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【発明の名称】 ポリフェノール含有生成物の製造方法、ポリフェノール含有生成物、α−アミラーゼ阻害剤、抗酸化剤および食用組成物
【発明者】 【氏名】吉田 英生
【住所又は居所】岡山県赤磐郡熊山町徳富３６３番地 備前化成株式会社内

【氏名】羽田 尚彦
【住所又は居所】岡山県赤磐郡熊山町徳富３６３番地 備前化成株式会社内
【要約】 【課題】天然物から簡便な操作で高収量で得られ、しかも有用な生理活性を有するポリフェノール含有生成物を提供する。

【解決手段】グァバ葉を原料とし、濃度３０〜８０重量％の含水有機溶剤を溶出溶媒とし、クロマトグラフィーによってポリフェノール含有画分を溶出させることによって、ポリフェノールを精製する。好ましくは、クロマトグラフィーが疎水クロマトグラフィーであり、また、含水有機溶剤が、エタノール、メタノールおよびアセトンからなる群より選ばれた一種以上の溶剤である。また、好ましくは、グァバ葉から水または含水有機溶剤によって抽出された抽出物の水溶液をクロマトグラフィーに吸着させ、次いで含水有機溶剤によって抽出する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グァバ葉を原料とし、濃度３０〜８０重量％の含水有機溶剤を溶出溶媒とし、クロマトグラフィーによってポリフェノール含有画分を溶出させることを特徴とする、ポリフェノール含有生成物の製造方法。
【請求項２】
前記クロマトグラフィーが疎水クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記含水有機溶剤が、エタノール、メタノールおよびアセトンからなる群より選ばれた一種以上の溶剤であることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記グァバ葉から得られた抽出物の溶液を前記クロマトグラフィーに吸着させ、次いで前記含水有機溶剤によって抽出することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つの請求項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一つの請求項に記載の方法によって精製されたことを特徴とする、ポリフェノール含有生成物。
【請求項６】
請求項５記載のポリフェノール含有生成物を有効成分とすることを特徴とする、α−アミラーゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項５記載のポリフェノール含有生成物を有効成分とすることを特徴とする、抗酸化剤。
【請求項８】
請求項５記載のポリフェノール含有生成物を有効成分とすることを特徴とする、食用組成物。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品（特に機能性食品）への利用が可能な有用な生理活性を有するポリフェノール含有生成物、その製造方法およびその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病、動脈硬化、癌などの生活習慣病患者が増加してきており、予防の観点から食事などが見直されてきている。α−アミラーゼの活性を阻害する物質が、糖尿病予防に有効とされ、例えば、月桂樹やグァバ（特許文献１、特許文献２）からの抽出生成物が開示されている。
【特許文献１】特許第２６７０７４２号公報
【特許文献２】再公表ＷＯ０１／０６６７１４号公報
【０００３】
また、抗酸化活性を有する物質は、活性酸素およびフリーラジカルの増加を抑え、動脈硬化や癌など数多くの疾患の予防や、その他の物質の酸化を抑制する。抗酸化剤は、活性酸素消去物質として（特許文献３）、（特許文献４）、（特許文献５）など数多くある。
【特許文献３】特開平４−２０２１３８
【特許文献４】特開平６−１３５８４８
【特許文献５】特開平８−３５５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
最近は、生活習慣病など種々の疾病に対する予防、改善効果をもつものとして機能性食品が注目されている。機能性食品は、クロレラ、ローヤルゼリー、あるいはアガリクスなどといった天然成分を含み、この天然成分の生理活性により人の免疫力や自然治癒力などを高め、病気の予防・改善を図るものである。そこで、上述のα−アミラーゼ阻害活性および抗酸化活性を有する天然物由来のポリフェノールを、このような機能性食品へ適用することが考えられる。しかし、例えば特許文献２に記載のポリフェノールの精製方法は、各々のポリフェノールを単独に精製するものであるために、精製が比較的煩雑であり、時間がかかる上、収量も少なく、コストが高い。このため、機能性食品への利用は行われていなかった。また、これと同時に、得られたポリフェノールの効果を一層向上させることも求められている。
【０００５】
本発明の課題は、天然物から簡便な操作で高収量で得られ、しかも有用な生理活性を有するポリフェノール含有生成物を提供すること、およびその用途と製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の課題に鑑み研究を進めた結果、（１）製造条件を工夫することより、ポリフェノールを高収量かつ高純度に含有するポリフェノール含有物をグァバ葉から簡便な方法で製造し得ること、（２）得られたポリフェノール含有生成物はα−アミラーゼ阻害活性、抗酸化活性といった有用な生理活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、グァバ葉を原料とし、濃度３０〜８０重量％の含水有機溶剤を溶出溶媒とし、クロマトグラフィーによってポリフェノール含有画分を溶出させることを特徴とする、ポリフェノール含有生成物の製造方法に係るものである。
【０００８】
また、本発明は、前記方法によって製造されたことを特徴とする、ポリフェノール含有生成物に係るものである。
【０００９】
更に、本発明は、前記ポリフェノール含有生成物を有効成分とすることを特徴とする、α−アミラーゼ阻害剤、抗酸化剤、および食用組成物に係るものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ポリフェノールを高収量かつ高純度に含有するポリフェノール含有物をグァバ葉から簡便な方法で製造し得る。また、得られたポリフェノール含有物は、α−アミラーゼ阻害活性、抗酸化活性といった有用な生理活性を顕著に有する。この結果、グァバ葉からの生成物を機能食品用途に広範に利用する目処が立ったものであり、本発明の産業上の利用価値はきわめて大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
グァバ葉の由来や産地は特に限定されない。好ましくは、グァバ葉の乾燥物を裁断し、この乾燥物からクロマトグラフィーによって含水有機溶剤を用いてポリフェノール含有画分を溶出させる。
【００１２】
好適な実施形態においては、グァバ葉からいったん予備抽出物を得、この予備抽出物を溶媒に溶解し、この溶液を、含水有機溶剤を溶出溶媒とするクロマトグラフィーに供する。
【００１３】
ここで、グァバ葉から抽出物を得る予備抽出工程においては、抽出方法は特に限定されない。例えば抽出溶剤として、水、含水有機溶剤、水溶性有機溶剤を利用できる。このうち含水有機溶剤が、高濃度のポリフェノール含有画分を得るという観点から特に好ましい。
【００１４】
予備抽出工程において、含水有機溶剤あるいは水溶性有機溶剤として利用できる有機溶剤は、特に限定されないが、エタノール、メタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類が好ましく、エタノール、メタノール、アセトンが好ましく、エタノールが最も好ましい。また二種類以上の有機溶剤の混合物であってもよい。
【００１５】
予備抽出工程においては、含水有機溶剤における有機溶剤の重量比率（複数の有機溶剤を使用する場合にはその合計比率）は限定されないが、高濃度のポリフェノール含有画分を得るという観点からは３０重量％以上、８０重量％以下が好ましく、４０重量％以上、６０重量％以下とすることが更に好ましい。
【００１６】
予備抽出工程における抽出温度は特に限定されないが、ポリフェノール含有画分における有効成分の濃度を向上させるためには、４０℃以上が好ましい。また、温度の上限も特にないが、有効成分の濃度を向上させるという観点からは、例えば１３０℃以下とすることができ、更に好ましくは１００℃以下とする。また、含水有機溶剤によって還流抽出することが最も好ましい。
【００１７】
予備抽出段階における抽出時間は特に限定されないが、ポリフェノールの濃度を向上させるという観点からは、例えば３０分以上とすることが好ましい。また、長時間抽出しても有効成分の収量は必ずしも増加しないので、この観点からは、抽出時間を１８０分以下とすることが好ましい。
【００１８】
好適な実施形態においては、予備抽出工程において得られた予備抽出物を溶媒に溶解し、溶液を得る。この溶液をクロマトグラフィーを用いた本抽出工程に供する。
ここで、予備抽出物の溶解に使用する溶剤は、予備抽出物の溶解が可能であれば特に限定されないが、水、あるいは含水有機溶剤が好ましい。含水有機溶剤に使用可能な有機溶剤は、前述した予備抽出用の有機溶剤を例示できる。
【００１９】
本抽出工程において使用するクロマトグラフィーの種類は特に限定されない。例えば、予備抽出物をクロマトグラフィーの媒質に吸着させた後に、含水有機溶剤を用いてポリフェノール含有画分を溶出させることができる。しかし、好適な実施形態においては、予備抽出物をいったんクロマトグラフィーの媒質に吸着させた後、水を流して未吸着物を洗浄し、次いで含水有機溶剤を媒質に流してポリフェノール含有画分を溶出させる。
【００２０】
クロマトグラフィーの種類としては、いわゆるイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを例示できるが、疎水クロマトグラフィーが、高濃度のポリフェノール含有画分を得るという点で優れていることを見いだした。
【００２１】
こうした疎水クロマトグラフィーを構成する充填剤は特に限定されないが、合成樹脂として、ポリスチレン系合成吸着剤、就職ポリスチレン系合成吸着剤、メタクリル系合成吸着剤を例示できる。また合成樹脂を修飾する場合には修飾官能基としては臭素基を例示できる。商品名を例示すると、三菱化学株式会社製の「ダイヤイオンHP-20」が特に好ましい。
【００２２】
本発明では、クロマトグラフィーを用いた抽出時に溶出溶媒として含水有機溶剤を使用する。この含水有機溶剤を構成する有機溶剤の種類は特に限定されないが、エタノール、メタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類が好ましく、エタノール、メタノール、アセトンが好ましく、エタノールが最も好ましい。また二種類以上の有機溶剤の混合物であってもよい。
【００２３】
クロマトグラフィーを用いた抽出時には、含水有機溶剤における有機溶剤の重量比率（複数の有機溶剤を使用する場合にはその合計比率）は、３０重量％以上、８０重量％以下とする。これによって、抗酸化性あるいはα−アミラーゼ阻害活性の高いポリフェノール含有画分が得られる。この観点からは、含水有機溶剤における有機溶剤の重量比率は、４０重量％以上とすることが更に好ましく、また、６０重量％以下とすることが更に好ましい。
【００２４】
このようにして、本発明のポリフェノール含有生成物が得られる。このポリフェノール含有生成物のポリフェノール含有量は、好ましくは重量比３０重量％以上、さらに好ましくは５０重量％以上、最も好ましくは７０重量％以上である。なお、本発明のポリフェノール含有生成物には、ポリフェノールの他、残部は以下の成分が含有されていてよい。 食物繊維、タンパク質、糖質、ミネラル類（カルシウム、鉄、カリウム、マグネシウム、ナトリウム等）
【００２５】
本発明におけるクロマトグラフィーを用いた抽出方法は、上記方法に限定されるものではなく、種々の変更が可能である。例えば、最初に、アセトン、メタノール、エタノール等の有機溶剤を用いて抽出処理し、ついで、逆相吸着剤、イオン交換樹脂、合成吸着剤を用いたカラムクロマトグラフィーで、本発明にしたがって含水有機溶剤を用いて分画処理し、濃縮画分を採取し、目的物である本発明のポリフェノール含有生成物を調整することができる。
【００２６】
本発明のポリフェノール含有生成物は、α−アミラーゼ阻害活性、抗酸化活性といった有用な生理活性を有することから、α−アミラーゼ阻害剤、抗酸化剤として利用可能であり、特に機能性食品などに好適に用いることができる。
【００２７】
また、本発明のポリフェノール含有生成物は、抗酸化活性を有することから、あらゆる生活習慣病、例えば、動脈硬化症、ガン、高血圧、糖尿病、脳血管症、高脂血症、心筋梗塞などの予防を目的とする食品生成物（食品または食品添加物）としての利用も可能である。本発明品の食品および食品添加物の形態としては、固形食品、ゲル状食品、飲料などが挙げられ、具体的には打錠、カプセル錠、顆粒品などの健康食品タイプの形態や、パン、クッキー、飴、ゼリー、ヨーグルト、そば、ドリンク、お茶などの形態にする事ができる。
【００２８】
次に、本発明のポリフェノール含有生成物を配合してなる食品生成物について説明する。本発明のポリフェノール含有生成物は、必要に応じて精製した後、賦形剤などの添加剤と混合して例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤などの形態で製品化することができる。さらに本発明で得られるポリフェノール含有生成物は、味、臭いに特異な厭味がないことから、経口により摂取することが可能である。投与量は、通常、成人でポリフェノール含有生成物の重量として１日あたり２０ｍｇ以上〜６００ｍｇ以下を数回に分けて服用するのが適当である。そのため、本発明で得られるポリフェノール含有生成物それ自体、あるいは該ポリフェノール含有生成物を食品に配合、添加し提供することができる。
【００２９】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これら製剤中のポリフェノール含有生成物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には本発明の生成物の他に、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００３０】
ここに、結合剤としてデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を例としてあげることができる。流動性促進剤では、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等を例としてあげることができる。また、ポリフェノール含有生成物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。
【００３１】
本発明のポリフェノール含有生成物の好適な態様は食用生成物である。すなわち、前述のようにして得られるポリフェノール含有生成物は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。
【００３２】
これらの食品類あるいは食用組成物における本発明のポリフェノール含有生成物の配合量は、当該食品や生成物の種類や状態等により一律に規定しがたいが、約０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％である。配合量が０．０１重量％未満では経口摂取による所望の効果が小さく、５０重量％を超えると食品の種類によっては風味を損なったり当該食品を調製できなくなる場合がある。なお、本発明のポリフェノール含有生成物は、これをそのまま食用に供してもさしつかえない。
【実施例】
【００３３】
（本発明のグァバ葉ポリフェノール含有生成物（画分）の精製）
（予備抽出工程）
原料のグァバ葉からポリフェノール含有生成物を精製した。まず、グァバ葉の乾燥物１００ｇを細断後、１０００ｍｌの５０％含水エタノールを加え、還流下、６０℃で２回抽出行った。抽出液はろ過後、減圧下で濃縮を行い、グァバ葉からの予備抽出物２１ｇを得た。この予備抽出物を比較例とする。
【００３４】
（本抽出工程）
次に、得られた予備抽出物を水に溶解した。得られた水溶液を疎水クロマトグラフィー用樹脂１５０ｍｌ（「ダイヤイオンＨＰ−２０」三菱化学株式会社製）に注入した。その後、水で未吸着物質を洗浄・除去し、５０％含水エタノールで溶出される画分Ｉ（実施例のポリフェノール含有生成物）を分画した。
グァバ葉予備抽出物（比較例）と、この画分Ｉ（ポリフェノール含有生成物）とについて、フォーリン・デニス法によりポリフェノール含量を解析した。その結果、ポリフェノール含量は、比較例の抽出物が４２％、画分Ｉが８０％であった。
【００３５】
（実施例および比較例の抽出物のα−アミラーゼ阻害活性）
上記方法により得られた実施例および比較例の各ポリフェノール含有生成物のα−アミラーゼ阻害活性を調べた。
α−アミラーゼ酵素に対する阻害作用の測定は、常法により行った。すなわち、α―アミラーゼはヒト唾液由来の酵素を用い、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した。基質にはでんぷん(溶性)を用い、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５）で０．５％溶液に調製した。反応は酵素、基質溶液、緩衝液、試験溶液または対照となる水を混合し、３７℃で１５分間行った。反応後、１．７ｍＭヨウ化カリウム／０．１７ｍＭヨウ素／１．７ｍＭ塩酸溶液を添加し、ヨウ素により着色した未分解のデンプン量を吸光度（Ａｂｓ．７００ｎｍ）測定した。阻害活性は、阻害率（％）のグラフより、酵素活性を５０％阻害する時の試料濃度を算出し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で表した。得られた結果を表1に示す。
【００３６】
【表１】


【００３７】
実施例の画分Ｉの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、８．８２μｇ／ｍｌであった。一方、比較例の予備抽出物の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、２３．８μｇ／ｍｌであった。即ち、α−アミラーゼ阻害活性に約２．７倍の差があった。実施例および比較例の抽出物におけるポリフェノール含量の比率は約１．９倍である。したがって、実施例の抽出物は、単にポリフェノール含量が高いというだけでなく、α−アミラーゼ阻害活性に優れたポリフェノール成分が顕著に濃縮されていることがわかる。
【００３８】
（実施例および比較例のポリフェノール含有生成物の抗酸化活性）
抗酸化活性の測定は、ＤＰＰＨラジカル消去能試験により行った。すなわち、実施例および比較例の各試料を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）：エタノール＝１：１の混液に溶かし、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジン）／エタノールを加え、室温で放置した。３０分後、ＤＰＰＨの色の減衰（消去量）を、吸光度（Ａｂｓ．５１７ｎｍ）測定した。得られた結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】


【００４０】
表２からわかるように、実施例の抽出物は、比較例に比べて、低濃度でも高いラジカル消去率を示すことが確認された。
【００４１】
以上のように、本発明のポリフェノール含有生成物は、α−アミラーゼ阻害活性、抗酸化活性といった有用な生理活性を有することから、α−アミラーゼ阻害剤、抗酸化剤として利用可能であり、特に機能性食品などに好適に用いることができるほか、前述したとおり、他の食用組成物（食品又は食品添加物）としても利用できるものである。
【出願人】 【識別番号】３９１００７３５６
【氏名又は名称】備前化成株式会社
【住所又は居所】岡山県赤磐郡熊山町徳富３６３番地
【出願日】 平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【代理人】 【識別番号】１０００９７４９０
【弁理士】
【氏名又は名称】細田 益稔

【識別番号】１０００９７５０４
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 純雄
【公開番号】 特開２００６−５６７９３（Ｐ２００６−５６７９３Ａ）
【公開日】 平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願番号】 特願２００４−２３７９０６（Ｐ２００４−２３７９０６）