、Ｒ₄とＲ₅は一緒になってHHDP基を形成する化合物（化合物８）である。
【００２１】
本発明のリパーゼ阻害剤に含まれる具体的化合物の例として、図１に示す化合物があげられる。
リパーゼ阻害剤
本発明のリパーゼ阻害活性化合物は、他の成分を含まずに単独でリパーゼ阻害剤として使用することもでき、または溶媒や固体担体とともにリパーゼ阻害剤として使用することが可能である。溶媒または担体は、下記飲食料および／または医薬品としての使用を考えて、食品としてまたは医薬品として安全に使用できるものであることが好ましい。本発明のリパーゼ阻害剤は種々の用途を有し、例えば試験研究用、中性脂肪の蓄積を予防するための食品、医薬品の有効成分としての使用が例示される。
リパーゼ阻害活性測定方法
本発明のリパーゼ阻害剤は、リパーゼ、特に膵リパーゼに対する強い阻害作用を有する。その阻害活性は、実施例１に具体的に記載する方法で測定できる。
リパーゼ阻害剤含有飲食料
本発明のリパーゼ阻害剤を、飲食料に添加して、食事からの脂肪分の摂取に伴う血中中性脂肪の望ましくない上昇を防止し、および／または上昇した血中中性脂肪を低減させることができる。飲食料の好ましい例は、日常的に摂取する飲食料、例えば、緑茶、麦茶、ウーロン茶、紅茶、コーヒー、スポーツドリンク、飲料水、調味料、ドレッシングである。しかし飲食料は、通常食するものであればよく、清涼飲料、カクテル、ビール、ウイスキー、焼酎、ワイン、清酒、調味料、ドレッシング、味付け米、加工食品、インスタント食品、レトルト食品、チョコレート、生クリーム、洋菓子、乳製品、健康食品、サプリメント等であってもよい。
【００２２】
飲食料に対する本発明のリパーゼ阻害剤の添加量は、１食あたりの有効成分の摂取量が0.1mg～10gとなるよう添加する。ただし、本発明のリパーゼ阻害剤は、食品に由来するため、安全性が非常に高く、飲食料に対する添加量に実質的上限はない。
リパーゼ阻害剤含有医薬品
本発明のリパーゼ阻害剤は、食事由来の脂肪の吸収を抑制し、血中中性脂肪の望ましくない上昇を防止および／または低下させるための薬剤の有効成分としても使用できる。好ましい薬剤は、経口投与される薬剤であり、その例として、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、キャンデー、ドロップ剤等があげられる。薬剤に含まれる本発明のリパーゼ阻害剤の量は、１回服用量当たり、0.1mg～10gである。
【００２３】
本発明の医薬品は、リパーゼ阻害成分の安全性が高いため、長期間にわたって服用しても安全である。したがって、生活習慣病としての肥満の防止または解消のために、日常的に服用することも可能である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、茶葉およびTellima grandifloraに由来するガロタンニンおよびエラジタンニン成分の少なくとも一種を含むリパーゼ阻害剤を添加し、香味を損なうことなく、嗜好性の高くて、かつ中性脂肪低減、健康増進を目的とした飲食料が提供できる。食事性脂肪の吸収を抑えるためには、食事とともに摂取することが望ましく、茶から得られた有効成分を強化した飲料は意義が大きい。特に、これらの成分を増強する事により、抗肥満作用、健康増進を目的とした飲料の提供が可能になった。
【実施例】
【００２５】
実施例１リパーゼ阻害活性の測定
リパーゼ活性の測定は、基質に蛍光性の４－メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（4-UMO）を使用し、反応によって生成した４－メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施した。
【００２６】
測定にあたり、緩衝液は、150 mM NaCl、1.36mM CaCl₂を含む 13 mM Tris-HCl (pH 8.0) を用いた。基質である4-UMO（Sigma社製）は0.1MのDMSO溶液として調製したものを上記緩衝液で1000倍希釈したものを、また、リパーゼはブタ膵リパーゼ（Sigma社製）を同様に上記緩衝液を用い400U/ml溶液として調製したものを酵素測定に供した。
【００２７】
酵素反応は、25℃条件下において、96 穴マイクロプレートに50 μｌの4-UMO緩衝液溶液、25 μl の蒸留水（あるいは試料水溶液）を添加し混合した後に、25 μｌのリパーゼ緩衝液溶液を添加することにより開始させた。30分間反応を行った後に、100 μｌの0.1M クエン酸緩衝液（pH 4.2）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４－メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長355nm、蛍光波長460nm）を蛍光プレートリーダー（Labsystems社製 Fluoroskan Asent CF）を用い測定した。
【００２８】
被験試料の阻害活性は、対照（蒸留水）の活性に対して50%阻害を与える試料量 IC₅₀（μM）として求めた。
測定サンプル
Gallic acid (化合物1)はナカライテスクより購入した。化合物2,3,4、5は橋本らの論文（Chem.Pharm.Bull 1989; 37(12): 3255-3563、Chem.Pharm.Bull 1989; 37(1): 77-85）の方法によりウーロン茶から精製した（実施例2）。 1,2,4,6-tetragalloylglucose（化合物6）は実施例3の方法でCamellia ptilophyllaから精製した。Tellimagrandin類（化合物7,8）は実施例4の方法でTellima grandifloraから精製した。
実施例２ガロタンニン類2,3,4,5の精製
化合物2,3、5は橋本らの論文（Chem.Pharm.Bull 1989; 37(12), 3255-3563),の方法により精製した。以下に簡単にその方法を示す。ウーロン茶葉を80%アセトンにて抽出した後、アセトンを除去し、セファデックスLH-20（ファルマシア社製）にて水、メタノール、50%アセトンを用いて分画を行った。水-メタノール溶出画分をMCI-gel CHP-20P（三菱化学社製）で水-メタノール溶出を行った後再度、セファデックスLH-20（ファルマシア社製）に負荷し水溶出で化合物2および3を得た。水-メタノール溶出画分をセファデックスLH-20（ファルマシア社製）にて水-メタノール溶出後、Fuji gel ODS-G3（富士シリシア化学）で水-メタノール溶出後溶出を行い、化合物5を得た。
【００２９】
また化合物4は論文Chem.Pharm.Bull 1989; 37(1): 77-85の方法で次のようにして精製した。ウーロン茶葉を80%アセトンにて抽出した後、アセトンを除去し、セファデックスLH-20（ファルマシア社製）にて水、メタノール、50%アセトンを用いて分画を行った。メタノール溶出物をMCI-gel CHP-20P（三菱化学社製）で水-メタノール溶出を行った後、BondapakC18（ウォーターズ社製）で水メタノール溶出、さらにセファデックスLH-20（ファルマシア社製）でエタノール溶出を行い、化合物4を得た。
実施例３ 1,2,4,6-tetragalloylglucose（化合物6）の精製
Camellia ptilophyllaの葉（乾燥物）100gを2000mlの熱水（90℃）で4分間抽出し凍結乾燥したものを用いて以下のように精製を行った。凍結乾燥粉末の1%水溶液をSep-Pak C18 Cartridge (5 ml, ウォーターズ社製)に吸着させ、これを水洗浄した後、アセトニトリルにより溶出する画分を凍結乾燥した。この画分、250mgをDevelosil C30-UG-5 (20mm x 250mm、野村化学社製)に負荷し、0.05% TFA存在下、5-30%アセトニトリルの直線勾配（5ml/min、180min）において溶出させ、A280nmの吸収をモニターしながら分画した。得られた画分を次いでYMC-Pak ODS (20 x 250mm、ワイエムシー社製)に負荷し、0.1% TFA存在下、20-25%アセトニトリルの直線勾配（6ml/mim、60min）において溶出させ精製を行い、1,2,4,6-tetragalloylglucose (化合物6)を得た。
実施例４ Tellimagrandin類の精製
Phytochemistry; 1976 15: 211-214に準じて以下のように抽出精製を行った。Tellima grandifloraの葉100gを液体窒素中で粉砕し、1000mlの50％エタノールで抽出し、溶媒を溜去後、吸着樹脂HP-20（三菱化学社製）に負荷し水洗浄した後、アセトニトリルにより溶出する画分を凍結乾燥した。この画分をDevelosil ODS-UG-5 (50mm x 500mm、野村化学社製)に負荷し、0.05% TFA存在下、5-25%アセトニトリルの直線勾配（32ml/min、80min）において溶出させ、A260nmの吸収をモニターしながら分画し、Tellimagrandin1およびTellimagrandin2を得た。
実施例５リパーゼ阻害活性
茶由来のガロカテキン類およびtellimagrandin類（エラジタンニン）のリパーゼ阻害活性を表1に示した。構造活性相関を検討するため、IC₅₀値はμMで表記した。なお、図1には評価に供した化合物の化学構造式を記載した。
【００３０】
これらのタンニンのなかでリパーゼ阻害活性を示したものは、没食子酸が糖に3分子以上結合している化合物（化合物4,6）およびHHDP基が結合したエラジタンニン類（化合物5,7,8）であった。没食子酸や没食子酸を1分子しか持たない配糖体は活性が無かった。没食子酸が多くなるほどリパーゼ阻害活性が強くなる事から活性発現には分子内の少なくとも二つのガレート基の存在が必要であることが判明した。
【００３１】
【表１】

【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例５でリパーゼ阻害活性の評価に供した化合物の化学構造式を示す。

【出願人】	【識別番号】０００００１９０４【氏名又は名称】サントリー株式会社
【出願日】	平成１６年８月２３日（２００４．８．２３）
【代理人】	【識別番号】１０００８９７０５【弁理士】【氏名又は名称】社本一夫【識別番号】１０００７６６９１【弁理士】【氏名又は名称】増井忠弐【識別番号】１０００７５２７０【弁理士】【氏名又は名称】小林泰【識別番号】１０００８０１３７【弁理士】【氏名又は名称】千葉昭男【識別番号】１０００９６０１３【弁理士】【氏名又は名称】富田博行【識別番号】１０００９２８８６【弁理士】【氏名又は名称】村上清
【公開番号】	特開２００６－５６８５０（Ｐ２００６－５６８５０Ａ）
【公開日】	平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願番号】	特願２００４－２４２６６６（Ｐ２００４－２４２６６６）