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【発明の名称】 アトピー性皮膚炎モデルラット
【発明者】 【氏名】金子 涼輔

【氏名】加藤 めぐみ

【氏名】平林 敬浩

【氏名】八木 健

【氏名】平林 真澄
【要約】 【課題】アトピー性皮膚炎モデル動物として用いることのできるヒトのアトピー性皮膚炎類似の皮膚炎を呈するトランスジェニックラットを提供する。

【解決手段】ラットＴＥＲＴ遺伝子をＣＡＧプロモーター下に挿入した発現ユニットをラット受精卵に注入し、ヒトのアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎症状を発症する個体を調べたところ、このユニット導入によってラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422（特定の配列からなる）の領域が破壊されていた。即ち、ＴＥＲＴ遺伝子を含む発現ユニットを導入することにより、アトピー性皮膚炎の発症を制御する遺伝子が破壊され、ヒトのアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎症状を示すトランスジェニックラットを得た。本発明は、ラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422の領域の少なくとも一部が破壊されたラットである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422の領域の少なくとも一部が破壊されたラット。
【請求項２】
ラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422の領域にその少なくとも一部が存在する遺伝子の少なくとも一つが破壊され、ヒトのアトピー性皮膚炎類似の皮膚炎を呈するラット。
【請求項３】
前記ラットが、近交系動物ではない、遺伝的に多様性のあるクローズドコロニー系統のWistarラットである請求項１又は２のラット。
【請求項４】
プロモーターとテロメア伸長酵素遺伝子を含む発現ユニットをラットに導入し、ラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422の領域の少なくとも一部が破壊され、ヒトのアトピー性皮膚炎類似の皮膚炎を呈するラットを選択することから成るアトピー性皮膚炎モデルラットの製法。
【請求項５】
更に、選択された雄ラットを同様に選択された雌ラットと交配し、継代することから成る請求項４に記載の製法。
【請求項６】
前記ラットに、近交系動物ではない、遺伝的に多様性のあるクローズドコロニー系統のWistarラットを用いた請求項４又は５に記載の製法。
【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
この発明は、アトピー性皮膚炎モデル動物として用いることのできるヒトのアトピー性皮膚炎類似の皮膚炎を呈するトランスジェニックラットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎の病理異常やその原因を探求するためにはモデル動物の開発が重要である。このアトピー性皮膚炎の原因遺伝子は複数存在すると言われているが（非特許文献１）、その全てが明らかになっているわけではない。現在までに、既知の原因遺伝子をターゲットとして、いくつかのアトピー性皮膚炎モデル動物（マウス）が作られている（非特許文献２、３）。しかし、これら従来のモデルマウスの皮膚炎発症開始時期は成体になってからであり、ヒトのアトピー性皮膚炎の発症時期の大部分が幼少期であることから、臨床結果と合致しているとは必ずしもいえない。さらに従来のモデルマウスは近交系マウスを用いて作製されているため、未知の原因遺伝子探索等に有用な遺伝的多様性を欠く。
一方、近年アトピー性皮膚炎患者のＴ細胞においてテロメア伸長酵素（te1omerase reverse transcriptase, TERT）が活性化していることが報告されている（非特許文献４）。
【０００３】
【非特許文献１】松尾裕彰、森田栄伸（2003）細胞、35、pp. 4-7
【非特許文献２】向井香織ら（2003）細胞、35、pp. 21-24
【非特許文献３】堀川達弥ら（2003）細胞、35、pp. 25-28
【非特許文献４】Wu K. et al., (2000) J. Immunol., 165, 4742-4747
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、アトピー性皮膚炎の治療標的遺伝子の探索方法や治療薬開発方法に利用できるアトピー性皮膚炎モデル動物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、近年アトピー性皮膚炎患者のＴ細胞においてテロメア伸長酵素(ＴＥＲＴ)が活性化していることが報告されたことから（非特許文献４）、アトピー性皮膚炎の病理異常やその原因を探求するためにはモデル動物の開発を目的として、ＴＥＲＴを過剰発現するトランスジェニックラットを作製した。その結果、ヒトのアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎症状を発症するトランスジェニックラットを得ることができた。
具体的には、ラットＴＥＲＴ遺伝子をＣＡＧプロモーター下に挿入した発現ユニットを作製し、これをWistarラット受精卵に注入し、産仔を得た。このうちのＴｇからヒトのアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎症状を発症する個体を選択し、調べたところ、このユニット導入によってラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422（配列番号１）の領域が破壊されていた。このラットの皮膚炎は生後２週齢より観察され、ヒトのアトピー性皮膚炎で見られる所見と一致していた。
即ち、ＴＥＲＴ遺伝子を含む発現ユニットを導入することにより、アトピー性皮膚炎の発症を制御する遺伝子が破壊され、ヒトのアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎症状を示すトランスジェニックラットを得ることができた。
【０００６】
即ち、本発明は、ラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422の領域の少なくとも一部が破壊されたラットである。
また本発明は、ラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422の領域にその少なくとも一部が存在する遺伝子の少なくとも一つが破壊され、ヒトのアトピー性皮膚炎類似の皮膚炎を呈するラットである。この遺伝子は、その少なくとも一部がこの領域に存在していればよく、一つ又は複数であってもよい。本発明のラットにおいてはこの遺伝子の少なくとも一つが破壊されていればよい。
更に、本発明は、プロモーターとテロメア伸長酵素遺伝子を含む発現ユニットをラットに導入し、ラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422の領域の少なくとも一部が破壊され、ヒトのアトピー性皮膚炎類似の皮膚炎を呈するラットを選択することから成るアトピー性皮膚炎モデルラットの製法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のラットはヒトのアトピー性皮膚炎に類似した皮膚炎症状を発症するため、その皮膚炎部分の組織像は、表皮肥厚（毛包の外毛根鞘も肥厚）、不全角化、海綿状態、表皮内細胞浸潤（軽度であるが、主にリンパ球）を認め、湿疹の組織像に合致する。この湿疹は、真皮に著明な好酸球浸潤と中等度の肥満細胞浸潤が認められる。これらは、ヒトのアトピー性皮膚炎において観察される所見と一致している。さらに、ヒトのアトピー性皮膚炎においてしばしば観察される、血清IgE抗体量の増加やインターフェロンγ発現量の低下も認められ、さらには、掻痒行動の増加も観察される。以上の症状はヒトのアトピー性皮膚炎に酷似している。
【０００８】
これらに加えて、発症時期や病態の推移もヒトの場合に類似している。つまり、多くの場合、ヒトでは乳児期から小児期においてアトピー性皮膚炎を発症し、成人すると治癒する場合が多い。本発明のラットにおいても授乳期（生後１０日齢）から皮膚炎が認められ、成熟（生後８週齢）するにしたがい、その皮膚炎は軽減していく。
以上のことから、本発明のラットはヒトのアトピー性皮膚炎の優れたモデルとなると考えられる。すなわち、本発明はラットであるため同一個体から繰り返して採血等のサンプリングが可能であるのでアトピー性皮膚炎治療薬の開発を行う際に有効な薬効評価方法として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のアトピー性皮膚炎モデルラットを作出するために、プロモーターとテロメア伸長酵素遺伝子を含む発現ユニットを作製した。
プロモーターとしては、CAGプロモーター(cytomegarovirus enhancer、chicken beta-actin promoter, Gene 108, 193-199.)、EF-1α（Necleic Acids Research, 18, 5322 (1990)）などが挙げられ、好ましくはCAGプロモーターを用いる。
テロメア伸長酵素遺伝子は、ラットのテロメア伸長酵素遺伝子（AY539717, rat telomerase reverse transcriptase）が好ましいが、ラットのテロメア伸長酵素遺伝子と相同製の高いヒト（AB085628、Human telomerase reverse transcriptase）やマウス（NM_009354、Mouse telomerase reverse transcriptase (Tert)）のものを用いてもよい。
また、この発現ユニットには、適宜マーカー遺伝子、Ires、ネオマイシン耐性遺伝子
（E00425）等を加えてもよい。
マーカー遺伝子としては、GFP(U55761, クロンテック社のEGFP-1ベクター：632319）、LacZ（V00296、大腸菌ベーターカラクトシダーゼ）等を用いることができる。
後述の実施例では、CAGプロモーター下流にrTERT(AY539717) cDNAとtau(NM_174106)GFP cDNAをires配列を間に介して導入した発現ユニット（CAG-rTERT-ires-tauGFP）を調製した。このユニットは、テロメア伸長酵素と微少管結合型緑色蛍光タンパク質を哺乳類細胞で恒常的に強く発現する。
【００１０】
ラットとしては、体サイズがマウスよりも大きなラットであって、更に近交系動物ではない、遺伝的に多様性のあるクローズドコロニー系統のWistarラット、SDラット、Donryuラット等が好ましい。
【００１１】
このように構成した発現ユニットをラット受精卵へ注入し、その受精卵を仮親に移植し、産仔させる。この産仔の中からこの発現ユニットが導入された産仔を選別する。
この産仔を生育後、健常ラットと交配させ、得られた産仔にこの発現ユニットが導入されたことを確認し、さらに皮膚炎の発症を確認することにより、アトピー性皮膚炎モデルラットを得ることができる。
このアトピー性皮膚炎モデルラットは、この発現ユニットを保持する雄ラットをこの発現ユニットを保持する雌ラットと交配し、継代することにより系統維持できる。
【００１２】
得られたラットのゲノム中において、この発現ユニットの挿入により、ラット14番染色体上（14p21）の23273001〜23273422の領域（配列番号１）が破壊された。従って、この領域にアトピー性皮膚炎の発症を制御する遺伝子が存在する。ヒトではこの領域は４番染色体q13.2の68.8 Mb付近に相当する。

以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００１３】
（１）CAG-rTERT-ires-tauGFPプラスミドの調製
注入するCAG-rTERT-ires-tauGFPユニット（以下「発現ユニット」という。）を切り出してくるためのCAG-rTERT-ires-tauGFPプラスミドを下記の方法で調製した。まず、ラット精巣からTrizol試薬（Invitrogen）を用いてTotal RNAを調製した。これを用いて、Superscript III (Invitrogen)によって相補DNA（cDNA）を調製した。このcDNAを鋳型にして以下のプライマーを用いてPCRを行いラットテロメレース触媒サブユニット（rTERT）遺伝子をクローニングした。一方で、ires-tauGFP (Rodriguez, I., Feinstein, P. and Mombaerts, P. (1999) Cell, 97, 199-208.)を制限酵素（XhoIとXbaI）により消化し、Blunting Kit (TAKARA)を用いて平滑末端化した断片をpCAGGSプラスミド（Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J., (1991) Gene, 108, 193-9.）を制限酵素（EcoRI）処理した後、同様に平滑末端化したものにLigation Kit (TAKARA)を用いて、挿入（ライゲーション）した。次いで、このプラスミドをEcoRI処理し、上記のrTERT遺伝子のEcoRI処理断片を挿入し、CAG-rTERT-ires-tauGFPプラスミド（11 kb）を得た。
【００１４】
（２）発現ユニットの調製
注入する発現ユニットを下記の方法で調整した。即ち、CAG-rTERT-ires-tauGFPプラスミドを制限酵素（SalIとXhoI）により消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動を行い、ベクター部分を除去し直鎖状DNA断片を分離した。分離したDNA断片をQIAEX II (Qiagen社)を用いて回収し、精製して発現ユニットを得た。得られた発現ユニット（精製DNA）を5μg/mlとなるように注入用バッファー（0.1 mM EDTA を含む1 mM Tris-HCl, pH 7.5）に溶解した。尚、注入操作に使用するまで4℃で保存した。
【００１５】
（３）トランスジェニックラットの作出
既報（特願平7-15037号）に従い、上記のように調製したDNAをラット前核期受精卵へ注入した。即ち、８週齢のウィスター系雌ラットを明暗サイクル１２時間（明時間5:00〜17:00）、23±2℃、湿度５５±５%で飼育し、膣スメア法により雌の性周期を観察してホルモン日を選択した。雌ラットに１５０IU/kgの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（pregnant mare serum gonadotropin; PMSG：PMSゼンヤク、日本全薬社）を腹腔内投与して過剰排卵処理を行い、その４８時間後に７５IU/kgのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（プペローゲン(human chorionic gonadotropin; hCG)、三共臓器社）を投与した後、雄との同居により交配を行った。hCG投与３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養にはmKRB液（Yoshida Y and Chang M.C., (1974) J. Reprod. Fertil., 36, 9-22）を使用した。採取した受精卵を0.1%ヒアルロニダーゼ（Hyaluronidase H3606、シグマ社）を含むmKRB液で37℃、5分間の酵素処理を行い、卵丘細胞を除去した後、mKRB液で３回洗浄して酵素を除去し、DNA注入操作までCO2インキュベーター内（5% CO2-95% Air, 37℃、飽和湿度）に保存した。この様にして調製したウイスターラットの受精卵の雄性前核に、発現ユニットを注入した。323個の注入操作した卵を仮親に移植し、49匹の産仔を得た。離乳直後の尾より調製したDNAをPCR法により検定した。PCRのためのプライマーとして、EGFP-F: GTTCAGCGTGTCCGGCGA（配列番号２）及びEGFP-R: GCGGTCACGAACTCCAGC（配列番号３）を用いた。
【００１６】
この結果、トランスジェニックラットが４ライン(A〜D)得られた。
ラインAにおいては、１２週間の性成熟期間を経過した後、健常雌ウイスターラットと交配させたところ正常な生殖能を有しており、4腹の雌ラットから合計51匹の次世代（G1）ラットが得られた。このうち雄12匹雌15匹に導入遺伝子が確認された。すなわち、合計27匹のG1トランスジェニックラットが得られたが、皮膚炎を発症する個体と発症しない個体が見られた。
【００１７】
そこで皮膚炎を発症している雄と雌を選択して、同居させることにより交配させた。
皮膚炎を発症しているかどうかは、図１に示すように、脱毛、出血を伴う皮膚病変の有無で判断できる。
これらは正常な生殖能力を有しており、得られたG2世代の導入遺伝子を有するトランスジェニックラット18匹のうち12匹は皮膚炎を発症した。その一方、導入遺伝子を有していない野生型G2世代ラットはまったく皮膚炎を発症していなかった。次いで、皮膚炎を発症しているG2世代の雄と雌を交配させて得られたG3世代についても、導入遺伝子を有するトランスジェニックラット12匹中7匹は皮膚炎を発症した。
このようにして、皮膚炎を発症しているトランスジェニックラットの雄と雌を交配させることによって系統が維持される。
【００１８】
一方で、残りの３ライン（ラインB、C、D）においては皮膚炎を発症しなかった。このことは発現ユニットが導入されても、アトピー性皮膚炎になるわけではないことを示している。つまり、ラインAのアトピー性皮膚炎の発症には発現ユニットが関与しているのではなく、導入されたゲノム上の位置に存在する遺伝子が関与していることを示している。
【００１９】
そこで、上記ラインAのラットについて、ザザンブロッティング及びPCRによって１４番染色体に遺伝子が導入されたことを確認した。
（１）サザンブロッティング
ラットゲノムDNAを尾組織片から定法にしたがって抽出した。そのゲノムDNAを制限酵素SpeIで切断し、電気泳動に供した。その後、定法にしたがってメンブレンに転写し、プローブとしてラット１４番染色体の一部（配列番号４、394 bp）を用いてサザンブロッティングを行った。その結果を図２に示す。
3 kbにバンドが確認され、１４番染色体への導入が明らかになった。なお、野生型ゲノム由来のバンドは7.6kbに観察された。
【００２０】
（２）ＰＣＲ
ラットのゲノムDNAを定法にしたがって抽出し、これを鋳型として、プライマーとして
rChr14/19837：GTAACACAAGGTACAGAGTCC（配列番号５）及びCAG-AS2：GTTATGTAACGCGGAACTCC（配列番号６）を用いて、PCRを行った。その結果を図３に示す。
PCRにより、発現ユニットとこれが挿入されたラット１４番染色体との間が増幅される。具体的には導入遺伝子のCAGプロモーターの一部80bpと由来未知の51bp及びラット１４番染色体の23273423から23273855の433bpの合計564bpが増幅され、発現ユニットが１４番染色体へ導入されたことがわかる。なお、他の位置に挿入された場合あるいはいずれの場所にも導入されていない場合には、この増幅産物は観察されない。
また、DNA配列決定法により、このユニット導入によってラット１４番染色体14p21の23273001〜23273422（配列番号１）の領域が破壊されていることがわかった。上記発現ユニットにはアトピー性皮膚炎を引き起こす作用は無いため、この領域には一つ又は複数のアトピー性皮膚炎の発症を制御する遺伝子が存在していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のトランスジェニックラットを示す図である。Ｔｇは本発明のトランスジェニックラットを示し、脱毛、出血を伴う皮膚病変を示している。Ｗｔは野生型Wistarラットを示す。
【図２】ラットＤＮＡのサザンブロッティングを示す。プローブとしてラット１４番染色体の一部（配列番号４、394 bp）を用いた。Ｔｇは本発明のトランスジェニックラットを示し、Ｗｔは野生型Wistarラットを示す。
【図３】ラットＤＮＡのＰＣＲを示す図である。導入した発現ユニットにより破壊された付近を増幅した。waterは陰性対照を示す。
【出願人】 【識別番号】５０４２６１０７７
【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構
【出願日】 平成１６年１１月２日（２００４．１１．２）
【代理人】 【識別番号】１００１１０２４９
【弁理士】
【氏名又は名称】下田 昭

【識別番号】１００１１３０２２
【弁理士】
【氏名又は名称】赤尾 謙一郎
【公開番号】 特開２００６−１２９７１０（Ｐ２００６−１２９７１０Ａ）
【公開日】 平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【出願番号】 特願２００４−３１８９２１（Ｐ２００４−３１８９２１）