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【発明の名称】 医用ポリフェノール溶液
【発明者】 【氏名】玄 丞烋

【氏名】松村 和明

【氏名】北住 典明
【要約】 【課題】ポリフェノールを有効成分として含む、細胞保存剤、組織保存剤、臓器保存剤、蛋白質複合体形成剤などにおいて、ポリフェノールの分解、沈殿の発生、溶液の変色、または過酸化水素の発生を抑制することができるものを提供する。

【解決手段】０．００２５〜０．０５重量％（２．５〜５００ｐｐｍ）の高純度のエピガロカテキンガレートと、０．００１〜０．０２重量％（１０〜２００ｐｐｍ）のアスコルビン酸又はアスコルビン酸金属塩と、０．００１〜０．０２重量％（１０〜２００ｐｐｍ）の二亜硫酸カリウムとを含む。好ましくは、アスコルビン酸の亜鉛塩を用いる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノールと、０．０００１〜０．０５重量％のアスコルビン酸又はアスコルビン酸金属塩とを含有することを特徴とする医用ポリフェノール溶液。
【請求項２】
ポリフェノールが、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）である請求項１に記載の医用ポリフェノール溶液。
【請求項３】
ポリフェノールの濃度が、０．００１〜０．１重量％である請求項１又は２に記載の医用ポリフェノール溶液。
【請求項４】
二亜硫酸カリウムを含有する請求項１〜３のいずれかに記載の医用ポリフェノール溶液。
【請求項５】
亜鉛、マグネシウム、銅、及び鉄などの金属イオンを含有する請求項１〜３のいずれかに記載の医用ポリフェノール溶液。
【請求項６】
細胞保存剤、組織保存剤、臓器保存剤、蛋白質複合体形成剤、遺伝子複合体形成剤、細胞接着抑制剤、又は免疫寛容剤である請求項１〜４のいずれかに記載の医用ポリフェノール溶液。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノールを有効成分とし、臓器保存剤、組織保存剤などとして使用可能な医用ポリフェノール溶液に属する。
【背景技術】
【０００２】
近年の外科手術技術の進歩に伴って、臓器移植の症例が増加している。臓器移植においては、臓器提供者（ドナー）から摘出された臓器が直ちに受容者（レシピエント）に移植されるのが理想的ではあるが、必ずしも直ちに移植手術されるとは限らない。そのため、摘出された貴重な臓器を如何に保存するかが極めて重要である。特に、虚血及び再灌流等によってフリーラジカルが発生すること、及びフリーラジカルに起因して生体膜の脂質に過酸化が生じることが保存の際に問題となる。
【０００３】
そこで、ポリフェノールを含む溶液からなる臓器保存剤が提案されている。ポリフェノールとは、同一分子内に複数のフェノール性水酸基をもち生理活性を有する植物成分であり、植物の葉、樹皮、果皮、種子等から抽出されるか、または同一の構造の化合物が合成されて得られる。ポリフェノールは抗酸化作用等の生理活性を有するので、フリーラジカルの発生及び生体膜の脂質過酸化を抑制する。その結果、ポリフェノールを含む臓器保存剤は、従来の凍結保存やＵＷ液(University of Wisconsin solution)による保存よりも優れた臓器保存効果を示す（特許文献１、特許文献２参照）。
【０００４】
さらに、ポリフェノールを含む溶液は、臓器保存剤以外にも、蛋白質複合体形成剤や遺伝子複合体形成剤などとして、医用目的に有用であることが知られている（特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２０００−３４４６０２号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０１９６８０号公報
【特許文献３】特開２００２−２５５８１１号公報
【特許文献４】特開２００３−２６７８０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の医用ポリフェノール溶液では、ポリフェノールが分解しやすい。そのため、褐色化する、沈殿物が生じやすい、といった欠点があった。また、ポリフェノールの濃度が小さい領域では、ポリフェノール溶液による効果が安定しない場合があった。
【０００６】
高純度のエピガロカテキンガレートをポリフェノールとして使用することでポリフェノールの分解が緩和されるものの（特許文献４参照）、不十分である。例えば、イーグルスＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)培地中、エピガロカテキンガレート２００ppm（０．０２重量％）、３７℃の条件においては、エピガロカテキンガレートの保持時間は１０時間未満である。さらに、従来の医用ポリフェノール溶液では、人体に有害な過酸化水素が発生しやすいという問題がある。
【０００７】
本発明の課題は、ポリフェノールの分解、沈殿の発生、溶液の変色、及び過酸化水素の発生を抑制することができる医用ポリフェノール溶液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の医用ポリフェノール溶液は、ポリフェノールと、０．０００１〜０．０５重量％のアスコルビン酸又はアスコルビン酸金属塩とを含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の医用ポリフェノール溶液によると、ポリフェノールの分解が抑制され、また過酸化水素の発生が抑制される。従って、本発明の医用ポリフェノール溶液では、溶液の効果が長時間維持される。さらに、沈殿の発生、溶液の変色を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の医用ポリフェノール溶液において、アスコルビン酸としては、Ｌ−アスコルビン酸が望ましい。また、アスコルビン酸金属塩の金属としては、ナトリウムなどのアルカリ金属の他、例えば亜鉛、マグネシウム、銅、及び鉄などの遷移金属を使用することができる。特に亜鉛を用いた場合、ポリフェノールに対する安定化効果が大きい。
【００１１】
アスコルビン酸及びアスコルビン酸金属塩の濃度は、０．０００１〜０．０５重量％（１〜５００ppm）であるが、好ましい濃度は０．０００１〜０．０３重量％（１〜３００ppm）であり、より好ましい濃度は０．００１〜０．０２重量％（１０〜２００ppm）である。
【００１２】
本発明におけるポリフェノールについては、限定されない。カテキン類、タンニン類、プロアントシアニジン（Oligomeric proanthocyanidins）又はリスベラトロールが使用され得る。例えば、３，３，４，５，７−フラボペントールで知られるカテキンが好ましく、特に好ましいのは、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）である。エピガロカテキンガレートの純度は、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％以上である。
【００１３】
また、ポリフェノールは、例えば、茶、ワイン、チョコレート、サボテン、海藻、野菜（たまねぎ（最外部の黄褐色の皮）、アロエ抽出物パセリの葉、白色野菜など）、柑橘類（温州みかん、だいだい、ポンカンの皮、夏みかんの皮、グレープフルーツ、レモンなど）、リンゴなどの果実類、穀物（こうりゃん、大豆、そば、小麦など）、ダリアの花などの種々の食品・植物に多く含まれているので、茶抽出物、海草抽出物、果実抽出物、サボテン抽出物又はワイン抽出物などの抽出物でも良い。
【００１４】
例えば茶抽出物は、水、エタノール、酢酸エチルなどの溶剤を用いて茶の葉より抽出することで得られ、カテキン類を主成分とし、その中でもエピガロカテキンガレートを最も多く含む。また、得られた茶抽出物あるいは市販の茶抽出物から、クロロフィルの除去、さらにカラムクロマトグラフ法による精製をすることによって、高純度のエピガロカテキンガレートを得ることが可能である。
【００１５】
本発明において、ポリフェノールの濃度は、０．００１〜０．１重量％（１０〜１０００ppm）が好ましい。より好ましい濃度は０．００２５〜０．０５重量％（２５〜５００ppm）であり、特に好ましい濃度は０．００５〜０．０１重量％（５０〜１００ppm）である。
【００１６】
また、Ｌ−アスコルビン酸の安定性を高めるため、二亜硫酸カリウムなどの酸化防止剤が加えられても良い。二亜硫酸カリウムを添加する場合、添加量は、好ましくは０．０００１〜０．０５重量％（１〜５００ppm）であり、好ましくは０．０００１〜０．０３重量％（１〜３００ppm）、より好ましくは０．００１〜０．０２重量％（１０〜２００ppm）である。
【００１７】
また、Ｌ−アスコルビン酸または、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム等を用いる場合に、亜鉛、マグネシウム、銅、及び鉄などの遷移金属のイオンを塩化物等の形で添加することができる。例えば、Ｌ−アスコルビン酸に対して、１／１５０〜１／２のモル比となるように、金属塩を添加することができ、これにより、ポリフェノールに対する安定化効果をさらに高めることができる。
【００１８】
本発明の医用ポリフェノール溶液は、例えば、細胞保存剤、組織保存剤、臓器保存剤、蛋白質複合体形成剤、遺伝子複合体形成剤、細胞接着抑制剤、又は免疫寛容剤として使用することができる。
【００１９】
細胞保存剤として使用する場合、保存対象となる細胞には、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などがある。
【００２０】
組織保存剤として使用する場合、保存対象となる組織には、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などがある。
【００２１】
臓器保存剤として使用する場合、保存対象となる臓器には、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、さい帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などがある。ここで、臓器保存剤には心臓手術時に使用される心停止液も含まれる。
【００２２】
細胞保存剤、組織保存剤又は臓器保存剤のとき、細胞等の保存対象はどの生物由来でも良い。好ましくは哺乳動物由来の細胞、組織又臓器であり、より好ましくはヒトの細胞、組織又は臓器である。
【００２３】
蛋白質複合体形成剤として使用する場合、対象となる蛋白質には、動物性蛋白質、植物性蛋白質、核蛋白質、リポ蛋白質、金属製蛋白質などがある。
【００２４】
ポリフェノールと、アスコルビン酸またはアスコルビン酸金属塩とが溶解される液については、医用ポリフェノール溶液の用途に応じて適宜選択すると良い。例えば、イーグルスＭＥＭ等の各種培養液、ＰＢＳ（−）等のリン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水が挙げられる。また、ユーロコリンズ液（Euro-Collins液, Squifflet, J.P. et al., Transplant Proc., 13693, 1981）、ＵＷ液（University of Wisconsin, Wahlberg, J. A. et al., Transplantation, 43, 5-8, 1987）等の従来の臓器保存液でも良い。
【００２５】
本発明の医用ポリフェノール溶液には、用途に応じて抗酸化剤、安定化剤等の薬剤が適宜添加されても良い。そのような成分として、以下が挙げられる：
リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、ＳＯＤ、ビタミンＥまたはグルタチオン）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類、及び多糖類の化合物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、ポリオキシエチレン・ソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ(商標)）、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニック(pluronic、商標)）またはポリエチレングリコール）；血栓溶解剤；血管拡張剤；組織賦活化剤；カテコラミン；ＰＤＥＩＩ阻害剤；カルシウム拮抗剤；βブロッカー；ステロイド剤；脂肪酸エステル；抗炎症剤；抗アレルギー剤；抗ヒスタミン剤。
【実施例１】
【００２６】
医用ポリフェノール溶液の調製には、市販の緑茶抽出物（株式会社ファーマフーズ研究所製、「ＴＰ−６０」、エピガロカテキンガレート(ＥＧＣｇ)含量約６０重量％）を用いた。これは一般的な方法により緑茶の茶葉から抽出を行ったものである。
【００２７】
その緑茶抽出物１０００ｇに対して１リットルの水及び１リットルのエタノールを加え、１０〜３０分間加熱溶解した後、冷蔵庫内で放置した。２４時間後、沈殿の発生を確認してから、低温下で濾別し乾燥させた。これにてクロロフィルが除去された。
【００２８】
次に、(株)三菱化学のイオン交換樹脂「ダイヤイオン（DIAION; 登録商標）ＨＰ−２０」の低圧カラムに充填した後、エタノールの２０％水溶液を溶離液として、ＵＶでモニタリングしながらカラム分離を行った。これにより、純度８０重量％のエピガロカテキンガレートの画分が得られた。続いて、それを東ソー株式会社のゲル濾過クロマトグラフィー用カラムである「トヨパール(登録商標)ＨＷ−４０Ｃ」を用い、メタノールの４０％水溶液を溶離液として、カラム分離を行った。これにより、高純度のエピガロカテキンガレートの画分が得られた。
【００２９】
このようにして得られたエピガロカテキンガレート精製物について、高速液体クロマトグラフ装置（（株）島津製作所製、ＳＣＬ１０Ａ）、及びＯＤＳ(octa decyl silyl)カラム（（株）ＹＭＣの「Ｊ‘ｓｐｅｒｅ ＯＤＳ Ｍ−８０」、１５０mm×４．６mm内径）を用い、また、移動相として含リン酸メタノール水溶液（メタノール／０．０５％リン酸水溶液＝２０／８０）を用い、カラム温度３０℃、及び検出波長２８０nmの条件にて、分析した。その結果、エピガロカテキンガレート精製物の純度はおよそ９８重量％であった。
【００３０】
このようにして製造された精製エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）１０mg及びＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）１０mgを、５０mLのイーグルスＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium、Sigma-Aldrich, Inc）培地に添加して溶解させた。そして、それを４℃の温度条件下で密閉保存し、各々について２４、７２、１２０、１６８、２４０及び３６０時間後におけるエピガロカテキンガレート及びＬ−アスコルビン酸の残存量を、上記純度分析と同一の高速液体クロマトグラフ分析により調べた。また、比較のために、エピガロカテキンガレートのみを１０mg添加したもの、及びＬ−アスコルビン酸のみを１０mg添加したものを用意し、同様な方法で残存量を調べた。さらに、エピガロカテキンガレート１０mg及びＬ−アスコルビン酸１０mgとともに、二亜硫酸カリウム１０mgを添加したものについても、同様な方法で残存量を調べた。結果を表１及び図１〜４に示す。
【表１】


【００３１】
表１及び図１〜４に見られるように、エピガロカテキンガレートのみで保存した場合には、２４時間後にはエピガロカテキンガレートを検出することができなかった。それに対して、エピガロカテキンガレートをＬ−アスコルビン酸とともに保存した場合には、２４０時間後においてもエピガロカテキンガレートを検出することができた。さらに、二亜硫酸カリウムをＬ−アスコルビン酸とともに添加した場合には、３６０時間後においても大部分のエピガロカテキンガレートが残存していた。
【実施例２】
【００３２】
実施例１で用いたと同じ純度９８％のエピガロカテキンガレートを用意し、濃度が０、５０、７５及び１００ppmとなるように、５０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ（−）、ｐＨ７．４）中に溶解させた。次いで、これら各溶液に対して、Ｌ−アスコルビン酸を種々の濃度（０〜１０００ppm）で添加した。そして、６時間後における過酸化水素発生量をＦＯＸII法（５７０nm光検出）によって調べた。結果を図５に示す。
【００３３】
図５に見られるように、Ｌ−アスコルビン酸によって過酸化水素の発生量が抑制されることが分かった。Ｌ−アスコルビン酸の濃度１〜５００ppm、特には１０〜２００ppmにおいて過酸化水素の発生が顕著に抑制され、濃度２０ppmにおいて最も抑制された。すなわち、全く予想と異なり、少量だけ添加した際に優れた抑制効果が示された。Ｌ−アスコルビン酸の濃度は、少量すぎると長期に効果を持続できないため、過酸化水素の発生を長期にわたって抑制する観点から、２０〜２００ｐｐｍが特に好ましいと考えられる。
【実施例３】
【００３４】
Ｌ−アスコルビン酸に代えて、Ｌ−アスコルビン酸亜鉛塩を用いた。実施例１と同程度の結果が得られた。
【実施例４】
【００３５】
実施例１のＬ−アスコルビン酸に、更に０．０３ミリモルのZnCl2を添加した。
【００３６】
実施例１の結果より約１０％EGCgの安定性が増大した。すなわち、表１中、試験例１（図１に対応）と同様の条件で、０．０３ミリモルのZnCl2を添加した場合、Ｌ−アスコルビン酸がほぼ消滅するまでの時間が１０％以上増加し、これによりＥＧＣｇが５０％以上残存する時間が約１０％増大した。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】エピガロカテキンガレート及びＬ−アスコルビン酸の残存量を示すグラフ（１）である。
【図２】エピガロカテキンガレート及びＬ−アスコルビン酸の残存量を示すグラフ（２）である。ニ亜硫酸カリウム存在下での結果を示す。
【図３】エピガロカテキンガレートの残存量を示すグラフである。
【図４】Ｌ−アスコルビン酸の残存量を示すグラフである。
【図５】アスコルビン酸の過酸化水素抑制効果を示すグラフである。
【出願人】 【識別番号】５０３３６０１１５
【氏名又は名称】独立行政法人科学技術振興機構
【識別番号】５０４１３２２７２
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
【識別番号】５０３２４７２２９
【氏名又は名称】玄 丞烋
【出願日】 平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【代理人】 【識別番号】１０００５９２２５
【弁理士】
【氏名又は名称】蔦田 璋子

【識別番号】１０００７６３１４
【弁理士】
【氏名又は名称】蔦田 正人

【識別番号】１００１１２６１２
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 哲士

【識別番号】１００１１２６２３
【弁理士】
【氏名又は名称】富田 克幸

【識別番号】１００１２４７０７
【弁理士】
【氏名又は名称】夫 世進
【公開番号】 特開２００６−１８８４３６（Ｐ２００６−１８８４３６Ａ）
【公開日】 平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願番号】 特願２００４−３８１７７２（Ｐ２００４−３８１７７２）