ＤＮＡ修復遺伝子が導入されたイネ科植物

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【発明の名称】	ＤＮＡ修復遺伝子が導入されたイネ科植物
【発明者】	【氏名】木村成介【氏名】坂口謙吾【氏名】石橋豊隆【氏名】古川智之
【要約】	【課題】植物、特にイネ科植物において、紫外線、化学物質あるいは放射線等による遺伝子損傷に対し、有効な耐性能が付加された植物を新たに提供する。【解決手段】遺伝子修復に関与する遺伝子の中で、特に、OsSEND－１遺伝子及び／又はOsUV-DDB2遺伝子を、植物に導入し、植物体内で強発現させる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子が挿入された組み換えベクターにより形質転換されていることを特徴とする、イネ科植物。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、若しくは該配列番号２に示されるアミノ酸配列において、一又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、一本鎖ＤＮＡに対しエンドヌクレアーゼ機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、一又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＤＮＡ損傷部位の認識機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子が挿入された組み換えベクターにより形質転換されていることを特徴とする、イネ科植物。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列、若しくは該配列番号３に示される塩基配列において、一又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された塩基配列を有し、かつ、一本鎖ＤＮＡに対してエンドヌクレアーゼ機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号６に示される塩基配列、若しくは配列番号６に示される塩基配列において、一又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加されたヌクレオチドを有し、かつ、ＤＮＡ損傷部位を認識する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項３】
イネ科植物が、培養細胞の形態である請求項１又は２に記載のイネ科植物。
【請求項４】
イネ科植物が、カルスの形態である請求項１又は２に記載のイネ科植物。
【請求項５】
イネ科植物が、種子の形態である請求項１又は２に記載のイネ科植物。

【発明の詳細な説明】【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ修復遺伝子が導入されたイネ科植物であって、紫外線あるいは化学物質等による遺伝子の損傷に対する耐性能を有する上記植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、オゾンホールの拡大等による紫外線量の増大、あるいは環境等への化学物質の放出等による、生物における遺伝子の損傷に対する懸念が広がっている。遺伝子の損傷は、ヒトを含む動物に対してガン発生要因になるが、これにとどまらず、植物への影響も見逃せないものがある。
【０００３】
すなわち、植物は動物等よりも、さらに長い時間紫外線等に晒され、また、そのような状態から逃れることができず、遺伝子の損傷による影響は、動物よりも植物の方がむしろ深刻といえる。特に、イネ科植物等の主要作物の遺伝子損傷による生育不全等に伴う収穫量の減少は、最近の地球人口の増大と合わせて、地球規模での重大な食糧危機を招く。
【０００４】
一方、生物には、もともと損傷した遺伝子を修復する能力を保持しているが、これらの能力も、ある一定以上の遺伝子損傷には対処できない。また、これらの遺伝子の修復に関与するタンパク質あるいはその遺伝子は極めて多数あり、その遺伝子修復機構は複雑である。
【０００５】
すなわち、遺伝子修復には多くの経路が存在し、非常に多くの蛋白質が関与している。例えば、光回復に関与するものとしてCPD photolyaseや(6-4)photolyaseがある。また、ヌクレオチド除去修復を行うものとして、XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPGのXP (xeroderma pigmentosum)群に属する蛋白質や、CSA (Cockayne syndrome, type A),CSB (Cockayne syndrome, type B), Rad23, UV-DDB1 (UV-dameged DNA binding protein 1), UV-DDB2 (UV-damaged DNA binding protein 2), TFIIH (Transcription Factor IIH), RPA (Replication Protein A), ERCC1 (excision repair complementing defective repair in Chinese hamster 1), PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigne), RFC (Replication Factor C), DNA polymerase delta, DNA polymerase epsilon, DNA ligase Iなどがある。
【０００６】
また、塩基除去修復を行うものとして、DNA glycosylaseやAP endonuclease, DNA polymerase beta, XRCC1, DNA ligase IIIなどがある。
また、二本鎖切断修復を行うものとして、Mrell (Meiotic recombination11), Rad50, Xrs2 (X-ray sensitive 2), DNA-PK (DNA dependent Protein Kinase), Ku70, Ku80, Xrcc4, DNA ligase IVなどが知られ、損傷乗り越えDNA複製経路を行うものとして、DNA polymerase zeta, DNA polymerase eta, DNA polymerase iota, DNA polymerase kappaが知られている。また、クロスリンク修復を行うものとしてSnmlなどがある。
しかし、植物、特に、イネ科植物においては、現在まで、これら遺伝子修復に関与する遺伝子を該植物に導入し、遺伝子損傷を有効に回復乃至低減させた例はない。
【０００７】
【非特許文献１】”高等植物のDNA修復機構”木村ら「生化学」2005年 77巻 pp113-123
【非特許文献２】Hays, J. B. DNA Repair (Amst) 2002, 1, 579-600.
【非特許文献３】Tuteja, N.；Singh, M. B.；Misra, M.K.；Bhalla, P. L.；Tuteja. R. Crit Rev Biochem Mol Biol 2001, 36, 337-97
【非特許文献４】Britt, A. B. Plant Physiol 1995, 108, 891-6
【非特許文献５】Vonarx, E. J.；Mitchell, H. L.；Karthikeyan, R.；Chatterjee, I.；Kunz, B. A. Mutat Res 1998, 400, 187-200
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の現状に鑑み、植物、特にイネ科植物において、紫外線、化学物質あるいは放射線等による遺伝子損傷に対し、有効な耐性能が付加された植物を新たに提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究の結果、遺伝子修復に関与する遺伝子の中で、特に、OsSEND-1遺伝子、及び／又はOsUV-DDB2遺伝子を、植物に導入し、植物体内で強発現させることにより、紫外線等による遺伝子損傷が抑制され、生育不良を有効に低減できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子が挿入された組み換えベクターにより形質転換されていることを特徴とする、イネ科植物。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、若しくは該配列番号２に示されるアミノ酸配列において、一又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、一本鎖ＤＮＡに対しエンドヌクレアーゼ機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、一又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＤＮＡ損傷部位の認識機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子が挿入された組み換えベクターにより形質転換されていることを特徴とする、イネ科植物。
（ａ）配列番号３に示される塩基配列、若しくは該配列番号３に示される塩基配列において、一又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された塩基配列を有し、かつ、一本鎖ＤＮＡに対しエンドヌクレアーゼ機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）配列番号６に示される塩基配列、若しくは配列番号６に示される塩基配列において、一又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加されたヌクレオチドを有し、かつ、ＤＮＡ損傷部位を認識する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）イネ科植物が、培養細胞の形態である（１）又は（２）に記載のイネ科植物。
（４）イネ科植物が、カルスの形態である（１）又は（２）に記載のイネ科植物。
（５）イネ科植物が、種子の形態である（１）又は（２）に記載のイネ科植物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、OsSEND-1及び／又はOsUV-DDB2遺伝子を植物、特にイネ科植物に導入することにより、紫外線、化学物質あるいは放射線等による遺伝子損傷に対し、有効な耐性能が付加された植物を提供できる。これにより、イネ科植物等の遺伝子損傷による生育不全等に伴う収穫量の減少を軽減させ、将来、予想される食糧危機に対処する点でも重要な手段となりうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明においては、イネ科植物に、OsSEND-1（Oryza sativa Single-strand DNA endonuclease 1）、及び／又はOsUV-DDB2（Oryza sativa UV-damaged DNA binding protein2）遺伝子を導入し、該植物体内で強発現させる。
上記OsSEND-1遺伝子は、イネから単離された、植物特有の遺伝子であり、その発現産物であるOsSEND-1タンパク質は、一本鎖ＤＮＡに対してエンドヌクレアーゼ活性を有し、ＤＮＡ修復に関与していることが知られている。また、OsUV-DDB2遺伝子は、イネから単離同定された遺伝子であるが、UV-DDB2遺伝子はイネに限らず、高等動物から、植物、酵母にまで広く見いだされているものであり、その発現産物であるUV-DDB2タンパク質は、UV-DDB1タンパク質とヘテロダイマーを構成し、遺伝子の損傷部位を認識し、該損傷部位に他の遺伝子修復に関与するタンパク質を運ぶ機能を有する。
OsSEND-1タンパク質及びUV-DDB2タンパク質は、それぞれ、配列表の配列番号２及び５で示されるアミノ酸配列を有する。
本発明で使用するOsSEND-1遺伝子は、OsSEND-1タンパク質あるいは該タンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードするものであればよい。したがって、本発明で使用するOsSEND-1遺伝子の具体的な塩基配列は、配列番号３に示されるが、これに限らず、配列番号３の塩基配列において、一又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された塩基配列を有し、かつ、一本鎖ＤＮＡに対してエンドヌクレアーゼ機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を包含する。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするもの、あるいは、該配列番号２に示されるアミノ酸配列において、一又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列をコードするものであっても、ＤＮＡ修復において一本鎖エンドヌクレアーゼ機能を有するタンパク質をコードするものも含む。
一方、同様に、本発明で使用するOsUV-DDB2遺伝子の具体的な塩基配列は、配列番号６に示されるが、これに限らず、配列番号６の塩基配列において、一又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、又は付加された塩基配列を有し、かつ、同様にＤＮＡ損傷部位を認識する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするもの、あるいは、該配列番号５に示されるアミノ酸配列において、一又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列をコードするものであって、かつ、同様にＤＮＡ損傷部位を認識する機能を有するタンパク質をコードするものも含む。
【００１２】
〔遺伝子の調製〕
本発明のOsSEND-1遺伝子は以下のようにして得られたものである。
すなわち、イネの培養細胞から、ｍＲＮＡを単離し、このｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応及びＤＮＡ合成反応により２本鎖ｃＤＮＡを合成し、これをLamda ZAPII（STRATAGENs社）にライゲーションし、パッケージングしてｃＤＮＡライブラリーを作成した。
一方、イネのＥＳＴクローンのデータベースを検索し、動物のRad2ヌクレアーゼファミリーに特異的なモチーフと高い相同性をもつＥＳＴクローンを見いだし、該ＥＳＴクローンを入手し、該ＥＳＴクローンのインサート配列を制限酵素で切り出してプローブとし、該プローブを使用して上記ｃＤＮＡライブラリーから、通常のプラークハイブリダイーション法により、スクリーニングし、OsSEND-1遺伝子を単離したものである。
また、OsUV-DDB2遺伝子は、イネのＥＳＴクローンの中から、動物のUV-DDB2遺伝子と相同性の高いＥＳＴクローンを見いだし、上記と同様にして、プローブを作成し、該プローブを用いて上記ｃＤＮＡライブラリーから単離したものである。
しかし、本発明のOsSEND-1遺伝子、OsUV-DDB2遺伝子を得る手段としては、上記方法に限らず、他の方法によっても得ることができる。
例えば、目的とする遺伝子の５’末端と３’末端が、ゲノムプロジェクトなどの配列情報により明らかな場合は、RT-PCR法により、遺伝子を単離することができる。イネの培養細胞や植物組織からmRNAを単離し、このmRNAを鋳型として逆転写反応によりcDNAを合成する。このcDNAを鋳型として、目的とする遺伝子の５’末端と３’末端の配列から設計したプライマーを用いてPCRを行う。PCRにより増幅された断片を適当なクローニングベクター（pBluescriptやpGEM等）にサブクローニングすることで、遺伝子が単離できる。
【００１３】
〔植物発現ベクターの作成〕
単離されたOsSEND-1遺伝子あるいはOsUV-DDB2遺伝子をイネ科植物に導入する方法としては、種々の方法が知られているが、バイナリーベクターを使用する方法が好ましい。使用するバイナリーベクターとしては、例えば、MLH7113等が挙げられる。このMLH7113は、薬剤耐性遺伝子領域（Pnos、NPTII及びTnos）を有するバイナリーベクターpBI121(Clontech社）のカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターの上流域に、カリフラワーモザイクウイルスの5’上流配列（E7）およびタバコモザイクウイルスの5’上流配列(Ω)を組み込んだものである。このベクターを使用する場合、OsSEND-1遺伝子あるいはOsUV-DDB2遺伝子は、該ベクターのマルチクローニングサイトに挿入する。このベクターの構造は図１に示される。
本発明においては、イネ科植物において、OsSEND-1遺伝子あるいはOsUV-DDB2遺伝子を強発現させるが、そのために使用するプロモーターとしては上記の他にトウモロコシなどのユビキチンプロモーター等が挙げられ、植物体内で強く発現する遺伝子のプロモーターであれば特に制限はなく、使用できる。
【００１４】
〔イネ科植物の形質転換〕
上記で得られた植物発現ベクターは、例えばAgrobacterium tumefaciens EHA101等のアグロバクテリウム属菌に、エレクトロポレーション法等を用いて導入し、薬剤含有選択培地で培養する。次に、シングルコロニーから上記発現ベクターが導入され、薬剤耐性を有する株を採取し、アグロバクテリウム属菌の懸濁液を調製し、これを感染源として、イネ科植物の形質転換に用いる。
イネ科植物の形質転換は、イネの適当な組織あるいは該組織から作成したカルスを上記アグロバクテリウム懸濁液と接触させることにより行う。以後、該組織あるいはカルスを生育させることにより、OsSEND-1遺伝子及び／又はOsUV-DDB2遺伝子が導入され、これら遺伝子が強発現しているイネ科植物が得られる。これら植物は紫外線等による遺伝子損傷に対し良好な耐性を有する。
【実施例】
【００１５】
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００１６】
〔実施例１〕
（１）遺伝子の単離
a) OsSEND-1の全鎖長ｃＤＮＡスクリーニング用プローブ
イネのESTクローンのデーターベース（http://www.dna.affrc.go.jp/misc/bank/index.html）を検索したところ、動物のRad2ヌクレアーゼファミリーに特異的なモチーフと高い相同性を持つESTクローン(E31468)を見いだした。このESTクローンを（独）農業生物資源研究所DNAバンクから入手し、該ESTクローンのインサート配列を制限酵素Sal IおよびNot Iで切り出し、以下のc工程のハイブリダイゼーションスクリーニングのプローブとした。
【００１７】
b) OsUV-DDB2の全鎖長ｃＤＮＡスクリーニングプローブ
イネのESTクローンのデーターベース（http://www.dna.affrc.go.jp/misc/bank/index.html）を検索したところ、動物のRad2ヌクレアーゼファミリーに特異的なモチーフと高い相同性を持つESTクローン(D47137)を見いだした。このESTクローンを（独）農業生物資源研究所DNAバンクから入手し、該ESTクローンのインサート配列を制限酵素Sal IおよびNot Iで切り出し、以下のc工程のハイブリダイゼーションスクリーニングのプローブとした。
【００１８】
ｃ）全鎖長cDNAのハイブリダイゼーションスクリーニング

対数増殖期にあるイネの培養細胞（Oc細胞）を回収し、RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAを単離した。Oligotex-dT30 (TaKaRa)によりtotal RNAからmRNAを精製した。このmRNAを鋳型に、NotI-oligo(dT)アダプタープライマー(Promega)をプライマーとして２本鎖cDNA合成をおこなった。2本鎖cDNA合成はStratagene社のcDNA合成キットを用いて行った。まず、第１鎖cDNA合成は、5μgのmRNAを70℃で5分加熱した後、NotI-oligo(dT) アダプタープライマーなどと混合し、StrataScript RT (Stratagen)により1時間逆転写反応を行うことにより行った。得られた第１鎖cDNAをテンプレートにして、E. coli. DNA polymerase IによりDNA合成を行い、末端の平滑化をPfu DNA polymerase (stratagene)により行うことで、2本鎖cDNAを合成した。得られた2本鎖cDNAの末端にEcoRIアダプターをDNA ligation kit (TAKARA)によりライゲーションさせた。その後5’末端のリン酸化をT4 polynucleotide kinaseにより行った。次に、2本鎖cDNAをNot Iにより切断したあと、SizesepTM400スパンカラム（ファルマシア）により精製した。得られた2本鎖cDNAをLamda ZAPII (Stratagene社)をEcoRIおよびNotIで切断したものにライゲーションした。これをGigapack III Gold (Stratagene社)を用いてIn vitro packagingを行い、イネ培養細胞由来のcDNAライブラリーを作成した。
次にこのcDNAライブラリーを用いてハイブリダイゼーションスクリーニングを行った。まずcDNAライブラリーのファージ懸濁液をホストである大腸菌XL1-Bler MRF’の培養液と混合し、37℃で15分培養することでファージをライブラリーに感染させた。次に、これをプレート上に播いてプラークを形成させた後、これらのプラークをナイロンメンブレンに写しとった。すなわち、このナイロンメンブレンにはcDNAライブラリーが固定されている。
次に、上記a)およびb)で作成したプローブをランダムプライムラベル法により放射性標識し、これを上記cDNAが固定されたナイロンメンブレンとハイブリダイゼーション（42℃16時間）させた。このナイロンメンブレンを洗浄後、オートラジオグラフィーを行うことで陽性クローンを選抜した。得られた陽性クローンをさらにハイブリダイゼーションスクリーニングにかける（合計３回、３次スクリーニングまで）ことにより単一のファージを得た。得られたファージをin vivo excisionによりプラスミド化した。このプラスミドの塩基配列をDNAシークエンサーにより解析した。以上によりOsSEND-1およびOsUV-DDB2の全鎖長のcDNAをそれぞれ得た（配列番号１、配列番号４）。
【００１９】
d）また、紫外線耐性試験の比較として、他のイネのＤＮＡ修復遺伝子も以下のようにして単離した。
【００２０】
OsRPA70aおよびOsRPA70b全鎖長遺伝子ｃＤＮＡ；
動物および酵母のRPAと相同性の高いESTクローンを上記データベース中に２種類見いだし、同様に入手した、このESTクローンのインサート配列を制限酵素、SalI及びNotIにより切り出してハイブリダイゼーションスクリーニングのプローブとして用いて、上記ｃＤＮＡライブラリから、上記と同様にスクリーニングし、全鎖長cDNAをそれぞれ単離した（配列番号７、配列番号１０）。
【００２１】
OsUV-DDB１全鎖長遺伝子ｃＤＮＡ；
動物のUV-DDB1と相同性の高いESTクローンを上記データベース中に見いだし、同様に入手した、このESTクローンのインサート配列を制限酵素、SalI及びNotIにより切り出してハイブリダイゼーションスクリーニングのプローブとして用いて、上記ｃＤＮＡライブラリーから上記と同様にスクリーニングし、全鎖長cDNAを単離した（配列番号１３）。
【００２２】
OsRadA全鎖長遺伝子cDNA；
原核生物のDNA組換えに関与する蛋白質であるRadAと相同性の高いESTクローンを上記データベース中に見いだし、同様に入手した、このＥＳＴクローンのインサート配列を制限酵素、SalI及びNotIにより切り出してハイブリダイゼーションスクリーニングのプローブとして用いて、上記ｃＤＮＡライブラリーから、上記と同様にスクリーニングし、全鎖長cDNAを単離した（配列番号１６）。
【００２３】
OsRFC3全鎖長遺伝子cDNA；
動物のRFC3と相同性の高いESTクローンを上記データベース中に見いだし、同様に入手した、このインサート配列を制限酵素、SalI及びNotIにより切り出してハイブリダイゼーションスクリーニングのプローブとして用いて、上記ｃＤＮＡライブラリーから上記と同様にスクリーニングし、全鎖長cDNAを単離した（配列番号１９）。
【００２４】
（２）植物発現ベクターの作成
ａ）OsSEND-1発現ベクター
上記（１）で得られた、OsSEND-1の全鎖長ｃＤＮＡを鋳型にして、CDS領域を、５’末端と３’末端にそれぞれBamHl site、Sacl siteをつけたプライマーを用いて以下のPCR条件で増幅した。
【００２５】
プライマー（センス）：CGGGATCCATGGGGGTGAAGAACCTGTGGGA（配列番号２２）
プライマー（アンチセンス）：CGAGCTCTCAATACAGCTCGTTCCGTATGC（配列番号２３）
PCR条件：
熱変成：94℃、30秒
アニーリング：50℃、30秒
伸長反応；72℃、2分
を30サイクル
【００２６】
得られた増幅断片をpBluescript SK＋プラスミドにサブクローニングした。次にこのプラスミドをBamHlとSaclの両制限酵素で切断し、遺伝子断片をアガロースゲル回収法によって精製した。この遺伝子断片をMLH7113ベクターのマルチクローニングサイトにライゲーションし、OsSEND-1発現ベクターとした。
該ベクターに導入されたOsSEND-1のＣＤＳ部分の塩基配列を配列番号３に、及びこれに対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２７】
ｂ）OsUV-DDB2発現用ベクター
上記（１）で得られた、OsUV-DDB2の全鎖長ｃＤＮＡを鋳型にして、CDS領域を、５’末端と３’末端にそれぞれBamHl site、Sacl siteをつけたプライマーを用いて以下のPCR条件で増幅した。
【００２８】
プライマー（センス）：CGGGATCCATGGGCCCTACCACCCGCGCCC（配列番号２４）
プライマー（アンチセンス）：CGAGCTCTCAAACCTTGGATTTGCCCTTCC（配列番号２５）
PCR条件：
熱変成：94℃、30秒
アニーリング：55℃、30秒
伸長反応；72℃、2分
を30サイクル
【００２９】
以下、上記（２）ａ）と同様にして、OsUV-DDB2発現用ベクターとした。
該ベクターに導入されたOsUV-DDB2のＣＤＳ部分の塩基配列を配列番号６に、及びこれに対応するアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００３０】
ｃ）他のイネのＤＮＡ修復遺伝子の発現ベクター
他のイネのＤＮＡ修復遺伝子についても、それぞれ以下の各プライマーを用いる他は上記（２）ａと同様にして、各ＤＮＡ修復遺伝子発現ベクターを得た。
【００３１】
ｄ）OsRPA70a発現用ベクター
プライマー（センス）：CGCGGATCCATGGCGATGGCGAGGCTGA（配列番号２６）
プライマー（アンチセンス）：CGAGCTCCTAATGTAGCGCCGAGGACTT（配列番号２７）
PCR条件：
熱変成：94℃、30秒
アニーリング：50℃、30秒
伸長反応；72℃、2分
を30サイクル
【００３２】
ｅ）OsRPA70b発現用ベクター
プライマー（センス）：CGCGGATCCATGGATTCCGACGCGGCACC（配列番号２８）
プライマー（アンチセンス）：CGAGCTCCTAGCAACCTGTCAGCTTGGCT（配列番号２９）
【００３３】
ｆ）OsUV-DDB1発現用ベクター
プライマー（センス）：CGGGATCCATGAGCGTGTGGAACTACGTC（配列番号３０）
プライマー（アンチセンス）：CGAGCTCCTAGTGCAATCTAGTCAGCTCCT（配列番号３１）
PCR条件：
熱変成：94℃、30秒
アニーリング：50℃、30秒
伸長反応；72℃、2分
を30サイクル
【００３４】
ｇ）OsRadA発現用ベクター
プライマー（センス）：CGGGATCCATGCCCCACCCCTCCGCCGCC（配列番号３２）
プライマー（アンチセンス）：CGAGCTCTCATCCTTGTGGCCTAAATAC（配列番号３３）
PCR条件：
熱変成：94℃、30秒
アニーリング：50℃、30秒
伸長反応；72℃、2分
を30サイクル
【００３５】
ｈ）OsRFC3発現用ベクター
プライマー（センス）：CGGGATCCATGGCGGGAGCCACCGCCGCCA（配列番号３４）
プライマー（アンチセンス）：CGAGCTCTTAGTGGGCAGCAGCAACCATA（配列番号３５）
PCR条件：
熱変成：94℃、30秒
アニーリング：50℃、30秒
伸長反応；72℃、2分
を30サイクル
【００３６】
これら発現ベクターに導入された各遺伝子の塩基配列、及び対応するアミノ酸配列は以下の配列番号によりそれぞれ示される。
OsRPA70a；配列番号９、８
OsRPA70a；配列番１２、１１
OsUV-DDB１；配列番号１５、１４
OsRadA；配列番号１８、１７
OsRFC3；配列番号２１、２０
【００３７】
（３）イネの形質転換
ａ）アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換とその懸濁液の調製
YEB培地中28℃、２日間浸透培養したアグロバクテリウムEHAl01懸濁液を10％グリセロール中に再懸濁し、エレクトロポレーション法（25mF, 200Ω、2.5kV）により、（２）で作成した各発現ベクターを用いてそれぞれ形質転換した。
それぞれ形質転換したアグロバクテリウムをYEBプレート（カナマイシン50mg/ml、ハイグロマイシン25mg/ml入り）にまき、28℃で２日間静置した。２日間静置してできたコロニーを上記の抗生物質を含むYEB選択培地溶液中に懸濁し、28℃で２日間浸透培養した。培養した懸濁液からプラスミド抽出を行い、懸濁液にプラスミドが含まれる事を確認した後、懸濁液をAB培地（１１当たり、K₂HPO₄ 3g、NaH₂PO₄・2H₂O 1.3g、NH₄Cl 1g、KCl 0.15g、CaCl₂・2H₂O 10mg、FeSO₄・7H₂O 2.5mg、グルコース 5g、アガー 15g（pH 7.2））上にストリークし、28℃で３日間、暗所で静置した。これを、AAM培地（11当たり、AA培地(Toriyama, K. and Hinata, K.（1986）Theor. Appl. Genet., 73. 16-19)、カザミノ酸 500mg、スクロース 68.5g、グルコース 36g、L-グルタミン900mg、アスパラギン酸300mg（pH 5.2））に懸濁し、各形質転換アグロバクテリウム懸濁溶液とした。
【００３８】
ｂ）イネの形質転換
イネの種子から籾殻を取り除き、N6Dプレート（１ｌ当たり、スクロース30g、カザミノ酸300mg、プロリン2878mg、SIGMA CHU(N6) BASAL SALT MIXTURE（SIGMA）3.981g、N6ビタミン5ml、2,4-D 2mg、0.4％ゲルライト）上に２週間、28℃で静置することで、脱分化を行った。得られたイネカルスをそれぞれ終濃度10mg/lのアセトシリンゴンとともに上記の各アグロバクテリウム懸濁液に浸して感染を行った後に、2N6-ASプレート（1l当たり、スクロース30g，グルコース10g、カザミノ酸 300mg、SIGAM CHU (N6) BASAL SALT MIXTURE (SIGMA) 3.981g、 N6ビタミン 10ml、2,4-D 2mg、FeSO₄・7H₂O 27.8mg、Na₂EDTA 37.3mg、myo-イノシトール 100mg、 0.2% ゲルライト、pH 5.2、カルベニシリン 500mg、ハイグロマイシン 25mg）上に移し、２８℃、暗所で３日間共存培養した。共存培養した各カルスを滅菌水で洗浄後、選抜培地（1l当たり、スクロース30g，カザアミノ酸 300mg、プロリン 2878mg、SIGMA CHU (N6) BASAL SALT MIXTURE (SIGMA) 3.981g、 myo-イノシトール 100mg、 N6ビタミン 5ml、2,4-D 2mg、 0.4% ゲルライト、pH 5.8、カルベニシリン 500mg、ハイグロマイシン 25mg)に移し、２８℃、明所で７日間培養した。７日間培養した各カルスをさらに選抜培地に移し、28℃、明所で７日間培養した。選抜されたカルスを再分化培地（1l当たり、スクロース 30g、ソルビトール 30g、カザミノ酸 2g、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類 (和光) 4.6g、カイネチン 2mg、ナフタレン酢酸 0.2mg、0.8% アガロース、pH 5.8，カルベニシリン 500mg、ハイグロマイシン 25mg）に移し、28℃、明所で１４日間培養した。仲長してきた個体をHF培地（1l当たり、スクロース 30g、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類 (和光) 4.6g、0.25% ゲルライト、 pH 5.8、カルベニシリン 500mg、ハイグロマイシン 25mg）に移し、10cmほど個体が生長したら、土壌に移した。その後植物を生育させ種子を回収した。
【００３９】
〔実施例２〕
紫外線耐性能の検討
（１）形質転換体における各導入遺伝子の強発現の検出
実施例１で得られた形質転換体のF2世代のイネの種子を定法により脱分化しカルスを得た。得られた形質転換カルスにおけるOsSEND-1遺伝子、OsUV-DDB2遺伝子、及び他のDNA修復遺伝子が強発現していることを確認するためにノーザンハイブリダイゼーション法による発現解析を行なった。
上記形質転換されたイネのカルスからRNeasy Plant Mini Kitを用いてtotal RNAを抽出した。
1レーン当たり、20μgのtotal RNAを1.2%アガロースホルムアミドゲルで電気泳動した後、ナイロンメンブレン（Hybond-Nメンブレン（Amersham社））にブロッテイングした。得られたメンブレンをプレハイブリダイゼーション処理した後ランダムプライマー法によりラベルした上記各導入遺伝子のｃDNAをプローブとして、ハイブリダイゼーションを行った。その後洗浄し、オートラジオグラフィーにより各導入遺伝子に対応するｍＲＮＡを検出した。結果を図２に示す。
７種類のDNA修復遺伝子について、それぞれ２または３系統の形質転換カルスについて発現量を調べたところ、コントロール（一番左のレーン）と比較して発現が上昇している系統があることが確認された。
ただしOsUV-DDB1が強発現しているカルスを得ることはできなかった。
【００４０】
（２）紫外線耐性能の検定
ａ）紫外線照射条件
以下の試験において形質転換体に対する紫外線照射は主にUV-Bを用いて行った。PHILIPS社製のUV-Bランプ（TL20W/01RS）を水平に複数本設置した。このUV-Bランプから照射される紫外線の波長は大部分がUV-B（290-320nm）である。照射するランプの本数と植物体までの距離を変えることで、照射量を調節することができる。照射強度はSpectrol inedigital radiometer(Spectronic Corporation社)で測定した。
【００４１】
ｂ）各ｃＤＮＡ導入形質転換体カルスの紫外線耐性能の検定
発現が上昇している系統のカルスについて下記の紫外線耐性能の検定を行った。
上記の形質転換カルスに10000J/m2，もしくは20000J/m2の強度のUV-Bを一時期に照射した。照射したカルスを28℃に４日及び７日培養し、カルスの大きさを測定することで、紫外線耐性能を解析した。複数回実験を繰り返して結果を評価した。紫外線耐性の上昇しているカルスは、コントロールと比較してカルスが大きく増殖することが期待される。
結果を図３および４に示す。10000J/m2もしくは20000J/m2のUV-Bをカルスに照射後、３日（図３）もしくは５日（図４）生育させた。コントロールとしての非照射群のカルスの大きさと比をグラフにしたものである。ベクターのみを形質転換させたコントロールは、UV-B照射することで生育が50～60％まで阻害されている。一方、形質転換体では生育の阻害が５～２０％程度回復していた。得にOsRPA70b，OsSEND-1，OsRFC3，OsUV-DDB2を強発現するカルスの紫外線耐性能の上昇が顕著であった。しかしながらOsRPA70bおよびOsRFC3を強発現する植物はカルスの生育速度が遅いため（図５）、以降の実験には用いなかった。
【００４２】
ｃ）形質転換植物体におけるOsSEND-1とOsUV-DDB2の発現解析
形質転換した植物体（水耕栽培で播種後１４日目のイネのシードリング）におけるOsSEND１の発現量をRT-PCR法により解析した。まず、形質転換植物体から常法によりtotal RNAを単離した。単離したtotal RNAを鋳型として、SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq（Invitorgen社）を用いてRT-PCRを行った。増幅断片をアガロースゲル電気泳動しトランスイルミネーターで観察した。
一方、形質転換植物体におけるOsUV-DDB2の発現量をノーザンハイブリダイゼーション法により解析した。まず、形質転換体からtotal RNAを単離した。１レーンあたり20μgのtotal RNAを、ホルムアルデヒドが入った1.2％アガロースゲル電気泳動で分離したあと、ナイロンメンブレンにブロッティングした。得られたメンブレンをプレハイブリダイゼーション処理した後、ランダムプライマー法によりラベルしたOsUV-DDB2のcDNAをプローブして、ハイブリダイゼーションをおこなった。その後洗浄し、オートラジオグラフィーによりシグナルを検出した。
複数の系統について解析したところ、図６に示すように、複数の形質転換植物体において、導入したOsSEND-1とOsUV-DDB2遺伝子が強発現していることが確認された。発現が上昇している系統の植物体について下記の紫外線耐性能の検定を行った。
【００４３】
ｄ）OsSEND-1とOsUV-DDB2導入形質転換植物体の耐紫外線能の検定
１回の実験あたり形質転換体のイネの種子を１２個体ずつ発芽させて使用した。発芽３日後のシードリングを土に植えかえて、UV-Bを1.2J/m2の強度で連続照射した。経時的に植物個体の丈長を測定することで植物個体の紫外線耐性能を評価した。複数回実験を繰り返して結果を評価した。紫外線耐性の上昇している植物体はコントロールと比較して生育の阻害が押さえられることが期待される。
図７は照射後、３日後もしくは５日後の植物体の成長率である（３，５日目の丈長を照射開始時の丈長で割ったもの）。野生型もしくはベクターのみを形質転換したコントロール植物は、３日後で２倍、５日後で４倍程度しか丈長がのびていないのに対して、OsSEND-1およびOsUV-DDBを強発現する植物は、生育阻害が回避されて、5.5～6倍の生長が観察された（図７）。
また、紫外線非照射下における丈長から照射下における丈長を引き算した値で紫外線耐性能を評価したのが図８である。この場合差が少ない（グラフで下にプロットされる）と紫外線耐性が上昇していると判断できる。OsSEND-1とOsUV-DDB2を強発現する植物は、コントロールと比べて紫外線耐性が上昇していることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明で使用したバイナリーベクターＭＬＨ７１３３の構造の概略を示す図である。
【図２】実施例２で行った形質転換カルスにおける各遺伝子の発現検出実験におけるオートラジオグラフィーの結果である。
【図３】実施例３（１）で行った、各遺伝子導入形質転換カルスのＵＶ－Ｂ照射後、３日間増殖させた後の増殖度を測定した結果を示すグラフである。
【図４】実施例３（１）で行った、各遺伝子導入形質転換カルスのＵＶ－Ｂ照射後、５日間増殖させた後の増殖度を測定した結果を示すグラフである。
【図５】実施例３（１）で行った、各遺伝子導入形質転換カルスの生育速度を比較したグラフである。
【図６】実施例３（２）で行った、OsSEND-1及びOsUV-DDB2遺伝子導入形質転換植物体における、同遺伝子の発現量の解析結果を示す写真である。
【図７】実施例３（２）で行った、ＵＶ－Ｂ照射後３日後及び５日後のOsSEND-1及びOsUV-DDB2遺伝子導入形質転換植物体の成長率を示すグラフである。
【図８】OsSEND-1及びOsUV-DDB2遺伝子導入形質転換植物体の紫外線耐性能（紫外線非照射下における丈長－照射下における丈長）を評価した結果を示すグラフである。

【出願人】	【識別番号】８０３０００１１５【氏名又は名称】学校法人東京理科大学
【出願日】	平成１７年４月２７日（２００５．４．２７）
【代理人】	【識別番号】１００１０５６８１【弁理士】【氏名又は名称】武井秀彦【識別番号】１００１１９４３７【弁理士】【氏名又は名称】吉村康男
【公開番号】	特開２００６－３０４６４５（Ｐ２００６－３０４６４５Ａ）
【公開日】	平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【出願番号】	特願２００５－１２９４１２（Ｐ２００５－１２９４１２）